Krooninen sairaus

tiivistelmä

Monista tunnistettu androgen geenien, sGCα1 (liukeneva guanylyl cyclase α1) näyttää keskeinen rooli välittämisessä pro-syöpä vaikutuksia androgeenien ja androgeenireseptorin. Klassisen rooli sGCα1 on hetero- kanssa sGCβ1 alayksikön, joka muodostaa sGC, entsyymiä, joka välittää typpioksidi signaloinnin kataly- synteesin syklisen guanosiinimonofosfaatin. Meidän julkaistut tiedot osoittavat, että sGCα1 voi ajaa eturauhassyövän soluproliferaatiota riippumaton hormoni ja antaa syöpäsolujen pro-selviytymisen toiminto, uudella mekanismilla p53 inhibition, jotka molemmat ovat riippumattomia sGCβ1, NO, ja cGMP. Kaikki nämä ominaisuudet tekevät sGCα1 tärkeä uusi tavoite eturauhasen syövän hoidossa. Siten, peptidit suunniteltiin kohdentamalla sGCα1, joiden tarkoituksena on häiritä tämän proteiinin pro-syöpä toimintaa. Yksi peptidi (A-8R) määritettiin olevan voimakkaasti sytotoksinen eturauhasen syöpäsoluja, nopeasti aiheuttamaan apoptoosin. Sytotoksisuus havaittiin sekä hormoniriippuvaisen ja, merkittävästi, hormoni-tulenkestävät eturauhasen syöpäsolujen, jolloin on mahdollista, että tätä peptidiä voidaan käyttää hoitoon yleensä tappava kastraation kestävä eturauhassyöpä. Hiirillä ksenografti tutkimuksissa peptidi A-8R pystyi lopettamaan kasvaimen kasvua paitsi hormoneista riippuvaisten solujen, mutta tärkeintä hormoneilla riippumaton soluja. Lisäksi mekanismi peptidi sytotoksisuutta on sukupolvi reaktiivisia happiradikaaleja, jotka viime aikoina on tunnustettu merkittävä toimintatapa tärkeä syöpälääkkeiden. Niinpä tämä tutkimus antaa vahvaa näyttöä siitä, että kohdistaminen tärkeä AR säädelty geeni on uudenlainen tehokas eturauhassyövän hoidossa.

Citation: Gao S, Hsieh CL, Bhansali M, Kannan A, Shemshedini L (2013) peptidi vastaan ​​Liukoinen Guanylyl syklaasiin α1: Uusi lähestymistapa eturauhassyövän hoitoon. PLoS ONE 8 (5): e64189. doi: 10,1371 /journal.pone.0064189

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 18 tammikuu 2013; Hyväksytty: 13 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 27, 2013

Copyright: © 2013 Gao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Yksi tärkeä kohdekudos androgeenien ja androgeenireseptorin (AR) on eturauhasen. Kuten kehittäminen normaalin eturauhasen, kasvua ja etenemistä eturauhassyövän ovat myös riippuvaisia ​​androgeenien ja AR [1]. Molemmissa normaalissa eturauhasessa kehitystä ja eturauhasen syövän synnyn, androgeenien ja AR ovat tärkeitä säätelyssä leviämisen ja selviytymistä eturauhasen solujen [2]. Androgeeniablaatio kastraatio rotilla johtaa vähentynyt proliferaatio ja lisääntynyt apoptoosin eturauhasen luminal epiteelisolujen, jolloin regressio eturauhanen. Kun fysiologinen androgeenien on korvattu kuohittua rotan eturauhasen epiteelisolujen proliferaatiota lisätään ja apoptoosi on vähentynyt, mikä käyttökuntoon normaalin eturauhasen [3]. Äskettäin on osoitettu, että mutaatio AR on riittävä aiheuttamaan eturauhasen syövän kehittymisen ja etenemisen [4], ja että yli-ilmentyminen AR muuntaa eturauhassyövän kasvua androgeeniriippuvaisen androgeenin riippumattoman [5]. Kaikki tiedot kertynyt tähän mennessä vahvasti siihen, että androgeenien, toiminnan kautta AR, säätelemään solujen lisääntymistä, samalla kun estetään määrä solukuoleman eturauhasen [6]. Dysregulaatio tämän tasapainon soluproliferaation ja solukuoleman on epäilemättä tärkeää kehitystä eturauhassyöpää.

