Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvain micromilieu osoittaa usein voimakkaampia asidoosi pakottaa soluja mukauttamaan fenotyyppiin kohti parantaa kasvaimen kehittymisen aiheuttama muuttunut solusignalointi ja transkription säätelyyn. Vuonna esittelee tutkimuksessa mekanismit ja mahdolliset seuraukset välinen ylikuuluminen ekstra- ja intrasellulaarisen pH (pH

e, pH

i) ja mitogeeniaktivoidut-proteiini-kinaasien (ERK1 /2, p38) analysoitiin. Tiedot saatiin pääosin AT1 R-3327 eturauhasen syöpä soluja, mutta periaate merkitys vahvistettiin 5 muissa solutyypeissä. Solunulkoisen asidoosi johtaa nopeaan ja jatkuva lasku pH

i rinnakkain p38 fosforylaation kaikissa solutyypeissä ja ERK1 /2 fosforylaation 3 6 solutyyppejä. Lisäksi p38 fosforylaation aikaansaamat ainoan solunsisäinen lactacidosis normaalilla pH

e. Esto ERK1 /2 fosforylaation aikana asidoosi johti nekroottista solukuolemaa. Ei todisteita osallistumista kinaasien C-SRC, PKC, PKA, PI3K tai EGFR eikä muutoksia solujen tilavuuden asidoosin aiheuttaman MAPK aktivaatio saatiin. Kuitenkin meidän tiedot osoittavat, että asidoosi lisää reaktiivisten happiradikaalien (ROS), luultavasti peräisin mitokondrioissa joka myöhemmin laukaista MAPK fosforylaatiota. Huuhteluilman ROS esti asidoosin aiheuttaman MAPK fosforylaatio taas lisäämällä H

2O

2 parantaa sitä. Lopuksi, asidoosi fosforylaatio lisääntyy transkriptiotekijä CREB kautta p38, mikä lisää transkriptionaalista aktiivisuutta CRE-reportterin jopa 24 h kytkemisen jälkeen solut takaisin normaaliin ympäristön miljöö. Täten hapan kasvain mikroympäristölle voi aiheuttaa pitkäkestoisempi p38-CREB-medited muutos transkription ohjelmassa, mikä voi ylläpitää muuttuneen fenotyypin, vaikka solut lähtevät kasvain ympäristössä.

Citation: Riemannin A, Schneider B , Ihling A, Nowak M, Sauvant C, Thews O, et ai. (2011) happamassa ympäristössä Johtaa ROS aiheutetun MAPK Signaling syöpäsoluissa. PLoS ONE 6 (7): e22445. doi: 10,1371 /journal.pone.0022445

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 21 kesäkuu 2011; Julkaistu: 26 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Riemannin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Deutsche Krebshilfe (Grants 106774/106906), BMBF (Pronet-T3 Ta-04) ja Wilhelm-Roux ohjelma Medical School, Universität Halle-Wittenberg. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kaksi mikroympäristöihin voidaan erottaa suhteen kiinteitä kasvaimia: (i) kudoksen ympäristön, jossa kasvainsolut oleskella (patologinen kudos ympäristö) ja (ii) paikallisen ympäristön luoma kasvainsolujen (kasvaimen mikroympäristössä) , joka voi tuottaa patologisen kudoksen ympäristön naapurisolujen. Patologinen kudosympäristö tukee kasvaimen edistämisen ja kasvaimen microenvironment tukee syövän etenemistä [1] – [4]. Kasvaimen mikroympäris- on tunnusomaista hapenpuutetta (hypoksia), seurauksena rakenteellisia ja toiminnallisia poikkeavuuksia verisuonten verkosto [5], mikä johtaa riittämättömään perfuusioon kiinteän kasvaimen [5], [6]. Säilyttääkseen energiantarpeesta kasvainsolut siirtyä niiden aineenvaihdunta glykolyysistä, mikä lisää glukoosin kulutusta ja lausutaan maitohapon tuotantoa. Tämä ilmiö voi myös esiintyä kasvaimia hapensaanti on riittävä – kutsutaan Warburg vaikutus. Äskettäin esitetty todisteita, jotka osoittavat liitos isoformi ilmaus pyruvaattikinaasin on tarpeen muuttunut metabolismi, joka tarjoaa valikoivan edun kasvainsoluja [7]. Yhdessä nämä ominaisuudet muodostavat monimutkaisen verkoston ja luoda metabolisen mikroympäristön, joka koostuu hypoksia, alhainen glukoosi, korkea laktaattipitoisuuksien ja solun asidoosi. pH-arvot kiinteitä kasvaimia ovat alueella 6,5-6,8 [6]. Tämä hapan ympäristö on tuonti kasvaimen edistämisen ja etenemiseen.

