Krooninen sairaus

tiivistelmä

onkogeeninen signalointi edistää kasvainten invaasio ja etäpesäkkeiden, osittain lisäämällä ilmaus tri- ja tetra- haarautuneita N-glykaanien. Haarautunut N-glykaanien sitoutuvat galectins muodostaa moniarvoinen ristikko, joka parantaa solun pinnan sijaintipaikan kasvutekijäreseptorien, ja fokaalisen adheesion vaihtuvuus. N-asetyyliglukosaminyylitransferaasi I (MGAT1), ensimmäinen haarautuva entsyymin reitin, tarvitaan lisäksi kaikkien myöhempien oksat. Tässä olemme ottaneet käyttöön MGAT1 shRNA ihmisen HeLa kohdunkaulan ja PC-3-Yellow eturauhaskasvainsoluissa linjat, tuottaa solulinjoja, joilla on alentunut transkriptio, entsyymin aktiivisuus ja haarautuneet N-glykaanien solun pinnalla. MGAT1 Knockdown esti HeLa solujen vaeltamiseen ja invaasio, mutta ei muuttanut solujen lisääntymisen hinnat. Swainsoniinia, estäjä α-mannosidaasi II välittömästi alavirtaan MGAT1, esti myös solujen invaasiota ja ei lisäaine kanssa MGAT1 shRNA, sopusoinnussa yhteinen vaikutusmekanismi. Focal tarttuvuus ja microfilamentti organisaatio MGAT1 pudotus soluissa osoittavat myös vähemmän liikkuvia fenotyyppi.

In vivo

, MGAT1 Knockdown PC-3-Yellow potilaalle tehdä eturauhassyöpäksenograftista malli merkittävästi vähentynyt ensisijaisen kasvaimen kasvua ja esiintyvyys keuhkometastaaseista. Tuloksemme osoittavat, että esto MGAT1 on potentiaalinen kohde syövän hoitoon.

Citation: Beheshti Zavareh R, Sukhai MA, Hurren R, Gronda M, Wang X, Simpson CD, et ai. (2012) Suppression of Cancer Progression mukaan MGAT1 shRNA knockdown. PLoS ONE 7 (9): e43721. doi: 10,1371 /journal.pone.0043721

Editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia

vastaanotettu: 4. toukokuuta 2012 Hyväksytty: 23 heinäkuu 2012; Julkaistu: 05 syyskuu 2012

Copyright: © Beheshti Zavareh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: Tutkimus oli avustuksin Kanadan Institutes of Health Research (CIHR) (MOP-62975) ja Kanadan Research Chair (CRC) (950-202079) ja JWD, ja Kanadan Institutes of Health Research (CIHR) ADS, joka on CIHR kliinikon tutkija ja Leukemia ja lymfooma Society Scholariin Clinical Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Metastaattinen syövät yleensä huono ennuste, ja näyttää rajoitettu vastauksia kemoterapiaa ja uudempia kohdennettuja hoitomuotojen [1]. Redundanssia kasvun reseptorit ja signalointi edistää hyökkäyksen ja lääkeresistenssi, ongelma, joka voisi ratkaista huomioon ylimääräisiä tasoja palautteen sääntelyä. Tässä suhteessa, reseptorit ovat N-glykosyloituja ER ja N-glykaanien uusittu Golgin matkalla solujen pintaan [2]. Onkogeeninen transformaatio lisää Ets-jentymisen N-asetyyliglukosaminyylitransferaasi V koodaa Mgat5, mediaalinen Golgi entsyymi, joka aloittaa β1,6GlcNAc antenni tri- ja tetra- haarautunut N-glykaanien [3] – [5]. Yli-ilmentyminen Mgat5 kuolemattomiksi tehdyissä epiteelisoluissa on osoitettu rentoutua kasvun ehkäiseminen ja edistää tuumorigeneesissä, kun solut injektoidaan hiiriin [6]. Kasvaimia synnyttävän indusoima Mgat5 ja sen β1,6GlcNAc tri- ja tetra- haarautuneita N-glykaanien tuotteet korreloivat etäpesäkkeiden ja vähentää eloonjäämisen ihmisen rintarauhasen ja paksusuolen syöpiin [7], [8]. Hiirillä, syövän etenemiseen viivästyy polyoomate–virus middle T siirtogeenisiä (PyMT) ja PTEN

