Krooninen sairaus

tiivistelmä

itseuudistumisen potentiaalin syöpäsolun voidaan arvioida käyttämällä erityistä määrityksiä, joita ovat ksenotransplantaatio immuunivajepotilailla eläimille tai viljelemällä tarttumattomat seerumittomassa kantasolujen media (SCM). Kuitenkin myös solujen itseuudistumisen potentiaali todella edistävät taudin ei tiedetä. Täällä tutkimme Tuumorigeenisuustutkimuksissa ja kohtalo syöpäsolujen in vivo melanoomamalii. Tutkimme solulinjoja, jotka olivat peräisin samasta emolinjan: ei-metastaattinen solulinja (K1735 /16), joka on metastaattinen solulinja (K1735 /M4) ja solulinja, joka on valittu ei-tarttuva olosuhteissa (K1735 /16S ). Kaikki solulinjat osoittivat samanlaisia ​​leviämisen kinetiikkaa kun kasvatetaan viljelymaljoille. K1735 /16 soluja kasvatettiin pehmeässä agarissa tai suspensiona tarttumattomat olosuhteet eivät muodosta pesäkkeitä tai pallosia, kun taas muut solulinjat osoittivat näkyvä colonogenicity ja sferoidiviljelmiä muodostumista kapasiteettia. Käyttämällä pallo rajoittavan laimennuksen analyysi (SLDA) seerumittomassa media, K1735 /16S ja K1735 /M4 soluja kasvatettiin keskeytys kykenee muodostamaan pallosia myös matalilla taajuuksilla keskittymiä, toisin kuin K1735 /16-soluissa. Tuumorigeenisen potentiaalin solulinjoista määritettiin SCID-hiirissä käyttäen sisäistä polkuanturan injektioita. Kouraantuntuva kasvaimet näkyivät kaikissa hiirissä. Yhteisymmärryksessä

in vitro

tutkimuksissa K1735 /M4 solulinja, osoitti suurinta kasvua kinetiikkaan, jonka jälkeen K1735 /16S solulinjassa, kun taas K1735 /16 solulinjassa oli alhaisin kasvaimen kasvupotentiaalia (

P

0,001). Sitä vastoin, kun toistuvat kokeet syngeenisissä C3H /HeN-hiirissä K1735 /16 solulinja tuotettu makroskooppisten kasvainten 30-100 päivää injektion jälkeen, kun taas K1735 /M4 ja K1735 /16S johdettu Kasvainten spontaanisti 90-100% hiiristä . TUNEL-analyysi osoitti huomattavasti suuremman määrän apoptoottisia soluja K1735 /16S ja K1735 /M4 cell line-johdettu kasvainten verrattuna K1735 /16 kasvaimet (P 0,001). Mallit olemme tutkineet tässä esiin mahdollisuuden, että solut korkean tuumorigeenisia aktiivisuus voi olla immunogeenisiä ja siten ovat alttiimpia immuuni-asetuksen.

Citation: Krelin Y, Berkovich L, Amit M, Gil Z (2013) välisestä assosiaatiosta Tuumorigeenisuustutkimuksissa ja Fate of syöpäsoluja Syngeeninen Melanooma Model. PLoS ONE 8 (4): e62124. doi: 10,1371 /journal.pone.0062124

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 19 maaliskuu 2013; Julkaistu 23. huhtikuuta 2013

Copyright: © 2013 Krelin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Israel Science Foundation (numero 1680-1608 ja 482/11), Israelin Cancer Association (avustus lahjoittanut Ellen ja Emanuel Kronitz muistoksi tohtori Leon Kronitz numero 20090068), Israelin terveysministeriön (numero 3-7355 ), The Weizmann Institute – Sourasky Medical Center yhteinen Grant, Tel Aviv Sourasky Intramural GRANT, ICRF Barbara S. Goodman omistetun tutkimus urakehitystä palkinnon (2011-601-BGPC) ja apurahan USA-Israel binational Science Foundation (numero +2.007.312) ja ZG Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on monimutkainen sairaus, johon eroja kasvainten tai solujen tietyn kasvaimen, sekä vaihtelua potilaiden välillä. Spektrissä solujen tietyn kasvaimen, alapopulaatiot solut voivat olla fenotyyppisesti erilaisia ​​ja niillä on erilliset proliferaatiopotentiaali. Esimerkiksi syövän kantasoluja (CSC) malli viittaa siihen, että vain pieni solujen alapopulaatio on itseuudistuminen ja kasvainten muodostumisen potentiaali, kun taas suurin osa kasvaimen koostuu ei-tuumorigeenisiä soluja [1]. Todisteita CSC: n malli löytyy sukusolujen syöpä, leukemia, rintasyöpä, paksusuolen syöpä ja joissakin aivojen syövät. [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Toisaalta, onko ihosyövän ovat yhdenmukaisia ​​tällaisen mallin on kysymys jatkuvaa keskustelua [12], [13].

