Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tetraploidi (4N) soluja pidetään tärkeänä syövän, koska ne voivat lisääntynyttä tuumorigeenisyyteen, vastustuskykyä perinteisiin hoitoihin, ja ovat uskotaan olevan esiasteita koko kromosomin aneuploidia-. Sen vuoksi on tärkeää määrittää, miten tetraploidi syöpäsoluja syntyy, ja miten ne kohdistetaan. P53 on tuumorisuppressoriproteiinia ja avainsäätelijä tetraploidy. Osana ”tetraploidy tarkastuspiste”, p53 inhiboi tetraploidi soluproliferaatiota edistämällä G1-pysähtymisen alkavaa tetraploidi soluissa (kutsutaan tetraploidi G1 pidätys). Nutlin-3a on prekliinisissä huume, joka stabiloi p53 estämällä vuorovaikutusta p53: n ja MDM2. Esillä olevassa tutkimuksessa, Nutlin-3a edistää p53-riippuvaisen tetraploidisista G1 pysähtymisen kaksi diploidi klooneja HCT116-koolonisyöpäsolulinja. Molemmat kloonit tehtiin endoreduplikaatio jälkeen Nutlin poistamisen, mikä aiheuttaa stabiilin tetraploidisista kloonia, jotka osoittivat lisääntyneen resistenssin ionisoivan säteilyn (IR) ja sisplatiinia (CP) aiheuttaman apoptoosin verrattuna niiden diploidinen esiasteita. Nämä havainnot osoittavat, että ohimenevä p53 aktivaatio Nutlin voi edistää tetraploidisista solujen muodostumista diploidinen esiasteista, ja tuloksena tetraploidinen solut ovat hoidon (IR /CP) resistenttejä. Tärkeää on, että tetraploidi kloonit valitun jälkeen Nutlin hoidon ilmaistuna noin kaksi kertaa niin paljon

P53

ja

MDM2

mRNA kuin diploidinen esiasteita ilmaistuna noin kaksi kertaa niin monta p53-MDM2-proteiinin kompleksit (co-immunosaostus) , ja olivat alttiimpia p53-riippuvaista apoptoosia ja kasvun pysähtymisen aiheuttama Nutlin. Näiden tulosten perusteella ehdotamme, että p53: lla uusi rooleja sekä muodostumista ja kohdistaminen tetraploidien soluja. Tarkemmin, ehdotamme, että 1) ohimenevä p53 aktivointi voi edistää tetraploidi-G1 pidätys ja sen seurauksena, voi vahingossa edistää muodostumista hoidon vastustuskykyisten tetraploidiset soluihin, ja 2) hoitoa vastustuskykyisten tetraploidiset soluissa, nojalla, joilla on korkeammat

p53

-geenin kopioluvun ja ilmaista kaksi kertaa niin monta p53-MDM2 kompleksit, ovat herkempiä apoptoosin ja /tai kasvun pysähtymisen anti-cancer MDM2-antagonistit (esim Nutlin).

Citation: Davaadelger B, Shen H, Maki CG (2014) Novel teht P53 on Genesis ja kohdentaminen tetraploidi syöpäsoluja. PLoS ONE 9 (11): e110844. doi: 10,1371 /journal.pone.0110844

Editor: Andrei L. Gartel, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: Kesäkuu 27, 2014; Hyväksytty: 24 syyskuu 2014; Julkaistu: 07 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Davaadelger et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Institutes of Health Grant 1RO1CA137598-01A1 National Cancer Institute (NCI) (ja C.G.M.). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijä Carl Maki on PLoS One toimituksellisen hallituksen jäsenenä. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One Pääkirjoitus politiikan ja kriteerit.

Johdanto

Tetraploidi solut sisältävät kaksi kertaa normaali määrä DNA: n ja ovat harvinaisia ​​useimmissa normaaleissa kudoksissa. Kuitenkin tetraploidi solut ovat suhteellisen yleisiä syöpään ja uskotaan edistää kasvainten kehittymiseen, aneuploidian, ja hoito vastus [1]. Suora todiste Tuumorigeenisuustutkimuksissa tetraploidien solujen saatiin Fujiwara et al. [2], joka eristettiin binucleated, tetraploidi maitorauhasen epiteelisolut p53-null hiiret. Huomattavaa on, nämä solut olivat alttiimpia karsinogeeniksi aiheuttama muutos (soft-agar kasvu) kuin diploidinen kollegansa, ja tetraploidi solut muodostivat kasvaimia nude-hiirissä, kun taas diploidit solut eivät. Muut tutkimukset ovat sidoksissa tetraploidy säteilylle ja kemoterapian resistenssin. Esimerkiksi Castedo et al. [3], [4] eristettiin tetraploidiset ja diploidinen kloonit kahdesta ihmisen syöpäsolujen linjat villin tyypin p53. Tärkeää on, tetraploidi kloonit olivat resistenttejä säteilyä ja useita solunsalpaajiin verrattuna diploidinen kollegansa. Lopuksi on yhä enemmän todisteita siitä, että aneuploidi syöpäsolut syntyvät joko epäsymmetrinen jako tai progressiivinen kromosomi tappio tetraploidisista esiasteista. Varhainen todisteita tästä tuli tutkimuksista premaligni Barrettin ruokatorvi. Näissä tutkimuksissa ulkonäkö tetraploidien solujen korreloi p53 menetys ja edeltää brutto aneuploidian ja syövän syntymistä [5], [6]. Kaiken tetraploidi solut voivat olla korkeampia Tuumorigeenisuustutkimuksissa, on hoito ja säteilyä kestävä, ja olla esiasteita syöpä aneuploidia-. Siksi on tärkeää tunnistaa miten tetraploidiset solut syntyvät ja miten ne voidaan kohdistaa syövän hoitoon.

