Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tavoite

MikroRNA (miRNA) ovat mukana erilaisissa neoplastiset sairaudet, kuten eturauhasen syöpä (PC). Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia Mirna profiilin PC kudoksessa, arvioida niiden yhdessä ennusteeseen viittaavia tietoja, ja arvioida mahdollisuuksia miRNA diagnostisina ja ennustetekijöitä markkereita.

Materiaalit ja menetelmät

From kohortin 535 potilailla toimitettiin eturauhasen (HE), näyte 30 potilaalla (14 potilasta nopeasti biokemiallisia vajaatoiminta (BF) ja 16 potilasta ilman BF) kanssa Gleason pisteet 7 analysoitiin. Kaikkiaan 1435 miRNA kvantitoitiin microarray hybridisaatiolla, ja valitut miRNA korkein keskihajonta (n = 50) todensi reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR (qRT-PCR).

In situ

-hybridisaatio (ISH) käytettiin arvioimaan ilmentymistä miR-21.

Tulokset

miR-21 oli ainoa miR joka oli merkitsevästi säädellään ylöspäin BF (p = 0,045) miR-21 oli säädelty potilailla, joilla BF verrattuna ei-BF (p = 0,05). Vuonna univariate analyyseissä, korkea strooman ilmentyminen miR-21 oli ennustava vaikutus biokemiallisiin vika-elinaika (BFFs) ja kliinisen vika-elinaika (CFFS) (p = 0,006 ja p = 0,04, vastaavasti). Vuonna Monimuuttuja-analyysissä korkea strooman ilmentyminen miR-21 ilmentyminen havaittiin olevan riippumaton ennustetekijä varten BFFs potilaalla on Gleason pisteet 6 (HR 2,41, CI 95% 1,06-5,49, p = 0,037).

Johtopäätös

korkea strooman ilmentymistä miR-21 oli yhteydessä huonoon biokemiallisten uusiutumista elinaikaa jälkeen RP. Jos potilaalla on Gleason pisteet 6, miR-21 voi auttaa ennustamaan riskiä tulevaisuudessa taudin etenemisen ja auttaa siten valitse potilaita mahdollisten hoitona tai tiukempaan seurantaan.

Citation: Melbø-Jørgensen C, Ness N, Andersen S, Valkov A, Dønnem T, Al-Saad S, et ai. (2014) stroomakasvaimet ilmentäminen MiR-21 ennustaa biokemialliset Epäonnistuminen Eturauhassyöpä Potilaat, joilla Gleason pisteet 6. PLoS ONE 9 (11): e113039. doi: 10,1371 /journal.pone.0113039

Editor: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Japani

vastaanotettu: 14 elokuu 2014; Hyväksytty 17. lokakuuta 2014; Julkaistu: 17 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Melbø-Jørgensen ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia Helse Nord, Pohjoinen Health Administration (www.helse-nord.no) ja Tromssan yliopisto Arktinen yliopisto Norjan (www.uit.no). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PC) on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat miehillä [1]. Tauti tulos on vaihteleva ja vaikeasti ennustettavissa. Viimeksi kuluneiden 30 vuoden aikana määrä radikaali prostatectomies (HE) on kasvanut 25-kertaiseksi, mikä johtuu pääasiassa potilaille ylidiagnosoida kanssa tappava syöpä [2]. Testaus prostataspesifinen antigeeni (PSA) on yleisin keino havaita eturauhasen syöpä. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että PSA-pitoisuudet ovat pysty erottamaan veltto ja hengenvaarallisia syövät aikaan diagnoosi [3]. Tunnistetiedot parempi ennustetekijöitä merkkiaineita riski kerrostuminen on siis suuri vaikutus kliiniseen hallintaan PC.

