PLoS ONE: tunnistaminen Cytoskeleton liittyvien proteiinien Essential Lysosomaalinen tasapainoa ja selviytymistä ihmisen syöpäsoluja
tiivistelmä
Microtubule-häiritsevää lääkkeet estävät lysosomaalisen kaupan ja aiheuttaa lysosomaalisen kalvon läpäiseväksi seurasi katepsiini riippuvaista solukuolemaa. Määrittelemään erityisiä ihmiskauppaan liittyvien proteiinien, jotka kontrolloivat solujen eloonjäämistä ja lysosomaalisen vakautta, me seulotaan molekyyli- moottori siRNA kirjasto ihmisen MCF7 rintasyövän soluja. SiRNA kohdistaminen neljä kinesiinien (KIF11 /Eg5, KIF20A, KIF21A, KIF25), myosiinin 1G (MYO1G), myosiinin raskaan ketjun 1 (MYH1) ja tropomyosin 2 (TPM2) todettiin tehokas indusoijat ei-apoptoottisen solukuoleman. Solukuolemaa indusoi KIF11, KIF21A, KIF25, MYH1 tai TPM2 siRNA edelsi lysosomaalisen kalvon läpäiseväksi, ja kaikki tunnistetut siRNA indusoi useita muutoksia endo-lysosomaalisen osaston,
eli
kasvoi lysosomaalisen tilavuus (KIF11, KIF20A , KIF25, MYO1G, MYH1), lisääntynyt kysteiini katepsiini aktiivisuutta (KIF20A, KIF25), muuttunut lysosomaalisen lokalisointi (KIF25, MYH1, TPM2), lisääntynyt dekstraani kertyminen (KIF20A), tai alentaa autophagic flux (MYO1G, MYH1). Mikä tärkeintä, kaikki seitsemän siRNA myös tappoi ihmisen kohdunkaulan syöpä (HeLa) ja osteosarkooma (U-2-OS) solujen ja säteilyherkälle syöpäsolujen muihin lysosomiin-epävakautta hoitoja,
eli
valohapetuksen, siramesine, etoposidi tai sisplatiinin . Samoin KIF11 siRNA, The KIF11 estäjän monastrol aiheuttama lysosomaalisen kalvon läpäiseväksi ja säteilyherkälle useat syöpäsolun riviä siramesine. Vaikka KIF11 inhibiittorit ovat kliinisessä kehitystä mitoosi salpaajat, meidän tiedot paljastavat uuden toiminnon KIF11 ohjauksessa lysosomaalisen vakautta ja ottaa käyttöön kuusi muuta molekyyli moottoreita putatiivisiksi syöpälääkkeen tavoitteita.
Citation: Groth-Pedersen L, Aits S , CORCELLE-Termeau E, Petersen NHT, Nylandsted J, Jäättelä M (2012) tunnistaminen Cytoskeleton liittyvien proteiinien Essential Lysosomaalinen tasapainoa ja selviytymistä ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 7 (10): e45381. doi: 10,1371 /journal.pone.0045381
Editor: Michael Sherman, Boston University Medical School, Yhdysvallat
vastaanotettu: 03 toukokuu 2012; Hyväksytty: 17 elokuu 2012; Julkaistu: 11 lokakuu 2012
Copyright: © Groth-Pedersen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tukivat Tanskan Syöpäyhdistys, Tanskan Medical Research Council, Tanskan tiede-, Euroopan komissio FP7 (APO-SYS), Tanskan National Research Foundation, ML Jørgensen G. Hansen Foundation, Alfred Benzon Foundation, Meyer Foundation, Novo Nordisk Foundation, Landshövding Per Westling Memorial Fund ja John ja Augusta Perssonin Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
lysosomeihin ovat happamia rakkulat, jotka sisältävät lukuisia hydrolaasien, jotka hajoavat soluelimiin ja makromolekyylien toimitetaan heille autophagy, endosytoosin ja fagosytoosin [1]. Parannettu lysosomaalisissa synteesi, kaupan ja solun vapauttamaan lysosomaalisen proteaasien (katepsiini) ovat tärkeitä tunnusmerkkejä syöpää ja jotka liittyvät metastaattista ja invasiivisen kapasiteetti syöpäsolujen [2], [3], [4]. Mielenkiintoista on, että nämä muutos liittyvät muutokset herkistää syöpäsolut lysosomaalisen solukuolemareittiin [5], muoto ohjelmoidun solukuoleman, joka voi ottaa, kun apoptoosi on estynyt, kuten on asian laita monissa syövissä [6]. Lysosomaalinen solukuolema on ominaista lysosomaalisen läpäiseväksi ja myöhemmin translokaation katepsiinit sytosoliin, missä ne aktivoivat apoptoosin tai suorittaa kuoleman ilman kaspaasi aktivointia [3].
joukossa syöpälääkkeet, jotka aktivoivat lysosomaalisen solukuolemaa ovat mikrotubulia epätasapainoon ja -stabilizing lääkkeet (
esim
vinka-alkaloidit ja taksaanit), jotka estävät lysosomaalisen kaupan ja aiheuttaa laajennus lysosomaalisen osaston seurasi lysosomaalisen repeämä ja katepsiini-riippuvaista solukuolemaa [7], [8]. Valitettavasti tällainen vakava cytoskeletal häiriö vaikuttaa myös elintoimintoihin terveissä soluissa johtaa myrkyllisyyttä potilailla [9]. Tarkempi kohdentaminen lysosomaalisen kaupan voisi siten parantaa hoidon huomattavasti.