P53 on tuumorisuppressorina ja tärkeä säätelijä tetraploidy [7]. p53 pidetään vähäisenä MDM2, E3-ligaasi, joka sitoutuu p53 ja edistää sen hajoamista [8], [9]. DNA-vaurioita ja muut rasitukset häiritsevät p53-MDM2 sitova, mikä aiheuttaa p53 tasot lisäämiseksi. Lisääntynyt p53 pysäyttää leviämisen indusoimalla geenien ilmentymisen, jotka edistävät G1-pidätystä (

P21

) tai apoptoosin (

PUMA, NOXA, BAX

) [10]. Todisteet siitä, että p53 funktiota ”tetraploidy tarkastuspiste” saadaan suurimmaksi osaksi -tutkimukset mikrotubulusten estäjiä (MTIs), joka lohko solujen metafaasissa. Solut pidätti metafaasiin pitkäaikainen MTI altistus voi lopulta poistua mitoosin ja anna pseudo-G1 tilassa, kutsutaan tetraploidi G1 [11], [12]. Endoreduplikaatio viittaa tapaukseen, jossa nämä tetraploidi solut tulevat S-vaiheen ja jäljitellä niiden DNA, jotka aiheuttavat suuren ploidia solujen lisääminen päällekkäisyyksiä genomin (8N, 16N, 32N, jne). Soluja, joista puuttuu p53 /p21 ovat taipuvaisempia MTI aiheuttama endoreduplikaatio kuin villityypin soluihin [11] – [14]. Tämä tukee p53-p21 riippuvainen tetraploidy tarkistuspisteen joka estää S-vaiheen tulon 4N soluja.

Tetraploidi G1-pidätys on tyypillisesti ominaista ehtyminen G2 /M-proteiinien (esim Sykliinit A /B, cdc2) ja lisääntynyt ilmaus G1 pidätys proteiinien (esim P53, p21) 4 N soluissa [15] – [19]. DNA: ta vaurioittavat aineet esim. ionisoiva säteily (IR) aktivoida p53 ja pidätys solut G1 ja G2-vaiheissa. Kaksi Ensimmäiset raportit löytyi IR aiheutti p53 ja p21-riippuvaista ehtyminen cdc2, sykliini ja sykliini B mRNA ja proteiini [20], [21]. Yhdessä tapauksessa, ehtyminen näistä G2 /M markkereita samaan endoreduplikaatio 1-6 päivää käsittelyn jälkeen [21]. Nämä havainnot ehdotti, että p53-p21 aktivaation IR-käsitellyissä soluissa voisi edistää tetraploidi G1 pidätys seurasi myöhemmin endoreduplikaatio. Nutlin-3a (Nutlin) on prekliinisissä huume, joka stabiloi p53 estämällä p53-MDM2 sitova. Me kertoi, että Nutlin voisi edistää tetraploidi G1 pidätys useita p53 villityypin solulinjoilla, tunnettu ehtyminen G2 /M-proteiinien ja lisääntynyt p53 ja p21 4N soluissa [18], [19]. Kun Nutlin poisto, p53 ja p21 laski ja joissakin tapauksissa solut koki endoreduplikaatio [18]. p53 ja p21 olivat tarpeen sekä tetraploidien G1 pidätyksen ja endoreduplikaatio jälkeen Nutlin poiston. Tärkeää on, vakaa tetraploidi kloonit voitiin eristää Nutlin käsitellyistä soluista, ja nämä tetraploidi kloonit olivat resistenttejä IR ja sisplatiinin (CP) aiheuttaman apoptoosin [19]. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, p53-p21 aktivoitiin Nutlin voivat edistää tetraploidi G1-pidätystä ja, kun p53 tasot vähennys (Nutlin poisto) solut voivat jäljitellä heidän DNA (endoreduplikaatio) ja aiheuttaa tetraploidi soluja, jotka ovat IR ja CP-resistenttejä. Kuitenkin varoitus näiden aiempien tutkimusten on, että ne tehtiin syöpäsolulinjoissa, joka voi sisältää seosta diploideja ja tetraploideja soluja, joista jotkut voivat olla luontaisesti IR /CP-resistenttejä. On mahdollista, että olimme eristettiin IR /CP kestävä tetraploidi klooneja, jotka olivat jo läsnä väestöstä, tai että tetraploidien kloonit me eristetty olivat peräisin diploidisoluissa jotka olivat jo IR /CP-resistenttejä. Siten se jäi epäselväksi, ohimenevä p53 aktivaation Nutlin voisi muuntaa diploidisoluissa osaksi tetraploidiset soluihin, ja jos kyllä, onko tuloksena tetraploidien kloonien näyttää lisääntyneen resistenssin hoidon indusoiman apoptoosin. Nykyinen tutkimus aloitettiin näiden kysymysten ja testata sitä mahdollisuutta, että tetraploidien syöpäsolut voivat olla erityisen herkkiä MDM2-antagonistit.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

