Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mucin 1 (MUC1) on heterodimeerinen proteiini, joka on poikkeuksellisesti ilmaistu erilaisissa ihmisen karsinoomia ja tietyt hematologisia syöpiä. Onkogeenisel- MUC1 transmembraani- C-terminaali alayksikön (MUC1-C) toiminnot osittain transdusoimalla kasvua ja selviytymistä signaaleja solun pinnan reseptoreihin. Kuitenkin tiedetään vähän rakenteesta MUC1-C sytoplasmisen domeenin mahdollisena huume kohde. Käyttäen menetelmiä rakenteellisten ennusteita, tuloksemme osoittavat, että erittäin konservoitunut CQCRRK sekvenssi, joka on lähellä solukalvon, muodostaa pieni tasku, joka altistaa kahden kysteiinitähteen muodostamiseksi disulfidisidoksia. Sitä vastoin jäljellä MUC1-C sytoplasminen domeeni ei ole ilmeistä rakenne, sopusoinnussa sisäisesti huonokuntoinen proteiinia. Tutkimuksemme siten keskitytty kohdistamaan MUC1 CQCRRK alueella. Tulokset osoittavat, että L- ja D-aminohappo CQCRRK sisältävät peptidit sitoutuvat suoraan CQC motiivi. Olemme lisäksi osoittavat, että D-aminohapon peptidi, joka on nimetty GO-203, lohkot homodimerisaation MUC1-C sytoplasminen domeeni in vitro ja transfektoiduissa soluissa. Lisäksi GO-203 sitoutuu suoraan endogeeniseen MUC1-C rinta- ja keuhkosyövän soluja. Rinnakkaispaikantumisen tutkimukset osoittavat lisäksi, että GO-203 pääasiallisesti sitoutuu MUC1-C solukalvon. Nämä havainnot tukevat edelleen kehittämistä aineita, jotka kohdistuvat MUC1-C sytoplasmadomeenissa CQC motiivi ja siten MUC1-C toiminto syöpäsoluissa.

Citation: Raina D, Agarwal P, Lee J, Bharti A, McKnight CJ Sharma P, et ai. (2015) karakterisointi MUC1-C sytoplasmadomeenissa kuin Cancer Target. PLoS ONE 10 (8): e0135156. doi: 10,1371 /journal.pone.0135156

Toimittaja: Srinivasa M. Srinivasula, IISER-TVM, Intia

vastaanotettu: 08 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 17 heinäkuu 2015; Julkaistu: 12 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Raina et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: Tutkimus raportoitu tässä julkaisussa tukivat National Cancer Institute of National Institutes of Health alle palkintoja CA097098 ja CA166480, http: //www.cancer. gov (DK). Suku Oncology tuettiin muodossa palkkojen tekijöille D.R. ja S. K. LeadInvent tuettiin muodossa palkkojen tekijöille P.A. ja P.S. Erityinen roolit nämä kirjoittajat nivelletty ”kirjoittajat maksut kohta”. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Olen lukenut lehden politiikka ja laatijat käsikirjoitus on seuraavat kilpailevien etujen : DK on tasapuolisuus Genus Syöpätautien on konsulttina. Liittämisellä suvun Oncology ja LeadInvent tätä työtä ei muuta meidän noudattamista PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

epithelia ovat kerroksia sivusuunnassa yhdistetty solujen apikaaliset-pohjapinta polaarisuus jotka on suojattu ulkoiselta ympäristöltä, jonka limakalvoa [1]. Limakalvon perhe eritetyn ja transmembraanisen glykoproteiinien kehittynyt metazoans suojaamista epiteelien että esimerkiksi rivi (i) hengitysteiden ja ruoansulatuskanavan kirjoitusten, ja (ii) kanavat erikoistuneissa elimissä [1]. Mucin 1 (MUC1) on transmembraaninen tämän perheen jäsen, joka tunnistettiin sen yli-ilmentymisen ihmisen rintasyöpiä [2]. MUC1 koostuu kahdesta alayksiköstä, jotka ovat peräisin itse- katkaisukohtien yhden polypeptidin ja puolestaan ​​muodostavat heterodimeerisen kompleksin apikaalisen kalvon normaalien epiteelisolujen [1]. MUC1 N-terminaalista alayksikköä (MUC1-N) sisältää tandem 20-aminohapon (aa) toistuu joka muuttamat

O

glykaanien. MUC1-C-terminaalinen alayksikön (MUC1-C) on transmembraaninen osa heterodimeerin ja ankkurit MUC1-N solun pintaan. MUC1 yli-ilmentyy erilaisissa karsinoomat, tukee käsitystä, että säätelyä MUC1-N /MUC1-C kompleksi edustaa alaversio normaalia toiminta edistää selviytymistä syöpäsolujen [1]. Tässä yhteydessä ja lisäksi osallistuvat limakalvoa, glykosyloituja MUC1-N voi parantaa solun pinnan reseptorin toiminnan tukemiseen kasvua ja selviytymistä [3]. Lisäksi ja yhdessä menetykseen polaarisuus, MUC1-C vuorovaikutuksessa solun pinnan molekyylejä, kuten reseptorityrosiinikinaaseissa ja edistää niiden aktivaation ja loppupään signalointi [4]. Merkittävää on, yli-ilmentyminen MUC1-C on riittävä antamaan ankkuroitumisesta riippumattomaan kasvuun ja tuumorigeenisyyden, tukemalla onkogeenisiä tehtävä tämän alayksikön [5].