Cytoskeleton dynamiikka ja solunsisäistä kuljetusta rakkulat, soluelimiin ja makromolekyylien pitkin mikrotubulusten ja aktiini solun tukirankojen riippuu molekyylien moottori proteiineja. Ne voidaan jakaa kinesiinien, dyneins ja myosiinien, jotka kaikki ovat sekaantuneet lysosomissa kaupan [10], [11], [12]. Lisäksi lukuisat lisäproteiineja säätelevät toimintaa moottorin proteiinien [13], [14], [15]. Kinesiinien ja dyneins, jotka liikkuvat pitkin mikrotubulushaarojen, kuljettaa erilaisia lastin ja auttaa luomaan mitoosisukkulan. 44 tunnettujen ihmisen kinesiinien liikkuvat pääasiassa kohti plus päitä mikrotubulusten reuna solun (anterogradista liikenne) [13]. Sen sijaan kaksi tunnettua ihmisen rahdin kuljettamiseen dynein raskaat ketjut, jotka muodostavat toimivan moottorin proteiinikomplekseina useita lisävaruste proteiinien kohti miinus päitä mikrotubulusten vuonna perinuclear solun alueella (taaksepäin liikenne) [14]. Lisäksi ihmisen genomi koodaa neljätoista axonemal dyneins vastaa liukuvan mikrotubulusten joka aiheuttaa pelaajan värekarvojen ja siimoja. Myosiinien, joista ihmisillä on -40, sitoutuvat aktiinisäikeiden että keskitetään alapuolelle solukalvon. Ne ovat erityisen tärkeitä lyhyen kantaman kuljetuksen aikana endosytoosin ja eksosytoosilla. Myosiinien myös tuottaa mekaanista voimaa lihaksen supistumisen, solujen vaeltamiseen ja sytokineesiin [15]. Muut aktiini-proteiinien kuten tropomyosins, jotka vaikuttavat aktiini dynaamisuutta ja vakaus [16], moduloivat myosiinin toiminto.
Tunnistaa molekyyli moottoreita ja niihin liittyviä proteiineja tarvitaan syöpäsolujen selviytymisen, me seulotaan siRNA kirjasto kohdistaminen 136 molekyyli- moottorit ja niihin liittyvät proteiinit siRNA jotka vähentävät elinkelpoisuuden MCF7-solujen. Seitsemän proteiinit tunnistettiin sitten ominaista niiden roolia solukuolemaan, solusyklin, solun tukirangan rakennetta, autophagy, lysosomaalisen toiminta ja lysosomaalisen eheys. Merkillistä, ehtyminen kaikki tunnistetut proteiinien laukaisi kuin apoptoottista solukuolemaa että edelsi dramaattisia muutoksia lysosomaalisen vakautta ja toiminta.
Tulokset
tunnistaminen solun tukirangan liittyvien proteiinien jonka ehtyminen indusoi ei-apoptoottiset syöpäsolun kuoleman
Cytoskeleton häiritseviä lääkkeitä indusoivat lysosomaalisen solukuoleman [7], [8]. Tunnistaa solun tukirangan säätelevä proteiineja, joita tarvitaan syöpäsolujen selviytymisen, me seulotaan Ambion Silencer® Molecular Motor Kirjasto (taulukko S1) myrkylliset vaikutukset MCF7 rintasyöpäsolujen käyttäen MTT vähentämisen määritystä. Proteiinit pidettiin ehdokkaita jos ≥2 /3 siRNA vähensi solujen tiheyttä 40% kolmen erillisen kokeen. Neljä kinesiiniin perheenjäsenet (KIF11, KIF20A, KIF21A, KIF25), kaksi myosiinien (MYO1G ja MYH1) ja tropomyosin 2 (TPM2) täytti nämä kriteerit (Fig. 1A) ja analysoitiin edelleen vahvistuksen jälkeen pudotus jonka siRNA: t (Fig. S1) .
(A, B) MCF7 (A), HeLa (B) ja U-2-OS (B) solut jätettiin käsittelemättä, käsiteltiin Oligofectamine (Oligo) tai transfektoitu ohjaus siRNA (CT) tai kolme itsenäistä siRNA vastaan osoitti tavoitteet erikseen (8 nM; A) tai altaat (3 x 6,67 nM, B). Solujen tiheys mitattiin 72 tunnin kuluttua MTT väheneminen määrityksessä. (C) MCF7-Bcl-2 tai MCF7-pCEP (kontrolli) transfektoitiin, kuten (B).
Vasen pohja
, kuluttua 96 h, solukuolemaa määritettiin laskemalla Hoechst 33342-värjättyjen solujen kondensoituneilla ytimet (kolme satunnaista alalla 100 solua). TNF: n (20 ng /ml, 24 h) toimi positiivisena kontrollina Bcl-2 herkkiä apoptoottisen solukuoleman.