p53 villityypin ja p53-null HCT116-soluja (kuvattu [11], saatiin tri Bert Vogelstein (John Hopkins University). D3 ja D8 on kuvattu [22] ja ne ovat diploideja kloonit eristettiin p53 villityypin HCT116-solut rajoittavan laimennuksen. soluja kasvatettiin McCoyn 5A-väliaine, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä (100 U /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml). solut maljattiin 24 tuntia ennen kuin se käsitelty Nutlin-3 (10 umol /l; Sigma), säteilytys (10 Gy), sisplatiinia (Bedford Laboratory), tai kuten.

Immunoblottausmääritys

Koko solu-uutteet valmistettiin suspendoimalla solupelletit hajotuspuskuriin (150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40, 50 mM Tris, pH 7,5), SDS-PAGE ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (NEN Life Science Products). Vasta-aineita p21 (H-164), sykliini A (H-432), Geminin (FL-309), Cdk2- (M2) ja p53 (AB-6) olivat Santa Cruz Biotechnology; vasta-sykliini B1 (V152), cdc2 (POH1) ja Tyr-15 Phospho-cdc2 olivat Cell Signaling; vasta-MDM2 (2a10) oli Calbiochem. Vasta-aine sykliini E (HE-2) oli BD Pharmingen. Ensisijainen vasta-aineet havaittiin vuohen anti-hiiri (Pierce) tai vuohen anti-kani (Life Technologies) toissijainen vasta konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin käyttäen Clarity kemiluminesenssin (Bio-Rad).

Virtaussytometrianalyysi ja Live Cell Sorting

solusyklin analyysi, solut otettiin talteen ja kiinnitettiin 25% etanolilla yön yli. Sitten solut värjättiin propidiumjodidilla (25 ug /ml; Calbiochem). Virtaussytometria-analyysi tehtiin Gallios virtaussytometrillä (Beckman Coulter), ja analysoitiin CellQuest (Becton Dickinson) ja FlowJo 8,7 (Treestar, Inc). Jokaisesta näytteestä, 10000 tapahtumien kerättiin. Elävien solujen lajittelu, soluja inkuboitiin Hoechst 33342 (2 umol /l; Invitrogen) 90 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja sitten korjattu. Cell lajittelu suoritettiin perustuen DNA-pitoisuus käyttäen MoFlo-sytometrillä varustettu UV-eksitaatio laser. Lajitellut solut maljattiin alhaisella tiheydellä.

mRNA-analyysi

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) suoritettiin mittaamaan mRNA-tasot sykliini A2, sykliini-B1, cdc2, P21, Bax, Noxa, PUMA, P53R2, Actin soluissa, jotka olivat käsittelemättömiä tai käsitelty Nutlin, sisplatiini, tai IR kuten. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-reaktiosta ajettiin on 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster, CA) käyttäen SybrGreen PCR Master Mix, (Applied Biosystems, Foster City, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lämpövuorottelu suoritettiin lopputilavuudessa 20 ui, joka sisälsi 2 ui cDNA: ta ja 400 nmol /l alukkeita (alukkeita luetellaan taulukossa S1). Kaikki näytteet monistettiin kolmena kappaleena käyttäen seuraavaa syklin mukaisesti: 95 ° C 2 minuuttia, 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 55 ° C: ssa 60 sekunnin ajan. Fluoresenssi mitattiin jokaisen jakson ja mRNA-tasot normalisoitiin käyttäen aktiini arvoja kaikissa näytteissä. Yksi huippu saatiin tavoitteita, tukee reaktion spesifisyys.

Metaphase levitteet

Solun inkuboitiin Kolkisiinia (50 ng /ul) (Sigma-Aldrich) tunnin ajan 37 ° C, otettiin talteen ja pestiin PBS: llä ja hypotoninen liuos (2 osaa 0,075 M KCI ja 1 osa 0,7% Na-sitraattia). Sitten solut kiinnitettiin kiinnitysainetta (3 osa metanolia ja 1 osa etikkahappoa) ja levitetään liukumäki. Leviää tutkittiin faasikontrastimikroskooppia.

FISH Analysis

Solut kerättiin ja pestiin PBS: llä. Inkuboidaan sitten hypotonisella liuoksella (2 osaa 0,075 M KCI ja 1 osa 0,7% Na-sitraattia) ja 20 min 37 ° C: ssa. Sitten solut kiinnitettiin kiinnitysainetta (3 osa metanolia ja 1 osa etikkahappoa). Objektilasit valmistettiin ja sitä seisotettiin 55 ° C: ssa 3 minuuttia on thermobrite. Levyjä inkuboitiin 0,05%: Pepsiini (Fisher # P53-100) 16 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja sitten pestiin PBS: llä ja dehydratoitiin 70%, 85% ja 100% etanolissa 1 minuutti jokaisessa huoneenlämpötilassa. Sitten koetin Vysis LSI TP53 SpectrumOrange /CEP 17 SpectrumGreen (Abbott Molecular Inc # 01N17-020) lisättiin hybridisoitua 73 ° C: ssa 5 minuutin ajan ja 37 ° 18 tuntia. Sitten levyt pestiin SSC-puskurilla (Gibco # 15557-044), 0,5% NP-40 (Fisher # P53-100) 2 min 73 ° C: ssa ja vastavärjättiin DAPI II (Abbott Molecular Inc # 30-804818). Objektilasit tutkittiin fluoresoivalla mikroskoopilla.

klonogeeninen Pitoisuus.