Tällä hetkellä ainoa määritys, joka määrittää Tuumorigeenisuustutkimuksissa ihmisen kasvaimissa liittyy ksenotransplantaatio eri alapopulaatiot syöpäsolujen osaksi kylkiin erittäin immunosuppressiivisten eläinten (esim NOD /SCID). Lisäksi stemness (eli kyky itse uudistaa ja erottaa) on arvioitu jatkuvasti

in vitro

by korvike määrityksiä, jotka tutkia palloja muodostavan kyky ja kyky muodostaa klooneja Anchorage riippumaton olosuhteissa, kuten puolikiinteä pehmeä agar [ ,,,0],14]. Aiemmat kokeet osoittivat, että monisoluisten kasvaimen palloset ovat morfologisesti ja luonteenomaisesti samanlaisia ​​kiinteitä kasvaimia

in vivo

[15], [16]. On myös osoitettu, että palloja muodostavan potentiaalia suspensiona tarttumattomat olosuhteissa johdonmukaisesti korreloi neoplastisen kasvupotentiaali immunosuppressoiduilla hiirillä [17], [18], [19], [20].

Sekä

in vitro

ja

in vivo

stemness määritykset käsitellään Tuumorigeenisuustutkimuksissa erillisten solujen ala- populaation, kun todellinen muodostumista kasvaimia potilailla voi riippua muista tekijöistä. Kasvain microenvironment jotka voivat olla päällä erityisiä ja isännän immuunijärjestelmä on heikentynyt NOD /SCID-hiiriin voi mahdollisesti muuttaa kohtaloa syöpäsolujen ja niiden osuutta taudin. Näin ollen kysymys siitä, solujen, joilla on korkea Tuumorigeenisuustutkimuksissa todella edistää kasvaimen kasvua potilailla, joilla on ehjä immuunijärjestelmä on edelleen ratkaisematta.

Tässä tutkimuksessa vertasi kahden liittyviä ilmiöitä syövän kehitystä: Tuumorigeenisuustutkimuksissa ja kohtalo syöpäsoluja. Voittamiseksi kaksi tärkeintä rajoituksia, jotka ovat ominaisia ​​ihonalainen ksenografti ihmisen syöpäsolujen osaksi immuunipuolustus hiiriin, eli lajien välisen rajan ja elinsiirrot asetusta, käytimme syngeeninen melanoomamalii ja potilaalle tehdä sisäisen footpad injektioita immuuni-toimivaltaisen eläimiä.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat

hiiri melanoomasolulinjojen (K1735 /16 ja K1735 /M4) olivat lahja laboratoriossa tohtori Lea Eisenbach (jäljempänä Weizmann Institute, Rehovot ). K1735 /16S-solulinja oli peräisin K1735 /16-solulinja, viljelemällä soluja ei-adherentit (katso alla) 16 päivää. Soluja kasvatettiin DMEM: ssä, jota on täydennetty MSCM, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa, 5% CO 2, kosteutetussa inkubaattorissa. Kaikki keskipitkän ainesosat hankittiin Biological Industries, Israel. Itse uudistamista ja pallomainen kasvun määrityksiä käytettiin melanooma seerumitonta kantasolujen media (MSCM), joka koostui Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa /F12, KnockOut ™ SR, 100 mM L-glutamiinia (Invitrogen), MEM ei-välttämättömiä aminohappoja Solution 10 mM, 2 ug /ml FGF (Sigma) ja antibiootteja. Sillä alalla kasvu määrityksiä käytimme MSCM vakioitiin hiiren alkion fibroblasteja (MEF) CF-1 24 tuntia. [21] Myös käytettiin reagensseja, kuten: natriumatsidia, paraformaldehydiä, ksyleeni ja natriumsitraattia ostettiin Sigma Aldrich, Israel.

Hiiret ja

in vivo

Jalka Pad Model

Nainen C3H /kana hiiriä ja Severe Combined Immunodeficiency (SCID) hiiriä ostettiin Harlan (Jerusalem, Israel). Kaikki hiiret pidettiin eläinten tilat Tel Avivin Medical Center (Tel-Aviv, Israel), aseptisissa olosuhteissa.