MUC1-C koostuu 58-aa solunulkoinen domeeni, 28- aa läpäisevä alue ja 72-aa sytoplasmadomeenia. MUC1-C solunulkoinen domeeni sisältää NPG motiivi asparagiinitähteessä kohteena

N

-glycosylation [6]. Sitoutuminen galektiini-3, että glykosyloidun NPG sivuston edistää muodostumista ekstrasellulaarisen siltoja MUC1-C: n ja muiden solun pinnan molekyylien, kuten epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) [6]. MUC1-C sytoplasmisen domeenin (MUC1-CD) sisältää CQC motiivin vieressä läpäisevä alue, joka on välttämätön ja riittävä muodostumista MUC1-C-homodimeerejä [7,8]. Tärkeää on, mutaatio CQC motiivi AQA lohkojen tuonti MUC1-C tumaan ja mitokondrion ulkokalvon [7,9,10]. Lisäksi CQC → AQA mutaatio kumoaa MUC1-C onkogeenisen toiminto, joka tukee tärkeyttä MUC1-C homodimerisaation ajo solunsisäisiä signaaleja, jotka antavat kasvun ja eloonjäämisen [7,11]. Näin ollen, MUC1-C CQC motiivi on tullut houkutteleva kohde kehittämiseen peptidin ja pienimolekyylisiä estäjiä, jotka estävät MUC1-C homo- ja toiminta [12,13].

Esillä on tutkittu rakenne MUC1-C sytoplasmadomeenissa perustuu sen potentiaali merkitys syövän tavoite. Me osoitamme, että MUC1-C sytoplasminen CQC motiivi asuu druggable kokoonpano, ja että loput sytoplasmisen domeenin on rakenteinen johdonmukainen muiden onkogeenisten molekyylien, jotka ohjaavat aktivointi useita signalointireittien [14]. Lisäksi osoitetaan, että MUC1-C sytoplasmadomeenissa voidaan valikoivasti kohdennettua kanssa peptidejä, jotka suoraan sitoutuvat CQC motiivi ja estää MUC1-C homodimerisoitumisessa in vitro ja soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Molecular Dynamics

MUC1-CD (aminohapot 1-15) rakenne oli rakennettu

ab-inito

edullisen phi /psi kulmat vastaavien aminohappojen. Tuloksena atomirakenne nimenomaisen vesimolekyylien ja ionien tutkittiin ilman kalvo kaksikerroksinen käyttäen Assisted Model Building Energy Refinement (oranssi) [15]. Sen jälkeen vakauttaminen vaiheet minimointi, lämmitys ja tasapainotus, vain 15 ns simulaatioita tehtiin tuottamaan 1500 konformaatioita erotettu 10 picoseconds, joka analysoitiin edelleen Root Mean Square Poikkeama (RMSD). Lisätutkimuksissa, MUC1-C kalvon alue, jolla on hallitseva heliksin konformaatio kuin ennustettu THMHMM ja TMPRED, lisättiin ennalta equalibrated 1-palmitoyyli-2-oleyyli-sn-glysero-3-fosfokoliini (POPC) bi -kerros ja solvatoitu nimenomaisen vedellä ja ioneja. Loput sytoplasmadomeeni aminohapot rakennettiin haluamallaan phi /psi näkökulmista. Nanomittakaavan molekyylidynamiikan (NAMD) [16], käytettiin suorittamaan molekyylitason dynamiikkaa tutkimuksessa.

NMR analyysi MUC1-CD

His-MUC1-CD ilmennettiin pET-MUC1- CD-plasmidin (Novagen, Billerica, MA) ja

15N-leimatun proteiinin valmistettiin, kuten on kuvattu [17]. NMR-näyte koostui 1,7 mg /ml His-MUC1-CD, 1% D

2O, vertailuyhdiste TMSP (250 uM) ja 10 mM d

10-DTT. PH säädettiin arvoon 5,0 lisäämällä 1 M HCl: ää. Yksi ja kaksiulotteinen

15N heteronuclear yksikvanttikoherenssispektroskopian (HSQC) tiedonkeruut suoritettiin 20 ° C: ssa ja 10 ° C: ssa 500 MHz Bruker Advance III NMR järjestelmä Boston University Core järjestely rakenteellisia NMR. Data-analyysi saatiin aikaan käyttämällä Bruker n topspinin ohjelmisto.

