Krooninen sairaus

tiivistelmä

tutkia monimuotoisuuden ja johdonmukaisuutta signalointireittien jotka säätelevät kasvainten solujen vaeltamiseen, päätimme kolme ihmisen kasvainsolulinjoja jotka kulkeutuivat hoidon jälkeen EGF. Sitten määrällisesti vaikutus viidentoista estäjien ekspressiotasoja tai fosforylaation tasoja yhdeksän proteiineja, jotka oli indusoitu EGF stimulaation kussakin näistä solulinjoista. Tietojen perusteella Tässä tutkimuksessa saadut ja kemiallis-biologisiin oletuksia, me päätellä solumigraatiota reittejä kussakin tuumorisolulinja, ja sitten verrataan niitä. Tämän seurauksena olemme havainneet, että sekä MEK /ERK ja JNK /c-Jun reittejä aktivoitiin kaikissa kolmessa vaeltavat solulinjoissa. Lisäksi GSK-3 ja p38 todettiin säädellä PI3K /Akt-reitin vain EC109 soluissa, ja JNK havaittiin ylikuulumisongelmissa p38 ja Fos liittyvät väylän vain TT soluissa. Yhdessä meidän analyyttinen järjestelmä voisi helposti erottaa yhteisen ja solutyyppispesifiselle reittejä vastuussa kasvaimen solujen vaeltamiseen.

Citation: Magi S, Saeki Y, Kasamatsu M, Tashiro E, Imoto M (2014) Chemical genominen-Based Pathway Analyysit kasvutekijän-välitteistä signalointia siirryttäessä syöpäsoluja. PLoS ONE 9 (5): e96776. doi: 10,1371 /journal.pone.0096776

Editor: Laszlo Buday, Unkarin tiedeakatemian, Unkari

vastaanotettu: 10 marraskuu 2013; Hyväksytty: 11 huhtikuu 2014; Julkaistu: 12 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Magi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Grant-in-tuki Challenging kartoittava tutkimus ja JSPS Fellows, opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede-, and Technology, Japani. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cell siirto on keskeinen monissa fysiologisissa prosesseissa, mukaan lukien alkion kehitys, haavan, immuunivasteita sekä kasvainsolun invaasiota ja etäpesäkkeiden [1]. Kun kasvainsolun liikkuu, useita signalointireittejä aloitetaan kautta reseptorityrosiinikinaasit (RTK: t), G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t), integriinit ja muut reseptorit. Merkittävä esimerkki RTK on epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), joka aktivoidaan sitomalla sen ligandin, epidermaalinen kasvutekijä (EGF) [2]. Aktivointi EGFR johtaa aktivoinnin yhden tai useamman väli- signalointiverkkoon oksat, jotka säätelevät solun liikkuvuus, kuten solunulkoinen-säännelty kinaasin (ERK) reitti [3], fosfoinositidi 3-OH-kinaasi (PI3K) reitti [4], Janus-kinaasi (Jak) reitin [5], c-Jun NH2 terminaali kinaasin (JNK) reitin, ja p38-reitin [6], [7].

ydinkohdat solunsisäisen muuttoliikkeeseen signalointi verkko on osoitettu aikaisemmissa tutkimuksissa. On kuitenkin todennäköistä, että molekyylejä, jotka säätelevät solujen vaeltamiseen yhdessä syöpäsolujen ei voi säädellä solujen vaeltamiseen muilla geneettisesti erilaista syöpäsoluja. Useat aiemmat raportit ovat osoittaneet, että kunkin syöpäsolun käynnistää siirtolaisuutta eri yhteyksissä käytetään erillistä molekyylien valikoimia, vaikka sama perusajatus solumigraation indusoi [8], [9]. Siksi ymmärtäminen monimuotoisuus ja yleisyyttä signalointireittien jotka säätelevät kasvainsolujen muuttoliikkeen eri solutyyppejä on tärkeää paitsi perustutkimusta solujen vaeltamiseen, mutta myös kehittämiseen antimetastaattisia anti-kasvain huumeet.