Left Top, Western blot vahvistaa yli-ilmentymisen Bcl-2 hoitamattomien MCF7-Bcl-2-soluissa.
Oikea
, Esimerkkejä kuvia Hoechst 33342-värjättyä ytimet MCF7-pCEP ja MCF7-Bcl-2-soluissa 96 tuntia transfektion jälkeen ilmoitetun siRNA. (D) MCF7-solut käsiteltiin kuten kohdassa (B).
Vasen
, 60 h, DNA värjättiin propidiumjodidilla ja solusyklin jakautuminen analysoitiin virtaussytometrialla (FL-2A).
Oikea
, Esimerkkejä histogrammien solusyklin solujen jakauma 60 h transfektion jälkeen ilmoitetun siRNA. Arvot edustavat välineet + SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (A, C, D), tai kolmena rinnakkaisena yhdessä edustavassa kokeessa (B, n = 3). *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,001, vs. hallita siRNA-transfektoiduissa soluissa tai yleisesti ( C).
Tämän jälkeen kokeita kolme siRNA: t kohde yhdistettiin ellei toisin mainita. Kuten MCF7-soluissa, ehtyminen tunnistettujen proteiinien vähensi tiheys HeLa kohdunkaula syöpä ja U-2-OS luusarkoomasoluissa merkittävästi vaikka kuvio poikkesi jonkin verran havaitusta MCF7-soluissa (kuvio. 1A, B). Tämä tulos varmistettiin käyttämällä yhden siRNA U-2-OS-soluja (tietoja ei esitetty). Seuraavaksi tutkittiin, havaitun solukuolema oli Bcl-2-herkän (apoptoottisten) trans- Bcl-2-yliekspressoivassa ja vektori transfektoitiin MCF7-soluissa [17] kanssa siRNA: t ja määrällisesti kuolemaan liittyvien kromatiinin kondensaatio kuluttua 96 h. Seitsemän siRNA aiheutti kromatiinin tiivistyminen 20-60%: lla soluista. Bcl-2 esti kromatiinin kondensaatio vasta tuumorinekroositekijä (TNF) käsittely (kontrollina apoptoottisen solukuoleman), ja osittain KIF21A siRNA-transfektoiduissa soluissa (kuvio. 1C). Erityisesti, KIF21A siRNA indusoivat yhä ydin- tiivistyminen -40% Bcl-2-yli-ilmentäviä soluja (Fig. 1 C). Samanlaisia tuloksia saatiin yhdellä siRNA: ita (tuloksia ei ole esitetty).
KIF11 ja KIF20A tiedetään säädellä sukkularihmaston muodostumista ja sytokineesi, vastaavasti [18], [19]. KIF11 ehtyminen pidätettiin soluja G2 /M-vaiheessa, kuten odotettua, kun taas KIF20A siRNA-transfektoiduissa soluissa kertynyt G1 vaiheessa (Fig. 1 D). Toinen siRNA ei aiheuttanut merkittäviä muutoksia solusyklin jakelun (Fig. 1 D).
vaikutus tunnistettu siRNA: iden päälle lysosomeihin ja solun tukirangan
Koska ei-apoptoottisen solukuoleman voi johtua lysosomaalisissa vaurioita, me seuraavaksi tutkittiin vaikutusta tunnistettuihin siRNA: iden on lysosomeista MCF7-soluissa. KIF11, KIF20A, KIF25, MYO1G ja MYH1 siRNA merkittävästi kasvattanut solujen laajentuneen endo-lysosomaalisen (hapan) osaston (Fig. 2A), ja soluissa köyhdytetyn varten KIF20A, KIF25 tai MYO1G tämä kasvu oli yhteydessä lisääntyneeseen lysosomaalisen proteaasin aktiivisuus (Fig. 2B). Päinvastoin, KIF11, MYH1 ja TPM2 siRNA vähensi katepsiini aktiivisuus johtuu mahdollisesti lysosomaalisen kalvon läpäiseväksi (katso alla). Lysosomeihin dispergoitiin koko sytoplasmassa soluissa, jotka on transfektoitu ohjaus, KIF11, KIF21A tai MYO1G siRNA (Fig. 2C). Päinvastoin, KIF20A-köyhdytettyä soluilla pitkä ulokkeita, jotka olivat usein tiheästi asutuilla by lysosomeihin ja KIF25, TPM2 ja MYH1 siRNA aiheutti oheislaitteiden lysosomaalisen yhdistäminen (Fig. 2C). Vastaavia lysosomaalisen jakelu havaittiin transfektoitaessa jossa kaikki kolme yhdessä siRNA: iden kohdistaminen KIF20A, KIF25 ja MYH1 ja siRNA: t 1 ja 3 kohdistaminen TPM2 (tuloksia ei ole esitetty).