Sitoutumisaffiniteettien

sitoutumisaffiniteetit FITC-GO-202 ja FITC-GO-203 määritettiin saturaatiositoutumisella menetelmällä [18]. Lyhyesti, 96-glutathione- tai nikkeli-päällystetyillä levyillä (Thermo Fisher, Waltham, MA) inkuboitiin 150 ul: lla PBS: ää, joka sisälsi 21,45 ug /ml GST-MUC1-CD, GST-MUC1-CD (AQA) tai His-MUC1-CD yön yli 4 ° C: ssa, minkä jälkeen pestään 50 mM Tris ja 150 mM NaCl: a, joka sisälsi 0,1% Tween-20 (TBST), ja estää jossa oli 0,5% BSA: ta TBS: ssä. Tämän jälkeen levyt pestiin 3 kertaa TBST: llä. FITC-GO-202 tai FITC-GO-203, lisättiin kuoppiin 0,19 uM 25 uM. Epäspesifinen sitoutuminen määritettiin, kun läsnä oli yksin GST: tä. Levyjä inkuboitiin 1 h 37 ° C: ssa ravistelijassa, minkä jälkeen pestään 3 kertaa sitomispuskurilla. Fluoresenssi-intensiteetti määritettiin Infinite M1000 PRO Tecan Microplate Reader (Tecan, NC), jossa eksitaatio 490 nm ja emissio 525 nm: ssä. GraphPad Prism 4.0 Software (San Diego, CA) käytettiin laskettaessa tasapainodissosiaatiovakio (Kd) ei-lineaarisen regression menetelmää.

Complex karakterisointi MALDI-TOF-MS:

Sidonta kokeiluja MUC1-CD ja GO-203 suoritettiin, kuten on kuvattu [19]. Kompleksit eluoitiin glutationihelmiin, dialysoitiin ja konsentroitiin käyttämällä Amicon Ultra sentrifugisuodattimet (Millipore, Billerica, MA). Kompleksit tehtiin sitten ei-pelkistävä elektroforeesi ja värjättiin Coomassie Blue. Proteiinivyöhykkeet leikattiin irti ja analysoitiin MALDI-TOF-MS kuvatulla tavalla [20]. Lyhyesti, geelit leikattiin pieniksi, yhtenäinen kappaletta; Geelin palaset olivat kuivattu asetonitriilillä ja sitten niihin lisätään 100 mM ammoniumbikarbonaattia ja sitten 2 pesu ja kuivaus syklit ammoniumbikarbonaatilla ja asetonitriilin, tässä järjestyksessä. Kun täydellinen kuivuminen, geelipalat suspendoitiin 12,5 ng /ul trypsiinillä 50 mM ammoniumbikarbonaattia (50 ui). Geelissä digestio suoritettiin 37 ° C: ssa 10-12 h ja näytteet tehtiin happamiksi 50 ui 0,5% TFA: ta. Kolmekymmentä ui tätä seosta poistettiin suolat C-18, joka sisältää Zip-Tip (Millipore, Billerica, MA). Trypsiini-pilkottu peptidit analysoitiin MALDI-TOF-MS (ABI-4800). MALDI-TOF-MS-analyysit suoritettiin käyttäen heijastin menetelmää, joka oli optimoitu hankinta massan välillä 700-3500 amu. Tietoja kerättiin ja analysoitiin tietoja Explorer ohjelmistopaketti (AB-Sciex, Framingham, MA) ja MASCOT (ver.2.0.04, Matrix Science, Boston, MA). MS-silta analyysi tehtiin käyttämällä Protein Prospector (ver.4.27.2 perus- ja ver.5.0, UCSF). Tietokanta hakuparametrit olivat: (i) trypsiinisoija sulatella, (ii) hapettaa Met, (iii) 2 väliin pilkkoutumisten ja (iv) disulfidisillassa mahdollisimman linkin molekyylien asetetaan 2 ja massa toleranssi 50 ppm. Searching tehtiin vastaan ​​GST-MUC1-CD ja GO-203.

Plasmidin Hakemisto Rakentaminen

ilmentävät GST-MUC1-CD, GST-MUC1-CD (AQA) ja His-MUC1-CD GFP-MUC1-CD ja FLAG-MUC1-CD on kuvattu [7]. His-merkitty MUC1-CD (rotta ja koira) kloonattiin pET28a: han vektori (Clontech, Mountain View, CA) ja ilmaistaan ​​

E

.

coli

BL21 (DE3).

In vitro

Dimerisaatio

puhdistettua His-MUC1-CD inkuboitiin PBS: ssä tai kasvavia määriä GO-203 1 h huoneen lämpötilassa, kuten on kuvattu [19]. Sitten proteiinit erotetaan ei-pelkistävissä polyakryyliamidigeeleillä ja analysoitiin immunoblottauksella.