miRNA muodostavat yhden luokan pieniä ei-koodaavan RNA-molekyylejä (-20 nukleotidiä), jotka ovat mukana säännellä proteiinien ilmentyminen . miRNA voidaan tuottaa sivutuotteena mRNA tuotannon välisen intronin matkustajia, tai voidaan transkriboitu yksi- tai polykistroninen tuotteen RNA-polymeraasi II: [4]. Ne toimivat sitoutumalla 3 ’UTR, että kohde-mRNA, ja aiheuttaa hiljentäminen mRNA, jonka Argonaut (Ago) proteiinin RNA-indusoidun hiljentäminen proteiini-kompleksin (RISC) [4], [5]. Monet miRNA ovat vapautettu syövän ja vaikutus kasvainten muodostumiseen ja etenemisen, koska ne sijaitsevat alueilla genomin jotka ovat yleisesti yli-ilmentynyt tai poistettu [6]. Useat miRNA ja niiden tavoitteet ilmaistaan ​​poikkeuksellisen PC, mikä johtaa syövän etenemiseen, invaasio, ja etäpesäkkeitä. Muuttuneen ilmauksia joidenkin valittujen miRNA ovat potentiaalisesti käyttökelpoisia biomarkkereita diagnoosi, ennuste, ja luokitusta varten PC [7] – [9]. miR-21 oli ensimmäinen onkogeeninen miRNA on löydetty [10]. PC, miR-21 katsotaan toimivan onkogeenin, mutta sen rooli on epäselvä, ja raportit ovat ristiriitaisia. Hulf et ai. [11] löytynyt miR-21, joka toimii kasvainsuppressorigeenin, kun taas Ribas et ai. [12] kertoi, että yli-ilmentyminen miR-21 edistänyt sekä hormoniriippuvaisen ja hormoni-riippumaton kasvaimen kasvua PC solulinjoissa. Lisäksi, he päättelivät, että kohonneet miR-21 lisää kasvainten kehittymiseen, kasvaimen kasvun ja indusoi kastraatio kestävä fenotyypin [13]. Sen sijaan, Folini et ai. [14] ei löytänyt mitään eroja miR-21 ilmentyminen normaalin eturauhasessa ja PC. Shi, et al. [15] löydetty miR-21 olla mukana chemoresistance ja että miR-21 oli säädellään ylöspäin Doketakseli resistenttien PC3 (PCR3) soluja verrattuna villin tyypin PC3-soluissa.

Tässä tutkimuksessa tutkimme miRNA profiili PC potilailla. Niistä 1435 miRNA, miR-21 oli ainoa ehdokas miRNA joka oli merkitsevästi säädelty ja tehtiin arvioida tarkemmin ennustetyövälineenä merkki koko kohortin. Alueneuvoston Lääketieteen ja Health Research Ethics (2009/1393), Data Protection virallisen tutkimuksen (NSD), ja National tietosuojaviranomaiselle ovat hyväksyneet tämän tutkimuksen. Eettisen toimikunnan luopua tarvetta suostumusta. Potilasasiakirjoihin oli anonymisoituja ja tunnistamattomiksi ennen analyysiä.

Potilaat ja menetelmät

Potilaiden ja kudosnäytteiden

Ensisijainen kasvain kudosta 535 eturauhasen (RP) potilasta diagnosoitu yliopistollisessa sairaalassa Pohjois-Norjan, St. Olav sairaala ja Nordland sairaalan 1995-2005 käytettiin tässä tutkimuksessa. Riittävä parafiiniin kudosblokeista ja täydellinen demografiset ja kliinis tulokset saatiin kaikille potilaille (taulukko 1). Kasvaimet olivat porrastettu muutetun Gleason luokitusjärjestelmä [16] ja järjesti WHO: n mukaan suuntaviivoja [17]. Kaikki ensisijainen kudokset histologisesti tarkastelleet kaksi patologit (ER ja LTB).

miRNA seulonta

miRNA profilointia, 30 potilasta sisällä Gleason Score (GS) 7 alaryhmä oli peräkkäin valittiin , 14 niistä nopeasti biokemiallisia vika BF (PSA≥0.4 ng /ml 24 kuukauden kuluessa leikkauksen jälkeen) ja 16 potilasta, joilla ei ole BF. GS 7 valittiin näillä potilailla osoittavat heterogeenisen kliininen tulos. MiRNA tunnistettiin mikrosirujen hybridisaatio ja määrällisesti RT-qPCR (taulukko 2). Kaikkiaan 1435 miRNA kvantitoitiin mikrosirujen hybridisaatio ja valittu miRNA korkein keskihajonta (n = 50) todensi kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR). Seitsemän miRNA tunnistettiin kaikkein ylä- tai alassäädetty. Näistä miR-21 oli ainoa ehdokas miR oli merkitsevästi ajan säätelee kertamuutosta. MiR-21 ilmentyminen jälkeen tutkittiin koko kohortin mukaan kromogeeniä

situ

-hybridisaatio (CISH) ja arvioidaan ennustetyövälineenä merkki PC. Molemmat kasvain epiteelisolujen ja kasvaimeen liittyvä strooman alueita tutkittiin erikseen. Mediaani seuranta-aika oli 89 kuukautta (vaihteluväli 6-188). Viimeinen potilas päivitys marraskuussa 2012.