Solut 24 tuntia ennen kuin käsittelemätön tai käsitelty CP, IR tai Nutlin vuonna sopivia laimennoksia muodostaa 50-100 pesäkkeitä. 2-3 viikon kuluessa pesäkkeet kiinnitetty formaldehydillä ja värjättiin 0,05% kristalliviolettia. Pesäkkeet laskettiin ja normalisoitu kanssa maljaustehokkuus käsittelemättömien solujen.

Tulokset

Nutlin edistää tetraploidi G1-pysähtymisen diploidisoluissa

halusi kysyä ohimenevä p53 aktivaatio Nutlin voisi edistää tetraploidi solujen muodostumista diploidinen esiasteista ja jos kyllä, onko tuloksena tetraploidien solut olisi kasvanut vastustuskyky hoidon indusoiman apoptoosin. HCT116 on ihmisen paksusuolen syövän solulinja, joka ekspressoi villin tyypin p53. Edellisessä tutkimuksessa, HCT116 maljattiin yhden solun tiheyteen ja kymmenestä erillisestä diploidinen kloonit eristettiin (kloonit nimetty D1-D10), joka vaihteli niiden suhteellinen herkkyys sisplatiini (CP) aiheuttaman apoptoosin [22]. Valitsimme diploidi klooneja D3 ja D8 nykyisen tutkimuksen, koska nämä kloonit osoittivat suhteellisen suuri herkkyys CP edellisessä tutkimuksessa. D3 ja D8 käsitellään Nutlin 24 tunnin kertynyt 2N ja 4N DNA-pitoisuus (kuvio 1A). Immunoblotit osoittivat Nutlin kohtelu sekä klooneja aiheuttama täydellinen tai lähes täydellinen ehtyminen sykliini, sykliini-B1, ja Tyr-15 fosforyloidun cdc2 (pCDC2), ja osittainen ehtyminen koko cdc2 proteiinin (kuvio 1 B). Sykliini A, sykliini-B1, ja cdc2 mRNA myös köyhdytettyä Nutlin käsitellyissä soluissa, mikä viittaa alentunut taso näistä G2 /M-proteiinien voi johtua vähentynyt transkriptio (kuvio 1 C). Sen sijaan, p53 ja p21-proteiinin tasot lisääntyi merkittävästi Nutlin jälkeen (kuvio 1 B). Aiemmat tutkimukset osoittivat, p53 ja p21 olivat kasvoi sekä 2N ja 4N Nutlin pidätettiin soluihin [18]. Siten Nutlin aiheuttaa ehtyminen G2 /M-proteiinien ja lisääntynyt ilmentyminen G1-pidätystä proteiineja (p53, p21) on 4N pidätetty soluja, joka ilmaisee tetraploidi G1 pidätys. Tärkeää on, Nutlin ollut vaikutusta sykliini, sykliini-B1, pCDC2, ja yhteensä cdc2 tasolla p53-null HCT116-soluissa (kuvio 1 B), ja ei aiheuttanut 2N ja 4N pidätys näissä soluissa (kuvio 1A), mikä osoittaa tetraploidi G1 pidätyksen aiheuttama Nutlin on p53-riippuvaista. Olemme myös tarkkailla tasoja geminin, DNA replikaatio estäjä, joka puuttuu G1 ja kerääntyy S, G2, ja M-vaiheen [23]. Geminin oli uhanalainen Nutlin D3 ja D8 soluja, sopusoinnussa solujen ollessa G1-pidätettiin (Kuva 1B). Cdk2 tasot eivät muuttuneet Nutlin, vaikka tasot G1-vaiheen sykliini proteiinien sykliini D1 ja sykliini E korotettiin, sopusoinnussa myös kennojen pidätetty G1-vaiheessa. Kaiken kaikkiaan tulokset osoittavat, että Nutlin aiheuttaa p53-riippuvaisen tetraploidi G1-pysähtymisen diploidi HCT116 klooneja D3 ja D8.

A) HCT116 diploidinen klooneja D3 ja D8, ja HCT116 jotka ilmentävät villityyppistä p53 (p53 + /+) tai ovat p53-null (p53 – /-) olivat käsittelemättömiä tai käsiteltiin Nutlin (pähkinä 10 uM) 24 tunnin ajan, ja solusyklin profiili määritettiin virtaussytometrialla. B) ilmentäminen ilmoitettu proteiinien seurattiin immunoblot soluissa käsittelemättömän tai käsitelty Nutlin (pähkinä 10 uM) 24 tunnin ajan. C) mRNA-tasot ilmoitetaan tekijät käsittelemättömissä soluissa tai soluissa, joita käsiteltiin Nutlin (pähkinä 10 uM) 24 tunnin ajan määritettiin qRT-PCR: llä.