Cell Culture

Ihmisen ZR-75-1 rintasyövässä (ATCC) ja H1975 keuhkosyöpä (ATCC) solulinjoja kasvatettiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (HI-FBS), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä. 293T-soluja kasvatettiin DMEM: ssä, jossa oli 10% HI-FBS: ää, antibiootteja ja 2 mmol /l L-glutamiinia. Soluja käsiteltiin FITC konjugoidulla-GO-202 (FITC-GO-202), FITC-GO-203 tai konjugoimattoman GO-203 syntetisoitiin MIT Biopolymer Laboratory (Cambridge, MA) ja AnaSpec, Inc. (San Jose, CA). P3XFLAG-CMV-10 (Sigma, St. Louis, MO), pEGFP-C1 ja pDsRed-Monomeeri-N1 (Clontech, Mountain View, CA), vektoreita käytettiin transfektioon rotan ja koiran MUC1-CD ja täyspitkä ihmisen MUC1 293T-soluissa, kun läsnä on Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY).

immunosaostus ja immunoblot-analyysi

Solulysaatit valmistettiin, kuten on kuvattu [19]. Liukoiset proteiinit immunosaostettiin anti-FLAG (Sigma, St. Louis, MO), anti-MUC1-C (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) tai kontrolli-IgG. Saostumat ja lysaatit eivät ne alistettiin immunosaostukselle immunoblotattiin anti-MUC1-C, anti-GFP (Abcam, Cambridge, MA), anti-FLAG ja anti-FITC: tä (Life Technologies, Grand Island, NY). Reaktiivisuus havaittiin piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita ja kemiluminesenssin.

Analyysi GO-203 Localization

293T-solut transfektoitiin MUC1-pDsRed-Monomeeri-N1 läsnä ollessa Lipofectamine 2000 48 h. Sitten soluja inkuboitiin FITC-GO-203: ssa 3 tuntia ja tutkittiin käyttäen Nikon-dekonvoluutio laaja-kentän epifluoresenssilla järjestelmä, jossa 100x immersioöljyobjektiivilinssillä. Kuvat otettiin käyttäen NIS-elementti ohjelmisto (Nikon) ja analysoitiin ImageJ ohjelmisto.

Tulokset

analyysi MUC1-C sytoplasmadomeenissa Structure

Jos haluat määrittää rakenteen 72-aminohapon MUC1 sytoplasminen domeeni (MUC1-CD), ensin käytetään useita ehtoja tuottamaan kiteitä puhdistetulla MUC1-CD-proteiinia. Nämä pyrkimykset kiteytys epäonnistuivat, kannustavat tutkimaan molekyylien simulointitutkimuksiin. Ensin kääntyi homologiamallinnusta yhtenä lähestymistapa kartoittaa rakenteellisten seikkojen MUC1-CD. Erityisesti kuitenkin MUC1-CD näytteillä juurikaan sekvenssihomologia tunnettujen proteiinien. Niinpä olemme tutkineet sekundaarinen rakenne ennusteita MUC1-CD eri menetelmillä, mukaan lukien ROBETTA [21] ja IGB-SSPro [22]. Tulokset näistä tutkimuksista yhdessä osoittivat, että MUC1-CD ei vastaa tyypillistä sekundaarinen rakenne.

Näin Keskityimme 15 ensimmäistä aminohappoa MUC1-CD (CQCRRKNYGQLDFIP) tutkimalla sen atomistisiin molekyylidynamiikka . MUC1-CD (1-15) malli rakennettiin

ab-inito

edullisen phi /psi kulmien aminohappoja. Saatu rakenne tutkittiin sitten nimenomaisella vedellä ja ioneja. Lyhyillä 15 nanosekunnin simulaatiot (1500 konformaatioita erotettu 10 picoseconds) kanssa AMBER ja ovat osoituksena RMSD, huomasimme, että MUC1-CD (1-15) sekvenssi on myös luonnostaan ​​jäsentymätön ilman edullisen konformaation (kuvio 1A). Lisäksi NMR-analyysi MUC1-CD on vahvistettu, ettei havaittavissa sekundaarista rakennetta (kuvio 1 B-1 D), kuten on esitetty läsnäolo huippujen välillä 7,5 ja 8,5 ppm, mikä on yhdenmukaista MUC1-CD on rakenteeton proteiinia.

(A) RMSD tilannekuvia saatu alkuperäisen

ab-initio

rakenne MUC1-CD (1-15). Y-akseli on RMSD ja X-akseli on tilannekuva sekvenssi (picoseconds). (B) Protoni-NMR-spektrit (1D) ja

15N-HSQC-spektrit MUC1-CD (1-15) hankittiin 500 MHz (C) 20 ° C: ssa ja (D) 10 ° C: ssa pH: ssa 5,0.

MUC1-CD (1-15) sisältää CQC motiivi seuraa kolme positiivisesti varautuneet tähteet (RRK). Sytoplasminen CQCRRK alue sijaitsee lähellä solukalvon (ennustama TMpred Phobius) ja siten voisi olla rooli MUC1-CD rakenteen vuoksi veloittaa-maksu vuorovaikutus negatiivisesti varautuneiden lipidien kerroksia. Siksi tutkittiin mahdollinen vaikutus solukalvon lipidien kerros CQCRRK jäämiä. 45 aminohapon MUC1-sekvenssi (SAQSGAG-VPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAV-CQCRRKNYGQ) rakennettiin