Microarray rakentaminen

Tissue Microarray (TMA) rakentaminen valittiin suurikapasiteettisten molekyyli patologian analyysi [18]. Kullekin tapauksessa patologi (ER) histologisesti yksilöity ja merkitty kaksi ydintä alueita kasvainsolujen (epiteelikasvainsolut), kaksi ydintä kasvaimen strooman kudokseen, yksi ydin alueilta normaalin epiteelisolujen, ja yksi ydin normaali strooman kudosta. TMA koottiin käyttäen kudosta ryhmittelyn väline (Beecher Instruments, Silver Springs, MD, USA). Lyhyesti, käytettiin 0,6 mm: n neulalla sato merkitty kudoksen alueita vastaavasta formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) kudospaloista. Näytteet asetetaan tyhjään vastaanottaja parafiiniblokkiin mukaan koordinoida kuvio. Jos haluat sisällyttää kaikki kairausnäytteitä, kaksitoista kudoksen array lohkojen rakennettiin. Useita 4 pm: n leikkeet leikattiin Micron mikrotomin (HM355S), kiinnitetty lasilevyille, ja sinetöity parafiini. Yksityiskohtaisten menetelmien on raportoitu aiemmin [19].

RNA

RNA eristettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettu näytteitä RECOVERALL- Yhteensä Nucleic Acid Isolation Kit FFPE kudoksen (Life Technologies) ja lähetettiin Exiqon (Vedbaek, Tanska), joka suoritti miRNA seulonta kokeessa. Tissue käytetty RNA oli kolme 4 mm syvä, 0,6 mm halkaisijaltaan lieriön ydintä korjattu merkitty kasvain osastoista FFPE lohkoja. Microarray käytettiin LNA array 6

th sukupolven ihmisen, rotan ja virusten mikrosirujen suunniteltu miRNA kirjasto 1435 ihmisen, rotan ja viruksen miRNA. Kokonais-RNA (500 ng) sekä näytteen ja viite leimattiin Hy3 ja Hy5 fluoresoiva leima, vastaavasti, käyttäen miRCURY LNA microRNA Hi-Power Labeling Kit, Hy3 /Hy5 (Exiqon, Tanska) noudattaen valmistajan kuvaamia. Hy3-leimattu näytteet ja Hy5-leimatun viitteenä RNA-näytettä sekoitettiin pareittain ja hybridisoidaan miRCURY LNA microRNA Array 6. Gen (Exiqon, Tanska), joka sisältää sieppauskoettimien suunnattu kaikille MikroRNA ihmisen, hiiren tai rotan rekisteröity miRBASE 16.0. Hybridisaatio suoritettiin mukaisesti miRCURY LNA microRNA Array Ohjekirja käyttäen Tecan HS4800 hybridisaatio station (Tecan, Itävalta). Hybridisaation jälkeen mikrosiru diat skannattiin ja varastoitava otsonia ympäristössä (otsoni tason alapuolella 2,0 ppb) estääkseen mahdollisia valkaisu fluoresoivan väriaineita. MiRCURY LNA microRNA Array Levyt skannattu käyttäen Agilent G2565BA Microarray Scanner System (Agilent Technologies, Inc., USA) ja kuva-analyysi suoritettiin käyttäen ImaGene 9 (miRCURY LNA microRNA Array Analysis Software, Exiqon, Tanska). Määrälliset signaalit taustakorjatut ja normalisoitu käyttämällä yleisiä Lowess (paikallisesti painotettu scatterplot tasoittava) regressio algoritmi.

kvantifiointi kypsä miRNA reaaliaikaisella qPCR

valintakriteerit miRNA PCR validointi oli; merkittävä P-arvo, korkea kertainen muutos ja ennen uskottavuuden. MiRNA valittiin jatkotutkimuksiin olivat miR-21, miR-141, miR-23a, miR-222, miR-205, miR-143 ja miR-145 (taulukko 2). Kaikki reaaliaikaiset qPCR Kokeet suoritettiin Exiqon (Vedbaek, Tanska).

RNA: ta (2 ui) käänteistranskriboitiin 10 ui reaktiot käyttäen miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR, Polyadenylaatio ja cDNA-synteesi kit (Exiqon ). cDNA laimennettiin 100 x ja määritettiin 10 ui PCR-reaktioissa mukaan protokolla miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR; Kunkin microRNA mitattiin kolmesta jonka qPCR on microRNA mittatilaustyönä pick-n-mix paneeli. Negatiiviset kontrollit ilman templaatin käänteistranskriptio reaktio suoritettiin ja profiloitu, kuten näytteet. Vahvistus suoritettiin LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche) 384-kuoppalevyillä. Vahvistusta käyrät analysoitiin käyttäen Roche LC ohjelmisto, sekä määrittämiseksi Ylityspaikka (Cp), jonka 2. johdannainen menetelmällä ja sulamiskäyräanalyysillä.