Olemme aiemmin osoittaneet, että yksi tärkeä välittäjä eturauhasen syöpäsolujen lisääntymistä on liukoinen guanylyl cyclase α1 (sGCα1;-geenin nimi

GUCY1A3

) [7]. sGCα1 tunnistettiin alun perin osana sGC, heterodimeerisen entsyymin, joka koostuu sGCα1 ja sGCβ1 alayksiköistä, joka välittää biologisia toimintoja typpioksidin (NO) [8]. Tässä fysiologisesti tärkeitä, ja läsnä signalointireitin, NO sitoutuu ja aktivoi sGC, jolloin muodostuu toissijaisen cGMP (3 ’, 5’-syklinen guanosiinimonofosfaatti), joka sitten aktivoi eri alavirran tavoitteita, mukaan lukien proteiinikinaasi G [9]. Meidän lab äskettäin tunnistettu sGCα1 uutena AR-säädellään geenin [7]. Olemme osoittaneet, että sGCα1 promoottori on tavoite AR sääntelyn ja johtaa huomattavasti korkeampi proteiinin tasot sGCα1 kuin sGCβ1 LNCaP-soluissa [7]. sGCα1 on välttämätön kasvulle sekä androgeeniriippuvaisten ja androgeeni-riippumaton eturauhasen syöpäsoluja. Tärkeintä, tämä vaikutus on riippumaton sGCβ1, NO, ja cGMP, ja näin ollen sGC entsyymin aktiivisuus [7]. Lisäksi, sGCα1 ilmentyminen on tuskin havaittavissa normaaleissa eturauhasen kudosten ja on merkittävästi kohonnut eturauhassyövän kudoksissa, joissa ilmentyminen noustessa yhä taudin vaiheesta ja korkein havaitun hormoni tulenkestävät eturauhassyöpä [7]. Viimeksi meidän lab raportoitu, että sGCα1 voi estää aktiivisuutta p53 ja parantaa selviytymisen eturauhassyöpäsolujen [10].

Kaikki ne pro-syöpä toimintoja sGCα1 viittaavat siihen, että tämä proteiini voi olla hyvä tavoite eturauhasen syövän hoidossa. Tilanteen korjaamiseksi, käytimme edellisessä tietoja, jotka osoittavat, että sGCβ1 ja sGC entsyymiaktiivisuutta eivät olleet mukana sGCα1 pro-syöpä toimintoja ja siten arveltu, että sGCβ1 dimerisaatio kanssa sGCα1 voi häiritä sen pro-leviämisen ja pro-eloonjäämisen toimintoja. Tämä sai meidät harkitsemaan peptideihin perustuva lähestymistapa häiritsevät sGCα1 pro-syöpä toiminnot, suunnittelu peptidien jäljitteli sGCβ1 hetero- verkkotunnuksia. Oletimme, että tällaiset peptidit voisivat sitoutua spesifisesti sGCα1 ja häiritä sen toimintoja. Niistä neljä käytetyistä peptideistä, joista kaksi osoitti sytotoksinen vaikutus syöpäsolujen. Yksi peptidi, jota kutsutaan A-8R, osoitti vahvinta aktiivisuutta ja näin ollen valittiin jatkotutkimuksiin. Peptidi A-8R ei ollut ainoastaan ​​sytotoksinen viljeltyihin soluihin, mutta oli myös voimakas syövän vastaista aktiivisuutta vastaan ​​kastraation-resistenttejä eturauhasen kasvaimia hiiren ksenografti-tutkimukset. Lisäksi meidän tiedot osoittavat, että peptidi A-8R tappaa syöpäsoluja reaktiivisten hapen lajien (ROS) ja induktio DNA-vaurioita. Meidän havainnot tässä tunnistaa uusi peptidi, joka voi pysäyttää kasvun kastraation vastustuskykyisten eturauhassyöpä (CRPC).

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja siRNA transfektio

LNCaP, C81, PC-3 ja Cos-soluja kasvatettiin kuten aiemmin on kuvattu [7]. CWR-22Rv1 soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jossa oli 10% FBS: ää ja 50 ug /ml gentamysiiniä (Gibco). Ohjaus siRNA, sGCα1 siRNA ja AKT siRNA (Dharmacon) 50 nM lopullinen konsentraatio transfektoitiin soluihin käyttäen Lipofectamine Simax (Invitrogen).

Generation of Stable Cell Lines

Generation stabiilien solulinjojen aiemmin on kuvattu [11]. LNCaP-solut transfektoitiin 2 ug kutakin pCI-Neo-vektoriin (negatiivinen kontrolli Promegalta), sGCα1 /pCI-Neo käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen), ja valittujen RPMI 1640 täydellistä alustaa, joka sisälsi 0,9 mg /ml neomysiiniä (Sigma). Pesäkkeet valittiin tunnistamalla sGCα1 mRNA: ta ja proteiinia tasot käyttäen PCR: ää ja Western-blottauksella.

Peptide Synthesis

Kaikki peptidit, joita käytetään tässä tutkimuksessa syntetisoitiin ChiScientific, on ≥95% puhtaus, ja ne olivat liuotettiin 70% DMSO: ta (ACROS Organic).

adenovirusinfektion

C81-solut infektoitiin 5-50 MOI joko adenovirusta, joka ekspressoi Akt (SignaGen) tai tyhjä adenovirus kontrollina. 48 tunnin jälkeen solut altistettiin peptidille hoitoon, jonka jälkeen Western-blottauksella tai lisääntymisen määritys.

leviämisen ja apoptoosi Analyysit

proliferaatiota, soluja kasvatettiin elatusaineessa, joka sisälsi 2% FBS: ää uutettiin dekstraanipäällysteisellä hiiltä (DCC). 48 tuntia myöhemmin, etanoli tai 1 nM R1881 lisättiin soluihin, jota seuraa peptidi hoitoon. MTT-määritystä (Sigma) käytettiin aiemmin [11] määrittää solujen lukumäärän. Apoptoosin, 5000-soluja siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin Vehicle (DMSO), peptidi A-8R (25 uM), etoposidi (50 uM) (Sigma) eri ajankohtina. Kaspaasi (3/7) aktiivisuus mitattiin käyttäen Apo-ONE homogeeninen kaspaasi-3/7 iinianalyysikitissä (Promega). PARP pilkkominen käytettiin myös apoptoosin mittaamiseksi, ja on kuvattu alla.