Transient Nutlin hoito edistää muodostumista hoidon resistenttien tetrapolid kloonien alkaen diploidi prekursorisoluista

aiemmin osoitti 4N pidätettiin solut voidaan aloittaa uudelleen DNA-synteesin jälkeen Nutlin poiston ja jäljitellä niiden DNA ilman välissä mitoosi jako, prosessi tunnetaan endoreduplikaatio [18], [19]. Kysyä D3 ja D8 tehdään endoreduplikaatio jälkeen Nutlin poistamisen solut Nutlin käsiteltiin 24 tunnin ajan, minkä jälkeen Nutlin poisto eri ajankohtina. Virtaussytometria tarkkailuun käytettiin solukierron profiilit ja immunoblot käyttää seuraamaan proteiinitasoja jälkeen Nutlin poisto (kuvio 2). D3 ja D8 kertynyt 2 N ja 4N DNA-pitoisuus, kun Nutlin hoidettiin 24 tuntia, kuten kuvassa 1. Molemmat kloonit tehtiin endoreduplikaatio jälkeen Nutlin poiston, osoituksena korostunut syntyminen 4N soluja 16 h kuluttua Nutlin poiston ja niiden ohimenevä kertymisestä 8N huippu. Syntyminen 4N soluja ja niiden kertymistä käytettäessä 8N huippu osoittaa 4N solujen aloittamista DNA-synteesin, replikoituvat DNA, ja syöttämällä mitoosin. Sykliini A2, sykliini-B1, ja cdc2 tasot palasivat 16 h kuluttua Nutlin poiston, sopusoinnussa solujen olleen enimmäkseen G2 /M tänä ajankohtana. Sykliini E-CDK2 aktiivisuuden uskotaan edistävän tai vaaditaan DNA-synteesin aloittamista [24], [25], ja p21 sitoutuu ja estää sykliini E-CDK2 toimintaa [26]. Erityisesti syntyminen 4N, DNA jäljittelevän solut 12-16 tunnin kuluttua Nutlin poiston samaan aikaan jyrkkä lasku p21-proteiinin tasoa. Me spekuloida alentuneesta p21 jälkeen Nutlin poistamisen sallittua aktivointi sykliini E-CDK2 komplekseja, jotka voivat sitten ajaa DNA-synteesiä.

A) Diploidi HCT116 klooneja D3 ja D8 olivat käsittelemättömiä (NT) tai altistetaan Nutlin (pähkinä 10 uM) 24 tunnin ajan, minkä jälkeen Nutlin poisto. Solut kerättiin osoitettuina aikoina, kun Nutlin poisto. Kiinteä solut värjättiin propidiumjodidilla (25 ug /ml) ja sille suoritettiin virtaussytometria-analyysi. B) Soluja käsittelemättömiä (NT) tai altistetaan Nutlin (pähkinä 10 uM) 24 tunnin ajan, minkä jälkeen Nutlin poisto. Solulysaatit kerättiin osoitettuina ajankohtina ja analysoitiin immunoblottauksella mainituilla vasta-aineilla. Aktiini oli latauskontrollina.

P-Cdc2

, fosfori-Cdc2 (Tyr-15).

Seuraavaksi halusimme kysyä endoreduplikaatio jälkeen Nutlin poiston voi johtaa vakaan tetraploidiset klooneja, ja jos kyllä , onko tuloksena tetraploidien kloonit olisivat resistenttejä CP tai ionisoivan säteilyn (IR) aiheuttaman apoptoosin. Tätä varten, D3 ja D8 oli Nutlin käsiteltiin 24 tunnin ajan, jota seuraa Nutlin poistamalla vielä 16 tuntia. Sitten solut leimattiin elävien solujen DNA tahra Hoechst 33342. 2N ja 8N solut eristettiin virtaussytometrialla ja maljattiin alhaisella tiheydellä eristämiseksi Yksittäisten kloonien (kuvio 3A). Kaikkiaan 11 D3 kloonien ja 12 D8 klooneja saatiin eristyksissä 8N populaatioiden jälkeen syntyneistä Nutlin poiston. 7 11 D3-kloonit (63%) ja 8 12 D8 klooneista (66%) kasvoi tetraploidisia 4N soluja. Tämän osoituksena olivat: 1) G1 huippu näiden kloonien päällekkäin G2 /M huippu D3 ja D8 diploidisoluissa (kuvio 3B), 2) kromosomi laskeminen metafaasivaiheeseen levitteitä, jotka tukivat tetraploidien omaavien kloonien kahdesti DNA sisältöä diploidi D3 ja D8 esiasteita (kuvio 3C), ja 3) FISH-analyysi käyttäen

P53

ja kromosomi 17-koettimia. Tämä FISH-analyysi osoitti tetraploidi klooneja on 4 kappaletta kromosomi 17 ja