+/- malleja syövän koskevasta Mgat5 puutteellinen tausta [9], [10]. Lisäksi Golgi α-mannosidaasi II: n estäjä swainsoniini inhiboi kasvainsolujen etäpesäkkeiden hiirimalleissa, ja testattiin lupaavia tuloksia kliinisissä kokeissa [11], [12].

Galectins sitoutuvat N-glykaanien reseptoreihin ja liuennut aine kuljettajat affiniteetilla suhteessa haarautuminen ja määrä N-glykaanien (NXS /T kiinnitys sivustoja) [13], [14]. Galektiini-3: n on osoitettu cross-link glykoproteiini reseptoreita solun pinnalla, joka muodostaa dynaamisen ristikko, joka hidastaa ihmiskaupan osaksi päällystetty-kuoppaan endosomeihin ja caveolin-1 lipidilauttoja, mikä edistää pinnan sijainnin ja herkkyys ligandit [14], [15 ]. Hilan on heterogeeninen ja sen on osoitettu säädellä pinnan säilyttäminen EGF, TGF-β ja VEGF-reseptoreihin [14], [16] sekä GLUT-2, -4 glukoositransporttereita ja TRPV5 Ca

++ kanava [13 ], [17], [18] (kuvio 1). Haarautunut N-glykaanien myös parantaa liikevaihdon kasvualusta ja solun kiinnikkeistä, tukee epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) syöpäsoluissa [19], [20]. Lisäksi Mgat5 ilmentymistä hiiren ihon edistää EMT-kaltainen fenotyyppi ja haavan paranemista [21]. Mgat5

– /- PyMT-nisäkasvainsoluja viljelmässä osoittavat vähensi pinta kotipaikan sytokiinireseptorien joka voidaan pelastaa (i) Mgat5 uudelleen ilmaisun, (ii) estämällä konstitutiivista endosytoosin, (iii) ehtymisestä caveolin-1 ja (iv) mukaan GlcNAc lisäravinteiden UDP-GlcNAc yhteisen luovuttaja varten Mgat entsyymit [13], [14]. GlcNAc lisäravinteen Mgat5

– /- solut lisää sisältöä bi- ja tri-antennaarisen N-glykaanien, joka pelastaa affiniteetit galektiini-3 ilman Mgat5 tuote [13]. Tämä viittaa siihen redundanssia N-glykaanirakenteet ja profiileja, jotka voivat tukea pahanlaatuiseen fenotyyppiin.

Oligosaccharyltransferase (OST) korvaa NXS /T sivustoja proteiinien karkea Endoplasmakalvosto (RER), siirtämällä esiasennettu glykaanitähteen maasta Glc

3Man

9GlcNAc

2-pp-dolikolimono- Asn. Glykoproteiinit liikennettä Golgin jossa N-glykaanien on uusittu, ja rakenteellisia yksityiskohtia riippuvat entsyymin ilmentymisen ja UDP-GlcNAc tarjontaa. Haaroittimelta entsyymit Mgat1, Mgat2, Mgat4, ja Mgat5 eroavat Km-arvot UDP-GlcNAc ”D” ja glykoproteiini akseptori ”A”. Reitti on kehittynyt varten koulutusjakson ultrasensitivity UDP-GlcNAc. Epitoopit valmistuvat trans-Golgi (pieni laatikko), jossa tehokas substituutio Gal luo LacNAc epitooppia, ja voidaan pidentää poly-LacNAc. Edelleen laajennus galaktoosin luo epitoopit galektiini sitovia, minkä vaikutukset reseptoriin dynamiikkaan, vuorovaikutusta ja ihmiskauppaa.