ab-initio

kanssa osan MUC1-C /ekstrasellulaarinen domeeni (MUC1-C /ECD; SAQSGAG), 28 aminohapon MUC1 -C /transmembraanidomeeni (MUC1-C /TMD, VPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAV) ja ensimmäisen 10 tähdettä MUC1-CD (CQCRRKNYGQ). Määritettynä molekyylidynamiikkaa tutkimuksissa TMD on hallitseva kierukan konformaatio (kuvio 2A). Loput aminohapot rakennettiin haluamallaan phi /psi näkökulmista. Tuloksena rakenne oli asetettu edustavan kalvo laastari (POPC kaksikerroksisen) ja atomistisiin molekyylidynamiikka tutkimuksia tehtiin 55 ns avulla NAMD ohjelmistoa. Havaitsimme tasapainotettuun rakenne vakaa RMSD ja edullisen konformaation (turn) on CQC alueella (kuvio 2A). Olemme myös havainneet, että kaksi Arg mieluummin suuntautumaan kohden kalvon koska maksu-maksu vuorovaikutus negatiivisesti varautuneiden fosfaatit lipidikaksoiskerroksen luoden pieni tasku CQC motiivi (kuvio 2B). Tämä edullinen pieni tasku suunta, yhdistettynä sen läheisyys lipidikaksoiskerroksen tukivat käsitystä, että CQC motiivi Cys-tähteet ovat vähentäneet konformationaalisten vapautta, joka altistaa hänet muodostamaan disulfidisidoksia tehokkaammin rajoitettu entropic rangaistus.

(A ) Toissijainen rakenne jakelu tilannekuvia saatiin suhteen simuloitu aikaa ja arvioidaan kanssa DSSP algoritmilla. Y-akseli on jäännös sekvenssi: (1-7-SAQSGAG), (8-35 -VPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAV), (36-45 -CQCRRKNYGQ). X-akseli on aika picoseconds (ps). (B) Kuva esittää alue lipidikaksoiskerroksen korostettu vaaleanpunainen, punainen ja oranssi tikkuja edustavat fosfolipidin monomeerien kanssa kierteisen MUC1-C TMD. Sytoplasmisen jäämät MUC1-C koostuu CQCRRK on korostettu kuin pallo ja tikku malli. Positiivisesti varautuneet arginiineilla vedetään ylös ja lukitaan kohti negatiivisesti varautuneiden fosfaatti- ryhmiä.

Sidonta Tutkimukset MUC1 CQC Motif

MUC1-C CQC motiivi antaa muodostumista MUC1- C homodimeerejä tarpeen MUC1-C toiminto [7,8]. Siksi syntyy peptidejä sisältävä CQCRRKN ​​sekvenssin mahdollisina aineina, jotka voivat sitoutua CQC taskuun ja estää MUC1-C homodimerisaation. Yksi sellainen peptidi, nimetty GO-202, sisältää poly-Arg-sekvenssin solun läpäisyä liittyy CQCRRKN ​​(L-aminohapot; Kuva 3A). GO-202 syntetisoitiin N-terminaalisen FITC etiketti arvioida suoran sitoutumisen tämän peptidin GST-MUC1-CD sitoutunut glutationi-päällystetty ELISA-levyjä. Määritettynä saturaatiositoutumisen menetelmä, dissosiaatiovakio (Kd) oli 0,88 uM (kuvio 3A). Olemme myös arvioitiin sitoutumista peptidin, joka on nimetty GO-203, jossa poly-Arg solun läpäisevä domeeni liittyy CQCRRKN ​​(D-aminohappoa; kuvio 3B). Inkubointi FITC-leimatun GO-203 GST-MUC1-CD osoitti Kd 0,63 uM (kuvio 3B). Spesifisyyden varmistamiseksi sitoutumisen, FITC-GO-203 inkuboitiin His-MUC1-CD sitoutuneen nikkelipäällysteisiä ELISA-levyjä (kuvio 3C). Näissä tutkimuksissa Kd oli 0,86 uM, mikä osoittaa, että vuorovaikutus GO-203 ja MUC1-CD ei ole annettu, että GST tai His-tag. Vahvista vuorovaikutuksen spesifisyyttä, FITC-GO-203 oli myös inkuboitiin GST-MUC1-CD, jossa CQC motiivi mutatoitiin AQA. Tässä ei ole vuorovaikutusta näkyi välillä FITC-GO-203: n ja GST-MUC1-CD (AQA) tukema havaitseminen vain taustafluoresenssin (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että sekä L- ja D-muotoja, CQCRRKN ​​peptidin suoraan sitoutua MUC1-CD, ja että sitoutuminen on spesifinen CQC motiivi.

(A) Näkyy ovat L-aa-sekvenssi GO -202 ja (B) D-aa sekvenssi GO-203. Näennäinen Kd sitoutumiselle (A) FITC-GO-202 GST-MUC1-CD, (B) FITC-GO-203 GST-MUC1-CD ja (C) FITC-GO-203 His-MUC1-CD proteiinit määritettiin saturaatiositoutumisella kokeita.