On tunnettua, että metabolinen microenvironment vaikutukset kasvainsolujen käyttäytymistä. Esimerkiksi, tehon sädehoitoa, fotodynaaminen hoito ja kemoterapeuttisia on heikentynyt kasvaimen ympäristö [8], [9]. Kasvu ja muuttoliike ominaisuudet sekä apoptoosin herkkyys voidaan vaikuttaa myös. Siten fenotyypin kasvainsolujen – ja näin ollen myös itse kasvain – riippuu lisäksi geneettisen määrittämistä, aineenvaihdunnan mikroympäristö. ”Siemen ja maaperä” -hypothesis, vaikka oletetaan, että hankinnan jälkeen kaikki tarvittavat syövän geneettisiä muutoksia vain muodostumista kasvaimen mikroympäris- sallii kasvainsolujen kasvua [10].

Yksityiskohtainen mekanistisen ymmärryksen on tärkeää deconstruct tämä microenvironment ja määrittää vaikutukset eri parametreja yksitellen voidakseen arvioida niiden osuutta. Katsoo, että on runsaasti kirjallisuutta hypoksia, että on tärkeää metabolista asidoosia huonommin tutkittu. Viime aikoina olemme osoitti, että metabolinen asidoosi sinänsä parantaa chemoresistance eturauhaskasvainsoluissa alle normoxic ja normoglykeeminen olosuhteissa [9], [11], mikä osoittaa, että asidoosi on tärkeä microenvironmental tekijä kasvaimen fenotyypin muutoksiin. Tämä asidoosi aiheuttama stimulaatio P-glykoproteiinin riippuvainen chemoresistance riippuu MAP-kinaasien, mutta se on epäselvää, miten aktivointi näiden kinaasien solunulkoinen pH-pelkistys tapahtuu [9]. Se voi riippua solunsisäisiä muutoksia pH-homeostaasin ja sen sääntely vastauksena solunulkoiseen asidoosi. Lisäksi on useita ehdokas signaalipolkuja linkittäisi pH-muutoksia MAPK aktivointi, esim. kinaasien PKA, PKB, PKC, c-Src tai EGFR [12]. Siksi käsillä olevan oli tutkia (i) pH-homeostaasin syöpäsolujen aikana metabolinen asidoosi on microenvironment, (ii) mekanismit ERK1 /2 ja p38 fosforylaatiota näissä olosuhteissa ja (iii) mahdollinen suhde näiden kahden prosessin sekä seuraukset vaikuttavat näistä reiteistä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Tässä osiossa AT1 rotan R-3327 Dunning prostatakarsinoomassa käytettiin kuten aiemmin on kuvattu [9]. Soluja kasvatettiin RPMI-10% vasikan sikiön seerumia (FCS) 37 ° C: ssa kostutetussa 5% CO

2 ilmakehässä ja osa viljeltiin kahdesti viikossa. LS513 soluja (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA, CRL-2134) kasvatettiin samoissa olosuhteissa kuin AT1 soluja. OK-solut (normaali epiteelisolujen munuaisten proksimaalisen tubuluksen ja opossumin munuaisen) [13] ja NCI-H358-soluja (ihmisen bronchioalveolar karsinooma; American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA; CRL-5807) kasvatettiin DMEM-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FCS: ää, MDCK-C7-solut (normaali munuaisten kerääminen kanavan epiteelisolut koiraeläin) [14] MEM-väliaineessa, jota täydensi 10% FCS: ää, ja CHO-solut (kuolemattomiksi munasarja solut kiinalaisen hamsterin) [15], Hamin F-12 väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FCS: ää. Kaikissa kokeissa, soluja kasvatettiin Petri astiat (Western blot) tai peitinlaseja (mittaus pH

i) ja siirrettiin elatusainetta ilman ylimääräisiä FCS supplementation: ssa 24 tuntia. Ohjaus solut altistettiin bikarbonaatti-HEPES-puskuroitu Ringerin liuos säädettiin pH-arvoon 7,4. Solunsisäinen asidoosi aiheutettiin korvaa 40 mM NaCl 40 mM maitohappoa ja vähentämisestä kloridisivutuote täysin korvaamalla NaCl natriumglukonaattia (7,4 mM jäljellä kloridi). Solunulkoinen asidoosi (pH 6,6) levitettiin käyttäen bikarbonaatti-MES (morfolinoetaanisulfonihappo) puskuroitu Ringer pH-säädön 6,6. Puskuri kapasiteetti (β) on 5,9 mmol /lxΔpH varten bikarbonaatti-HEPES puskuroitua Ringerin liuoksen pH 7,4 ja 3,9 mmol /lxΔpH varten bikarbonaatti-MES puskuroidussa Ringerin liuos.

Koejärjestely

sen jälkeen, kun seerumi ehtyminen 24 tuntia, soluja inkuboitiin yksi edellä mainituista puskureita (1 ml) ja enintään 3 h. Kaikki estäjiä tai aktivaattoreita käytetään, lisättiin tänä itämisaika.