ongelman ratkaisemiseksi, olemme aiemmin tutkineet vaikutusta pienmolekyylisalpaajien kymmeneen solumigraatiota tyyppiä. Me eron yhteisen ja solutyyppispesifiselle signaaleja vastaavien solujen vaeltamiseen [10]. Aiempi tutkimus on osoittanut, jotka molekyylit ovat todella osallistuu solun migraatio kunkin syöpäsolun tyyppi. Kuitenkin signalointi verkot näiden molekyylien, jotka säätelevät solujen vaeltamiseen jää epäselväksi. Tässä raportissa käsitellä tätä asiaa, käytimme lähestymistapa yhdistetään kemiallisen genetiikan ja systeemibiologian, mikä on vähitellen tunnustettu käyttökelpoinen menetelmä liittäessään signalointireitin verkkojen [11]. Edellisessä raportissa, olemme huomanneet, että kolme syöpäsolulinjoissa (eli epidermaalinen karsinooma A431-soluja, ruokatorven karsinooma EC109 soluja, ja kilpirauhasen karsinooma TT soluja) hankitaan solun liikkuvuus EGF stimulaation, mutta kemosensitiivisyys klusterin analyysi osoitti, että A431-soluja ja EC109 solut ovat ryhmittyneet samaan klusteriin, toisaalta, TT-solut luokitellaan eri klusteriin. Näin ollen tässä tutkimuksessa, paljastaa monimuotoisuutta ja yhtenäisyyttä EGF-indusoidun signalointireitin säätelevä solumigraatiota näiden kolmen soluissa, me kvantitatiivisesti tutkittiin, mikä vaikutus kemiallisten estäjien EGF-indusoidun ilmentymisen tasoa tai fosforylaation tasolla useiden signalointimolekyylien tunnistaa joka signalointi molekyyli toimii ylävirtaan muiden signalointimolekyylien. Käyttäen näiden kokeiden tulokset, kartoitimme solu muuttoliike polku kussakin tasyöpäsolulinja, ja vertasi polku karttoja paljastaa verkon topologian olevan joko yhteinen kaikille syöpäsolujen tai erityisesti tiettyihin solutyyppeihin.

tulokset

eri aktivointia malleja EGF signaloinnin yksi kolmesta syöpäsolulinjoja

Ensinnäkin, havaitsimme fosforylaatiota tai ilmaus signalointimolekyylien aiheuttama EGF kolmella syöpäsolulinjoissa yli ajan myötä (kuvio 1 ja S1). Autofosforylaation EGF-reseptorin ja sen jälkeen EGF-indusoitu fosforylaatio p38 molemmat havaittiin kaikissa solulinjoissa, 5 min jälkeen, EGF stimulaation, kuten hyvin tiedetään. Kasvu ilmentymisen c-Fos ja fosforylaation c-Jun havaittiin kaikissa solulinjoissa 1 h kuluttua EGF stimulaation. Toisaalta, useita muita molekyylejä osoitti eri aika-riippuvainen aktivaatio profiilit näiden kolmen syöpäsolulinjoja. Esimerkiksi, fosforylaatiota Akt (p-Akt, S473 ja T308 jäämät) indusoitiin välillä 5 min ja 1 h jälkeen, EGF stimulaation EC109 soluissa ja TT-soluja. Kuitenkin fosforylaation tasot p-Akt (S473) ja p-Akt (T308) A431-solut olivat melko vakiona jopa sen jälkeen, EGF stimulaation jopa 12 tuntia. Lisäksi, suhteellinen intensiteetti p-Akt (T308) oli maksimi-intensiteetti 5 min sen jälkeen, kun EGF-stimulaation TT-soluissa, mutta sen jälkeen 1 h EC109 soluissa. Rakenteessa ERK-fosforylaation (p-ERK) on myös erilainen yksi kolmesta syöpäsolun riviä. ERK oli ohimenevästi fosforyloitiin EGF stimulaation kaikissa kolmessa soluissa, kun taas sen huippu havaittiin 5 min kuluttua EGF stimulaation A431-soluissa ja EC109 soluja, ja sen jälkeen 1 h TT soluissa. Ilmentymisen taso EGFR alkoi laskea seuraavasti EGF stimulaation EC109 soluissa ja TT-solut, mutta ei A431-soluissa.