(A-D) MCF7-solut jätettiin käsittelemättä, käsiteltiin Oligofectamine (Oligo) tai transfektoitu ohjaus siRNA (CT) tai osoitettu siRNA altaita. (A) jälkeen 60 tuntia, solut laajentuneen happamien lokero (myöhäinen endosomeista ja lysosomeihin) tunnistettiin virtaussytometrialla (FL-2A) on LysoTracker Red-värjäytyneiden solujen. Kynnys korkean intensiteetin värjäytyminen on määritelty siten, että 90% ohjaus siRNA-transfektoiduissa soluissa olivat alle. (B) 72 tunnin kuluttua, yhteensä kysteiini katepsiini aktiivisuus (zFR-AFC pilkkominen) määritettiin. HSPA1 ja CTSB siRNA toimi sisäisen valvonnan. (C, D) 60 h, solut värjättiin Lamppu-2 (C) tai F-aktiini (D), ja analysoitiin konfokaalimikroskopialla. Kuvat ovat näytetään.
Nuolet
yhdistämisestä lysosomaalisen rakenteiden solussa ulokkeita /periferiassa.
Bars
, 20 um. Arvot edustavat keinot + SD vähintään kolmen erillisen kokeen. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,001, vs. hallita siRNA-transfektoiduissa soluissa.
Seuraavaksi tutkimme, täyttääkö muutettu lysosomaalisen lokalisointi liittyi muutoksiin aktiini tai mikrotubulus tukirankansa, jotka molemmat osallistuvat lysosomaalisen kaupan [20]. Ehtyminen KIF25 ja MYH1 kasvanut dramaattisesti F-aktiini tasot ja stressi kuidut, jotka voivat edistää lysosomaalisen relocalization (Fig. 2D). Pienempi kasvu rasitukseen liittyviä säikeitä havaittiin käsittelemällä MYO1G ja TPM2 siRNA, kun taas mitään muutoksia nähtiin muiden siRNA: t (Fig. 2D). Mikään tunnistettu siRNA: iden ollut havaittavia vaikutuksia mikrotubulusten visualisoituina α-tubuliinin värjäyksen (tuloksia ei ole esitetty).
vaikutus tunnistettu siRNA: iden päälle autophagy ja dekstraani kertymistä
lysosomeihin saavat lasti pääasiassa kautta autophagy ja endosytoosin. Vaikutuksen testaamiseksi tunnistettujen siRNA: iden on autophagy, käytimme MCF7-solut ilmentävät tfLC3, pH-herkkä tandem fluoresoiva proteiini, joka koostuu monomeeristä punainen fluoresoiva proteiini (MRFP), tehostettu vihreä fluoresoiva proteiini (eGFP) ja mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 1 kevytketjun 3 (LC3) [21]. Alustavissa autophagic vacuoles (AVI) tfLC3 säteilee vihreä ja punainen fluoresenssi taas hajottavien autophagic vacuoles (AVD) se fluoresoi vain punainen koska eGFP fluoresenssi häviää happamissa amphisomes ja autolysosomes. Kuten aikaisemmin on raportoitu [22], ehtyminen raptor, osa nisäkkään rapamysiinin kohde monimutkaisia 1, joka normaalisti estää autophagy, lisäsi sekä AVI ja AVD osoittaa lisääntynyt autophagic vuon (Fig. 3A, B). Sen sijaan, MYO1G ja MYH1 siRNA altaat sekä kaikki kolme yhdessä siRNA: t kohdistuvat MYH1 ja siRNA: t 1 ja 3 kohdistaminen MYO1G lisääntynyt AVI, mutta ei AVD. SiRNA: t kohdistuvat muut viisi ehdokasta ei ollut selvää vaikutusta tässä määrityksessä (kuvio. 3A, B ja tietoja ei ole esitetty). Kyky MYO1G ja MYH1 siRNA estää autophagic vuon myös osoittaa lisääntyminen p62 /sequestesome (p62 /SQSTM1, proteiini tehokkaasti hajottaa autophagy) tasoja ja vähensi kykyä koskevan autophagy indusoijan, rapamysiini, vähentämään p62 /SQSTM1 tasot jälkeen siRNA hoitoja (Fig. 3C).
(A-D) tfLC3-MCF7-solut (A, B) tai MCF7-soluja (C, D) jätettiin käsittelemättä, käsiteltiin Oligofectamine (Oligo) tai transfektoitu ohjaus siRNA (CT) tai osoitettu siRNA altaat (3 x 6,67 nM). (A, B) 48 h jälkeen, tfLC3-MCF7-solut analysoitiin konfokaalimikroskopialla. Kuvat ovat (A;
Bars
, 10 pm) ja kvantifiointiin puncta (B) on esitetty. Raptor siRNA (RPTOR) toimi kontrollina lisääntynyt autophagic muutostilassa. Suljettu nuolet osoittavat avd, avoin nuolet osoittavat AVI. (C) jälkeen 60 h, taso p62 /SQSTM1 (P62), joka hajottaa autophagy, tutkittiin Western blot. Rapamysiini (20 nM, 4 h) käytettiin indusoimaan autophagy. Luvut esittävät P62 tasot prosentteina tasosta käsittelemätön kontrolli siRNA-transfektoiduissa soluissa. (D)
Top, 60 h, MCF7-soluja käsiteltiin 100 ug /ml Alexa Fluor 488-dekstraania (dekstraani-488) 1 tunnin ajan ja analysoitiin virtaussytometrialla (FL1-H). Kynnys korkean intensiteetin värjäyksen määriteltiin siten, että 88% valvonnan siRNA-transfektoiduissa soluissa olivat alle.