Sytosoliset pH

Sytosoliset pH yksittäisiä soluja määritettiin käyttäen pH-herkkä väriaine BCECF (2 ’, 7’-bis- ( 2-karboksietyyli) -5- (ja-6) -carboxyfluorescein, asetoksimetyyliesteri, Invitrogen, Paisley, UK), kuten aiemmin on kuvattu [16], [17]. Lyhyesti, soluja inkuboitiin Ringerin liuoksella, joka sisälsi 5 uM BCECF-AM 15 min ajan. Sitten kansi luistaa huuhdeltiin 2 kertaa superfuusioelatusainetta ratkaisu poistaa ylimääräinen väriaine ja siirretään vaiheeseen käänteisen Axiovert 100 TV (Zeiss, Oberkochen, Saksa). Herätevalon aallonpituudet olivat 450 nm /490 nm, valoon mitattiin bandpass-suodatinta (515-565 nm). Tiedonhankintaa oli yksi fluoresenssin intensiteetin suhdetta 10 s välein. Sen jälkeen taustan vähentäminen, fluoresenssin intensiteetti suhde laskettiin. pH kalibrointi suoritettiin jokaisen kokeen jonka nigerisiiniä (Sigma, St. Louis, USA) tekniikka [18], [19] käyttämällä kahden pisteen kalibrointi (pH 6,8 ja 7,5). Kalibrointiliuokset sisälsivät 132 mM KCI ja 1 mM CaCl

2, 1 mM MgCI

2, 10 mM HEPES ja 10 uM nigerisiiniä.

Cell volyymi

The effect of asidoosin solun tilavuus määritettiin elektronisesti kanssa Casy solulaskuria (Innovatis, Reutlingen, Saksa). Näin ollen soluja inkuboitiin, kuten edellä on mainittu, irrotettiin trypsinoinnilla ja solujen määrä ja elinkelpoisuus mitattiin 10 minuutin kuluttua tai 3 h vastaavissa Ringerin liuokset.

Western blot

Western-blottaus suoritettiin vakioprotokollia. Solut lyysattiin (0,1% Triton X-100 PBS: ssä, proteaasiestäjäseostabletit, 37 mg /l natriumortovanadaattia tai 150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,4, 1% Nonidet P-40, 0,1% SDS, 1% natriumdeoksikolaatti, 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, proteaasi-inhibiittori cocktail, 184 mg /l natriumortovanadaattia), solun proteiini määritettiin BCA-methode (BC määritysreagenssit päässä Uptima), erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille . Sen jälkeen, membraaneja inkuboitiin vasta-aineiden kanssa, jotka ovat spesifisiä ERK1 /2, p38, MKK3 /6; fosfo-ERK1 /2, fosfo-p38, fosfo-MKK3 /6, CREB ja fosfo-CREB (1:1000, Cell Signalling). Sitoutunut ensisijainen vasta-aine visualisoitiin käyttäen piparjuuriperoksidaasikonjugoiduilla toissijainen vasta-aineita ja ECL-järjestelmää (Pierce /Thermo Fisher Scientific) ja Molecular Imager ChemiDoc XRS System (Biorad, Munich, Saksa). Kvantitatiivinen analyysi suoritettiin Määrä Yksi ohjelmisto (Biorad).

CRE-SEAP reportterigeenimäärityksessä

transaktivointi arvioitiin Mercury ™ Pathway Profilointi reportterigeenimäärityksessä järjestelmä Clontech Inc. käyttää erittävien emäksistä fosfataasi (SEAP) valvonnassa määriteltyjen cis-sääntelyyn vaste-elementtien (CRE) kuten toimittaja, olennaisesti kuten aikaisemmin [20], [21]. Lyhyesti, solut transfektoitu pCRE-SEAP rakentaa tai tyhjiä vektoreita. SEAP-aktiivisuus media määritettiin kanssa AttoPhos® System Promegalta (Mannheim, Saksa) ja normalisoitu transfektio ohjaus (ß-galaktosidaasi).

LDH: n vapautuminen

LDH toimintaa mediassa ja solulysaateista mitattiin käyttämällä vakioyhteyskäytäntöä [22] sovitettu alempaan asteikon (200 ui) monikuoppaiselle lukija (Infinite, Tecan, Berliini).

kaspaasi-3-aktiivisuus

Cells pestiin kerran PBS-puskurilla (4 ° C) ja inkuboitiin 100 ul: lla solujen hajotuspuskuria (10 mM TRIS, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,01% Triton X-100, pH 7,5) 10 minuutin ajan jäissä, korjattu, ja sentrifugoitiin 16000g 10 min ajan 4 ° C: ssa. 60 ui supernatanttia inkuboitiin 65 ui reaktiopuskuria (20 mM PIPES, 4 mM EDTA, 0,2% CHAPS, 10 mM DTT, pH 7,4), joka sisälsi 42 uM DEVD-AFC (lopullinen konsentraatio) 37 ° C: ssa, ja fluoresenssin katkaistun tuote, 7-amino-4-trifluorimetyylikumariinia (AFC), mitattiin 400 nm: n virityksellä ja 505 nm: n emissioaallonpituudella käyttäen kuopan laskuri (Infinite, Tecan, Berliini). Lohkaistaan ​​AFC kvantifioitiin kalibrointikäyrä tunnettuja AFC pitoisuuksia. Proteiinipitoisuus määritettiin bikinkoniini- hapon määritystä (Interchim, Montluçon, Ranska) käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina.