P53

, kun taas diploidinen D3 ja D8 soluissa on 2 kappaletta kromosomi 17 ja

P53

(kuvio 3D). Lopuksi testasimme, onko tetraploidisista klooneja, jotka ovat syntyneet sen jälkeen, kun Nutlin hoidon olivat resistenttejä CP ja IR: n indusoiman apoptoosin yli diploidi kanssa. Ensimmäinen, 5 tetraploidi klooneista ja 5 diploidinen klooneista, jotka eristettiin Nutlin käsiteltiin D3 tai D8 solut altistettiin CP (20 uM) tai IR (10 Gy), ja apoptoosia seurataan 48 tuntia myöhemmin osa-G1 DNA-pitoisuus. Kuten kuviossa 4A on esitetty, tetraploidi kloonien ryhmässä oli merkittävästi vastustuskykyisempi CP ja IR: n indusoiman apoptoosin yli emosoluista ja diploideja eristettyjen kloonien jälkeen Nutlin hoidon. Yksittäiset tetraploidi klooneja (T3 ja TD6) olivat myös resistenttejä CP ja IR: n indusoiman apoptoosin verrattuna diploidi kollegansa (D3 ja D81B), osoituksena alempi prosenttia Saharan G1 soluihin jälkeen CP ja IR käsittely (kuvio 4B) ja alempi lauseke of pilkkoa PARP ja halkaistut kaspaasi-3 (kuvio 4D). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​raportteja meille ja muille, että osoitti tetraploidi solut voivat olla resistenttejä näille hoidoille [3], [19]. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että p53 ja p21 voi myötävaikuttaa CP ja IR-resistenssi HCT116 ja muiden solujen, todennäköisesti indusoimalla tai pakottavat solusykliä pidätys, joka estää CP tai IR-käsiteltyjen solujen lisääntyvissä ja pyrkimällä hajauttamaan [27] – [31]. Erityisesti löysimme p53, MDM2, ja p21 proteiinit indusoitiin vastaavia tasoja CP ja IR-käsiteltyjen diploidinen ja tetraploidi klooneja (kuvio 4C), ja että p53: een reagoiva solukierron pysähtymisen geenit (

P21

), DNA korjaus geenit (

P53R2

), ja apoptoottiset geenit (

PUMA, Noxa, Bax

), myös aiheuttama vertailukelpoisemman CP ja IR-käsiteltyjen diploidinen ja tetraploidi klooneja (kuvio 4E). Nämä tulokset viittaavat siihen, CP ja IR-vastus tetraploidien klooneja ei liity lisääntynyt p53 tasoa tai aktiivisuutta. Kaikkiaan tulokset osoittavat ohimenevä p53 aktivaation Nutlin voivat edistää tetraploidiset G1 pidätyksen ja endoreduplikaatio jälkeen Nutlin poiston diploidi esiastesolujen, mikä johtaa sukupolven terapian (CP /IR) kestävät tetraploidi klooneja.

) Näkyy on menettely eristää diploidinen ja tetraploidi kloonia soluihin väliaikaisesti alttiiksi Nutlin. D3 ja D8 olivat käsittelemättömiä (NT) tai käsiteltiin 10 uM Nutlin (pähkinä) 24 tunnin ajan, minkä jälkeen Nutlin poistamalla vielä 16 tuntia. Sitten solut elää Hoechstilla 33342 (5 ug /ml). Cell lajittelu suoritettiin MoFlo-sytometrillä varustettu UV-virityksen aallonpituudella laser. Lajitellut 2N ja 8N solut alhaisella tiheydellä normaalissa väliaineessa (miinus Nutlin) ja yksittäiset kloonit eristettiin. B)

Top, vertailusta DNA välillä D3 ja edustava tetraploidi klooni eristettiin D3.

Bottom

, vertailu DNA välillä edustajan diploidi klooni (D81B) eristetty D8 soluista, ja edustava tetraploidi klooni (TD6) eristetty D8 soluista. C) edustaja metafaasissa levisi diploidisista D3 soluista ja tetraploidi T3 solut. Numero oikeassa alareunassa ilmaisee kromosomien lukumäärän laskettiin. D) FISH-analyysi, jossa kromosomi 17 (Chr 17) ja p53-koettimia näyttää tetraploidi (T3) solut sisältävät 4 kappaletta p53 ja Chr 17, kun taas diploidi (D3) solut sisältävät 2 kopiota p53 ja Chr 17.

A) viisi diploidisia klooneja eristettiin Nutlin käsiteltyjen D3-solut (D3 diploidi) ja D8 soluja (D8 diploidi), ja viisi tetraploidi kloonit eristettiin Nutlin käsiteltyjen D3-solut (D3 tetraploidi) ja D8 soluja (D8 tetraploidi) olivat käsittelemätön (NT) tai altistetaan CP (20 uM) tai IR (10 Gy) 48 tunnin ajan. Prosenttiosuus solujen osa-G1 DNA määritettiin. Näkyy ovat keskiarvo tulokset kolmesta eri kokeesta,

baareja

, Keskivirhe (SE). * Merkitys arvo (P 0,05). B) Tetraploidi klooneja (T3, TD6) ja niiden diploideja kollegansa (D3, D81B) olivat käsittelemättömiä (NT) tai altistetaan CP (20 uM) tai IR (10 Gy) 72 tuntia. Prosenttiosuus solujen sub-G1-DNA (propidiumjodidivärjäys) määritettiin. Näkyy ovat keskiarvo tulokset kolmesta eri kokeesta,