Bottom
, Esimerkki histogrammien dekstraani-488 pitoisuus transfektoitujen solujen valvontaa tai KIF20A siRNA. M1 = gate korkean intensiteetin värjäystä. Arvot edustavat välineet + SEM 20 solua yhdessä edustavassa kokeessa (B, n = 3) tai keinoja + SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (D). *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,001, vs. hallita siRNA-transfektoiduissa soluissa.
Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus tunnistettujen siRNA: iden on otto 10 kDa Alexa Jauhot 488-dekstraanin virtaussytometrialla. KIF20A ehtyminen lisääntynyt kertyminen dekstraanin merkittävästi, kun taas KIF11 siRNA aiheutti lievää (p = 0,066) lisäys. Muut viisi siRNA: t ei ollut mitään vaikutusta tässä määrityksessä (kuvio. 3D). On huomattava, että tässä määrityksessä voi erottaa lisääntynyt endosytoosi ja laski eksosytoosin.
vähentäminen lysosomaalisen vakauden tunnistetun siRNA: t ja monastrol
ei-apoptoottisen solukuoleman ja lukuisia lysosomaalisen muutoksia edellä on todettu sai meidät tutkimaan vaikutusta tunnistettujen siRNA: iden on lysosomaalisen vakauteen. Ensin mittasimme kykyä lysosomeihin säilyttää akridiinioranssin, metakromaattinen emäksisen väriaineen, kun altistettiin sininen valo [23]. KIF11, KIF20A, KIF21A, MYH1 ja TPM2 siRNA herkistyneet MCF7-soluissa merkittävästi valohapetuksen aiheuttamaa lysosomaalisen vuoto ja KIF25 siRNA osoitti samanlaista taipumusta 60 h transfektion jälkeen (Fig. 4A, B). Kun analysoitiin 72 tunnin jälkeen, kaikki siRNA olisivat kannustaneet lysosomaalisen vuoto (ulkonäkö lysosomaalisen proteaasien sytosoliin), vaikka vaikutus KIF20A ja MYO1G siRNA ei aivan tilastollisesti merkitsevä (kuvio. 4C). Erityisesti, hoito MCF7-solujen monastrol, hyvin tunnettu pienmolekyylisalpaajien on KIF11 [24], on myös indusoitu lysosomaalisen kalvon läpäiseväksi (Fig. 4D). Siten ehtyminen kunkin seitsemän proteiineja sekä monastrol hoitotuloksia lysosomaalisen epävakautta.
(A-C) MCF7-solut jätetään hoitamatta, käsiteltiin Oligofectamine (Oligo) tai transfektoitu ohjaus siRNA (CT ) tai osoitettu siRNA altaat (3 x 6,67 nM). (A ja B) jälkeen 60 tuntia, solut käsiteltiin akridiinioranssilla ja analysoitiin elävien solujen kuvantamiseen mitata menetys lysosomaalisen eheyden (lisääntynyt vihreä fluoresenssi), kun laser hoitoa. Vahvuus on vähintään 25 solujen ennalta määritellyille alueille tutkittiin kutakin koetta. Kolmen erillisen kokeen esitetään A ja arvot B edustavat keinot + SD Näiden kokeiden klo 60 sekunnin ajan vaiheessa. (C) 72 tunnin kuluttua, soluliman ja yhteensä kysteiini katepsiini toimintaa mitattiin analysoimalla pilkkomalla zFR-AFC. Toimintaa soluliman otteita näkyvät prosenttiosuudet toiminnan vastaavassa kokonaisuutteissa. HSPA1 ja CTSB siRNA toimivat kontrolleina induktioon lysosomaalisen vuotojen ja transfektion tehoa, vastaavasti. (D) Sytosoliset kysteiini katepsiini toimintaa MCF7-soluissa se jätetään hoitamatta tai vehikkeliä (2% dimetyylisulfoksidia, DMSO) tai osoitetut pitoisuudet monastrol 72 h määritettiin kuten kohdassa (C). Arvot edustavat välineet + SD viisi (C) tai kolme (D) riippumatonta koetta. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,001, vs. hallita siRNA-transfektoiduissa (B, C) tai ajoneuvon käsiteltyjä soluja (D).