määritys solunulkoisen pH: n, glukoosin ja laktaatin

pH mitattiin veren kaasuanalysaattorin (ABL5, Radiometer, Kööpenhamina, Tanska). Määrittämiseksi glukoosin pitoisuus, glukoosin (HK) iinianalyysikitissä Sigma (G3293) käytettiin (2 tai 5 ul: n näyte, vastaavasti, plus 200 ui kit) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Laktaatti määritettiin käyttämällä laktaattia reagenssia (Trinity) mukaisesti valmistajan ohjeiden (10 ul: n näyte plus 100 pl kit). Kukin koe suoritettiin vähintään kolmena rinnakkaisena.

ROS muodostumista

reaktiivisten happiradikaalien (ROS) arvioitiin fluoresoivalla värillä DCFDA-AM (Molecular Probes, Leiden, Alankomaat), joka reagoi kasvun kanssa fluoresenssin läsnäollessa H

2O

2 kerran esterisidoksen on pilkottu solun esteraasien. Solut siirrostettiin 24-kuoppalevyillä ja inkuboidaan 30 minuuttia väriaineen jälkeen asianomaiset hoidot. Tämän jälkeen fluoresenssi (eksitaatio 485 nm; emissio 535 nm) mitattiin käyttämällä monikuoppaiselle laskuri (Infinite, Tecan, Berliini, Saksa). Lisäksi tyhjä arvot ilman soluja ja nollanäytteistä ilman väriaine määritettiin ja vähennettiin. Kasvu fluoresenssissa tyhjän arvo ilmaistaan ​​per mg proteiinia käytettiin mittana ROS muodostumista.

määritys mitokondrioiden toiminnan

Jotta arvioida mitokondrioiden toimintaa, voimme määrittää kertymistä rodamiini 123 altistumisen jälkeen pH 7,4 tai pH 6,6. Sen jälkeen, kun 3 tunnin altistuksen soluja inkuboitiin 20 minuuttia 0,1 uM rodamiini 123 HEPES-Ringer sekä, kun läsnä on 20 uM CCCP tai 2 uM nigerisiini [23], [24]. Lopussa solut hajotettiin 0,1% Triton X-100 ja solujen fluoresenssi määritettiin käyttäen kuopan laskuri (Infinite, Tecan, Berliini). Mitokondrioiden rodamiini 123 estetään läsnäollessa CCCP koska Ψ

m romahtaa. Sitä vastoin, mitokondrioiden rodamiini 123 on maksimaalinen, kun läsnä on nigerisiini, joka romahtaa pH-gradientti sisemmän mitokondriokalvon. Tämän seurauksena koko energiaa elektroninsiirtoketju muuntuu Ψ

m. Näin ollen, rodamiini 123: n läsnä ollessa nigerisiiniä miinus rodamiini 123: n läsnä ollessa CCCP edustaa karkea arvio mitokondrioiden toiminnan ja eliminoi ei-spesifisiä vaikutuksia. Rodamiini 123 oli kalibroitu käyttäen lyysipuskuria sisältävät tunnettuja pitoisuuksia rodamiini 123.

Materiaalit

Jos ei toisin mainita, kemikaalit olivat Sigma-Aldrich, Munchen, Saksa.

Tietojen analysointi

Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM. Kaikissa kokeissa, N on yhtä suuri kuin määrä viljelylevyjä tai solut, joita käytetään suorittamaan mittauksia ole mainittu toisin. Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kaksi kohtaa. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin parittomia Studentin t-testiä tai ANOVA tarvittaessa. Erot katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun P 0,05.

Tulokset

Solunsisäinen pH seuraavat solunulkoisen asidoosi

Kuva. 1A esittää solunsisäistä pH: ta eri solutyyppejä. Alentaminen solunulkoinen pH aina alensi pH

i, vaikka aste tämän vähennyksen poikkesivat voimakkaasti välillä solulinjoista. Kontrolloiduissa olosuhteissa (pH 7,4), solunsisäinen pH oli aina pienempi kuin solunulkoiseen osastoon. Kuitenkin alle asidoosi (pH 6,6) solunsisäinen pH oli korkeampi useimmissa solulinjoissa. Tämä käänteinen pH-gradientti on kuvattu aiemmin kiinteisiin kasvaimiin