Eläinkokeet suoritettiin noudattaen kaikkia asiaankuuluvia käytäntöjä, menettelyjä ja lainsäädännön vaatimukset Institutional animal Care ja Käytä komitea (IACUC), Research animal Resource Center (RARC) Tel Avivin yliopiston ja National Institutes of Health (NIH) ”Guide for Care ja käyttö Laboratory Animals”. Kaikki eläin menettelyt suoritettiin hengittämällä 2% isofluraani. Kun tutkimukset, kaikki eläimet lopetettiin CO

2 hengitettynä.

jalka pad syngeneeisissä melanooman kautta luotiin, kuten on kuvattu aiemmin Harrell ym. [22]. Lyhyesti, kolmekymmentä, 6 viikon ikäisiä hiiriä nukutettiin inhaloitavien isofluraanilla kaikkia menettelyjä. Vasemman takajalan jalka pad steriloitiin alkoholilla ja sitten hitaasti ruiskutettiin 50 ui solususpensiota pitoisuutena 2 x 10

5 solua /50 ui yli 2 minuutin ajan. Sitten hiiret herätti ja niiden jalka pad tarkkaillaan kasvaimen koon ja merkkejä kivusta tai haavaumia kahdesti viikossa.

Kokeilla syngeenisen C3H /kana hiiriä, toistettiin 3 kertaa, ja kussakin kokeessa me pistetään 10- 15 hiirtä ryhmässä. Kokeissa SCID käytimme 6-7 hiirtä ryhmää kohti. Vuonna solulajittelussa kokeilu, jokainen ryhmä (5-6 hiirtä ryhmää kohti) injektoitiin lajitellun CD133 (+), ohjaus K1735 /M4 tai ohjaus K1735 /16 solujen syngeneeisissä C3H /kana hiirillä.

Immunohistokemia

näytteitä injektiokohdasta melanoomasolulinjojen saatiin päivinä 16 ja 40, kiinnitettiin 4% paraformaldehydi, dehydratoidaan alkoholin, kirkastettiin ksyleenissä ja upotettiin parafiiniin. Neljän mikronin leikkeitä värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H klooni ab66155 Abcam Cambridge, UK), hiiren anti-hiiri /ihmisen MelanA (01:20; klooni ab731 Abcam Cambridge, UK). Vectastain Elite ABC Peroxidase Kit (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) käytettiin sekundaarinen vasta-aineiden havaitsemista. Visualisointi tehtiin käyttämällä DAB: tä substraattina (klooni ab64238, Abcam Cambridge, UK). Patologi tutki liukuu sokea tavalla.

Immunoblottausmääritys

ilmentymistä ABCB5 (1:1000; klooni PAB9925, Abnova Taipei, Taiwan), nestiinifenotyypin (1:200; klooni mab353 , Chemicon, Billerica, USA) ja CD271 /NGFR (1:200; klooni sc-8317, Santa Cruz, USA), soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä. Sitten solut vapautettiin ilman entsymaattisella digestiolla 4 ° C: ssa. Solupelletit sonikoitiin 10 sekunnin ajan ja kirkastettiin sentrifugoimalla. Kokonaisproteiinista (50 ug) tehtiin elektroforeesi 7,5% Tris-HCI geelit (Bio-Rad, Hercules, CA) ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja, tukossa ja altistettiin primaarisen vasta-aineen, jota seurasi sekundäärinen vasta-aine oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin. Bändejä kehitettiin käyttäen ECL Plus havaitsemisjärjestelmä (Amersham, Piscataway, NJ). Tiheys kvantitoitiin käyttäen tietokoneohjattua CCD-kamera (AlphaImager Imaging Systems, Alpha Innotech, San Legndra, CA).

virtaussytometria ja Cell Sorting

havaitsemiseksi solupintamarkkerien kasvainsoluihin, melanooma solulinjoja käsiteltiin trypsiinillä tai ei-entsymaattisesti irrotettiin EDTA: lla ja sentrifugoitiin 1500 rpm /min 5 minuutin ajan. [23] Lyhyesti, solut pestiin Ca

2 + vapaa Mg

2 + vapaa fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), ja 4 ml 1 mM EDTA: ta (Sigma Aldrich), lisättiin jokaiseen pulloon . Pulloja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5 minuutin ajan ja sekoitettiin hitaasti, kunnes solut irrotettiin. Kymmenen millilitraa PBS-puskuria lisättiin sitten kuhunkin pulloon ja solut poimitaan putkiin, sentrifugoitiin ja pestiin Ca