A431-soluja, EC109 soluja, ja TT-solut EGF (30 ng ml

-1) varten ilmoitettu aika ja kokosoluliuotteista joutuivat western blotting. A.U., mielivaltainen yksikkö normalisoitunut intensiteetti aktiini. Keinot ja SDS kolmen itsenäisen kokeen näkyvät. Kuvaajan värit ovat kumpikin solulinja tiedot: A431-solut (punainen), EC109 solut (vihreä), ja TT-solut (sininen). Katkoviiva osoittaa, että EGF stimulaatio ei aiheuttanut merkittävää muutosta A.U. Kunkin molekyylin (Yksisuuntainen ANOVA). Alkuperäiset immunoblottaus kuvat on esitetty kuvassa S1.

Vaikutukset muuttoliikkeen estäjien EGF muuttoliikkeelle signalointi

Seuraavaksi tutkimme vaikutuksia 15 estäjien, mikä vaikutti kykyä solut voivat siirtyä edellisessä raportissa [10], on EGF: n indusoiman fosforylaation tai ilmentymistä näiden signalointimolekyylien ajanhetkellä, jolla on suurin intensiteetti kunkin signalointimolekyyli kuten on esitetty ajan funktiona (taulukko S1) kussakin syövän solulinja ( Kuva S2). Taulukko S2 luetellaan ja kokeellisen pitoisuuksia käytetään kemian estäjien signaalitransduktion tässä tutkimuksessa käytetyt, ja niiden toimintatavat. Immunoblottaustietojen kuvat Kuvassa S2 kuuluu bändejä kustakin neljä edellytystä: negatiivinen kontrolli (EGR – ja estäjä -, kaista 1), positiivinen kontrolli (EGF + ja estäjä -, kaista 2), sekä EGF ja estäjän käsiteltyjen ehto (EGF + ja estäjä +, kaista 3), ja estäjä saaneista ehto (EGR – ja estäjä +, kaista 4). Määrällisesti inhibiittorien vaikutus, me normalisoidaan sitten signaalin voimakkuus niin, että kaista 1 (toisin sanoen ei-käsitelty ehto) nimettiin 0, ja kaista 2 (eli EGF-käsiteltyjen ehto), joka oli nimetty 1. Perustuen näiden standardien me määrällisesti suhteellisen signaalin voimakkuuden kaistat 3 ja 4, ja lopulta saimme kvantitatiivinen aineisto vaikutuksesta kemiallisten estäjien EGF muuttoliikkeelle signalointi kussakin solulinjassa (kuva 2).

Heat kartat kuvaavat vaikutuksia pienmolekyylisalpaajien EGF-indusoitu signalointi A431-soluissa (ylhäällä), EC109 solut (keskellä), ja TT soluja (alhaalla). Data normalisoitiin keskitys ei kohdella kunnossa kuin 0, ja skaalaus EGF-käsiteltyjen ehto 1. Kaikkia solulinjoja käsiteltiin EGF jälkeen esikäsittely estäjillä 15 minuutin ajan. Sen jälkeen, kun osoitetun ajan, solut kerättiin ja niille suoritettiin Western blot. AMD; Aktinomysiini D, CHX; Sykloheksimidi, HMA; Herbimycin A. pitoisuus kemialliset estäjät on lueteltu taulukossa S2. Alkuperäiset immunoblottaus kuvat on esitetty kuvassa S2.