in vivo

[6] osoittaa, että malli käytetään esillä olevassa tutkimuksessa muistuttaa

in vivo

tilanteessa asianmukaisesti. Vaikka CHO ja H358 solunsisäinen pH on laskenut alle solunulkoinen pH on osoitus voimakas net protoni puristamiseen. Alkaen termodynaamiset seikat soluissa ilman protonin ekstruuderit (olettaen, että kalvo potentiaali -40 mV) solunsisäistä pH: ta olisi noin 0,65 yksikköä alhaisempi kuin solunulkoiseen pH-arvoon. Kokeissa (pH

e 6,6) pH-arvoon

i ~6.0 olisi odotettavissa passiivisesta jakeluun. On selvää, CHO ja H358-soluissa pursota protonit aktiivisesti vastaan ​​passiivinen tasapaino, vaikka niiden kapasiteetti näyttää olevan jonkin verran pienempi kuin muissa solulinjoissa.

(A) pH

i mitattu kontrolloiduissa olosuhteissa (pH 7,4 ) ja aikana solunulkoinen asidoosi (pH 6,6) (N = 3-7). (B) pH-gradientti AT1-soluissa kurissa (pH 7,4) ja hapan (pH 6,6) edellytykset kaksi eri ajankohtina; ympyrä: pH

e, neliö: pH

i.

muutos solunsisäisen pH nopeasti seuraa solunulkoinen asidoosia ja oli stabiili useiden tuntien. Esimerkiksi AT1 solujen solunsisäisen pH: n (pH

i) nopeasti laskenut pH 7,22 ± 0,08 pH-arvoon 6,75 ± 0,09 10 min (Fig. 1 B). Tämä pH-muutos säilyi yli 3 h (Fig. 1 B), mutta palautuvia vaihdettaessa takaisin fysiologinen pH

e (säätelyyn pH-homeostaasin AT1 soluissa kts. S1). Lasku pH

e aikana 3 tunnin inkuboinnin tulosten laajasta muodostumista maitohappoa (Warburg vaikutus, Fig. S2).

Asidoosi aiheuttama MAPK aktivaation eri solutyyppejä

altistamalla solut kohtalainen solunulkoiseen asidoosi johtaa huomattavaan aktivaation ERK1 /2 ja p38 MAP-kinaasien. Kuva. Kuvio 2A esittää fosforylaatio sekä kinaasien inkuboinnin jälkeen AT1-soluja kolme tuntia pH: ssa 6,6. Analysoidaan ajan kulku osoittaa, että fosforylaatio oli havaittavissa jo 5 min ja kesti 3 h (Fig. 2B). Vaikutus p38 aktivaation nähtiin laajan kirjon erilaisia ​​kasvaimen tai normaalia kudosta solulinjoissa (Fig. 2C). Nämä havainnot osoittavat, että p38-fosforylaation asidoosia lisääntynyt eri soluissa riippumatta siitä johdettu kasvain tai normaalia kudosta osoittaen yleismaailmallinen mekanismi stressin aiheuttama signalointi. Sen sijaan, asidoosi aiheuttaman ERK1 /2 aktivointi ei havaittu kaikissa solutyypeissä tutkittiin ja se ei liity tuumorigeenisyyteen solujen (Fig. 2C), vaikka solunsisäinen pH laski kaikissa solulinjoissa. Täten muutokset pH

i eivät näytä olevan yleismaailmallinen laukaista asidoosi aiheuttaman ERK1 /2 fosforylaatio. Sekä MAPK mitään määrällisiä korrelaatiota pH

i tai muutoksia solunsisäinen pH ja p38 tai ERK1 /2 fosforylaatio eri solutyyppejä havaittiin (Fig. S3). Yhdessä nämä tulokset johtivat päätelmään, että bulk solunsisäistä pH tai muutoksia pH

i eivät ole keskeisiä sääntelijöiden ERK1 /2 fosforylaation aiheuttama solunulkoisen asidoosin vaan toimivat universaali laukaista p38 fosforylaatiota. Koska periaate mekanismit (solunsisäinen happamoituminen, p38 fosforylaatio) havaittiin AT1 soluissa edelleen kokeet suoritettiin tämän tietyn solutyypin.

(A) Tyypillinen Western blot fosforyloidun ja yleistä proteiinia ERK1 /2 ja p38 in AT1 solut itämisajan jälkeen 3 h joko pH 7,4 tai pH 6,6. (B) ajan kuluessa asidoosin aiheuttaman ERK1 /2 ja p38 fosforylaation AT1 soluissa. Arvot fosforyloidun proteiinin jaettuna kaiken proteiinin, 180 min HEPES-Ringer pH 7,4 määritellään 100%. (N = 3-10). (C) vaikutus happamissa olosuhteissa on ERK1 /2: n ja p38 fosforylaation esitetty% valvonnan (pH 7,4) erilaisissa solulinjoissa. (N = 5-12); (*) P 0,05.