monistuksen tehokkuus laskettiin käyttämällä algoritmeja samanlainen LinReg ohjelmisto . Kaikki määritykset tarkastettiin erillisiä sulamisen käyriä ja sulamislämpötila (T

m) tarkistettiin olemaan sisällä ominaisuudet tunnetaan määritystä varten. Lisäksi määrityksissä havaittiin 5 op: n vähemmän kuin negatiivinen kontrolli, ja jossa Cp 37 sisällytettävä data-analyysi. Tiedot, jotka eivät läpäisseet näitä kriteerejä jätettiin pois mitään myöhempää analyysia varten.

käyttäminen NormFinder paras normalisoija todettiin olevan miR-23b. Kaikki tiedot oli normalisoitu tähän miRNA kaikissa näytteissä (miR-23b – määritys Cp).

In situ

-hybridisaatio

Kromogeeni

situ

-hybridisaatio (CISH) suoritettiin ”Yhden päivän microRNA ISH-protokolla” kehittämä Exiqon, Vedbek, Tanska. Leimatut lukita nukleiinihappo (LNA) modifioitu koettimia Exiqon Mir-21 (HSA-miR-21miRCURY LNA Sähkö-. Nro 38102-15), positiivinen kontrolli (U6 on /mmu /RNO) ja negatiivinen kontrolli (ryntäily-miRNA) oli käyttää. Jotkut optimointeja menetelmän tehtiin saada erityistä ja herkkä havaitsemiseen miRNA meidän osastoja FFPE TMA.

4 pm TMA laseja inkuboitiin kolme vuorokautta 37 ° C: liittää ydintä Super Frost Plus dioja . Leikkeitä deparaffinised ksyleeniin (3 x 5 min) ja hydratoidaan sitten etanolin ratkaisuja PBS, pH 7,4. Proteinaasi-K 20 um /ml, käsittely tehtiin PK-puskuriin (5 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1 mM NaCl, autoklavoidaan) 37 ° C: ssa 20 minuutin ajan ThermoBrite hybridizer. Sen jälkeen PBS pese leikkeet uudelleenhydratoitujen läpi etanolilla ja ilmakuivattiin. LNA-koettimet denaturoitiin kuumentamalla 90 ° C: ssa 4 minuutin ajan. Hybridisaatio LNA-koettimien miR-21 (50 nM), salattu miRNA (50 nM) ja U6 (1 nM) on suoritettiin ThermoBrite hybridizer 50 ° C: ssa 60 min. Tiukat pesut suoritettiin huoneen lämpötilassa 5 x SSC-puskurissa, joka on esilämmitetty SSC puskureita (50 ° C), 5 min 5 x SSC, 2 x 5 min 1 x SSC, 2 x 5 min 0,2 SSC, ja 5 min RT 0,2 x SSC. Osiot blokattiin vastaan ​​epäspesifinen sitoutuminen estoliuoksessa DIG pestä ja Block puskuri setti (11 585 762 001, Roche, Mannheim, Saksa) 15 minuuttia huoneenlämpötilassa kosteassa kammiossa. Alkalinen fosfataasi (AP) konjugoitua anti DIG (11 093 274 910, Roche, Mannheim, Saksa) 1:800 inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa kosteassa kammiossa immunologisen havaitsemiseen. Sen jälkeen PBS-T pestään substraatti entsymaattisia reaktioita toteutettiin NBT /BCIP (11 697 471 001, Roche, Mannheim, Saksa) 30 ° C: ssa ThermoBrite 120 min. Reaktio pysäytettiin 2 x 5 min pesulla KTBT puskurissa (50 nM Tris-HCl, 150 nM NaCl, 10nm KCI) ja sen jälkeen pesu kahdesti tislattuun veteen. Leikkeitä laskuri värjättiin ydin- nopea punainen (WALDECK, ZE-012-250) huoneenlämpötilassa 1 min ja sitten huuhdottiin vesijohtovedellä. Kuivuminen suoritettiin lisäämällä kaltevuudet etanolia ratkaisujen ja lopuksi asennus Histokitt kiinnitysväliaine (Assistant-Histokitt, 1025/250 Sondheim /Rhoen Saksa).