Herkistyminen lysosomiin häiritsevistä huumeiden tunnistetun siRNA: t ja monastrol
Koska siRNA: t horjutti lysosomeihin, tutkimme ne myös herkistää solut lysosomiin häiritsevistä huumeita. Tätä tarkoitusta varten MCF7-solut transfektoitiin siRNA: illa 48 tunnin ajan ja sitten käsiteltiin vielä 48 h siramesine, etoposidin tai sisplatiinin, jotka kaikki kykenevät aiheuttamaan lysosomaalisen solukuoleman [5], [25]. Kaikki siRNA: t paitsi KIF25 siRNA herkistyneet solut siramesine vahvin vaikutus havaittiin KIF11 ja KIF21A siRNA (Fig. 5A, B). Sillä KIF11, tämä vahvistettiin käyttäen kolme yhden siRNA: t (tuloksia ei ole esitetty). Herkistyminen etoposidia nähtiin KIF11, KIF21A, KIF25, MYH1 ja TPM2 siRNA (Fig. 5A, B). KIF20A siRNA ei ollut mitään vaikutusta, kun taas MYO1G siRNA vähentää solukuolemaa vasteena etoposidi, mikä mahdollisesti johtuu sen kyvystä inhiboida autophagy, jotka voivat vaikuttaa etoposidin aiheuttaman kuoleman [26]. Lisäksi, KIF11, KIF21, MYH1 ja TPM2 siRNA parannettu sisplatiinin indusoimaa solukuolemaa, mutta koska vaihtelut kokeissa vaikutus oli vain merkittävä KIF21A siRNA. Lisäksi yhdistämällä monastrol ja siramesine tuloksena synergistinen solukuoleman induktioon MCF7, HeLa, U-2-OS ja DU-145-soluissa (kuvio. 5C, S2). Näin ollen kaikki siRNA: t herkistyneet syöpäsoluja yhdelle tai useammalle lysosomiin häiritseviä lääkkeitä vahvin havaitut vaikutukset soluissa, joista puuttuu KIF11 tai KIF21A.
(A, B) MCF7-solut jätettiin käsittelemättä, käsiteltiin Oligofectamine (Oligo) tai transfektoitu ohjaus siRNA tai merkitty siRNA altaat (3 x 6,67 nM). 48 tunnin kuluttua solut jätetään hoitamatta tai käsiteltiin 2 uM siramesine (
Top), 50 uM etoposidi (
keski
) tai 10pM sisplatiinin (
pohja
) varten vielä 48 h ennen valomikroskoopilla kuvat on otettu (edustaja kuvat B) ja solukuolemaa kvantifioitiin LDH vapautumisen määrityksellä (A). (C) MCF7-solut jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin 2 uM siramesine yhdessä osoitetun pitoisuudet monastrol 72 h ja solukuolemaa kvantitoitiin LDH vapautumisen määrityksellä. Arvot edustavat keinot + SD vähintään kolmen erillisen kokeen. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,001, vs. hallita siRNA-transfektoiduissa soluissa (A) tai solut käsiteltiin 2 uM siramesine yksin (C).
keskustelu
tässä tutkimuksessa tunnistimme KIF11, KIF20A, KIF21, KIF25, MYO1G, MYH1 ja TPM2 kuten proteiineja, joiden ehtyminen aiheuttaa kasvun esto ja ei-apoptoottista solukuolemaa syöpäsoluissa (taulukko 1). Tietääksemme tämä tutkimus on ensimmäinen tunnistaa KIF21A, KIF25, MYO1G, MYH1 ja TPM2 kuten proteiinien välttämättömiä syöpäsolun selviytymisen, kun taas toiset ovat aikaisemmin raportoitu solukuolemaa kun ehtyminen KIF11 [27], [28], [29 ] ja KIF20A [30] muissa syöpäsolulinjoissa. Samoin kuin havainnot edellisessä tutkimuksessa osoittaa, että ehtyminen KIF5B on myrkyllistä HeLa-solut kuin MCF7 soluihin [31], havaitsimme joitakin eroja herkkyydet eri syöpäsolulinjojen tunnistettuihin siRNA: t. Tämä voi johtua eroista ekspressiotasoja kohdegeenien tai siihen liittyviä geenejä tarpeeton toimintoja.
On huomattava, että ektooppinen ekspressio Bcl-2 ei pelastamaan MCF7-solut sytotoksisuus indusoitiin kaikki tunnistetut siRNA: illa paitsi KIF21A siRNA. Jopa KIF21A vaje solujen, kohdunulkoinen Bcl-2 vähensi solukuoleman vain osittain 60-40%. Epäherkkyyden Bcl-2 ehdotti osallistumista vaihtoehtoisten solukuoleman mekanismeja mieluummin kuin klassisen apoptoosin. Tämä käsite tuki voimakkaasti myöhemmin havainto, että ehtyminen kaikki seitsemän proteiinien aiheutti jonkin verran lysosomaalisen epävakautta, tunnusmerkki lysosomaalisen solukuolemareittiin [3], [32]. Se on, ei kuitenkaan ole heti selvää, kuinka ehtyminen tunnistetuista proteiineista johtaa lysosomien häiriöitä.
tunnistettu kinesiinien, KIF11, jota kutsutaan myös kinesiinin kara-proteiinin tai Eg5, on tutkittu laajimmin, erityisesti ajatellen syövän [33]. KIF11 muodostaa homotetrameerinä, joka on vastuussa kara muodostumisen mitoosin aikana [18]. Tämän mukaisesti ja yhdenmukaisia muiden tutkimusten [28], [29], KIF11 ehtymisen pidätettiin MCF7-solujen G2 /M solusyklin vaihe. KIF11 inhibition on myös raportoitu tappaa ihmisen munasarjakarsinooma- ja leukemiasoluja kautta luontainen apoptoottisen reitin on Bcl-2-ottavalla tavalla [28], [34]. Sen sijaan KIF11 siRNA aiheutti Bcl-2-herkkä kuin apoptoottista kuolemaa MCF7-soluissa, jotka todennäköisesti johtui epävakauden lysosomeihin ja vastaavasti vapauttaa kysteiinin katepsiinit sytosoliin. KIF11 esto voi laukaista lysosomaalisen solukuolemareittiin myös muissa solutyypeissä, koska lysosomifuusio vakauttava Hsp70 suojaa myeloomasolujen sytotoksisuutta vastaan aiheuttama dimethylenastron, farmakologisen estäjä KIF11 [29].