Mgat1 katalysoi lisäyksen ensimmäisen haaran, ja tuote tarvitaan toiminnan α-mannosidaasin II ja Mgat2, ja sitten Mgat4 ja Mgat5 katalyyttisesti tilata reitti [2] (kuvio 1). Alhainen Mgat1 toimintaa rajoittaa lähdön tri- ja tetra-haarautunut end tuotteita, mutta korkea voi myös tehdä saman riistämällä UDP-GlcNAc tarjontaa Mgat4 ja Mgat5 entsyymi myöhemmin reitin. Todellakin, Mgat entsyymit näyttö laskeva affiniteetti UDP-GlcNAc: n, joka johtaa reitin ultrasensitivity, jolla on ominainen sigmoidal tuotos Mgat5 tuotteiden vastauksena tämän yhteisen metaboliitiksi [13]. Heksosamiinin polku alustoille leikkaavat perus- aineenvaihduntaa, joka on tunnettu tehtävä laajoja muutoksia syöpäsoluissa [22]. UDP-GlcNAc synteesin heksosamiinin reitti riippuu glukoosin, glutamiinin, ja asetyyli-CoA syöttö heksosamiinin reittiin, sekä GlcNAc pelastaa. GlcNAc ja GlcNAc-p voi olla koholla välivaiheessa eturauhasen syövän etenemisessä [23], ja se voi olla tärkeä rooli edistettäessä kasvainprogression [24]. Siksi estämällä haarautuva aikaisin reitti voi olla toteuttamiskelpoinen strategia välttää aineenvaihdunnan korvausta.

alkaa tutkia roolia MGAT1, me tuotettu ihmisen tuumorisolulinjoja ilmensivät stabiilisti MGAT1 shRNA, ja saavutti -70% tukahduttamista haarautunut

N

glykaanit ja invasiivisia fenotyyppi, muuttamatta lisääntymistä ja elinkelpoisuuden soluviljelmässä. MGAT1 pudotus vähentynyt kasvun ja etäpesäkkeiden ihmisen eturauhasen syöpäsolujen ksenografti ortotooppisten hiirimallissa. Vaikka MGAT1 tarvitaan hiiren kehityksen jälkeen päivä E9.5 [25], [26], tulokset viittaavat siihen, että osittainen systeeminen ehtyminen MGAT1 aikuisilla voi olla siedettävä ja ovat tärkeitä syöpälääkkeen vaikutuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

HeLa ihmisen kohdunkaulan syövän soluja (ostettu ATCC: ltä) pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle Medium (DMEM). PC-3-Yellow-soluja (erittäin metastaattinen klooni PC-3 ihmisen eturauhassyövän solulinja ekspressoi stabiilisti punainen fluoresoiva proteiini (RFP) ja vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP), joka oli lahja G. Glinsky, Ordway Research Institute, [27 ]) ylläpidettiin RPMI 1640 Kaikki solut oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Hyclone, Logan, UT), antibiootit, viljeltiin standardi kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ilmakehässä.

L-PHA: n sitoutumisen solun pinnan glykaanien

solut ympättiin 96-kuoppalevyille 500 solua kuoppaa kohti. Sen jälkeen kiinni yön yli, solut kiinnitettiin 3,7% formaldehydillä ja pestään. Pinta-tri- ja tetra-haarautunut

N

glykaanit värjättiin L-PHA (20 ug /ml) konjugoituna Alexa Fluor 488 tai Alexa Fluor 647 ja tumat värjättiin 5 ug /ml 4 ”, 6-diamino-2-fenyyli, Hydroksipropaanihappo (DAPI, Hydroksipropaanihappo) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Yhteenlaskettu intensiteetti L-PHA värjäystä kullakin solujen määrä määritettiin käyttämällä Cellomics ArrayScan II (Cellomics, Pittsburgh, PA) [13].