vähentäminen muuttoliikkeen signalointi kolmella syöpäsolulinjoissa

jälkeen olemme yrittäneet päätellä signalointiverkon säätelevät solujen vaeltamiseen kussakin tasyöpäsolulinja perustuvat on kemosensitiivisyys profiilit saatuna ilmentymistilanne EGF aiheuttama signalointi molekyylejä. Alalla kemiallisen biologian, signalointireitin voidaan päätellä käyttäen käsitettä on kuvattu kuviossa 3 (katso myös, Kokeelliset menetelmät). Sen määrittämiseksi, ovatko inhibiittorit häiritsi signalointi molekyylien tai ei, määrittelimme ± 0,5 kynnysarvona. Kun kyseessä on kuviossa 3a, MEK inhibiittori U0126 tukahdutetaan EGF-indusoitu fosforylaatio ERK (p-ERK) yli 50%. Tällaisissa tapauksissa määrittelimme kaksi positiivista signaalia määräykset; yksi EGFR MEK, ja toinen MEK p-ERK. Kun kyseessä on kuviossa 3b, PI3K-inhibiittori LY294002 kasvoi EGF-indusoitu c-Fos-ekspressiota yli 50%. Näissä tapauksissa määrittelimme olemassaolo yksi positiivinen asetuksen suhde ei EGFR c-Fos ja yksi negatiivinen sääntely suhde ei PI3K c-Fos. Siinä tapauksessa, kuvion 3c, GSK-3-estäjällä SB415286 kasvanut c-Jun-ilmentymisen ilman EGF stimulaatiota. Näissä tapauksissa määrittelimme olemassaolo yksi positiivinen asetuksen suhde ei EGFR c-Jun ja yksi negatiivinen sääntely suhde ei GSK-3 c-kesäkuu Tällä tavoin, joka perustuu semi-kvantitatiivinen profiili (kuvio 2 ja käsite on kuvattu kuviossa 3), me päätellä signalointiverkon kullekin syövän solulinja allekirjoitettu suunnattu graafi (kuvio 4). EGR muuttoliikkeelle väylän A431 jotka koostuivat 19 solmua ja 39 reunat (kuva 4a), polku on EC109 jotka koostuivat 22 solmua ja 62 reunat (kuvio 4b), ja väylän TT soluissa koostui 21 solmujen ja 51 reunat (kuvio 4c). Syy, miksi määrä reittejä A431-soluissa on vähemmän kuin kahdessa muussa solulinjat voisi olla, että tasot p-Akt (T308) ja p-Akt (S473) ei voitu arvioida A431-soluissa.

Yksityiskohtainen kuvaus on esitetty tulokset osiossa ja kokeelliset menetelmät jaksossa.

EGF muuttoliikkeelle signalointia verkossa (a) A431-solut, (b) EC109 soluja, ja (c) TT soluja. Kynnys asetettiin ± 50% positiivisista kontrolli. Reunan väri päätetään perustuu merkki reunoilla; punainen osoittaa positiivinen signalointi ja sininen ilmaisee kielteisiä signalointi. Koko solmu osoittaa määrä yhdistää reunat. Väri solmun osoittaa, kuinka monta lähtö reitit: gradientti väriskaalan vihreästä punaiseksi, interpoloitu yli keltainen.

vertailu signalointipolkujen kussakin tasyöpäsolulinja

Based näiden polku karttoja, poimimamme yhteinen rakenne signalointipolkujen solun kulkua kaikissa kolmessa syöpäsolulinjasta tässä tutkimuksessa. Kuva 5a esittää yhteisen topologia joukossa kolme solulinjat. Tämä yhteinen polku sisältää MEK /ERK /c-Fos reitti ja JNK /c-Jun-reitin, joille molemmille on laajalti tutkittu alalla solumigraation [6], [7], [12], [13]. Olemme myös havainneet, että MEK säädellään ekspressiotasot c-Fos ja p21, ja että PI3K tukahdutti ekspressiotasot c-Fos kolmen syöpäsolulinjoissa. Toisaalta, muut EGFR-säännelty signaalit kuten ROCK ja CysLT1 ei ollut tuotos reittejä, mikä viittaa siihen, että loppupään signaaleja näiden molekyylien voivat vaihdella keskenään tasyöpäsolulinja. Seuraavaksi arvioitiin erityisiä rakenteita migraation liittyvien signalointireittien kullakin syöpäsolulinjoissa (kuvio 5b~d). Erityinen väylän A431-soluissa sisältää vain 11 polkuja, mukaan lukien p-JNK → c-Jun ilmaisun ja 5-lipoksigenaasin (5-LO) → c-Fos. Määrän erityisiä reittejä EC109 soluissa ja TT solut ovat 24 ja 13, vastaavasti, mikä osoittaa, että noin viidesosa kolmasosa reittejä näissä soluissa ovat cell-type-riippuvaisten reittien.