2 + /Mg

2 + vapaata PBS: ää. Määrä irrotettuja soluja luettiin hemasytometriä (Marienfeld, Saksa). Sitten solut otettiin talteen, pestiin jääkylmällä 0,5% FBS: ää ja 0,02% natriumatsidi PBS: ssä ja blokattiin liuoksella, jossa oli 0,5% FBS: ää ja 5 ug /ml puhdistettua anti-CD16 /CD32 (BioLegend, San Diego, USA) PBS: ssa 15 min huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen solut värjättiin APC konjugoidulla anti-hiiri-CD133 mAb (klooni 13A4, eBioscience, San Diego, USA), APC-leimattua anti-hiiri-CD117 (klooni 2B8, eBioscience, San Diego, USA), FITC-leimattu anti- hiiren Sca-1α: n (klooni D7, eBioscience, San Diego, USA), CD271 (klooni ab8874, Abcam Cambridge, UK), ja vuohen polyklonaalista Toissijainen vasta-aine kanin lgG: tä (klooni ab6108, Abcam Cambridge, UK) 30 minuutin ajan jäissä. Näytteitä pestiin sitten ja analysoitiin BD FACSCanto ™ II (BD Bioscience, USA).

lajitteluun käytimme Mac® Analyysilaitteisto (# 130-090-312, Miltenyl Biotec Inc., USA) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti: K1735 /M4 solut värjättiin APC konjugoidulla anti-hiiri-CD133 mAb ja solujen erottaminen eteni anti-APC mikrohelmet (# 130-090-855, Miltenyl Biotec Inc., USA). Solu osio suoritettiin kahdesti samoja soluja jotta rikastuttaa CD133 positiivisia solupopulaation. Sen jälkeen solujen erottaminen CD133 positiivisia solupopulaation pestiin PBS: llä ja valmisteltu injektiota (7,5 x 10

4 solua /200 ul /hiiri) tai tarkastusta FACS.

proliferaatiomääritystä

solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 1000 solua per kuoppa DMEM-MSCM. 24, 48 ja 72 tuntia, solukasvu määritettiin käyttämällä Kolorimetrinen XTT soluproleferaatiomäärityksessä (Beit Haemek, Israel). Näytteet analysoitiin Spectra MR Dynex (Chantilly, USA).

Soft Agar Pitoisuus

alikvootit 10

4 melanooma-solut suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan, 0,35% agaria MSCM. Alikvootit kaadettiin kuuden kuoppalevyille päälle 1,5 ml kerros 0,5% agaria MSCM, annettiin jähmettyä ja inkuboitiin 21 päivää 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 5% CO2: ta. Astiat valokuvattiin stereoskooppisen kuvantamisjärjestelmä (stereo Lumar.V12. Zeiss, Saksa) ja numero pesäkettä 1 /cm

2 arvioitiin hankinnan jälkeen käyttäen ImagJ (NIH, Bethesda, MD) kuva-analyysi-ohjelmisto.

arviointi Kasvaimen sferoidi Formation and Self-uusimisen Analyysi

2 ml pienempi agarkerroksen valmistettiin uudelleen suspendoimalla 0,5% agaria, jossa MSCM, joka sitten annettiin kiinteytyä 6-kuoppaisille levyille. Alikvootit 3 x 10

4 melanoomasolujen MSCM maljattiin suspensiossa olosuhteissa pehmeällä agar-kerros, ja inkuboitiin 2-16 päivää 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 5% CO

2 ennen analyysiä.

Sphere rajoittavan laimennuksen Analysis (SLDA) suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu. [24] Lyhyesti, palloja kerättiin 14 päivän kuluttua pidetään suspensiossa olosuhteissa 6 kuoppaisille levyille, erotettu trypsiinillä ja maljattiin uudelleen tarttumattomat olosuhteet MSCM avulla laimennus alikvootteja: 1000, 300, 100, 50, 10 solua /96 -wells levy. Neljätoista päivää myöhemmin, kuoppien määrä ilman pallo muodostuminen kvantitoitiin ja tietojen log-muunnettiin ja piirrettiin pinnoitus tiheys. Lineaarinen regressio käytettiin laskea taajuuden solujen, jotka kykenevät lisääntymään muodostamiseksi melanooma alalla.