Western-blottaus

Western-blottaus suoritettiin, kuten on kuvattu [7] käyttämällä ensisijaista vasta-aineita sGCα1 (Cayman Chemical), pan-Akt (Cell Signaling Technology), fosfori-AKT (S473, T308) (Cell Signaling Technology), fosfori-PDK1 (Cell Signaling Technology), fosfori-GSK-3β (Cell Signaling Technology), PARP (Cell Signaling Technology), ja β- aktiini (Abcam).

Immunosytokemia

Immunosytokemia käytettiin tutkimaan solunosasijaintia sGCα1 ja Biotiini-leimatun peptidi-8R LNCaP-soluissa. FITC-leimattua anti-sGCα1-vasta-ainetta (1:100 laimennus; Santa Cruz Biotechnology), anti-biotiini-vasta-aine (1:200; Santa Cruz Biotechnology) käytettiin immunocytochemisty kuvatulla [12].

immunosaostus, biotiini pulldown, ja Binding Affinity

immunosaostus (IP) LNCaP-soluja, suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [10]. Koko-solu otteita LNCaP-solut altistettiin IP käyttämällä Protein A /G plus agaroosi (Santa Cruz). IP-aineet olivat vastaan ​​sGCα1 (Cayman Chemical), sGCβ1 (Cayman Chemical), tai kaniinin IgG (Santa Cruz) kontrollina. Biotiinia avattavasta, 5 ug biotiini-leimattu peptidi A: ta inkuboitiin NeutrAvidin agaroosi Resin (Thermo Scientific) 3 tunnin ajan 4 ° C: ssa, minkä jälkeen koko solun uute LNCaP-solut lisättiin ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Hartsi pestiin ja eluoitiin SDS näyte puskurilla, mitä seurasi SDS-PAGE-geelielektroforeesilla. Kilpailuun määritystä, sama koe toistettiin seuraava muutos: LNCaP solu-uute jaettiin 3 yhtä suureen osaan, kunkin osan ollessa 5 ug peptidi A-8R-Biotin ja Vehicle, 150 ug peptidi C-8R, tai 150 ug peptidi A-8R.

sitoutumisaffiniteetti kokeissa, kokosolu-uute C81-soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien peptidin A-8R koodattu FITC huoneen lämpötilassa 2 tuntia. IP suoritettiin käyttäen vasta-aineita sGCα1 tai kaniinin IgG kontrollina. Peptidi A-8R-FITC avattavasta mitattiin fluoresenssi signaali heräte ja emissioaallonpituuksia 485 ja 521 nm, vastaavasti, käyttäen monen hyvin fluoresenssilevynlukijalla.

ROS Mittaus- ja pelastus

solunsisäiset ROS-tasot arvioitiin käyttäen fluoresoivaa koetinta 5- (ja-6) -chloromethyl-2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (CM-H

2DCFDA) (Invitrogen). Sen jälkeen käsittelyt peptidi A-8R, C81 solut ladattiin 20 uM CM-H

2DCFDA ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan pimeässä. Sitten solut pestiin PBS: llä, ja fluoresenssi mitattiin viritys- ja emissioaallonpituuksia 490 ja 535 nm, vastaavasti, käyttäen useita hyvin fluoresenssilevynlukijalla. NAC (N-asetyylikysteiini) (Sigma) pelastus kokeessa soluja esikäsiteltiin 1 tai 5 mM NAC 2 tuntia ennen kuin lisättiin peptidi A-8R.

Comet määritys

C81-soluja käsiteltiin peptidi A-8R 1 tunnin jälkeen 2 tunnin esikäsittely 5 mM NAC tai ajoneuvo, ja trypsinoitiin, ja sekoitetaan Comet LM-agaroosi (CometAssay, Trevigen) ja siirrettiin dioja. Elektroforeesi ja SYBR-Green värjäys suoritettiin valmistajan protokollan.