(a ) yhteinen EGF-indusoitu signaali verkkoon joukossa kolme syöpäsolun riviä. (B~d) Erityinen EGF-indusoitu signaali verkon (b) A431-solut, (c) EC109 soluja, ja (d) TT-soluja. Reunan väri päätetään perustuu merkki reunoilla; punainen osoittaa positiivinen signalointi ja sininen ilmaisee kielteisiä signalointi.

Aikaisemmassa tutkimuksessa, me ennustaa, että vastaavia reittejä aiheuttamiseksi ja säätelevät soluvaelluksen A431-soluissa ja EC109 soluja, mutta nämä reitit voivat olla erilaisia ​​kuin TT soluihin [10]. Selventää ero signalointireittejä kahden ryhmän välillä, me sitten verrataan signaloinnin reitit EC109 solujen ja TT-soluja, joka sisältää kaikki samat solmut (kuvio 6). Kuvio 6a esittää päällekkäisen reitin topologiaa molemmissa solulinjoissa. Tämä polku kartta sisältää PI3K → p-Akt, JNK → p-Akt (S473) ja ROCK → p-p38, mikä viittaa siihen, että nämä reitit olla johdonmukainen rooli solujen vaeltamiseen. Kuva 6b, c esittelee erityinen polku topologioita vuonna EC109 soluissa ja TT-soluissa, vastaavasti. Yhteensä 29 reittiä (47% reittejä EC109 solut), kuten MEK → c-Jun, GSK-3 → p-Akt (S473) ja HMG-CoA-→ Pakt (T308), ovat spesifisiä EC109 soluja, ja 18 reittiä (35% reittejä TT soluissa), kuten p-JNK → p-p38, ja ROCK → c-Fos, ovat spesifisiä TT soluja. Fosforylaation p-Akt on ajan säädellä p38, GSK-3, ja HMG-CoA: EC109 soluissa, vaikkei ollut mitään erityistä positiivinen polku p-Akt TT soluissa. Toisaalta, JNK tarvitaan lisäystä sekä c-Fos ilmaisua ja fosforylaatiota p38 TT soluissa, kun taas tällaista sääntelyä ei havaittu EC109 soluissa. Lisäksi on EGFR-p38 positiivista palautetta silmukka TT soluissa, mutta ei ole sellaista väylän EC109 soluissa. Nämä tulokset osoittavat, että aktivointi Akt voi olla keskeinen solun migraation EC109 soluja, mutta Akt aktivaatioreitin riippuu syöpäsolujen tyyppejä. Lisäksi stressi-reagoiva MAPK reitti voi olla määräävässä asemassa sääntelyn koulutusjakson solumigraation TT soluja.