pisteytys CISH

Kuva-analyysi tehtiin käyttäen ARIOL kuvantamisjärjestelmä (Genetix, San Jose, USA) säveltäminen mikroskoopin (Olympus BX 61) varustettu automaattisella vaiheessa ja liukumäki kuormaimen yhdessä kameralla. Ytimet valokuvattiin käyttäen 20x suurennuksilla. Hallitseva värjäytymisen intensiteetti epiteelikasvainsolut ja kasvaimen ympäröivä stroomasolujen pisteytettiin; 0 = negatiivinen, 1 = heikko, 2 = kohtalainen ja 3 = voimakas. Kaikki näytteet anonymisoituja ja itsenäisesti tekee kaksi patologit (ER ja AV). Arvioitaessa yhden muuttujan tietylle ydin, tarkkailijat olivat sokaissut tulokset muiden muuttujien ja lopputuloksen. Mean pisteet kulloinkin laskettiin kaikista neljästä ydintä ja molemmat tutkinnon. Jos asiasta ei päästä (pisteet ristiriita 1), levyt tutkittiin uudelleen ja päästiin yksimielisyyteen tarkkailijoiden.

Tilastolliset menetelmät

Kaikki Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen tilastollista pakettia IBM SPSS, versio 21 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) (S1). Pisteytys arvot kustakin patologi verrattiin väliseen tarkkailijan luotettavuutta käyttämällä kaksisuuntaisen random efektimalli ehdottoman sopimuksen määritelmän. Wilcoxonin testiä käytettiin sen arvioimiseksi, onko se oli tilastollisesti merkitsevä ero ilmaus miR-21 välillä normaalin kudoksen ja syöpä kudosta. Verrattaessa kahta näytettä ryhmää (BF vs. ei-BF ryhmä) päässä qPCR tuloksista, kaksipuolinen Studentin t-testiä käytettiin. Koko kohortin Pearson chi-square testejä ja Spearmanin korrelaatio koe suoritettiin tutkimaan assosiaatioita miR-21 ilmentyminen ja kliinis markkereita. Kaplan-Meyer menetelmää käytettiin tekemään tontit BFFs ja CFFS. Log-rank-testi käytettiin testaamaan tilastollista merkittävyyttä. Merkittävät muuttujia yhden muuttujan analyysit arvioidaan tarkemmin monimuuttuja eloonjääminen analyysi käyttäen taaksepäin vaiheittaista Coxin regressiomallin todennäköisyydellä vaiheittain merkinnän poistamista 0,05 ja 0,10, tässä järjestyksessä. Merkitsevyystasolla käytettiin p 0,05 kaikissa analyyseissä. Kaikki selviytyminen analyysit suoritettiin käyttäen kolmea eri päätepisteiden: (i) biokemiallinen vika elinaika (BFFs), (ii) kliininen vika elinaika (CFFS), ja (iii) PC ​​kuolema elinaika (PCDF). BF luonnehdittiin PSA≥0.4 ng /ml ja nousee vähintään kahden eri verinäytettä leikkauksen jälkeen. CF määriteltiin vahvistettu paikallinen oireiden etenemisen ja /tai todentaa etäpesäke luun, sisäelimissä tai imusolmukkeiden CT, MR, luukuvaus tai ultraäänitutkimus. PCDFC määriteltiin aiheuttama kuolema progressiivinen PC.

Tulokset

Potilaiden ominaisuudet ja kliinis muuttujat

Yhteensä kohortti.

Katsaus potilaan kohortin demografiset, kliiniset ja histopatologiset ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. mediaani ikä leikkaus oli 62 (vaihteluväli 45-75). Prostatectomies olivat retropubic vuonna 435 tapausta ja välilihan 100 tapauksissa. Viimein seurannassa 170 potilasta oli ollut BF, 36 CF, ja 15 potilasta oli kuollut PC.

miRNA seulonta alaryhmä.

30 potilaalla on Gleason pisteet 7 jolle tehtiin miRNA seulonta, mediaani-ikä oli 65 vuotta (vaihteluväli 57-71), mediaani PSA 18,8 ng /ml (vaihteluväli 5-79), mediaani kasvaimen koko 22 mm (vaihteluväli 3-45), 21% koki CF ja 14% oli kuollut eturauhasen syöpä. Kokonaismäärän potilaiden ryhmän Gleason pisteet 7 (n = 270), mediaani-ikä oli 62 (vaihteluväli 47-74), mediaani PSA 18,0 ng /ml (vaihteluväli 0,7-71), mediaani tuumorin koon 23 mm, 22% kokenut CF ja 9% oli kuollut eturauhassyöpää. Mikään näistä erot olivat tilastollisesti merkitseviä.