Vaikutus asidoosin solujen elinkelpoisuuden

Sen arvioimiseksi eri mekanismeja solukuoleman valkuaispitoisuus maljaa kohti (yleinen solujen elinkelpoisuuden), induktio apoptoosin (kaspaasi-3-aktiivisuus) ja kuolion (LDH-release) analysoitiin. Asidoosi sinänsä herättänyt mitään merkittävää muutosta solun eloonjäämisen (Fig. 3). Silti, kun ERK /2 polku estyi nekroottinen solukuolema nousi merkittävästi, mikä johti soluja. Kaspaasi-3-aktiivisuus ei muuttunut, mikä viittaa muuttaminen ei apoptoosin korko. Estämällä p38-reitin oli käytännössä ilman vaikutusta. Nämä tiedot osoittavat, että asidoosi aiheuttama ERK1 /2-fosforylaation aktivoi pelastus ohjelma estää nekroottisen solukuoleman. Tällä hetkellä täydellinen koesarja tässä sarjassa on tehty vain AT1 soluissa. Tästä syystä jää avoimeksi, onko vaiheet asidoosin aiheuttaman ERK1 /2 seurannut aktivoituminen kuolion tapahtuu kaikissa solulinjoissa yleisenä mekanismi. Koska jotkut solulinjat eivät näytä aktivoimisen ERK1 /2 asidoosi (Fig. 2C) voi olla mahdollista, että ERK1 /2-riippuvuus solun elinkelpoisuus on ainakin kvantitatiivisesti erilainen eri eri solulinjoissa. Tässä lisäkokeita tarvitaan.

(A) Cell proteiinipitoisuus, (B) kaspaasi-3-aktiivisuus (apoptoosia) ja (C) LDH-vapautumisen (nekroosi) ja AT1 soluissa, sen jälkeen 3 h inkuboinnin eri pH tai ilman inhibiittoreita ERK1 /2 (U0126) tai p38 (SB203580) reittiin (N = 12-18); (*) P 0,05.

Solunsisäinen happamoitumista ja p38 fosforylaatio

vaikutus solunsisäisen happamoitumisen aikana estämällä bikarbonaatin liikenteen DIDS ja /tai lisäkuormitusta laktaatilla on MAPK aktivointi oli tutkittu. Normaalissa solunulkoinen pH (7,4) joko eristetyn inhibition bikarbonaatin liikenteen (200 uM DIDS) tai solujen inkubaation laktaatti (40 mM) sai aikaan melko heikko happamoitumisen 0,1 pH-yksikköä (Fig. 4A). Kuitenkin yhdistelmä hoitojen määrä väheni pH selvästi 0,3 yksikköä. Analysoidaan MAPK aktivaatio näissä olosuhteissa osoitti, että ainoa inhibitio bikarbonaatti liikenteen DIDS tai altistuminen AT1 solut erittävät fysiologisessa solunulkoinen pH oli ei riitä muuttamaan p38 tai ERK1 /2-fosforylaation (kuvio. 4B), todennäköisesti, koska pH

i palautuu hyvin nopeasti, kun läsnä oli ekstrasellulaarisen laktaattia (kuvio. S1B). Samanaikainen lisäys DIDS ja laktaatin johti huomattavasti p38 fosforylaatiota (kuvio. 4B). Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että pääosa muutoksista solunsisäisen pH välittävät stimuloivaa vaikutusta solunulkoisen asidoosin on p38 muttei ERK1 /2. ERK1 /2-fosforylaation stimuloi vähentää solunulkoinen pH, mutta ei pienempi solunsisäistä pH: ta (Fig. 4B).

(A) Pitkän aikavälin vaikutukset (3 h) altistuksen DIDS (200 uM) ja /tai lisätty 40 mM laktaattia (N = 14-56) pH

i. pH-muutoksia verrattuna kontrolliin olosuhteissa (pH 7,4) (*) p 0,05. (B) suhde fosforyloidun MAPK /yleistä proteiinin% valvonnan (pH 7,4); N = 3-7 Perk; N = 4-9 fosfo-p38; (*) P 0,05.

Asidoosi aiheuttama ERK1 /2 ja p38 fosforylaatio on riippumaton fosfataasiaktiivisuus, mutta riippuu MAPK MEK1 /2 ja MKK3 /6, vastaavasti