MGAT1 hiljentämiseltä lentiviraalinen toimitettujen RNA-interferenssi

rakentaminen hiusneula-pLKO.1 vektorit (joka kantaa puromysiini-antibioottiresistenssigeeniä), joka sisältää lyhyitä hiusneula-RNA (shRNA) sekvenssit ja tuotanto shRNA viruksia on kuvattu yksityiskohtaisesti [28]. ShRNAs kohdistaminen MGAT1 koodaavat sekvenssit ovat seuraavat:

MGAT1

-sh1 (NM_002406), 5′-CCCTGAGATCTCAAGAACGAT-3 ’; ja

MGAT1

-sh2 (NM_002406), 5′-GCACCTCAAGTTTATCAAGCT-3 ’. Ohjaus shRNA koodaavat sekvenssit ovat seuraavat: RFP, 5’-CTACAAGACCGACATCAAGCT-3 ’ja LacZ, 5′-CCGTCATAGCGATAACGAGTT-3’. Lentivirusvektorikonstruktit infektioita tehtiin oleellisesti, kuten on kuvattu aiemmin [28]. Lyhyesti, kiinnittyneet solut käsiteltiin 0,5 ml: lla viruksen sen jälkeen inkuboimalla yön yli (37 ° C, 5% CO

2) irrottamatta virus. Seuraavana päivänä, viruksen alusta korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi puromysiiniä (1 ug /ml) ja valitse populaatio resistentit solut.

Reverse-transkriptaasia reaaliaikainen PCR

Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin 1 ug DNaasi-käsiteltyjen solujen kokonais-RNA: sta käyttämällä satunnaisia ​​alukkeita ja SuperScript II käänteiskopioijaentsyymiä (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Reaaliaikainen PCR määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena 5 ng RNA: ta vastaavan cDNA: n, SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), ja 400 nM geenin-spesifisiä alukkeita. Reaktiot käsiteltiin ja analysoitiin ABI 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Eteen /taakse-PCR paria ihmisen cDNA olivat seuraavat: ihmisen GlcNAc-TI: Eteenpäin 5’CGGAGCAGGCCAAGTTC-3 ’, Reverse 5’CCTTGCCCGCAGTCCTA-3′, 18S: Eteenpäin 5’- AGG AAT TGA CGG AAG GGC AC- 3 ’, Reverse 5′-GGA CAT CTA AGG GCA TCA CA-3’. Suhteellinen mRNA: n ekspressio määritettiin käyttäen ΔΔCT kuvattua menetelmää.

GlcNAc-transferaasi toimintaa

entsyymiaktiivisuus MGAT1was mitattiin käyttäen synteettistä reseptoreita, kuten aiemmin on kuvattu [29]. Lyhyesti, solujen lysaatit inkuboitiin MGAT1 akseptorin Manα (1,3) [Manα (1,6)] Glcβ1-O- (CH

2)

7CH

3 (Toronto Research Chemicals, Toronto, ON ), liuoksessa, joka sisältää 0,5 mM UDP- [6

3H] GlcNAc (44400 dpm /nmol), 125 mM MES (pH 6,5), 50 mM GlcNAc, 1 mM UDP-GlcNAc: n, 0,8 mM AMP ja 10 mM MnCl2: . Inkuboinnin jälkeen reaktio lopetettiin lisäämällä jääkylmää H

2O. Siirto [6

3H] GlcNAc että akseptori kvantitoitiin nestetuikelaskennalla.