Quantitative Käänteinen transkriptio-PCR

Kokonais-RNA uutettiin hiiren melanoomasolulinjoja käyttämällä RNeasy Mini (Qiagen, Alankomaat), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Puhdistettu RNA kvantitoitiin käyttäen NanoDrop® ND-1000 spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies Inc., USA). cDNA syntetisoitiin 200 ng kokonais-RNA käyttäen VersoTM cDNA Kit (Thermo Scientific, Epsom, UK) ja sattumanvaraisia ​​heksameerejä. cDNA PCR-monistaminen suoritettiin käyttäen Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix–UDG kanssa ROX (Invitrogen Corporation, Grand Island, NY USA) Step One Plus Real Time PCR-järjestelmä (Applied Biosystems) geenispesifisillä oligonukleotidiparien (Sigma Aldrich, Israel). Jokainen geeni tarkistettiin kolme eri paria alukkeita, taulukossa S1. Varmistaa spesifisyyden reaktio-olosuhteet, lopussa yksittäisten kulkee, sulamislämpötila (Tm) monistetut tuotteet mitattiin vahvistaa sen homogeenisuuden. Sykliolosuhteet olivat seuraavat: 50 ° C 2 minuuttia, 95 ° C: ssa 2 minuutin ajan, 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C 30 sekuntia, yhteensä 40 sykliä. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena. Kvantifiointiin, standardi käyrät saatiin käyttäen laimennossarja cDNA monistettiin samassa reaaliaikainen PCR aikavälillä. Tulokset normalisoitiin ACTB ja 18S mRNA-tasoja. 2-ΔΔCT menetelmää on sovellettu analysoimaan suhteelliset muutokset geenin ilmentymisen. Kun kvantifiointiin menettelyn tuotteet erotettiin 2,5% agaroosigeelielektroforeesilla vahvistaa, että reaktio oli monistettu DNA fragmentteja odotettua kokoa.

Tilastollinen analyysi

Opiskelijan

t

testit tai analyysit ryhmien välillä (ANOVA) käytettiin tilastolliseen analyysiin tarvittaessa. Eroja pidettiin merkittävinä osoitteessa

P

0,05. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SD, ellei toisin ole mainittu. Kaikki kokeet toistettiin kolmena kappaleena. Tiedot Tyypillisissä kokeissa esitetään.

In vivo

kokeet koostuivat 10-15 hiirtä kussakin koeryhmässä.

Tulokset

Jotta voidaan arvioida korrelaatio syöpäsolu itseuudistumiseen potentiaali ja solujen kohtalon, me valittuun hiiren melanoomasoluja, jotka olivat peräisin samasta emosolulinjassa, mutta joilla on eri fenotyyppejä

in-vivo

ja

in-vitro

. K1735 hiiren melanoomasolulinja on käytetty laajasti tutkia melanooma [25]. Tämä solulinja, jolla on alhainen taipumus muodostaa etäpesäkkeitä, aiheutettiin C3H /kana hiirillä krooninen altistuminen UV-B-säteily. Meidän tutkimus, me valitsemme kolme solulinjoja, jotka olivat peräisin tästä emosolulinjassa, mutta erosivat merkittävästi niiden Tuumorigeenisuustutkimuksissa, palloja muodostavan kyky ja kyky muodostaa klooneja [26], [27], [28]. K1735 /16 on ei-metastaattinen solulinja ja K1735 /M4-solulinja oli peräisin keuhkometastaasitestissä ja on korkea metastaattinen potentiaali. Kolmas solulinja, K1735 /16S, oli peräisin K1735 /16 solulinja pitämällä solut suspensiossa tarttumattomat edellytykset 16 päivää. Kaikki kolme solulinjat osoittivat samanlaisia ​​leviämisen kinetiikkaa kun kasvatetaan viljelmässä levyillä (Fig. 1A).

(A) Proliferation kurssi kulttuuri saaneilla levyt määritettiin 96 tunnin kuluttua käyttäen XTT-määritystä. Tiedot ovat keskiarvo ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena. (B) keskimääräinen lukumäärä pesäkkeiden kasvatettu pehmeällä agarilla 21 päivän jälkeen viljelmässä. Tiedot ovat keskiarvo ± SD viisi HPF (P 0,001). (C) edustaja mikroskooppiset kuvat kasvaimen pallosia 21 päivän kuluttua pinnoitus. (D) edustaja mikroskooppiset kuvat kasvaimen pallosia, 6 vuorokauden kuluttua maljaamalla tarttumattomat olosuhteissa.