Hiiri Vieraslajisiirteen -tuumoritutkimukset

2 x 10

6 C81 solua 50 ui kasvualusta sekoitettiin 50 ui Matrigel (BD Biosciences) ja ruiskutetaan molempiin kylkiin 4-6 viikon ikäisille SCID uroshiirillä. Kun kasvaimen koossa oli 200 mm

3, 50 ui peptidi A-8R (40 mg peptidi A-8R /kg eläimen) tai ajoneuvo (DMSO), injektoitiin suoraan kasvaimia joka toinen päivä. Injektiot lopetettiin 5 kertaa ja kasvaimet mitattiin joka 3 päivä. Hiiret lopetettiin 3 viikon kuluttua, ja kasvaimet irrotettiin. Kaikki toimenpiteet hyväksynyt Toledon yliopisto Division of Lab Animal recourses (DLAR). Proteiini uutteet valmistettiin keittämällä kasvainkudoksen 3 × SDS-puskurissa, ja arvioitiin SDS-PAGE-geelissä.

Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Eläimet National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea yliopiston Toledo (Protocol numero: 106418). Kokeiden aikana kaikki eläimet seurattiin päivittäin sairastuvuutta ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Lopussa Tutkimuksen kaikki eläimet lopetettiin käyttämällä hengittämällä hiilidioksidia, jonka jälkeen Leikkaus suoritettiin valmisteveron kasvaimia kaikista eläimistä.

Tulokset

Peptidit kohdistaminen sGCα1 ovat sytotoksisia Eturauhassyöpä Cells

tietoja, jotka osoittavat sGCα1 tarvitaan selviytymisen [10] ja lisääntymistä [7] eturauhassyöpäsolujen viittaavat siihen, että tämä proteiini voi olla hyvä kohde eturauhasen syövän hoidossa. Alkaa käsitellä tätä mahdollisuutta, käytimme nämä aiemmat tiedot osoittavat, että sGCα1 pro-syöpä toiminnot ovat riippumattomia NO signalointi ja sGCβ1 [7], [10] ja että sGCβ1 voi lievittää sGCα1 välittämää tukahduttamisesta p53 transkriptionaalisen aktiivisuuden [10], viittaa siihen, että sGCβ1 dimerisaatio kanssa sGCα1 voi häiritä sGCα1 pro-syöpä toimintoja. Tämä sai meidät harkitsemaan peptideihin perustuva lähestymistapa häiritsevät sGCα1 toimintoja käyttäen peptidejä, jotka jäljittelevät neljä tunnettua sGCβ1 hetero- verkkotunnuksia [13]. Nämä peptidit, nimeltään peptidi A, B, C, ja D, pituus vaihteli 11-19 aminohappoa. Kukin peptidi sisälsi 8 ​​arginiinit karboksipäähän (Fig. 1A), on sekvenssi tiedetään välittävän solukalvon translokaatio ja solujen sisäistämisen [14]. Peptidit testattiin aktiivisuus LNCaP-soluissa, solulinjassa, joka ilmentää sekä AR ja sGCα1 [7]. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, peptidi A-8R oli vahva, annoksesta riippuvaa, sytotoksista aktiivisuutta, tappaen lähes kaikki solut päivällä 4. peptidi B-8R oli myös negatiivinen vaikutus, tukahduttaa solujen kasvua, mutta se ei alentanut solujen määrä kuin peptidi A-8R teki ( kuva 1B). Toisaalta, peptidit C-8R ja D-8R oli vähäinen vaikutus (Fig. 1 B). Ottaen huomioon sen voimakkaan sytotoksisen aktiivisuuden, peptidi A-8R valittiin jatkotutkimuksiin.

(A) Neljä peptidit suunniteltiin kohdentamalla sGCα1, jossa kukin peptidi, joka sisältää kahdeksan arginiinit C-päähän kalvoon translokaatio. (B) LNCaP-soluja kasvatettiin 10% seerumia eri pitoisuuksia neljä peptidien, kuten on esitetty. Solujen määrä mitattiin 0-4 päivää inkuboinnin. Tietopisteet edustavat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ja keskihajontaa. Tähdet osoittavat tilastollista merkittävyyttä (P 0,0002) Peptidin yritysostoja suhteessa Vehicle.

peptidi A: Associatesin Endogeeninen sGCα1 eturauhassyöpäsoluissa

peptidi A-8R suunniteltiin vuorovaikutuksessa sGCα1, joka on vahvistettu käyttäen kolmea menetelmää. Peptidi A-8R syntetisoitiin biotiinimerkkiaineen C-terminaalisessa päässä, jolloin peptidi A:-8R-Biotin. Ensimmäisessä kokeessa, LNCaP-soluja käsiteltiin peptidin A-8R-Biotin ja alistettiin immunosytokemialla käyttämällä vasta-ainetta Biotiini havaitsemiseksi merkitty peptidi A-8R ja toinen vastaan ​​sGCα1 havaitsemiseksi tätä proteiinia (Fig. 2A). Kuten aiemmin havaittiin, endogeeninen sGCα1 havaittiin ainoastaan ​​sytoplasmassa LNCaP-solujen, joka ympäröi ytimen [7]. Tärkeää on, peptidi A-8R-Biotin todettiin myös sytoplasmassa ja colocalizes kanssa sGCα1, mikä näkyy sulautuneen kuvia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että peptidi A-8R-Biotin vuorovaikutuksessa endogeenisten sGCα1, joka varmistettiin avattavassa kokeilu. Tässä toisessa määrityksessä (Fig. 2B), LNCaP kokosolu-uutetta inkuboitiin peptidi A-8R-Biotin ja alistettiin streptavidiini-agaroosia puhdistus, mikä yhteistyössä puhdistus sGCα1. Sen sijaan agaroosihelmiä voineet pull-down sGCα1 ilman peptidi A-8R-Biotin. Mitata spesifisyys sitoutumisen, avattavasta Koe toistettiin olosuhteissa, joissa ylimäärä leimaamatonta peptidi A-8R tai peptidi C-8R lisättiin reaktio biotiini-leimattu peptidi A-8R. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, peptidi A-8R inhiboi merkittävästi peptidi A-8R-Biotin vuorovaikutus sGCα1, kun taas peptidi C-8R ei ollut mitään vaikutusta, joka näyttää tietyn vuorovaikutuksen peptidi A-8R, jossa sGCα1. Hyödynsimme immunosaostuksella (IP) on sGCα1 määrittää sen sitoutumisaffiniteetti peptidi A-8R. Peptidi A-8R leimattu FITC käytettiin määrittämään, että peptidi sitoutumisaffiniteettia (K