Samalla tavalla KIF11, ehtyminen KIF21A aiheuttanut liiallinen lysosomaalisen läpäiseväksi ja solukuolemaa. On huomattava, että indusoimaa solukuolemaa KIF21A ehtyminen alkoi jo -50 h transfektion jälkeen, ja näin ollen se saattaisi olla vaikutusta muiden mittausten lysosomaalisten funktion tässä tutkimuksessa (taulukko 1). KIF21A sitoutuu guaniininukleotidiä-vaihto tekijä RYP1 [35], joka auttaa ylläpitämään järjestämistä Golgin laitteeseen [36]. Siten KIF21A ehtyminen saattaa vaikuttaa kaupan lysosomaalisen komponenttien Golgin laitteessa on endo-lysosomaalisen osaston aiheuttaen lysosomaalisen toimintahäiriö. Muuten juuri mitään tiedetä KIF21A ja tuloksemme voimakkaasti kannustaa tarkastelemaan edelleen rooliaan normaaleissa ja syöpäsoluissa.
Kolmas kinesiiniin tunnistettu meidän näyttö, KIF20A (kutsutaan myös Rabkinesin-6, RAB6KIFL tai MKlp2) on raportoitu olevan välttämättömiä sytokineesiin HeLa-soluissa, joissa sen inhibitio johtaa siihen, että muodostuu monitumaisia soluja [19], [37], ja selviytymisen haimasyövän soluja mekanismilla, johon ei liity tukos sytokineesin [30]. Samoin haimasyöpäsoluissa, KIF20A-köyhdytettyä MCF7-solut eivät pidättää mitoosissa tai näyttää Monitumaiset fenotyyppi viittaa siihen, että muut kinesiinien saattanut saada sen mitoosi toiminta näissä soluissa. Sen sijaan, KIF20A ehtyminen johti kertymistä MCF7-soluja G1-vaiheessa solusyklin ja aiheutti lysosomaalisen solukuolemaa. Solukuolemaa edelsi lisääntynyt lysosomaalisissa tilavuuden, kysteiini katepsiini aktiivisuus ja dekstraani keskittymisen ja epävakauden lysosomaalisen kalvoja. Havaitut vaikutukset endo-lysosomaalisen osaston voi liittyä toiseen aiemmin raportoitu funktio KIF20A, nimittäin sen osallistumista kaupan Golgin liittyvien rakkuloiden solukalvoon kautta vuorovaikutuksessa Rab6 [30], [38].
väheneminen viime tunnistetut kinesiiniaktiivisuuteen, KIF25, aiheutti perifeerinen lysosomaalisen aggregaatiota ja kasvu lysosomaalisissa määrän, fenotyypin joka muistutti aiheuttama mikrotubulia häiritsevää lääkkeet [7]. Vapautettu kaupan ja lisääntynyt lysosomaalisen tilavuus saattanut vaikuttaa lysosomaalisen läpäiseväksi suurennettuna lysosomeihin ovat alttiita häiriöille [39]. KIF25 ehtyminen myös aiheutti muodostumista aktiini rasitukseen liittyviä säikeitä, jotka voivat johtua muuttaa Rho signalointi, kuten aiemmin on havaittu, kun mikrotubulusten epävakautta [40]. Nämä ensimmäinen vihjeitä KIF25 toiminnon lysosomaalisen ihmiskaupan ja syöpäbiologian aihetta tarkemmin tutkimus tästä laajalti tuntematon jäsen kinesiiniin perheen.
Lisäksi mikrotubuleihin vuorovaikutuksessa kinesiinien tunnistimme kolme aktiini-sitovia proteiineja, MYH1, MYO1G ja TPM2, kuten tärkeitä proteiineja syövän solujen eloonjäämistä. MYH1, jota kutsutaan myös myosiinin raskaan ketjun 2 × (MyHC-2X), on osa sarkomeerin nopeasti luustolihasten kuituja [41]. Sen toiminnot kuin lihassolujen ovat lähes tuntematon, mutta se voi auttaa järjestämään aktiini kuituja ja näin vaikuttaa aktiini-riippuvaisen ihmiskaupan tai organelle ankkurointi. Tämän mukaisesti, MYH1-köyhdytettyä MCF7-soluissa osoitti kasvua aktiini rasitukseen liittyviä säikeitä ja oheislaitteiden lysosomaalisen aggregaatiota mukana laajennettu lysosomaalisen osaston ja lysosomaalisen läpäiseväksi. Lisäksi, MYH1 ehtyminen aiheutti eston autophagic hajoamista ja kertymistä alkuperäisen autophagic vakuolit osoittaa viallisen autophagosome-lysosomifuusio, joka voi johtua siitä, että väärin sijoittelun lysosomeihin.