Microarray seulonta ja qPCR validointi

600 1435 miRNA tutkimien mikrosiruja, oli ilmaus yli taustan (tausta signaalin voimakkuus määritellään 1,2 kertaa intensiteetti 1 -quartile kukin dia) (taulukko 2). Näistä 50 miRNA korkein keskihajonta (SD) analysoitiin edelleen. Alkaen microarray analyysit, hierarkkinen 2D-klusterointi osoitti suhteellisen ilmentymistason miRNA, jotka olivat säädelty molemmissa ryhmissä (kuvio 1a). Ekspressiotasot 7 miRNA oli validoitu RT-qPCR (taulukko 3, kuvio 1 a). Viisi seitsemästä analysoitu miRNA osoittivat samanlaisia ​​suuntaus kahteen ryhmään. Heat Map kaaviossa esitetään tulos kaksisuuntaisen hierarkkinen ryhmittely ilmentymistason viiden miRNA. Z-oli rajattu -2-2 (kuvio 1 b). miR-21 oli ainoa miRNA joka oli merkitsevästi säädellään ylöspäin BF ryhmässä. Tämä oli yhdenmukaiset ryhmän tuloksia. Siellä oli vahva korrelaatio matriisi hybridisaatio ja qRT-PCR.

a) suhteellinen ekspressiotasot 50 miRNA joka ilmaistiin kaikki 30 Hyväksytty kudosnäytteiden kanssa Gleason pisteet 7. X-akseli esittää yksilöitä ja Y-akseli esittää miRNA. Punaiset neliöt koodaavat sääteli miRNA ja vihreät neliöt koodaavat alassäädetty miRNA. b) Lämpökartta tulokset kaksisuuntainen hierarkkinen klusterointi perustuu qPCR tuloksia. MiRNA oli sama suuntaus qPCR validointi ja mikrosiruanalyysillä. Normalisoitu (DCP) arvoja on käytetty analyysiin. Punainen väri edustaa lauseke yläpuolella keskiarvon, sininen väri edustaa ilmaisun alempi kuin keskimääräinen.

Expression of miR-21 ja korrelaatioita koko kohortin

Yleisesti miR-21 ilmennettiin korkeammalla tasolla kasvaimen strooman alueilla kuin kasvaimen epiteelisoluissa (kuvio 2). Intensiteetti miR-21 ilmentyminen oli vahvempi sytoplasmassa kasvainkudoksessa verrattuna normaaleissa kudoksissa potilailta (p 0,001). Ei ollut eroa miR-21 ilmentyminen välillä kasvaimen epiteelisolujen ja normaalit epiteelisolujen. Merkittävä korkeampi ilmentyminen miR-21 löydettiin kasvain strooman alueella kuin ei-neoplastisia strooman alue (p 0,001). Vertaamalla kasvaimen epiteelisolujen kasvainten stroomasoluissa, miR-21 ilmentyi suuremmilla tasoilla kasvainten stroomasoluissa (p 0,001).

oli merkittäviä korrelaatioita korkea tuumorin strooman ilmentymisen miR-21 ja pT-vaihe (

r

= 0,134, p = 0,003), hermoa tunkeutuminen (PNI) (

r

= 0,175, p 0,001) ja verisuonten tunkeutuminen (

r

= 0,222 p 0,001). Löysimme heikko korrelaatio strooman ilmentymistä mir-21 ja Gleason (

r

= 0,218, p 0,001). Oli myös merkittäviä korrelaatioita strooman ilmentymistä miR-21 ja Gleason Score (GS); GS 7, GS 7 ja GS 7 (r = 0,238, p 0,001).

ei ollut eroja strooman ilmentyminen miR-21 välillä alaryhmien Gleason pisteet, 3 + 4 (n = 220, 41%) ja 4 + 3 (n = 80, 15%) (r = – 0,001, p = 0,991).

univariate analyysi

kliinis muuttujat pT-vaihe ( p 0,001), preoperatiivinen PSA-arvo kahtia 10 ng /dl (n = 221, p 0,001), Gleason (p 0,001), kasvaimen koko kaksijakoinen 20 mm (n = 285, p 0,001), hermoa tunkeutuminen (PNI) (ei = 134, p 0,001), positiivinen kirurgiset marginaalit (PSM) (n = 286, p = 0,041), positiivinen kirurgiset kehän marginaali (n = 154, p 0,001), positiivinen kirurgiset apikaalisella marginaali (n = 210, p = 0,04), ja verisuonten tunkeutuminen (n = 43, p 0,001) olivat kaikki merkittävästi korreloi BFFs vuonna yksiulotteista eloonjäämisen analyysit (taulukko 1).