D) sGCα1 oli 11,6 uM (Fig. 2C), joka kuuluu aktiivinen alue pitoisuuden peptidin A-8R sytotoksisuus . Yhdessä nämä tulokset vahvistavat tiettyyn fyysiseen yhdistyksen välillä peptidi A-8R ja sGCα1. Kuva. 2D osoittaa, että lisäämällä Biotiini tag peptidi A-8R ei vaikuta sen sytotoksista tehoa.

(A) LNCaP-soluja käsiteltiin 25 uM biotiini-leimattu peptidi A-8R 2 tuntia ja suoritettiin immunosytokemia käyttäen anti-sGCα1 tai anti-biotiini-vasta-ainetta voidaan mitata subsellulaarisen kolokalisaation endogeenisen sGCα1 ja peptidi A-8R. DAPI käytettiin tahraa ytimiä. (B) LNCaP sytosolin uutteita inkuboitiin peptidi A-8R-Biotin ja alistettiin puhdistukseen käyttäen streptavidiini-agaroosia. Tämä avattavasta koe toistettiin kilpailevien ylimäärä leimaamatonta Peptide C-8R tai peptidi A-8R. Molemmissa tapauksissa Western blotting käytettiin mittaamaan yhteistyössä puhdistus sGCα1. (C) LNCaP solu-uutetta inkuboitiin eri pitoisuuksien peptidi A-8R-FITC ja endogeenisen sGCα1 immunosaostettiin. Co-puhdistettu peptidi A-8R-FITC kvantifioitiin mittaamalla fluoresenssi signaali emission. Epälineaarinen regressioanalyysi käytettiin määrittämään affiniteetin peptidin A-8R sitoutumisen sGCα1. (D) LNCaP-soluja kasvatettiin 10% seerumia eri konsentraatioita peptidiä A-8R tai A-8R-Biotin, kuten on esitetty. Solujen määrä mitattiin 0-48 tunnin inkubaation. Tietopisteet edustavat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ja keskihajontaa. Tähdet osoittavat tilastollista merkittävyyttä (P 0,02) Peptidin yritysostoja suhteessa Vehicle.

peptidi A ei vaikuttaa sGC Entsyymiaktiivisuusmittaukset

Koska Peptidi A suunniteltu jäljittelemään sGCβ1 hetero- domeeni, on mahdollista, että tämä peptidi voi vaikuttaa sGCα1-sGCβ1 heterodimerisaation ja siten entsyymin aktiivisuuden. Vastatakseen vaihtoehtoa me mitata suoraan vuorovaikutukseen sGCα1 kanssa sGCβ1 IP käyttämällä vasta-aineita sGCα1 ja sGCβ1. Peptidi A-8R ollut vaikutusta joko sGCα1 yhteistyössä IP sGCβ1 tai sGCβ1 yhteistyössä IP kanssa sGCα1 (Fig. S1A), mikä osoittaa selvästi, että peptidi A ei häiritse sGCα1-sGCβ1 hetero-. Vahvistus tälle saatiin ELISA kokeilu mittaamalla cGMP synteesiä. Kuten on esitetty kuviossa. S1B, R1881 hoitoa huomattavasti koholla cGMP tasoilla, vastaa meidän aiemmin julkaistu tietoja, joiden androgen induktio sGCα1 ilmaisun ja cGMP synteesi [7]. Tärkeää on, peptidi A-8R pystynyt merkittävästi tukahduttaa cGMP tasoilla, joko poissa tai läsnä ollessa androgeenireseptorin (Fig. S1B). Nämä tiedot yhdessä osoittavat, että peptidi A ei häiritse sGC entsyymin aktiivisuutta ja siten viittaa siihen, että NO signalointi ei ole mukana sen sytotoksisuuteen. Suoraan testata, lisäsimme 8-Br-cGMP käsitellyille soluihin. 8-Br-cGMP ollut vaikutusta ajoneuvo- tai peptidi A-8R-käsiteltyjä soluja, vaikka se pystyi osittain pelastus soluja käsitellään sGC estäjä ODQ (Fig. S1C). Toinen lähestymistapa oli lisätä NO seskvestrointiaine C-PTIO, joka parantaa sen sijaan helpottunut sytotoksisuutta peptidi A-8R 10 ja 25 uM, mutta kiinnostavaa ei 50gM (Fig. S1D). Nämä tiedot yhdessä osoittavat, että peptidi A-8R ei häiritse eikä riipu NO signalointi.