Koska fosforylaatio lisääntyy voisi olla joko lisääntyneen kinaasiaktiivisuutta tai heikentyneestä fosfataasin nopeuden vaikutusta fosfataasin estoa asidoosi aiheuttaman MAPK aktivaatio tutkittiin. Kun tyrosine- tai theronine /seriini-fosfa- estyi käyttämällä joko ortovanadaattia (100gM) tai ocadaic happoa (100 nM) vaikutusta solunulkoisen asidoosin on ERK1 /2 ja p38 fosforylaatio oli lisäaineena (Fig. S4). Kaikissa kokeissa pp38 ilman fosfataasiestäjät aiheutettiin kertoimella 3-4 (kuviot. S4 ja S5) verrattavissa aiemmissa kokeellinen sarjassa (Fig. 2C). Näin ollen on epätodennäköistä, että vaikutus asidoosin välittää muutokset fosfataasiaktiivisuus. Keskeinen vaihe ERK1 /2 aktivointi on alkupään kinaasi MEK1 /2, joka yhdistää suurin osa signalointireittien yhdentyvät ERK1 /2 [12]. Kun MEK1 /2 estyi 10 uM U0126, perustason fosforylaatiota ERK1 /2 väheni huomattavasti ja vaikutus asidoosin kumottiin (Fig. S5). U0126 esti asidoosi aiheuttamaa ERK1 /2-fosforylaation vaikka läsnä kaksi fosfataasi-inhibiittorit ortovanadaattia ja ocadaic happoa, joka osoittaa, että MEK1 /2 on olennaista vaikutusta havaittu. p38 aktivaatio ei inhiboinut U0126 (Fig. S5), mutta 3 tunnin aikana asidoosi (pH 6,6) kinaasin MKK3 /6, joka on ylävirtaan p38, fosforyloitiin pH-riippuvaisella tavalla (kuvio. 5). Yhdessä meidän tiedot viittaavat siihen, asidoosi aiheuttaman vaikutuksia MAPK eivät riipu muutoksia fosfataasiaktiivisuus, kun taas MEK1 /2 on ratkaisevaa ERK1 /2 aktivointi ja lisääntynyt p38 fosforylaatio johtuu lisääntyneestä aktiivisuudesta MKK3 /6 happamissa olosuhteissa.

Arvot edustavat suhde fosforyloidun proteiinin (pp38 tai Perk) jaettuna proteiinin (p38, ERK). Nämä arvot on sitten normalisoitu suhde valvonnan kokeissa pH: ssa 7,4. (*) P 0,05 versus pH 7,4. (N = 4).

Asidoosi aiheuttama MAPK aktivointi ei riipu EGFR, PKC, PKA, PI3K tai Src-ryhmän kinaasien

paljastaa mahdollisen signalointireittejä johtavan solunulkoisia asidoosi käyttöavaimen ERK1 /2 ja p38, useita lupaavia kohteita analysoitiin estämällä niitä erityisiä estäjiä. Rooli epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR), proteiinikinaasi C: n (PKC), proteiinikinaasi A (PKA), fosfatidyyli-inositoli-3-kinaasi (PI3K) ja Src-perheen tyrosiini- kinaasien tutkittiin AG1478, Bisindolylmaleimide I (BIM), Rp-isomeeri, LY294002 ja PP2, vastaavasti. Kaikki nämä kinaasien voi olla merkittävä rooli kasvaimen edistämisen ja etenemiseen. Kuitenkaan yksikään estäjien osoitti merkittävää vaikutusta asidoosin aiheuttamaa ERK1 /2 tai p38-aktivaation, kuten on kuvattu kuvioissa. S6 ja S7, vaikka maksimaalinen pitoisuuksia käytettiin.

cAMP on potentiaalinen kaksi vaikutusta MAPK signalointi [12], [25]. Aktivointi PKA cAMP voi johtaa inhibitioon MEK1 /2 ja /tai Raf-1 (C-Raf). Kuitenkin aktivointi EPAC cAMP aktivoi B-Raf kautta Rap1. Soveltaminen läpäisevä membraani analoginen dibutyryyli-cAMP (db-cAMP, cAMP-puristin)

sinänsä

vähentänyt ERK1 /2, mutta ei p38 fosforylaatiota (kuvio. S7). Lisäksi vaikutus solunulkoisen asidoosin oli täysin kumottu. Endogeenisen cAMP muodostumisen forskoliinin (aktivaattori adenylyl cyclases) esiin samankaltainen vaikutus kuin db-cAMP (Fig. S7). Siten ERK1 /2, mutta ei p38 signalointi on cAMP-herkkä ja vaikutus on todennäköisesti välittyy PKA mahdollisesti estämällä C-Raf.

OGR1 ei ratkaisevaa MAPK fosforylaation happamassa mikroympäristölle

selventämiseksi mekanismi pH-anturi ja MAPK aktivoinnin edelleen roolia G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien, pystyvät aistimaan solunulkoisen protoneja /pH, on tutkittu. Näiden, munasarjasyöpä G-proteiiniin kytketty reseptori 1 (OGR1) on osoitettu aktivoivan MAPK-reitin [26]. Ei ole mitään erityisiä estäjiä OGR1 käytettävissä, mutta on osoitettu, että protoni aiheuttama aktivointi ERK1 /2 OGR1 on kumottu uM kuparin ionikonsentraatioissa. Vaikka tämä ei ole spesifinen esto sitä voidaan käyttää väärentää hypoteesi OGR1 osallistumista. Kun läsnä on 10 uM CuCl

2 lisääntyminen ERK1 /2: n ja p38 fosforylaation nähtiin, että on edelleen parantaa solun ulkopuolisen asidoosi (Fig. S8A). Siten OGR1 ei todennäköisesti ole välittävän vaikutusta solunulkoisen asidoosin on MAPK signalointi.