GO-203 lomakkeet disulfidisidokset kanssa MUC1-CD on CQC Motif

lisäarvioimiseksi yhdistys GO-203, jossa MUC1-CD , GO-203 inkuboitiin puhdistetulla GST-MUC1-CD. Kompleksit erotettiin SDS-PAGE: lla ja tryptiset digestiot analysoitiin MALDI-TOF-MS (kuvio 4A). Peptidi tunnistus perustuu MS-silta analyysi tryptinen digestio MALDI-TOF-data vastaan ​​sekvenssit 2 tunnetuilla komponenteilla reaktion, eli GST-MUC1-CD (S1 kuvio) ja GO-203. Peptididimeeriä yhdellä disulfidisillalla CQC motiivi edusti huippu m /z 1483.6084 Da (kuvio 4B) ja ominaisuudet lueteltu taulukossa 1. Tätä piikkiä ei havaittu trypsiinikartta liuottamaa GST + GO-203 ja GST-MUC1-CD näytteitä, mikä osoittaa, että GO-203 lomakkeet disulfidisillat nimenomaan MUC1-CD, eikä GST.

(A) Trypsiini digest 35 kDa GST-MUC1-CD ja Go- 203 kompleksi analysoitiin MALDI-TOF massa sormenjälkien. (B) Korostettu alue (A) on laajennettu osoittaa tietyn peptidin huippunsa m /z 1483 Da, koska muodostumista disulfidisilta GO-203 ja MUC1-CD.

GO-203 Blocks MUC1-CD homodimerisaation

in vitro

MUC1-CD sekvenssi rajoittuu nisäkäslajeista on ilmaantunut myöhään evoluutiossa [6]. CQCRRK sekvenssi on konservoitunut rotan, koiran ja ihmisen proteiineja (kuvio 5A). Proteiini sekvenssihomologia-analyysi käyttäen Clustal Omega lisäksi osoittanut, että ihmisen MUC1-CD (AAA60019.1) osakkeiden merkittävä sekvenssihomologia 83% kanssa MUC1-CD-proteiinit rotan (AAI66505) ja koira (NP_001181906.1) (kuvio 5A). Arvioida toiminnallista merkitystä CQCRRK, me tuotti puhdistettua His-merkittyjen rotan MUC1-CD-proteiinia (~ 10 kDa) (kuvio 5B). Inkubointi rotan His-MUC1-CD pH 7,4 liittyi muodostumista ~ 20 kDa: n homodimeerejä (kuvio 5B). Lisäksi lisäämällä GO-203 at yhä suurempia määriä suhteessa His-MUC1-CD laski homodimerisaation (kuvio 5B). Koiran ja ihmisen His-MUC1-CD-proteiinit myös muodostunut homodimeerit jotka ehkäisee tehokkaasti GO-203 (kuvio 5C ja 5D). Sitä vastoin CP-2-peptidi, joka sisältää AQARRKN, ei ollut mitään vaikutusta ihmisen MUC1-CD homodimerisaation (kuvio 5D).

(A) Ihmisen, rotan ja koiran MUC1-CD-proteiinit jakavat korkea sekvenssihomologia kuin rinnakkain käyttämällä Clustal Omega. Konservoituneiden alueiden näkyvät laatikot, jossa punainen laatikko ilmaiseva CQCRRK alueella. (B) rotan ja (C) koira puhdistettua His-MUC1-CD-proteiinit, inkuboitiin PBS: llä (kontrolli) tai kasvavia määriä GO-203 (50, 150 ja 450 uM) 1 h huoneen lämpötilassa. Proteiinit erotetaan ei-pelkistävissä polyakryyliamidigeelissä ja analysoitiin immunoblottauksella anti-MUC1-C. (D) Puhdistettu ihmisen His-MUC1-CD-proteiinia inkuboitiin PBS: llä (kontrolli), CP-2 (150 uM) tai GO-203 (150 uM) 1 h huoneen lämpötilassa. Proteiinit erotetaan ei-pelkistävissä polyakryyliamidigeelissä ja analysoitiin immunoblottauksella anti-MUC1-C.

GO-203 Blocks MUC1-CD homo- soluissa,

lisäarvioimiseksi vaikutukset kohdistuvat MUC1-CD CQCRRK motiivi soluissa, me 293T-solujen ilmaista rotan GFP-merkityn tai FLAG-merkitty MUC1-CD (kuvio 6A, vasemmalla). Coimmunoprecipitation tutkimukset osoittivat, että FLAG-MUC1-CD muodostaa dimeerejä GFP-MUC1-CD (kuvio 6A, oikealla). Erityisesti käsittely 293T solut GO-203 oli liittynyt inhibition FLAG-MUC1-CD /GFP-MUC1-CD-kompleksit (kuvio 6A, oikealla). Sitä vastoin hoito CP-2 ei ollut ilmeistä vaikutusta (kuvio 6A, oikealla). Transfektio 293T-solut ilmaista merkityt koira MUC1-CD (kuvio 6B, vasen ja oikea) tai ihmisen MUC1-CD (kuvio 6C, vasen ja oikea) vahvisti muodostumista MUC1-CD homodimeerejä. Lisäksi GO-203-hoito johti eston MUC1-CD homodimerisaation (kuvio 6B, oikea ja 6C, oikealla). Lisäksi on osoitettava, että CP-2 hoito ei ole vaikutusta MUC1-CD homodimeerin muodostumisen tukenut spesifisyys kohdistaminen CQC motiivi (kuvio 6B, oikea ja 6C, oikealla).