Muuttoliike ja invaasio määritykset

Invasion ja muuttoliike määritykset HeLa-soluissa suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [30 ]. Lyhyesti HeLa-soluja (2 x 10

5) otettiin talteen ja istutettiin päällystämättömän hyökkäys kammiota migraatiokokeessa tai BioCoat Matrigel Invasion Chambers (BD Biosciences, Mississauga, ON) invaasio määrityksissä. Sekä siirtymisen ja invaasio määrityksissä, kasvualustaa, joka sisälsi 10% FBS: ää käytettiin kemoattraktantti pohjaan hyvin. Seuraavat 48 tunnin inkubaation jälkeen solut, jotka olivat vaeltaneet tai tunkeutuneet alapinnalle kalvon värjättiin Diff-Quik Stain (BD Biosciences). Määrä muuttaa tai tunkeutuvat solut kuvattiin ja laskettiin käyttäen Aperio ScanScope CS koko dia Scanner (AperioTechnologies, Vista, CA) ja Image-Pro Plus Software (versio 4.5; Media Cybernetics Inc., Silversprings, MD). Jotta testata vaikutusta samanaikaisen MGAT1 eston ja swainsoniini hoito, HeLa-soluja käsiteltiin 2 uM swainsoniini 72 tuntia ennen muuttoa ja invaasiomääritys edellä kuvatulla tavalla.

arvioimiseksi hyökkäyksen ja maahanmuuttoon PC- 3-Yellow soluja, soluja seerumin vailla yli yön ja kylvetään ylemmässä kammiossa 16-kuoppaisen CIM-plate (Roche Applied Sciences) muuttoliikettä määrityksiä tai matrigeelin (BD Biosciences, Mississauga, oN) pinnoitettu levy hyökkäystä määrityksiä. Alempi kammio sisälsi 20% FBS kuin kemoterapia-houkuttimena, ja levyt laitettiin Roche xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (RTCA) DP alusta (Roche Applied Sciences). Reaaliaikainen mittaukset tehtiin viiden minuutin välein 36 tuntia. RTCA Analyzer mittaa sähkövastus soluja, jotka siirtyvät alapinta kalvon, ja vertaa hyvin solujen määrä edellä kuvatulla menetelmällä.

Immunosytokemia

Solut ympättiin fibronektiinillä päällystetyn peitinlaseja (Sigma-Aldrich, Oakville, ON). Jälkeen kiinni yön yli, solut kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä 10 minuutin ajan, minkä jälkeen läpäiseväksi käyttäen 0,2% Triton-X-100. Kun oli salvattu 5% BSA: lla 1 tunnin ajan, soluja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa hiiren anti-β1-integriini (1:200, Millipore) tai anti-fosfo-paksilliini (pY31) vasta-aine (1:400, Epitomics). Peitelasit pestiin PBS: llä ja inkuboitiin sitten aasin anti-hiiri-IgG-Cy3-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (1:200, Millipore) ja β1-integriinin tai anti-kani-lgG-FITC konjugoitu vasta-aine (1:500, Millipore) ja paksilliinin. Värjäys aktiini tehtiin falloidiinia konjugoitu tetra- B-isotiosyanaatti (TRITC, Sigma-Aldrich) 10 minuutin ajan. PBS-pesun jälkeen, Pääliliuskat kiinnitetty dioja fluoresoivalla kiinnitysväliaine ja kuvattiin käyttäen 40 × linssin Zeiss LSM700 konfokaalimikroskoopilla (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Saksa).