Rooli Na

+ /K

+ – ATPaasi in asidoosi aiheuttaman ERK1 /2 aktivointi?

Toinen mahdollinen mekanismi pH- ”tunteva” olisi Na

+ /K

+ – ATPaasi, entsyymiä, joka estyy asidoosia ja saattavat aiheuttaa MAPK aktivaatio joko muutoksia solujen elektrolyyttipitoisuuksien homeostaasin tai signaloinnilla kautta EGFR [27], [28]. Kuva. S8 osoittaa, että asidoosi aiheuttama estämällä Na

+ /K

+ – ATPaasi saattaa osaltaan ERK1 /2 fosforylaation AT1 soluissa. Koska soluvolyymiä muutokset, jotka ovat osa signalointiryöpyn [29] olivat melko heterogeenistä eri solulinjojen, vastaan ​​puhuu ratkaiseva rooli asidoosi aiheuttaman ERK1 /2 fosforylaation.

vaikutus ROS vuonna asidoosi aiheuttaman MAPK aktivointi

koska reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) voivat toimia solunsisäinen signalointi molekyyli [30], analysoimme myös ROS tuotanto muuttuu aikana solunulkoinen asidoosi. Altistamalla solut ekstrasellulaariseen asidoosi aiheuttamaa ROS muodostumista (Kuva. 6A). Jotta erottaa vaikutusta ekstra- ja intrasellulaarisen happamuuden soluja lisäksi inkuboitiin laktaattia ja DIDS normaalissa solunulkoinen pH jossa kummankin aineen yhdistelmän oli voimakkain vaikutus solunsisäinen pH (Fig. 4A) ja esiin merkittävä kasvu ROS muodostumista (Fig. 6B). Puhdistusjärjestelmä ROS kanssa Tiron alensi ROS tason hallinnassa tila (pH 7,4) sekä aikana asidoosi (kuviot. 6A ja B). DPI (diphenyleneiodonium kloridi), estäjä flavoproteins, kuten NO nopaliinisyntaasin tai NADPH oksidaasin, ei vähentänyt ROS muodostumista.

(A) ROS muodostumisen aikana solunulkoinen asidoosi kanssa soveltamisen ROS scavengers Tiron, DPI tai rotenone (N = 9-12). (A) ROS muodostuminen (mitattuna DCF-DA fluoresenssi) aikana solunsisäinen asidoosi (aiheuttama laktaatti + DIDS; ks. 4A) kanssa soveltamisesta ROS scavengers Tiron, DPI tai rotenone (N = 3). (C) Suhteellinen mitokondrioiden toimintaa (mitattuna rodamiini 123 kertyminen) klo valvontaolosuhteet (pH 7,4) ja aikana solunulkoinen asidoosi (pH 6,6); N = 12. (*) p 0,05.

läsnäollessa rotenonin, estäjä mitokondrion kompleksin I ROS muodostuminen parannettu happamissa mutta ei kontrolloiduissa olosuhteissa (kuviot. 6A ja B ), eli asidoosi stimuloi rotenone aiheuttamaa ROS muodostumista. Nämä tulokset on vahvistettu käyttämällä mitokondriot-spesifinen fluoresenssi koetin MitoSox. Tämän koetin mitokondrion ROS muodostuminen lisääntyi läsnäollessa rotenone 236 ± 44% pH: ssa 7,4 kuin 903 ± 219% pH: ssa 6,6 (n = 6; p 0,05) vahvistetaan voimakas vaikutus happaman pH ROS tuotanto mitokondrioita . Tietoihin ei mitokondrioiden päinvastaisessa elektronien kuljetusta lähteenä ROS mutta antaa viitteitä lisääntynyt NADH /NAD

+ ratio laukaista [31]. Monimutkainen I tuottaa superoksidianionin, että NADH: n läsnäollessa, ja tämä sukupolvi on parantaa rotenone ja ΔpH koko mitokondrion kalvon. Bruttomääräisillä aktivointi mitokondrioiden toimintaa ei voitu havaita (kuvio. 6C).

inkuboimalla soluja H

2O

2, suhteellisen vakaa ROS molekyyli, johti annoksesta riippuva aktivointi ensisijaisesti of p38-MAP-kinaasin (Fig. 7B). ERK1 /2 fosforylaatio lisääntyi. Inkuboimalla soluja Tiron joka pystyy merkittävästi vähentämään ROS muodostumista (kuviot. 6A ja B) inhiboi sekä p38 ja ERK1 /2 aktivointi (kuviot. 7A ja B), joka osoittaa, että ROS muodostuminen on ylävirtaan MAPK fosforylaation.