Soft Agar Colony ja Sferoidiviljelmiä Formation Mahdolliset

Kasvain kasvatettujen solujen kolmiulotteisessa monisoluisten steroideja monien luotettavana

in vitro

malli, joka kopioi joitakin monimutkaisia ​​ominaisuuksia kiinteiden kasvainten [29]. Ensin pyrittiin luonnehtimaan kyky muodostaa klooneja ja palloja muodostavan kykyä kolme solulinjojen K1735 /16, K1735 /16S ja K1735 /M4 pehmeässä agarissa. K1735 /16 solulinjaa kasvatetaan pehmeä agar jättänyt muodostamaan pesäkkeitä 21 päivän jälkeen viljelmän (Fig. 1 B ja C). Toisaalta, sekä metastaattisen K1735 /M4 solulinjan ja K1735 /16S solulinjassa oli näkyvä pesäke muodostelma kapasiteetti (Fig. 1 B ja 1 C). Me seuraavaksi tutkittava, onko sama fenotyyppinen heterogeenisyys on sattunut jousitus tarttumaton olosuhteissa, jota pidetään monien on lähin lähentäminen

in vivo

tuumorigeenisyystesti niistä in vitro määrityksissä [30], [31 ], [32], [33], [34]. Pallo muodostuminen kapasiteetti arvioitiin 6 vuorokauden kuluttua pinnoituksen kanssa MSCM. Kuvassa 1D K1735 /M4 ja K1735 /16S solulinjat osoittivat näkyvästi palloja muodostavan kyky, kun taas K1735 /16 solulinjaa ei kasvanut näissä stressin olosuhteissa. Kuitenkin, kun K1735 /16-soluja pidettiin näissä olosuhteissa 16-20 päivää, muutaman sferoidit voitiin havaita joitakin levyjä.

Stemness Mahdolliset

arvioimiseksi itseuudistumisen potentiaalia kolme solulinjojen, suoritimme sarjan laimennus määrityksiä käyttäen on SLDA seerumittomassa media, ohjataan tutkia kykyä rajoittavan laimennuksen analyysi melanoomasolujen pallosten muodostamiseksi ei-tarttuva olosuhteissa ja vahvistettu taajuus analyysi melanooman pallo muodostumista. [24], [35], [36] Kaikki kolme solulinjoissa oli samanlainen leviämisen potentiaalia levitettiin 96-kaivoista elylevyillä normaaliolosuhteissa (Fig. 2A). Vuonna sijaan itseuudistumisen potentiaalia seerumittomassa alustassa ei-metastaattinen solulinja, K1735 /16, erosivat selvästi muista kahdessa solulinjassa. SLDA suoritetaan sen jälkeen toisen kylvöä paljasti, että taajuuden solujen, jotka kykenevät itsestään uusitaan oli 1/216 varten K1735 /M4-solulinja, 1/296 että K1735 /16S-solulinjan ja 1/36733 varten K1735-16 solulinja MSCM (Fig. 2). Lisäksi, K1735-16 solut eivät kykene muodostamaan pallojen adeherent olosuhteissa, kun taas K1735 /M4-soluja muodostuu spontaanisti sphares in seerumittomassa alustassa.

SLDA suoritetaan sen jälkeen toisen kylvöä kanssa MSCM paljasti, että taajuus jotka kykenevät itse uudistaa oli A. 1/216 varten K1735 /M4 solulinja, B. 1/296 että K1735 /16S solulinjassa ja C. 1/74720 varten K1735-16 solulinjan. Leikkauspiste log (37% negatiivinen kaivot) käytettiin laskemiseen palloja muodostavan taajuuden (katso materiaalit ja menetelmät).

Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, fenotyyppisen heterogeenisyys yhden hiiren melanoomasoluja, jotka olivat peräisin samasta emosolulinjassa. Itsestään uudistumispotentiaalia suspension tarttumaton määritys on verrattavissa palloja muodostavan kyky ja kyky muodostaa klooneja pehmeässä agarissa määrityksen.