In vivo -mallissa eturauhasen syövän etäpesäkkeiden

Kaukaiset kasvainten muodostumiseen arvioitiin

in vivo

kuten aikaisemmin on kuvattu [31]. Lyhyesti, PC-3-Yellow soluista, jotka ilmentävät stabiilisti RFP ja ilman MGAT1 knockdown, ruiskutettiin ortotooppisesti eturauhasissa of sublethally säteilytettyä (3,5 Gy) SCID hiirillä. Hiiriä, joihin injektoitiin kasvainsoluja ylläpidettiin 4 viikkoa injektion jälkeen, jolloin eläimet lopetettiin kautta niska sijoiltaan täydellinen tutkimus. Punainen fluoresoiva kasvaimia havaittiin kautta koko kehon kuvantamisen ja koko elimen kuvantaminen käyttäen Leica MZ FLIII loisteputki stereomikroskooppi, jossa on 100 W elohopea lamppu, 560/40 virityssuodattimen, ja 610 pitkän pass emissiosuotimen. Kuvat otettiin käyttäen Olympus DP70 digitaalikamera 0,8 x suurennus ja analysoitiin Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics). Yksi yhteinen päti tunnistaa ja mitata fluoresenssi kunkin elimen kuin määrä fluoresoivia täpliä kohti keuhkolohko. Hiiret saatiin in-house jalostusohjelmassa ja sijaitsee laminaarivirtaus- häkeissä standardoiduissa ympäristöolosuhteissa kanssa

mielinmäärin

pääsy ruokaan ja veteen. Kaikki kokeet hyväksynyt paikallisten institutionaalisten eettisten Review Board (University Health Network-Ontario Cancer Institute Animal Care ja käyttö komitea) ja tehtiin määräysten mukaisesti Kanadan neuvoston Animal Care. Kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen.

Tulokset ja keskustelu

MGAT1 shRNAi vähentää N-glykaani aluevaltaus, solujen vaeltamiseen ja invaasiota

arvioimiseksi solun autonominen vaikutukset MGAT1 ehtyminen pahanlaatuisiin solujen kasvua ja invaasiota, HeLa ihmisen kohdunkaulan syövän soluja infektoitiin lentiviruksen shRNA vektorit kohdistuvat MGAT1 tai säätelysekvenssejä, ja vakaa solupopulaatioiden valittiin puromysiinin kanssa. Target pudotus käyttämällä kahta itsenäistä shRNA sekvenssit varmistettiin qRT-PCR: llä (kuvio 2A). shRNA1 ja shRNA2 vähensi myös MGAT1 entsymaattinen aktiivisuus ja vähentynyt L-PHA solun pinnan värjäytymisen suhteessa ehtyminen mRNA: ta ja entsyymin aktiivisuus (kuvio 2B, C). L-PHA sitoutuu tuotteisiin alas-virta MGAT1, The β1,6GlcNAc tri- ja tetra haarautuneita N-glykaanien [32]. MGAT1 pudotus ei muuttanut solujen elinkelpoisuutta ja jakaantumista (kuvio 2D ja tietoja ei näytetty).

A) HeLa-solut infektoitiin lentivirusvektoreita kohdistaminen MGAT1 (shRNA1 tai shRNA2) tai kontrolli shRNA sekvenssit. Vakaa solupopulaatioita valittiin lisäämällä puromysiiniä (1 ug /ml). A) MGAT1 mRNA mitattiin qRT-PCR, B) MGAT1 entsyymin aktiivisuus, C) L-PHA reaktiivisen pinnan N-glykaanien Array Scan mikroskoopilla, D) leviämisen yli 4 päivää Data edustaa keskiarvoa ± SD suhteessa mRNA: n suhteen säätelysekvenssi (n = 3 itsenäistä koetta suoritettiin kolmena kappaleena).

vaikutusten arvioimiseksi MGAT1 shRNA2 knockdown HeLa solujen vaeltamiseen ja invaasiota, solut ympättiin kammioihin huokoisia suodattimia seerumittomassa medium, ja 10% FBS pantiin alempaan kammioon kuin chemo-houkutinta. Solumigraation pohjaan kammioon mitattiin 48 tuntia myöhemmin. Vastaavat tutkimukset suoritettiin käyttäen Matrigel päällystettyjä suodattimia mitata soluinvaasiota vaikka este. Knockdovvn MGAT1 laski Solujen migraation ja invaasion, suhteessa MGAT1 ehtymisen (kuvio 3A, 3B). Reitti estyy yhden askeleen alavirtaan MGAT1, on α-mannosidaasi II, käyttäen swainsoniini inhiboi myös invaasio, kuten aiemmin on raportoitu [33], [34]. Swainsoniinia hoito yksinään esti muuttoliike ja invaasio, mutta vähemmässä määrin kuin shRNA2. Tämä saattaa johtua siitä, että paralogi α-mannosidaasin IIx, joka on vähemmän herkkä swainsoniini. Tärkeää on, swainsoniini ollut ylimääräisiä vaikutuksia MGAT1 shRNA2 soluissa, mikä viittaa siihen, että optimaalinen tukahduttaminen maahanmuutto- ja invaasion kohdistamalla haarautuminen reitin havaitaan -70% ehtyminen MGAT1 (kuvio 3C, 3D).