293T-solut transfektoitiin ohimenevästi kohteeseen ilmaista tyhjän vektorin ja (A) rotta GFP-MUC1-CD ja FLAG-MUC1-CD, (B) koira GFP-MUC1-CD ja FLAG-MUC1-CD tai (C) ihmisen GFP-MUC1-CD ja FLAG-MUC1 -CD. 48 h, solut jätettiin käsittelemättä (kontrolli) tai käsiteltiin 5 uM GO-203 tai CP-2 joka päivä 3 päivää. Solut kerättiin sitten ja immunoblottauksella anti-GFP: n ja anti-FLAG (vasemmanpuoleiset paneelit). Kokosolulysaateille myös saostettiin anti-FLAG ja sakat immunoblotattiin mainituilla vasta-aineilla (oikea paneeli).

sitoutuminen GO-203 Endogeeninen MUC1-C Solut

Sen määrittämiseksi, GO-203 kumppaniaan endogeenisen MUC1-C, käsittelimme ZR-75-1 rintasyövän solut FITC-GO-203. Analyysi anti-MUC1-C saostuu immunoblottauksella anti-FITC osoitti, että GO-203 lomakkeet komplekseja MUC1-C (kuvio 7A). Samanlaisia ​​tutkimuksia suoritettiin FITC-GO-203-käsitelty H1975 keuhkosyöpäsoluissa tuki siten käsitystä, että GO-203 kumppaniaan endogeenisen MUC1-C (kuvio 7B). MUC1-C ilmaistaan ​​~ 25-20 kDa N-glykosyloidun muodon ja 17/15 kDa-glykosyloidun lajit [6,8]. Lisäksi, MUC1-C on havaittavissa, kuten homodimeerien ja korkeamman asteen oligomeerejä ei-pelkistävissä olosuhteissa, jota käytettiin näissä kokeissa [8]. Tässä yhteydessä ja kuten on esitetty koko immunoblot saatu edellä esitetyt tulokset (kuvio 7A ja 7B), FITC-GO-203 on vuorovaikutuksessa eri MUC1-C monomeeriset ja oligomeeriset muodot (S2A ja S2B kuviossa). Määritellä lokalisointi GO-203 /MUC1-C komplekseja, immunofluoresenssilla micoroscopy suoritettiin 293T transfektoitu ilmaista DsRedMN1-leimatun MUC1 ja /tai käsitelty FITC-GO-203. Ohjaus 293T-solut inkuboitiin Hoechstin väriaine tahraa ytimiä ei ollut havaittavaa DsREd tai FITC signaalit (kuvio 7C). Sitä vastoin soluissa, transfektoiduissa ilmaista DSRedMN1-MUC1, The DSRed signaalit pääasiassa paikallisia pitkin solukalvon muutaman pisteitä havaittavissa tumassa (kuvio 7D). 293T-soluissa käsiteltiin FITC-GO-203 Pelkästään FITC signaalit olivat paikallisia pitkin kalvo ja solulimassa (Kuva 7E). Lisäksi 293T solut, jotka ilmentävät DSRedMN1-MUC1 ja käsiteltiin FITC-GO-203, co-lokalisaatio DSRed ja FITC-signaalit (Punainen + vihreä → keltainen) havaittiin pitkin kalvon (kuvio 7F). Kirkkaampi FITC-GO-203 värjäystä 293T soluissa, jotka ilmentävät MUC1 verrattuna, että MUC1-null-asetus voidaan selittää säilyttäminen FITC-GO-203 in komplekseja MUC1-C solukalvon.

(A) ZR-75-1 ja (B) H1975-solut jätettiin käsittelemättä (kontrolli), ja käsiteltiin 5 uM FITC-GO-203: ssa yön yli. Lyysi suoritetaan ei-pelkistävissä puskuriin. Lysaatit saostettiin anti-MUC1-C tai kontrolli-IgG, minkä jälkeen lisättiin ei-pelkistävän näytepuskuria. Sakat immunoblotattiin anti-FITC ja anti-MUC1-C. 293T-solut jätettiin käsittelemättä (C, kontrolli), (D) transfektoitiin ohimenevästi DsRedMN1-MUC1, (E), käsiteltiin 5 uM FITC-GO-203, tai (F), jotka on transfektoitu DsRedMN1-MUC1 ja käsiteltiin 5 uM FITC- GO-203. Distribution of MUC1 (punainen) tai FITC-GO-203 (vihreä) ja rinnakkaispaikantumisen (keltainen) arvioitiin immunofluoresenssimikroskopialla. Tumat vastavärjättiin Hoechstin värillä (sininen).