Tuumorigeenisuustutkimuksissa SCID-hiirissä

Seuraavaksi pyrimme arvioimaan kasvaimia potentiaali kolme solulinjojen immuunipuutteisilla hiirillä käyttäen potilaalle tehdä sisäistä jalkatyynyyn injektiot. Tämä arvioitiin injektoimalla 2 x 10

5 vastaeroteltujen K1735 /16, K1735 /M4 ja K1735 /16S syövän solujen polkuanturaan SCID-hiirten. Kouraantuntuva kasvaimet näkyivät kaikissa hiirissä 20 päivän kuluessa. Kuten on esitetty kuviossa 3A, metastaattisen solulinja, K1735 /M4, osoitti korkeinta kasvukinetiikkaan, jonka jälkeen K1735 /16S solulinja, kun taas ei-metastaattinen /ei-colonogenic 1735/16 solulinja oli alhaisin kasvaimen kasvua potentiaalia (n = 6-7 hiirtä ryhmää kohti,

P

0,001). Nämä tiedot viittaavat siihen, että itseuudistumisen potentiaali

in vitro

voi ennustaa

in vivo

Tuumorigeenisuustutkimuksissa SCID-hiirissä.

(A) Melanoomasolulinjat (2 × 10

5) ruiskutettiin käpälään SCID hiirillä. K1735 /M4-solulinja oli suurinta kasvaimen kasvun kinetiikkaan, jonka jälkeen K1735 /16S-solulinja. K1735 /16 solulinjassa oli hitain kasvaimen kasvua (n = 5-6 ryhmää kohden, P 0,001). (B) Sama pitoisuus solujen ruiskutetaan polkuanturaan syngeenisten C3H /HeN-hiirissä. Tällä kertaa K1735 /M4 ja K1735 /16S oli minimaaliset Tuumorigeenisuustutkimuksissa, kun taas K1735 /16S solulinjassa oli korkeimmat kasvaimen kasvua kinetc (kokeita 3 peräkkäistä kertaa n = 10-15 eläintä ryhmää kohti; P 0,001 välillä K1735 /16 ja K1735 /M4 tai K1735 /16S solulinjoilla). (C) edustaja histologisia piirteitä kasvaimia kasvatettiin immunokompetenteissa eläinten 16 päivä istutuksen jälkeen. (D) immunohistokemiallinen analyysi anti-Ki-67 Ab (leviämisen markkeri) osoittaa vastaava ilmaisu kolmessa solulinjoissa. (E) immunohistokemiallinen värjäys anti-Melan ab (melanooma markkeri) osoitti positiivista ilmentymistä kaikissa kasvaimia muttei viereisissä normaalia kudosta.

Tuumorigeenisuustutkimuksissa immunokompetenteissa Hiiret

Seuraavaksi halusimme arvioida, Tuumorigeenisuustutkimuksissa kolme solulinjojen, kuten paljastui kaksi

in vivo

ja

in vitro

yllä kuvattuja määrityksiä, voi ennustaa todellisen kohtalon syöpäsolujen immunokompetenteissa eläimiä. Tämä kysymys voidaan ratkaista vain syngeenisissä hiiren malleja, jotka voivat heijastaa kasvaimen vastainen immuunivaste, ja mikroympäristön vasteen. Siksi me toistuva sisäisen footpad injektiot aiemmin esiintynyt SCID hiirillä, mutta tällä kertaa käyttäen syngeneeisissä C3H /kana hiirillä.

Meidän yllätys, kohtalo syöpäsolujen Geneettisesti malli oli aivan päinvastainen kuin se aikaisemmin kuvattu SCID-hiirissä. Kuten on esitetty kuviossa 3B, K1735 /16-soluja injektoidaan sisäiseen polkuanturaan C3H /HeN-hiiret osoittivat korkeimman syövän kasvua kinetiikkaa, kun taas vain pieni määrä eläimille kehittyi kasvaimia injektion jälkeen K1735 /M4 tai K1735 /16S-solulinja (kokeet suoritettiin 3 kertaa n = 10-15 hiirtä ryhmää kohti,

P

0,001). Histologinen analyysi kasvainten H 0,001). TUNEL analyysi paljasti, että määrä apoptoottisten solujen K1735 /16 solulinjaa johdettu kasvainten oli merkittävästi alhaisempi kuin K1735 /16S ja K1735 /M4-solujen linjat johdettu kasvaimia.