A) HeLa solut maljattiin kammioihin 8 um huokosia ja 10% FBS: ää käytettiin kemoattraktantti. B) HeLa-solut maljattiin invaasio kammioihin kanssa Matrigeliä. 48 tunnin kuluttua solut, jotka olivat vaeltaneet huokosten läpi kiinnitettiin, värjättiin ja laskettiin automaattisesti. C) muuttoliike ja D) invaasio määrityksiä tai ilman esikäsittelyä varten 72 h 2 uM swainsoniini (SW) varten 72 tuntia ennen. Keskimääräinen lukumäärä siirtynyt solujen ± SD 3 itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena piirrettiin. (E) Solumorfologia värjäämällä fosfo-paksilliini ja TRITC konjugoitua phalloidin F-aktiini, joka on esitetty yhdistetyn kuvan.

Cell siirtymänopeuksien osittain riippuvaisia ​​α5β1 integriinireseptoriantagonisteja yhteyksiä kasvualusta fibronektiinin , jotka stimuloivat paikallisia tarttumista signalointi, liikevaihdon ja käyttövoima [35]. Haarautunut N-glykaanien tuotteet MGAT5 ovat läsnä α5β1, muun muassa reseptoreihin ja solun pinnan proteiinien, ja on osoitettu edistävän α5β1 aktivointi, merkinanto-, ja kasvaimen solumigraatio [19]. Integriinin aktivaatio johtaa fosforylaatioon paksilliini mukaan FAK ja Src, joka johtaa F-aktiini remodeling ja soluliikkuvuus [36]. HeLa soluja MGAT1 Knockdown, F-aktiini stressi kuidut olivat halkaisijaltaan pienempi, vähemmän yhtenevät solun ennusteisiin, ja taipumus rajoittaa solu- (kuvio 3E). Värjäys p-paksilliini paljasti pienempi ja klustereita reunalla solun ennusteita. Sitä vastoin kontrolli HeLa-solut oli näkyvä ja pitkä stressi kuituja, jotka työntyvät valejalka päätyen suurempia fosfo-paksilliini värjäys paikallisessa tarttumisessa, ominaisia ​​enemmän liikkuvia fenotyyppi kuin MGAT1 pudotus soluja.

MGAT1 pudotus pienenee kasvaimen kasvua ja etäpesäke

in vivo

vaikutusten arvioimiseksi MGAT1 knockdown eläinmallissa syövän etäpesäkkeiden, käytimme ihmisen PC-3-Yellow eturauhasen syöpäsolujen, vakiintunut ksenograftimallissa. PC-3-Yellow-solut infektoitiin lentivirus sisältävät MGAT1 shRNA2 tai säätelysekvenssejä, ja vakaa solupopulaatiot valittiin kuten edellä. MGAT1 mRNA, entsyymiaktiivisuus, ja solun pinnan haaroittuminen olivat kaikki vähenevät -70% (kuva 4A-C). MGAT1 Knockdown laski sekä solujen kulkeutumista ja solujen invaasiota in vitro ja in vivo mallissa (kuvio 4D, E). MGAT1 pudotus ei muuttanut kasvun ja elinkelpoisuuden PC-3-Yellow-soluja (tietoja ei esitetty). Siten