(a) yhteinen signalointi verkon välillä EC109 solujen ja TT soluja. (B) erityiset EGF-indusoitu signaali verkon EC109 soluissa. (C) Erityinen EGF-indusoitu signaali verkon TT soluissa. Reunan väri päätetään perustuu merkki reunoilla; punainen osoittaa positiivinen signalointi ja sininen ilmaisee kielteisiä signalointi.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa kartoitimme sääntely signalointi väyliä soluvaelluksen orvaskeden karsinooma A431-solut, ruokatorven syöpä EC109 soluja ja kilpirauhaskarsinoomaa TT soluja. Vertaamalla niitä, me paljasti yhteisiä reittejä kolmen solulinjoissa ja tunnistettu solun tyyppikohtaista signalointireittien, joka perustuu kemialliseen geneettinen ja systeemibiologian lähestymistavan. Saavuttaakseen tämän tavoitteen, meillä ensinnäkin verrattuna ajasta riippuva aktivointi kuviot signalointimolekyylien kussakin solulinjassa mukana EGF-indusoidun solujen vaeltamiseen. Aktivointi kuviot noin signalointimolekyylien ovat osittain erilaiset näiden kolmen syöpäsolulinjoissa (kuvio 1). Esimerkiksi, aktivointi kuviot c-Fos ja p-p38 ovat melko samankaltainen kaikissa kolmessa syöpäsolulinjoissa testattu, kun taas kuviot p-ERK ja p-c-Jun ovat erilaisia. Suhteelliset intensiteetit pitkittyneen p-ERK ja p-c-Jun TT solut ovat korkeammat kuin A431-soluissa ja EC109 soluja. Kiinnostavaa kyllä, tämä ero on sopusoinnussa aiemmin raportoitu luokitukset pysyvät kemosensitiivisyys profiilien näiden kolmen solulinjoista [10], mikä viittaa siihen, että jatkuva ERK ja c-Jun-fosforylaation osallistuvat solutyyppispesifisten väyliä soluvaelluksen TT soluissa. Ottaen positiivista palautetta mekanismi, jonka jatkuva JNK toiminta voi edistää ERK signalointi IRS-2 [14] kerrottiin, nämä mekanismit voivat toimia myös TT solujen vaeltamiseen. Sitä vastoin, fosforylaatiota Akt indusoitiin EGF stimulaation EC109 soluissa ja TT-solut, mutta fosforylaation tasot Akt olivat hieman vakio A431-soluissa EGF stimulaatiota. Aiemmin olemme raportoitu, että EGF-indusoidun migraation A431-solujen tukahdutetaan lisäämällä PI3K-estäjien [10]. Näin ollen vaikka EGF ei merkittävästi indusoi Akt fosforylaation, vakaassa tilassa fosforyloitu ja aktivoitua Akt tarvitaan EGF aiheuttama muuttoliike A431 soluja. Toinen ero ajan funktiona dataa kolmen syöpäsolulinjoissa on esitetty ilmentymisen taso EGFR. EGF stimulaatio väheni ilmentymistason EGFR EC109 soluissa ja TT-solut, mutta ei A431-soluissa. Kun EGF sitoutuu EGFR: ään, EGFR: n tiedetään internalisoidaan nopeasti solun pinnan kautta useita reittejä pitkin, mukaan lukien clathrin päällystetty kuoppia [9], [15]. Sisäistetään reseptorit ovat joko kierrätetään solun pinnalle tai kuljetetaan lysosomeihin hajoamista. On hyvin tunnettua, että kohtalo reseptorien ohjataan useita proteiineja, kun sisäistämisen, kuten CBL ja LRRK1 [16], [17]. Siten tuloksemme saattavat osoittaa, että sääntely EGF aiheuttama reseptorin hajoaminen on erilainen yksi kolmesta syöpäsolun riviä, ja tämä ero sanelee jatkuva aktivointi alavirran signalointia tavoitteita.

Regulatory väyliä soluvaelluksen kussakin syöpä solulinja määritettiin tutkimalla vaikutusta solujen vaeltamiseen estäjien signaalitransduktioon molekyylejä (kuvio 4). Päällekkäin reitti topologia kaikissa kolmessa testattu solulinjoissa sisältää JNK → p-c-Jun, joka on ennustettu yhteinen säädin aikaisemmassa tutkimuksessa. Tämä viittaa siihen, että sääntelyn signalointia syöpäsolun siirtymää JNK kautta fosforylaation c-Jun on todella yhteinen mekanismi kaikenlaisia ​​syöpäsoluja. Koska emme voineet havaita merkittäviä säätely ylöspäin p-Akt in EGF stimuloimaa A431 solut tässä tutkimuksessa, EGF signalointireitille Kartan A431-soluissa voinut sisällyttää sääntelyn p-Akt ja sisältää siten myös vähemmän solmuja ja reunat kuin että EC109 solut ja TT solujen meidän analyysimenetelmä. Siksi tulkinta vertailun joukossa reitin kartat joukossa kolme syöpäsolulinjoista on tehtävä varovaisesti.