Expression Kavereita Stem Cell markkereita

Todisteet viittaavat siihen, että tuumorigeenisiä soluja voidaan erottaa ei-tuumorigeenisiä soluja, joka perustuu spesifisten markkereiden. Siksi tutkittiin kyky raportoitu kantasolujen merkkiaineita ennustaa kliinistä fenotyyppi kolmen melanoomasolulinjoja. Se oli aiemmin osoittaneet, että c-Kit, CD133 ja CD271 ilmentämismääritykset voi erottaa tuumorigeenisia ulkopuolisten tuumorigeenisiä melanoomasolujen [13], [37], [38], [39]. Tutkimme myös ilmaus Sca-1α, joka osoitettiin liittyvän Tuumorigeenisuustutkimuksissa rinta-, eturauhas- ja keuhkosyöpää [13], [37], [38], [39]. Siksi tutkittiin ilmentymistä näiden markkereiden virtaussytometrialla kaikissa kolmessa solulinjoissa. Solut irrotettiin käyttäen trypsiinipilkkomiskohdan tai entsymaattisessa vapaissa olosuhteissa käyttäen EDTA. Kuvio 6-trypsiini käsiteltyjä soluja ja kuvio S1-EDTA käsitellyissä soluissa osoittaa, että c-Kit, CD133 ja CD271-positiiviset solut havaittiin vain vähemmistön soluja. Sen sijaan, Sca-1α ekspressio havaittiin 50% K1735 /16-soluissa, mutta ei muissa solulinjoissa. Nämä tulokset vahvistettiin kvantitatiivisella RT-PCR-analyysit.

Expression kantasolujen merkkiaineiden määritettiin käyttäen anti-Sca-1α, c-Kit, CD133 ja CD271 Abs. Toisin kuin muut merkit, SCA-1α on ilmaistu 50%: n solujen K1735 /16-solulinja, mutta ei muissa solulinjoissa. Tulokset ovat yksi kolmesta Tyypillisissä kokeissa. Niiden positiivisten solujen ja markkereita näkyvät oikeassa yläkulmassa. B16 hiiren melanoomasoluja, luuytimen (BM) tai aivosolujen (BC) käytettiin positiivisina verrokkeina.

lisäksi pyrittiin selvittämään muita CSC markkereita ilmaisemat melanoomasoluja, jotka voivat ennakoida tuumorigeenisiä fenotyyppi. Niinpä seulotaan vielä 16 markkereita aiemmin osoitettu ekspressoituvan CSCS [12], [13], [21], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]. Käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR-analyysi emme kyenneet havaitsemaan korkeampi ilmentyminen Abcg2, ABCB5, CD20, CD24, CD34, CD44, CD166, Oct4, Cripto-1, CD-90, Gli1 tai Sox2 Jonkin K1735 /M4, K1735 /16S ja K1735 /16 solulinjoissa (Fig. 7). Olemme vahvistivat nämä tulokset joidenkin merkkiaineiden Western blotilla (kuvio. 8). Mielenkiintoista, kolme merkkiä Nanog, ALDH3A1 ja nestiinifenotyypin, oli ilmaistu K1735 /16 solulinjassa, mutta ei sen tytär solulinjassa K1735 /16S tai metastaattisen K1735 /M4 solulinjassa. Kaikkiaan seuloimme 19 eri markkereita, jotka olivat aiemmin ehdotettu olevan liittyy Tuumorigeenisuustutkimuksissa syöpäsoluja, ja ne kaikki, erittäin tuumorigeenisiä solulinjoja K1735 /M4 ja K1735 /16S oli sama tai pienempi ilmentyminen verrattuna matalan tuumorigeenistä solulinjassa.

suhteellinen ilmentyminen 15 merkkiaineiden aikaisemmin ehdotettu käytettäväksi ennustaa itseuudistumisen potentiaalia syöpäsolujen. ALDH3A1, Nanog ja nestiinifenotyypin ilmaistaan ​​lähinnä K1735 /16 solulinjassa, mutta ei K1735 /16S ja K1735 /M4 solulinjoilla. Muut kantasolujen merkkiaineita, kuten Sox2 ei havaittu ero ilmentymistä näiden kolmen solulinjoja. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta eri kokeesta. Vastaeroteltujen luuytimen ja aivojen soluja käytettiin positiivisina verrokkeina (oikea sarake).

Nämä merkkiaineet aikaisemmin ehdotettu käytettäväksi ennustaa melanooman itseuudistumisen potentiaalia. HTB-72 ihmisen melanoomasolulinjan ja hiiren astrosyytit (AST) käytettiin positiivisina kontrolleina. Huomaa, että ainoa markkeri, joka ilmaistaan ​​hiiren melanoomasolulinjoja oli Nestine, joka on ilmaistu ei-metastaattinen solulinja (K1735 /16).

Lopuksi pyrki vahvistamaan tuloksemme kloonivalinnalla solulajittelussa yhteismarkkinavaiheessa solutasolla. Tämä määritys suunnattu onko sub populaatiot K1735 /M4 voi aiheuttaa tehostetun kyky muodostaa klooneja ja itseuudistumisen.