baareja

, Keskivirhe (SE). * Merkitys arvo (P 0,05). C) Ilmoitettu diploidinen ja tetraploidi kloonit olivat käsittelemättömiä (NT) tai altistetaan CP (20 uM) tai IR (10 Gy) 24 tuntia. p53, p21, ja MDM2-proteiinin tasot määritettiin immunoblottauksella ja määrällisten. Numerot kertovat kunkin tason proteiinia. Aktiini käytettiin latauskontrollina. D) Ilmoitettu diploidinen ja tetraploidi kloonit käsittelemättä (NT) tai altistetaan CP (20 uM) tai IR (10 Gy) 48 tunnin ajan. Pilkotaan PARP ja kaspaasi-3-proteiinin tasot määritettiin immunoblottauksella ja määrällisesti suhteessa käsittelemättömään. E) qRT-PCR: ää käytettiin määrittämään mRNA-tasot ilmoitetaan geenien diploidi (D3, D81B) ja tetraploideja (T3, TD6) klooneja, jotka olivat joko käsittelemättömiä (NT) tai altistetaan CP (20 uM) tai IR (10 Gy ) 24 tunnin ajan. Taso kunkin mRNA transkriptin käsittelemättömissä diploidi klooneja (D3 NT, D81B NT) katsottiin ”1.0”, ja kaikki muut arvot piirretään suhteessa siihen.

Tetraploidi kloonit ovat alttiimpia p53- riippuvaista apoptoosia ja kasvun pysähtymisen aiheuttama Nutlin

Se oli hieman yllättävää, että p53 indusoitiin vertailukelpoisella CP ja IR diploidisista ja tetraploidiset klooneja, huolimatta siitä, että tetraploidien kloonit satama kaksi kertaa enemmän kopioita

P53

geeni (FISH, kuvio 3D). Tämä osoittaa tason, jolle p53 aiheutetaan CP ja IR ei riipu

P53

kopioiden määrä, vaan sen sijaan voivat rajoittaa muut tekijät, ehkä määrää vaurioituneen DNA: n tai aktivoitumisen taso stressin aiheuttama kinaasit että vakauttaa p53. Olemme kuitenkin spekuloitu mille tasolle p53 indusoi MDM2-antagonistit (esim Nutlin) voi riippua

P53

kopiomäärä, ja että tetraploidi solut voivat siis ilmaista korkeampia p53 tasoja vastauksena Nutlin ja olla hyper- herkkä Nutlin-välitteistä kasvun esto. Tämän testaamiseksi diploidinen D3 ja D81B ja niiden tetraploidiset kollegansa T3 ja TD6 oli Nutlin käsiteltiin 24 tuntia. P53 ja MDM2-proteiinin tasot määritettiin immunoblottauksella ja mRNA-tasot määritettiin qRT-PCR: llä. Tulokset osoittivat, että tetraploidien klooneista koholla (~2X enemmän) p53 ja MDM2-mRNA: ta ja proteiinia kuin diploidinen klooneja, sekä basaalisesti (kuvio 5A) ja sen jälkeen 24 tunnin Nutlin hoidossa (kuviot 5C). Arvioida p53-MDM2 monimutkainen tasot, soluja käsiteltiin proteasomin estäjä MG132 estää p53 hajoamista, ja p53-MDM2 kompleksit määritetään samanaikainen immunosaostus. Nämä tutkimukset osoittivat tetraploidi klooneja oli enemmän p53-MDM2 kompleksit jälkeen MG132 hoidon kuin diploidinen klooneja, josta ne ovat syntyneet (kuvio 5B). Siten tetraploidi kloonit ilmentävät korkeampia tasoja p53 ja MDM2, ja olla korkeampia p53-MDM2 komplekseja. Me veikattu tetraploidi klooneja tämä johtaisi korkeampiin p53 tasoille jälkeen Nutlin hoidon, ja sen seurauksena kasvuun p53-riippuvaisten G1 pysähtymiseen ja apoptoosiin. Tämän testaamiseksi vertasimme suhteellinen herkkyys diploidinen ja tetraploidi kloonit Nutlin aiheuttaman solusyklin pysähtymisen tai apoptoosin. Ensimmäinen, diploidinen ja tetraploidi kloonit käsiteltiin kasvavia annoksia Nutlin (1,0-5,0 uM) 24 tunnin ajan. Lisääntynyt G1 /S-suhde, mikä ehtyminen S-vaiheessa olevien solujen ja kertymistä soluja G1-vaiheessa käytettiin mittana Nutlin aiheuttama G1 pidätys. Kuten kuviossa 6A tetraploidi kloonien ryhmässä olivat alttiimpia Nutlin aiheuttama G1 pidätys kuin emosoluista tai diploidi kloonia (G1 /S-suhde kasvoi enemmän yhä Nutlin annoksilla tetraploidisista klooneja kuin vanhempien tai diploidi kloonia). Yksittäiset tetraploidiset klooneja T3 ja TD6 olivat myös alttiimpia Nutlin aiheuttama G1 pidätys kuin diploidinen kollegansa D3 ja D81B (kuvio 6B). Kuten on esitetty kuviossa 6C, p53 ja p21-proteiinin indusoitiin korkeammalle tasolle ja alemman Nutlin annoksilla tetraploidien kloonien verrattuna diploidinen klooneja. Nämä tulokset osoittavat tetraploidien kloonit ilmentävät korkeampia tasoja p53 ja p21 jälkeen Nutlin hoidon ja ovat herkempiä kuin diploidi klooneja Nutlin aiheuttama G1 pidätys. Seuraava, diploidinen ja tetraploidi kloonit käsiteltiin suurempi Nutlin annos (20 uM) 72 tunnin ajan, ja apoptoosin seurataan prosenttia soluja sub-G1-DNA-sisältö ja /tai ekspressiota pilkotun PARP ja pilkottiin kaspaasi-3. Kuten on esitetty kuviossa 6D, tetraploidi kloonien ryhmässä olivat alttiimpia Nutlin indusoiman apoptoosin kuin diploidi klooneja. Yksittäiset tetraploidi klooneja (T3 ja TD6) olivat myös alttiimpia Nutlin indusoiman apoptoosin kuin diploidi kollegansa (D3 ja D81B), osoituksena korkeammalla prosentilla Saharan G1 soluihin jälkeen Nutlin hoidon ja lisääntyneen ilmentymisen pilkotun PARP ja halkaistut kaspaasi-3 ( Kuviot 6E ja F).