4

th neljännekseen käytettiin cut-off. Korkea ilmentyminen miR-21 kasvaimen strooman alueilla korreloi merkitsevästi BF (n = 170, p = 0,006, kuvio 3a), ja CF (n = 36, p = 0,041, kuvio ei ole esitetty). Ei ollut mitään korrelaatiota korkea strooman ilmentyminen miR-21 ja PCD (n = 14, p = 0,505).

b) Potilaat, Gleason pisteet 6.

alaryhmäanalyyseissa löysimme korkeat strooman ilme Mir-21 kohdistuu merkittävä liittyy suurentunut riski BF potilailla, joilla on GS 6 (n = 167, p = 0,023, Kuvio S3b), mutta tämä ei havaittu potilailla, joilla on GS 7 (n = 262, p = 0,228) , Gleason asteen 3 + 4 (n = 189, p = 0,0290, Gleason asteen 4 + 3 (n = 73, p = 0,818), ja GS 7 (n = 36, p = 0,895). Huomasimme myös korkea strooman ilmaus korreloi BF potilaille positiivisia kehän marginaalit (n = 139, p = 0,026), mutta ei niille, joissa on ilmainen kehän marginaalien (n = 339, p = 0,107).

Monimuuttuja-analyysi

Merkittävät kliinis ja molekyylitason markkereita yhden muuttujan analyysin vietiin monimuuttuja malliin. Taulukossa 4 on esitetty itsenäisen ennustavat tekijät BF; pT-vaihe (p = 0,001), Gleason luokka (p = 0,021), kuin apikaalisella PSM (n = 286, p = 0,001), apikaalisella PSM (n = 210, p = 0,003). CF; Gleason grade (p = 0,013), PNI (n = 134, p = 0,028), ei-apikaalisella PSM (p = 0,028).

Korkea strooman ilmentymistä miR-21 oli itsenäinen ennustetekijä BF, jos potilaalla on Gleason pisteet 6 (n = 167, HR 2,40, CI 95% 1,06-5,49, p = 0,037). Merkittävä assosiaatio korkea strooman ilmentymisen miR-21 ja BF todettiin myös, että potilaiden alaryhmässä PSM (HR 1,95, CI 95% 1,95-3,21, p = 0,008). Kuitenkin koko kohortin (n = 471), oli vain suuntaus riippumattoman yhdistyksen välillä strooman ilmentymistä miR-21 ja BF (n = 170, p = 0,089). Korkea strooman ilmentyminen miR-21 ei ollut itsenäinen ennustetekijöitä muuttuja CF (n = 36, p = 0,395).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa havaitsimme suuremman ilmaus asennuspalveli- 21 syöpäkudoksiin verrattuna normaaliin eturauhasen kudosta. Ilmaisu oli eniten kasvaimen strooman alueilla. Korkea kasvain strooman ilmentymistä miR-21 oli itsenäinen ennustetekijä biokemiallisia vajaatoimintaa sairastavilla potilailla Gleason arvosana 6 mutta ei kliinistä vika, johtunee muutamia tapahtumia jälkimmäisessä ryhmässä. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus raportoi kasvain strooman ilmentymistä miR-21 ennustetyövälineenä merkkiaineena BF jälkeen eturauhasen. Lisäksi olemme löytäneet myös korkea strooman ilmaus olevan itsenäistä merkkiaine PSM RP yksilöitä.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA muutu merkittävästi eturauhassyövässä, mikä viittaa siihen, että miRNA toimivat keskeiset säätelijöinä eturauhasen syövän synnyn. Useita tutkimuksia on tehty tunnistaa PC-erityinen miRNA allekirjoitus, mutta n on päästy suhteessa miRNA roolin kehittymistä ja etenemistä PC [20], [21]. Eräässä tutkimuksessa Violinia et al. [22], kokonais-RNA uutettiin 363 kiinteiden syöpien, mukaan lukien eturauhas- syöpä, ja 177 normaaleissa kudoksissa. He löysivät yleinen säätely ylöspäin 39 miRNA, kuten miR-21, kun taas 6 miRNA olivat alassäädetty. Nämä tulokset olivat osittain kanssa tekemä tutkimus AMBS et al. jossa kokonais-RNA 60 mikro-leikeltiin PC ja 16 ympäröivä ei ollut kasvainta kudosta analysoitiin [23]. MiR-21 pidetään yleisesti onkogeenin, mutta toistaiseksi sen rooli PC on epäselvä ja raportit ovat ristiriitaisia ​​[11], [12], [14], [20]. miR-21 on havaittu olevan koholla PC3 ja DU145 androgeenistä riippumattomia solulinjoja [24]. Lisäksi miR-21 otettiin esimerkiksi androgeenireseptorin säädelty miRNA joiden taso oli kohonnut PC verrattuna viereiseen normaaliin kudokseen [12]. Estoja miR-21 vähentää androgeenin indusoiman PC soluproliferaatiota, kun taas kohonnut ilmentyminen miR-21 edistävää parannettu kasvaimen kasvua ja kastraatio vastus

vivo

[12]. Toiset ovat myös löytäneet miR-21 säädelty potilailla, joilla on hormoneja ja solunsalpaajaresistentti PC [13], [15].