peptidi A: Estää kasvu Sekä Hormoni riippuvaisia ​​ja kastraatio kestävä Eturauhassyöpä Cells, mutta ei sGCα1-vajaiden solujen

Voit selvittää androgeenireseptorin vaikutti sytotoksista aktiivisuutta peptidi A-8R, kokeen kuvassa. 1B toistettiin, kun läsnä on hormoni. Kuten Fig. 3A osoittaa, peptidi A-8R oli sama voimakas sytotoksinen aktiivisuus tai ilman androgen aiheuttaen kaikki solut hukkuu päivällä 6 hoidetuilla 50pM peptidiä. Inaktiivinen peptidi, peptidi C-8R, ei ollut merkittävää vaikutusta samana pitoisuutena (Fig. 3A), mikä osoittaa, että aminohapposekvenssin peptidin A tarvitaan sytotoksisen vaikutuksen ja ilman potentiaalisia sytotoksisuus indusoitiin 8-arginiini-sekvenssin .

auto tai erilaisia ​​pitoisuuksia peptidi A-8R tai C-8R, kuten on esitetty, lisättiin (A) hormoniriippuvaisen LNCaP-soluja kasvatettiin 2% seerumia tai ilman ja 1 nM R1881, (C) kastraatio kestävä C81 tai CWR-22Rv1 soluja, tai (E) sGCα1-puutteellinen PC-3 tai Cos-soluissa. Solujen määrä mitattiin eri päivän inkubaation. Tietopisteet edustavat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ja keskihajontaa. Tähdet osoittavat tilastollista merkittävyyttä (P 0,03) Peptidin yritysostoja suhteessa Vehicle. Western blotting tarkkailuun käytettiin endogeenisen sGCα1 (B) C81 ja CWR-22Rv1 soluissa, hoitaa ilman tai 1 nM R1881, tai (E) PC-3 ja Cos-soluissa, verrattuna LNCaP-soluja. Huomaa, että β-aktiini ohjata Proteiinilisäyksen.

Sen tutkimiseksi, kalvo translokaatiota signaali tarvitaan sytotoksisuuden peptidi A-8R, olemme analysoineet aktiivisuuden peptidi A: puuttuu 8 arginiinia . Kuten on esitetty kuviossa. S2, peptidi A ilman arginiinit oli vähän negatiivinen vaikutus, toisin kuin voimakas sytotoksinen vaikutus peptidin A-8R. Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että solujen sisäistämisen tarvitaan peptidin sytotoksisen vaikutuksen.

aiemmin on osoitettu, että sGCα1 edistää eturauhassyövän proliferaatiota, ja sen ekspressio lisääntyy korkeamman vaiheessa eturauhassyövän [7]. Kuten on esitetty aikaisemmin, sGCα1 proteiinin ilmentyminen on säädelty androgeenien androgeeni-riippuvaisten solujen, ja konstitutiivinen androgeeni-riippumaton C81 ja CWR-22Rv1 soluja, joissa CWR-22Rv1 solut, jotka ilmentävät alempia kuin C81-soluissa (kuvio. 3B). Niinpä olimme kiinnostuneita tutkimaan peptidin vaikutus näihin hormoni tulenkestävät syöpäsolujen. Peptidi A-8R oli erittäin tehokkaasti tukahduttaa kasvua C81-soluissa (kuvio. 3C), yhteensovitus vaikutus hormoniriippuvaista LNCaP. Peptidi A-8R oli tehokas myös toisen hormonin tulenkestävä eturauhassyöpäsolulinja, CWR-22Rv1 soluja, jotka ovat erillään LNCaP (Fig. 3C). Mikä tärkeintä, nämä tiedot osoittavat, että hormoni tulenkestävät eturauhassyöpä solut ovat herkkiä sytotoksista vaikutusta peptidi A-8R, jotka ovat hormoneilla riippuvaisten solujen, viittaa siihen, että tämä peptidi saattaa olla tehokkaita CRPC, tappava muodossa tauti.