Toinen tunnistettu myosiinin, MYO1G, on rikastettu solukalvon hematopoieettisten solujen, joissa on ehdotettu parantamaan solujen elastisuutta [42], [43]. Kuten muut luokan I myosiinien [15], MYO1G voi myös olla mukana rakkula torjumiseksi. Kumpikaan ei kuitenkaan lysosomaalisen lokalisointi eikä dekstraanin kertymistä muuttunut MYO1G vaje solujen ja muiden lysosomaalisen vaikutukset olivat lievempiä kuin jälkeen ehtyminen muiden tunnistettu osumia. MYO1G ehtyminen oli kuitenkin voimakas estävä vaikutus autophagic vuon, mikä saattaa johtua havaitut muutokset aktiini kuituja. Äskettäin MYH9 /NMHC-IIA havaittiin olevan osallisena autophagosome muodostumiseen aikana nälkään [44], ja tuloksemme osoittavat, että rooli ylimääräisiä myosiinien, erityisesti MYH1 ja MYO1G, vuonna autophagy olisi tutkittava edelleen.
ainoa ei-moottoriajoneuvo proteiini tunnistettu meidän näyttö oli TPM2, joka muodostaa säikeet pitkin aktiini kuituja ja ohjaa lihasten supistumisen estämällä aktiini-myosiinin vuorovaikutus. Ei-lihassoluissa, TPM2 ja muut tropomyosins uskotaan vakauttamiseksi aktiinisäikeiden ja säädellä aktiini toimintoja kuten solun liikkuvuus ja organelle ja rakkula liikenne [16]. TPM2 ehtyminen aiheutti oheislaitteiden lysosomaalisen yhdistäminen osoittaa, että TPM2 voi todellakin toimivat aktiini-riippuvaisten lysosomaalisen ihmiskauppaa. Tämä on yhdenmukaista tietoja, jotka osoittavat, että mikroinjektio TPM1 ja TPM2 vasta-aineet estää kuljetuksen solunsisäisen rakeiden [45].
haitallisia lysosomaalisen havaitut muutokset, kun ehtyminen KIF25, TPM2 ja MYH1 voidaan yhdistää niiden näennäinen funktio lysosomaalisen ihmiskauppaa mutta jää vähemmän selvää, miten alas-säätely muiden proteiinien häiriintynyt lysosomeihin. On mahdollista, että heidän ehtyminen oli hienovarainen vaikutuksia lysosomaalisissa ihmiskauppaa, kuten muutokset lyhyen kantaman kaupan lysosomeihin tai kaupan lysosomiin alapopulaation, jotka eivät olleet havaittavissa erityisesti käytettyjen menetelmien. Vaihtoehtoisesti kuljetus lipidien tai proteiineja, jotka edistävät lysosomaalisissa eheys, kuten lysosomaaliset kalvo proteiineja, Hsp70 ja hapan sfingomyelinaasin [5], [23], ehkä on muutettu. Enemmän välillisesti, niiden heikkeneminen voi aiheuttaa solun tukirangan muutoksia, jotka vahingoittavat muita soluelinten ja siten aktivoida signa- jotka laukaisevat lysosomaalisen läpäiseväksi.
Tunnistetut proteiinit voivat olla sopivia tavoitteita syöpähoidon syöpäsoluihin herkistyneet lysosomaalisen solukuolemaa [ ,,,0],4], [5]. Useat inhibiittorit KIF11, joka on yliaktiivista monenlaisia syöpiä (Oncomine, https://www.oncomine.org), ovat jo kliinisissä tutkimuksissa syöpälääkkeet [9], ja KIF20A estäjä on äskettäin tunnistettu [46]. Nämä inhibiittorit kehitettiin mitoosi salpaajia mutta tuloksemme osoittavat, että niiden syövänvastainen aktiivisuus saattaa myös johtua lysosomaalisen häiriöitä. Huomasimme myös, että ehtyminen seitsemän osumia tehostettu myrkyllisyydestä valohapetuksen ja lysosomissa häiritsevien lääkkeiden siramesine, etoposidi ja sisplatiini. Epätehokkaalla kaikki lääkkeet jälkeen havaittiin ehtyminen KIF11, KIF21A ja TPM2 taas downregulation muut proteiinit oli synergistinen vain joidenkin lääkkeiden, mikä saattaa johtua eroista mekanismi lysosomaalisen häiriöitä tai huumeiden ottoa. Näin ollen yhdistettäessä moottoriajoneuvoja proteiinia esto muiden lysosomifuusio häiritseviä hoitoja näyttää olevan lupaava strategia syövän hoidossa. Tämä olisi erityisesti testata jo käytettävissä KIF11 estäjiä, joissa on vain vaatimaton syöpälääkkeen vaikutuksia yksittäisinä aineina [9].
Lisäksi syövän yhteyksiä tutkitaan tässä, tuloksemme antaa vihjeitä etiologiaa harvinaisissa häiriöt johtuu mutaatioista KIF21A ja TPM2.