Keskustelu

MUC1-C transmembraaninen alayksikön vuorovaikutuksessa RTK, kuten EGFR, solun pinnalla ja edistää niiden aktivaation ja alavirran solunsisäisen signalointireitteihin [6,19,23]. Niinpä on ollut syntymässä kiinnostusta funktiona MUC1-C sytoplasmadomeenissa kuin onkoproteiini. Tässä yhteydessä, yliekspressio MUC1-C sytoplasminen domeeni on riittävä antamaan ankkuroitumisesta riippumattomaan kasvuun ja kasvainten muodostumiseen [5]. Miten MUC1-C sytoplasmadomeenissa indusoi muutos on painopiste huomattavan tutkimuksen; kuitenkin tiedetään vain vähän rakenteesta tämän onkogeenisten proteiinia. Esillä olevissa tutkimuksissa siis tutkitaan fysikaaliset ominaisuudet 72-aminohapon cytoplastic alueella ja osoittavat, että muut kuin CQCRRK sekvenssin asuvat vieressä solukalvon, jäljellä olevan proteiinin ei ole ilmeistä rakenne.

puuttuminen yksilöitävissä alfaheliksiä tai beta-levyt oli kiinnostavaa, että MUC1-C sytoplasmisen domeenin sekvenssien alavirtaan CQC motiivin kuuluvat fosforylaatio useat kinaasit, jotka sisältävät muun muassa EGFR, MET, SRC, ABL, GSK3 ja PKC [ ,,,0],1,4]. Tämä puolestaan ​​translaation jälkeisiä modifikaatioita säädellä vuorovaikutuksia MUC1-C sytoplasmadomeenissa efek- erilaisia ​​signalointireittien, jotka liittyvät muutoksen [1,4]. Yhtenä esimerkkinä fosforylaation MUC1-C sytoplasmisen domeenin antaa sitoutumaan WNT reitin efektori, β-kateniinin, ja siten aktivaation WNT kohdegeenien [5,24]. Muu työ on sidoksissa MUC1-C sytoplasmadomeenissa aktivointiin NF-KB-p65 [25,26] ja STAT1 /3 [27,28] reittejä. Tällä tavoin luonnostaan ​​huonokuntoinen rakenne MUC1-C sytoplasmadomeenissa ilmeisesti on kyky läpikäydä erilaisia ​​translaation jälkeisiä muutoksia ja olla vuorovaikutuksessa useiden efektoreja.

proteiinit luonnostaan ​​häiriintyneestä rakenteita esiintyy koko genomin ja sisältävät onkoproteiineja, kuten p53 [29], PTEN [30], androgeenireseptorin [31] ja muut [14]. Nämä proteiinit usein haasteita lääkekehitykseen puuttumisen vuoksi taskuihin tai hyvin määritelty kolmiulotteinen taittuu [14]. Siksi olemme keskittyneet suunnitteluun aineita, jotka kohdistuvat CQC aihe, joka perustuu havaintoihin, että endogeeninen MUC1-C muotoja homodimeerien ja CQC kysteiinit ovat välttämättömiä ja riittäviä tähän vuorovaikutukseen [7,8]. Lisäksi olemme havainneet, että muta- CQC motiivi AQA kumottu kapasiteetin MUC1-C edistää muutosta [7]. Esillä olevat tulokset osoittavat, että L-aminohappo [R]

9-CQCRRKN-peptidi (GO-202) sitoutuu suoraan MUC1-C sytoplasminen domeeni. Kiinnostavaa, samanlaisia ​​tuloksia saatiin, jossa on D-aminohappoa [R]

9-CQCRRKN ​​peptidi (GO-203), sopusoinnussa retro-inverso vaikutus, jossa CQC motiivi reunustaa molemmin puolin emäksisiä aminohappoja. Spesifisyys näistä kysteiinin välittämää vuorovaikutusta vahvistettiin tutkimus osoita, että muuntuva CQC on AQA in MUC1-C sytoplasmadomeenissa tai CP-2 kontrollipeptidiä kumotaan sitova.

konsertti suoraan sitoutumalla MUC1- C sytoplasmadomeenia CQC aihe, GO-203 oli tehokas häiritsemään MUC1-CD-homodimeerien in vitro. Lisäksi GO-203 käsittely esti muodostumista GFP-MUC1-CD /FLAG-MUC1-CD homodimeerien soluissa, sopusoinnussa solunsisäisen sitoutumisen GO-203 tagged-MUC1-CD monomeerit ja siten estää saatavuutta MUC1-C sytoplasmisen alueen CQC motiivi homodimeerinä muodostumista. Tältä osin ja tärkeintä, coimmunoprecipitation tutkimukset osoittivat lisäksi, että FITC-GO-203 kumppaniaan endogeenisen MUC1-C rinta- ja keuhkosyövän soluja. Lisäksi konfokaali tutkimukset osoittivat, että GO-203 sitoutuu ensisijaisesti MUC1-C solukalvon. Nämä havainnot yhdessä tukevat käsitystä, että GO-203 sitoutuu MUC1-C sytoplasminen domeeni CQC motiivi soluissa ja siten estää MUC1-C homodimerisoitumisessa ja toiminta.