Jos haluat keskustella ja tulosten varmistamiseksi Ryhmäanalyysin edellisessä raportissa [10], vihdoin verrattuna polun kartan vastuussa solujen välistä muuttoliikettä EC109 solujen ja TT soluja, ja määritti päällekkäin tai solutyyppispesifisten topologia (kuva 6). Akt-fosforylaation aallot EC109 solut ovat hitaampia kuin TT-soluissa (kuvio 1 ja taulukko S1), mikä viittaa siihen, että useamman välittävän proteiinit säätelevät Akt: n fosforylaation EC109 soluja kuin TT soluja. Itse asiassa, taso Akt-fosforylaation oli säädelty p38, GSK-3, ja HMG-CoA-in EC109 soluissa, kun taas näitä reittejä ei sisällytetty TT-soluissa (kuvio 6b, c). Toisaalta, ERK-fosforylaation aallot TT solut ovat hitaampia ja jatkuvaa kuin EC109 soluissa (kuvio 1 ja taulukko S1), mikä viittaa siihen, että enemmän väli- proteiinit säätelevät ERK-fosforylaation TT soluja kuin EC109 soluja. Mutta emme voineet havaita mitään erityistä sääntelyä, joka voi ylläpitää fosforylaation taso ERK TT soluissa. Katsomme, että toinen molekyyli emme arvioida tässä tutkimuksessa voi edistää kestävää ERK-fosforylaation. Nämä erot EGF aiheuttama signalointireitin saattaa heijastaa eroja tilassa solumigraation perustuvan solumorfologiaan. Aiemmissa tutkimuksessa, huomasimme, että EC109 solut siirretään säilyttäen solu-solu kontaktit (kollektiivinen muuttoliike), mutta TT solut siirretään yksittäisinä soluina (yksittäinen siirtyminen) [10]. Valossa edellä esitetyistä tuloksista, on todennäköistä, että syöpäsolut liikkua yhden solun, kun MAPK-reitti on jatkuvasti päällä, kun taas solut vaeltavat yhdessä ja säilyttää solu-solu-adheesio, kun PI3K /Akt-reitillä on jatkuvasti aktivoitu p38 ja GKS- 3. Nämä erilliset roolit MAPK ja PI3K väyliä muuttoliike tilat on myös tukevat seuraavat aiemmissa raporteissa. MAPK aktivointi ollen indusoi RhoA aktivointi ja epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä-siirtymä, kun taas PI3K aktivointi estää RhoA toimintaa paksusuolensyöpä [9]. Lisäksi PI3K rekrytoimista kiinnitysalueisiin [18], jossa niiden aktivointi kadheriinin signaloinnin vaikutukset kadheriinin toiminta ja vahvistaa solu-soluadheesion [19], [20]. Tähän voi liittyä PI3K aiheuttama Rac1 aktivointia, koska E-kadheriinin stimuloimaa aktiinisytoskeletonver- uudelleenjärjestely edellyttää Rac aktivointia ja PI3P aktivoituva GEF Tiam1 [21].