Olemme havainneet, että korkean kasvain strooman ilmentymisen miR-21 kasvaimissa Gleason pisteet 6 ennustettu BF. Tämä on linjassa aikaisempien raporttien [25]. Stroomakasvaimet miR-21 ilmentyminen analyysi voi olla mahdollinen keino ennustaa, erittäin pitkälle kasvaimia, jotka todennäköisimmin edetä. Viimeaikaiset tutkimukset ovat antaneet arvokasta oivalluksia selvennetään involment Mir-21 kasvaimen mikroympäristössä: Bullock et al. [26] osoittivat, että ilmen- tymisen lisääntymisen miR-21 ilmentyminen tapahtuu syöpään liittyvän strooman soluissa, mutta ei kolorektaalisista syöpäsoluja. Lisäksi he havaitsivat, että kohdunulkoinen miR-21 ilmentyminen fibroblasteissa moduloidaan sytotoksista vaikutusta Oksaliplatiini (chemotherapheutic käytetään kohtelu paksusuolen syöpä), mikä johti syövän etenemiseen. Bronisz et ai. [27] osoitti, että downregulation mir-320 rintakasvainkudoksessa strooman fibroblasteissa ohjelmoi kasvain microenvironment aktivoimalla pro-kasvaimia synnyttävän secretome, ja mielenkiintoisesti, Yao et al. [28] kertoi, että myofibroblastin transdifferentiation peräisin kantaisä fibroblastien vastauksena TGF-β voitaisiin ehkäistä käyttämällä erityisiä antisense inhibiittorit miR-21. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, pro-metastaattinen vaikutus mRNA: iden fibroblastien erilaistumista ja fenotyypin, ja että miR-21 voi välittää läpi kasvaimen mikroympäristössä. Kuitenkin biologinen ja toiminnallinen todisteita tukemaan näitä havaintoja, etenkin eturauhasen karsinoomat, on rajallinen.

On tunnettua, että alle 3%: lla Gleason score≤6 koskaan edetä käsiteltyä tai ei, ja että merkittävä osuus näistä potilaista edelleen tehdään tarpeettomia hoitoon jälkeen diagnoosi alhaisen riskin PC (joka perustuu PSA 10 ng /ml ja vaihe ≤ T2a) [29], [30]. Stroomakasvaimet miR-21 ilmentyminen analyysi voi olla mahdollinen keino ennustaa, erittäin pitkälle kasvaimia, jotka todennäköisimmin edetä. Lisätutkimukset selventää tarkkaa roolia miR-21 näissä erittäin pitkälle kasvaimia tarvitaan. Toisin kuin aiemmissa raporteissa, löysimme korkea ilmentyminen miR-21 potilailla, joilla on positiivinen kirurgisten marginaalit, [25]. Molekyylimekanismeja tähän ei tiedetä.

tulokset poikkeavat toisistaan ​​miR-21 eri tutkimuksissa saattaa heijastaa heterogeenisyys PC, sekä erilaisia ​​tutkimuksen suunnittelu ja menetelmiä. MiRNA seulonta koko kohortin olisi vahvistanut meidän tutkimusta. Sitä paitsi laatu tutkituissa kudoksissa (mukaan lukien käsittely) voi merkittävästi vaikuttaa tulkintaan microarray data. Lisäksi mielenkiintoisia tietoja BF, tutkimuksemme on hieman rajoittaa vähän tapauksia, joissa kliinisen pahenemisvaiheen tai PCD. Lisätutkimukset tämän mikroRNA ja siihen liittyvien reittien voi paljastaa uusia mekanismeja syövän etenemisen ja terapeuttisen intervention.

Johtopäätös

Tämä tutkimus miRNA profilointia ja validointi eturauhassyövässä esitetään lisää todisteita miR-21 ennustetyövälineenä merkki PC. Nämä tulokset osoittavat, että strooman ilmentyminen miR-21 on tärkeä rooli sairauden etenemisessä, mutta taustalla mekanismi tarvitsee lisätutkimuksia.

tukeminen Information

Tiedosto S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0113039.s001

(ZIP) B

Kiitokset

Kiitämme osallistuvien laboratorioteknikoiden laitoksella Patologian UNN tuesta ja teknisiä taitoja. Erityisesti haluamme kiittää Magnus Persson, Mona Pedersen ja Marit Nina Nilsen, Christopher Fenton, Øystein Størkersen ja Anders Angelsen.