in vitro

fenotyypit olivat hämmästyttävän samankaltaisia ​​vaikutuksia MGAT1 Knockdown HeLa-soluissa. Vaikutusten arvioimiseksi on MGAT1 Knockdown kasvainten etäpesäkkeitä, ohjaus tai MGAT1 pudotus PC-3-Yellow eturauhassyövän solut ruiskutettiin ortotooppisesti eturauhasen rauhaset Saharan kuolettavasti säteilytettyä SCID-hiirten (n = 15 per ryhmä). Neljä viikkoa injektion jälkeen, hiiret tapettiin, ja kaukana kasvaimen muodostumista elinten kuvioitiin fluoresenssimikroskopialla. Kasvaimet kehitetty eturauhasen kaikkien hiirten ruiskutetaan MGAT1 Knockdown ja ohjaus RFP-leimattu PC-3-Yellow soluissa. Hiirillä injektoitiin kontrolli solujen kasvaimen muodostumisen havaittiin kliinisesti merkittävää sivustoja etäpesäkkeitä, kuten keuhko-, imusolmukkeiden ja maksan. Kuitenkin kasvainten tilavuus pienennettiin ja vähemmän etäinen keuhkoetäpesäkkeet havaittiin hiirillä ruiskutetaan MGAT1 pudotus soluja (kuvio 4F, G). Kaiken kaikkiaan enemmän hiiristä MGAT1 knockdown ryhmä olivat vapaita etäpesäkkeiden. Siten yhdessä, MGAT1 knockdown estää kaukainen kasvainten muodostumista

in vivo

.

PC-3-Yellow solujen MGAT1-shRNA2 tai ohjaus shRNA sekvenssit arvioitiin A) MGAT1-mRNA-tasojen qRT-PCR: llä. B) MGAT1 entsyymin aktiivisuus, C) L-PHA reaktiivisen pinnan N-glykaanien Arrayscan mikroskoopilla, D) invaasio kautta Matrigel este ja muuttoliike (E) käyttäen xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. Data edustaa keskiarvoa ± SD solun indeksi (3 riippumatonta kokeiluja nelinkertaisesti). (F) Kasvaimen koon ja (G) etäpesäke hiirillä ruiskutetaan PC-3-Yellow solujen MGAT1-shRNA2 tai ohjaus shRNA sekvenssit. Hiiret injektoitiin ortotooppisesti, 0,5 x 10

6 solua per hiiri, eturauhaseen osa-kuolettavasti säteilytettyä SCID hiirillä. Neljä viikkoa injektion jälkeen, hiiret tapettiin ja niiden elimet kuvattiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia. Numerot etäpesäkenystyröiden kaikissa viidessä lohkoa keuhkojen kvantifioitiin käyttäen kuva-analyysi-ohjelmisto. Jokainen piste edustaa yhtä hiirtä.

Yhteenvetona -70% MGAT1 pudotus tukahduttaa N-glykaanin haaroittumista ja invasiivisen fenotyypin HeLa ja PC-3-Yellow soluissa. Tärkeää on, MGAT1 pudotus vähentynyt kasvun ja etäpesäkkeiden PC-3-Yellow soluista ortotooppisten eturauhassyövän ksenograftimallissa. Jokainen N-glykaanin haarat on epitoopin galectins, ja yhdessä ne voi tukea kasvua signalointia solun pinnalla. Korvaus ja pelastaminen galektiini hila epitooppiennustamisen kuljetus oksat on havaittu Mgat5

– /- syöpäsolut [13] ja Mgat4

– /- hiiren kudoksista [37]. Onkogeeninen signalointi syöpäsoluissa up-säätelee transkriptiota ja toimintaa MGAT4 ja Mgat5 [4], [5], [38] sekä heksosamiinin koulutusjakson välituotteina [23], mutta kohdistaminen MGAT1 vältetään nämä mekanismit pelastus. Siksi MGAT1 voi olla käyttökelpoisia kohteita syövän hoidossa estää etäpesäkkeiden sekä kasvaimen kasvua.