Endogeeninen sGCα1 ilmaistaan ​​LNCaP, C81, ja CWR-22Rv1 solut (ks. 3B), jotka kaikki ovat herkkiä sytotoksista vaikutusta peptidi A-8R. Nämä tiedot viittaavat siihen, että peptidi vaikutus vaatii endogeenisen sGCα1 ilmaisu, odotettu havainto, koska sGCα1 oli suunniteltu tavoite peptidi A-8R. Jotta saataisiin enemmän todisteita tätä hypoteesia, kaksi syöpäsolun riviä tutkittiin, jotka eivät ilmennä endogeenista sGCα1 (Fig. 3d). Peptidi A-8R ollut juurikaan ole vaikutusta PC-3 (eturauhassyöpä) tai Cos (hiiri munuaissyövän) soluja (Kuva. 3E). Nämä tiedot tukevat voimakkaasti väitettä, että sytotoksinen aktiivisuus peptidin A-8R riippuu endogeenisen sGCα1 proteiinia.

peptidi A Down-regulation AKT eturauhassyöpäsoluissa

ymmärtää, miten sGCα1 on välittäjinä solu leviämisen, käytimme estäjä joko MAPK tai PI3K-AKT signalointi, kaksi tärkeää signalointireittejä säätelemällä solujen eloonjäämistä ja proliferaatiota. On mielenkiintoista, että PI3K-AKT-estäjällä LY294002 dramaattisesti tukahdutettu LNCaP-solujen lisääntymisen (kuvio. S3A). Tämä sai meidät tutkimaan mahdollisuutta, että sGCα1 voivat aiheuttaa leviämisen kautta tämä signalointireitille. Käyttämällä stabiileja LNCaP solulinjoissa, jotka yli-ilmentävät sGCα1 (Fig. S3B), joka ilmenee pa- androgeenin indusoiman proliferaation (kuvio. S3C), löydettiin Western-blottauksella että veren kokonaiskolesterolia AKT ja fosforyloidun AKT suuresti koholla näissä LNα1-6 ja LNα1-4 solut (Fig. S3B); nämä solut ilmaisivat myös korkeampi fosforyloitua PDK1, kinaasi toimii AKT ja GSK-3β, tavoite AKT [15]. Sen varmistamiseksi, että lisääntynyt AKT tasot johtuivat sGCα1 yli-ilmentyminen, siRNA käytettiin pudotus ilmentymistä sGCα1 vuonna LNα1-6 soluissa, mikä vähensi merkittävästi veren kokonaiskolesterolia ja fosforyloidun AKT (Fig. S3D). Tärkeää on, sGCα1 ei vaikuttanut tasoja AKT mRNA: ta (tietoja ei esitetä), viittaa siihen, että sGCα1 toimii Akt-proteiinia, ehkä vaikuttavat sen vakautta. Mielenkiintoista, siRNA knockdovvn sGCα1 (Fig. S3F) suuresti esti kasvua LNCaP-soluja (kuvio. S3E), mikä osoittaa selvästi, että endogeeniset sGCα1 tarjoaa solujen selviytymisen ja kasvua edistävän toiminto.

Koska meidän data yllä (katso kuviot. S3B, S3D) viittaa siihen, että sGCα1 toimii Akt-proteiinia, peptidi A-8R sitoutumisen sGCα1 voidaan olettaa vaikuttavan AKT. Itse asiassa, hoito LNCaP-solujen peptidi A-8R oli vahva, ajasta riippuva negatiivista vaikutusta AKT-proteiinia siten, että 50 min useimmat mitattavissa AKT on mennyt (Fig. S4A). Kuten olisi odotettavissa, fosforyloidun AKT on samat vaikutukset (Fig. S4A). Passiiviovi ohjaus Peptide C-8R ei ollut vaikutusta joko koko AKT tai fosforyloidun AKT tasolla (Kuva. S4A). Mielenkiintoista on, että sama negatiivinen vaikutus AKT proteiinipitoisuuden (Fig. S4b) havaittiin hiiren ksenograftikasvaimissa (katso jäljempänä) käsiteltiin peptidi A-8R, kuten havaittiin LNCaP-soluissa (kuvio. S4A).

Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​sen hypoteesin kanssa, että peptidi A-8R häiritsee pro-syöpä toimintoja sGCα1 ja viittaavat siihen, että ainakin yksi mekanismi sen sytotoksisen toiminta on kautta häiriöitä AKT-proteiinin. Suoraan testata tätä hypoteesia, me yli-ilmentynyt AKT: ä käyttäen adenoviruksen järjestelmä, joka johti merkittävästi kohonneita AKT käsitellyissä soluissa 10 ja 25 uM peptidi A-8R (Fig. S4C). Yllättäen adenovirus-ilmaisi AKT kyennyt pelastamaan soluja käsiteltiin 10- 50 uM peptidi A-8R (Fig. S4d), mikä viittaa siihen, että AKT alassäätöä ei ole mukana Peptide A-8R sytotoksisuus.