A) P53 ja MDM2 mRNA verrattiin käsittelemättömän tetraploidi klooneja (T3, TD6) ja niiden diploideja kollegansa (D3, D81B). B) Diploidi (D3, D81B) ja tetraploidinen (T3, TD6) kloonit olivat käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin proteasomin estäjä MG132 (10 uM) 8 tuntia.

Ylä

Tasot MDM2, p53, ja aktiini (kuormituksen valvonta) käsittelemättömän ja MG132 käsitellyt solut näytetään.

Ala

määrittämiseksi tasoja p53-MDM2 komplekseja diploideja ja tetraploideja soluja, proteiini lysaatit immunosaostettiin anti-p53-vasta-ainetta, jota seurasi immunoblottaus MDM2. C) Diploid (D3, D81B) ja tetraploideja (T3, TD6) kloonit olivat käsittelemättömiä tai käsiteltiin Nutlin (10 uM) 24 tunnin ajan. p53 ja MDM2-proteiinin tasot havaittiin immunoblottauksella ja kvantifioidaan Image-J-ohjelmisto. Suhteellinen määrä p53 ja MDM2-proteiinin käsittelemättömän diploidi kloonien annetaan arvo ”1,0”. Numerot kertovat kunkin tason proteiinia. Aktiini käytettiin latauskontrollina.

A) Viisi diploidisia klooneista, jotka eristettiin Nutlin käsiteltiin D3-solut (D3 Diploid) ja D8-soluja (D8 Diploid), ja viisi tetraploidi klooneista, jotka eristettiin Nutlin käsitellylle D3-soluja (D3 tetraploidi) ja D8-soluja (D8 tetraploidinen) olivat käsittelemättömiä tai käsiteltiin lisäämällä Nutlin (1,0-5,0 uM) 24 tunnin ajan. Prosentuaalinen G1 ja S-vaiheessa olevien solujen määritettiin virtaussytometrialla, ja kertainen muutos G1 /S-suhde on piirretty. Hoitamaton diploidi kloonit G1 /S-suhde sai arvon 1,0. Kuviossa esitetään keskiarvo kolmesta erillisestä kokeesta, +/- SE. B) Tetraploidi kloonia (T3, TD6) ja diploideja kollegansa (D3, D81B) olivat käsittelemättömiä tai käsiteltiin Nutlin (1,0-5,0 uM) 24 tunnin ajan. Taitteen muutos G1 /S-suhde on piirretty. Kuviossa esitetään keskiarvo kolmesta erillisestä kokeesta, +/- SE. C) Diploidi (D3, D81B) ja tetraploidinen (T3, TD6) kloonit olivat käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin lisäämällä Nutlin (1,0-5,0 uM) 24 tuntia. P53 ja p21-proteiinin tasojen määrä käyttäen Image-J-ohjelmisto. Numerot osoittavat suhteellisia tasoja kullekin proteiinille. P53 ja p21 tasot käsittelemättömien diploidi kloonien annetaan arvo ”1,0”. Aktiini käytettiin latauskontrollina. D) Viisi diploidisia klooneja eristettiin Nutlin käsiteltyjen D3-solut (D3 Diploidi) ja D8 soluja (D8 Diploidi), ja viisi tetraploidi kloonit eristettiin Nutlin käsiteltyjen D3-solut (D3 Tetraploidi) ja D8 soluja (D8 Tetraploidi) olivat käsittelemättömiä (NT) tai käsitelty Nutlin (20 uM) 72 tuntia ja apoptoosi määritettiin. Näkyy ovat keskiarvo tulokset kolmesta eri kokeesta,

baareja

, Keskivirhe (SE). * (P 0,05). E) edustaja diploidi (D3, D81B) ja tetraploideja (T3, TD6) kloonit olivat käsittelemättömiä (NT) tai käsiteltiin Nutlin (20 uM) 72 tunnin ajan. Prosenttiosuus solujen osa-G1-DNA-sisältö (propidiumjodidivärjäys) määritettiin. Näkyy ovat keskiarvo tulokset kolmesta eri kokeesta,

baareja

, Keskivirhe (SE). * Merkitys arvo (P 0,05).