peptidi A: osumalla syöpäsolujen Generation ROS

Koska AKT yli-ilmentyminen ei pelastamaan peptidi A-käsitellyt solut (kts. S4d), etsimme eri sytotoksisuusmekanismin. Mielenkiintoista on, että viimeaikaiset tiedot ovat osoittaneet, että tehokkain syöpälääkkeet, kuten sisplatiini ja doksorubisiini, indusoivat kasvainsolujen kuolemaa nostamalla tason reaktiivisten happilajien (ROS) [16], [17]. Ottaen huomioon nopeasti sytotoksisuuden aiheuttama peptidi A (tuloksia ei ole esitetty), tutkimme mahdollisuutta, että ROS oli mukana. Todellakin, peptidi A-8R hoito johti merkittävään ROS induktioon LNCaP 30 minuutin (Fig. 4A), kun taas sGCα1-negatiivinen PC-3-solut eivät reagoi (Kuva. S5a). Tärkeää on, että aktiivinen peptidi, C-8R, ei aiheuttaa ROS sukupolvi (Fig. S5B). Kuten odotettua, ROS sukupolvi LNCaP-soluissa nousivat, kun peptidi A-8R pitoisuus nostettiin 10-25 uM, mutta yllättäen laski 50 uM (Fig. 4A). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ROS: n syntyminen voi olla vastuussa peptidi A-8R sytotoksisuuden alhaisemmilla pitoisuuksilla 10 ja 25 uM, mutta ei 50 uM.

(A) C81-soluja käsiteltiin Ajoneuvo tai eri umolaarisena pitoisuudet Peptidi A-8R ja ilman tai 0-5 mM NAC ja seurattava ROS sukupolvi jälkeen 0-30 min mitattuna fluoresenssin intensiteetti (FI). Pylväsdiagrammit edustavat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ja keskihajontaa. Huomaa, että tähdellä pylväsnäytöllä löytyi NAC verrataan vastaavia tietoja ilman NAC. (B) C81-soluja käsiteltiin Ajoneuvo tai erilaisia ​​pitoisuuksia peptidi A-8R, kuten on esitetty, ja 0-5 mM NAC, kuten on esitetty, ja seurataan solujen määrä jälkeen 0-6 päivää inkuboinnin mitattuna MTT: llä. Tietopisteet edustavat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ja keskihajontaa. Tähdet osoittavat tilastollista merkittävyyttä (P 0,04). (C) C81-soluja käsiteltiin Ajoneuvo tai erilaisia ​​pitoisuuksia peptidi A-8R, kuten on esitetty, ja tai ilman 5 mM NAC, kuten on esitetty, ja seurataan DNA-vaurioita jälkeen 1 tunnin inkuboinnin mitattuna Comet määrityksellä.

Ongelman mahdollisuus, käytimme ROS puhdistusainetta NAC (N-asetyylikysteiini) [18]. Kuten on esitetty kuviossa. 5B, NAC kykeni täydellisesti pelastaa solujen lisääntymisen käsitelty 10pM peptidiä A-8R tai lähes täysin 25 uM. Nämä NAC vaikutukset leviämisen vastaavat NAC vaikutuksia peptidi A-8R välittämää ROS sukupolven (Fig. 4A), mikä viittaa vahvasti siihen, että ROS sukupolvi on vastuussa Peptide sytotoksisuutta. Mielenkiintoista on, että NAC ei merkittävästi pelastaa solujen kasvun käsiteltiin 50 uM peptidi A-8R (Fig. 4B). Tämä havainto yhdessä aikaisemmassa tulos osoittaa minimaalinen ROS induktion kanssa 50 uM peptidi A-8R (kts. 4A), väittävät, että tämä korkea pitoisuus peptidi A-8R tappaa soluja kautta mekanismi riippumaton ROS sukupolvi.

(A) LNCaP, (B) PC-3, tai (C) Cos-soluja käsiteltiin Ajoneuvo, peptidi A-8R (10 uM), tai etoposidi (20 uM) ja 0-24 tuntia ja altistettiin kaspaasi määritys apoptoosin mittaamiseksi. Pylväsdiagrammit edustavat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ja keskihajontaa. Kaikki toimet ovat suhteessa ensimmäinen edellytys, ja tämä aktiivisuus asetettiin 1. Tähdet osoittavat tilastollista merkittävyyttä (P 0,005). (D) LNCaP-soluja käsiteltiin Ajoneuvo, Peptide C-8R, peptidi A-8R, tai etoposidi (kunkin lääkkeen 50 uM) 8 tunnin ajan ja tarkkailtiin apoptoosin mittaamalla PARP pilkkomalla käyttäen Western-blottauksella. Huomaa, että β-aktiini käyttää ohjaamaan proteiinin lisäämistä.

ROS-solukuolema liittyy DNA-vaurioita [19], joka on indusoitu heikosti 10 uM peptidi A-8R ja paljon muuta voimakkaasti 25 uM, mitattuna Comet määrityksellä (Fig. 4C); tärkeintä, tämä induktio on täysin tukossa NAC, mikä osoittaa selvästi peptidi-A-8R aiheuttama DNA-vaurioita vaatii ROS sukupolvi. Mielenkiintoista on, että 50 uM peptidi A-8R, joka tappaa useimmat solut, ei synnytä Comet signaalin (Fig. 4C). Kuten on esitetty kuviossa. S6, tämä pitoisuus peptidin tappaa soluja ja häiritsee niiden ydinten ja DNA niin, että DAPI värjäys sadot mitään signaalia ja NAC ei ollut vaikutusta.

peptidi A: aiheuttaa apoptoosia eturauhassyöpäsolujen

Kohonneita Kuten on esitetty kuviossa.