Yhdessä meidän kemiallinen genomi- perustuu polku analyysi kolmessa syöpäsolun linjat osoittaa johdonmukaisuutta ja vaihtelua EGF aiheuttama sääntelyn signalointireitin säätelemiseksi syöpäsolun kulkeutumiselle solutyyppejä yhdistämällä lähestymistapa kemiallisen biologian ja systeemibiologian. Erityisesti GSK-3 ja p38 säädellä p-Akt vain ruokatorven syöpä EC109 soluja, toisaalta, JNK säätelee p38 ja Fos liittyvät polku vain kilpirauhaskarsinoomaa TT soluja. Nämä havainnot osoittavat, että jotkut solutyyppispesifiselle signalointireitin säätö- solujen vaeltamiseen olisi terapeuttista kohdemolekyylit solutyyppispesifisiä syövän etäpesäkkeiden: GSK-3- ja p38- liittyviä reittejä ruokatorven syöpä, ja stressi reagoiva-MAPK-relaterd reittejä kilpirauhassyövän . Kuitenkin ymmärtää yhdenmukaisuus ja erilaisten sääntelyyn liittyvien signalointireitin tarkemmin, on olemassa useita kysymyksiä meidän pitäisi käsitellä tulevaisuudessa. Olimme aikaisemmin yksi estäjää yhtä vastaan ​​signalointi molekyyli tässä tutkimuksessa useita estäjiä vastaan ​​yksi signalointi molekyyli olisi käytettävä spesifisyyden varmistamiseksi estäjiä. Lisäksi kun me vaikutusten arvioimiseksi estäjien EGF-indusoitu fosforylaatio tai ilmentymistä näiden signalointimolekyylien olisi tarkistettava. Olisi myös suunniteltava miten erottaa sääntelyn koulutusjakson solujen siirtymisen kyseisestä muita soluvasteita kuten solujen kasvua. Kuitenkin tässä tutkimuksessa, tarjoamme uuden lähestymistavan ymmärtämiseksi ominaisuuksia syövän solujen vaeltamiseen signalointi, ja avaa mahdollisuuksia paljastaa uutta rakenteisen tavoitteeksi syövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

A431-soluja (saatu ATCC CRL-1555) pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 5% vasikan seerumia (CS), 0,1 gl

-1 kanamysiiniä, 100 yksikköä ml

-1 penisilliini G, 0,6 gl

-1 L-glutamiinia ja 2,5 gl

-1 NaHCO

3. EC109 (lahjakas tri Doki, Osakan yliopisto, Japani), TT-solut (lahjakas peräisin KIRIN yhtiö, Japani) ylläpidettiin Roswell Park Memorial Institute (RPMI) väliaine 1640 lisätty 5% FBS, 0,1 gl

-1 kanamysiiniä , 100 yksikköä ml

-1 penisilliini G, 0,6 gl

-1 L-glutamiinia ja 2,5 gl

-1 NaHCO

3. Tavanomaisesta kulttuuri, soluja inkuboitiin vakio kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO

2.

reagenssit

AG1478 (EGFR estäjä), rapamysiini (mTOR-estäjä), ja Y27632 (ROCK-estäjä) hankittiin Calbiochem. MK571 (CysLT1 estäjä) hankittiin Cayman. AA861 (5-lipoksigenaasin estäjä), aktinomysiini D (Transcription-estäjä), Sykloheksimidi (Translation estäjä), LY294002 (PI3K-estäjä), mevastatiini (HMG-CoA-reduktaasi-inhibiittori), MG132 (Proteasome estäjä), SB203580 (p38-estäjä), SB415286 ( GSK-3: n estäjä), SP600125 (JNK-inhibiittori), U0126 (MEK: n estäjä) ja epidermaalisen kasvutekijän (EGF) hankittiin Sigmalta. Herbimycin A (Hsp90 estäjä) puhdistettiin viljelmistä

Streptomyces

sp. omassa laboratoriossa.

Western-blottaus

jälkeen esikäsittely joko ajoneuvon tai inhibiittorit 15 minuuttia, solut käsiteltiin EGF varten ilmoitettuun aikaan. Solut lyysattiin RIPA-puskuriin (25 mM Hepes pH 7,8, 1,5% Triton X-100, 1% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 0,5 M NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 0,1 mM natriumvanadaattia, 1 mM PMSF, ja 0,1 mg ml

-1 leupeptiiniä) 4 ° C: sonikoimalla. Lysaatit sentrifugoitiin ja supernatantit otettiin talteen. Sen jälkeen, kun määritetään proteiinin konsentraatio kussakin lysaatissa, ja jotka kiehuvat yhtä suureen tilavuuteen latauspuskuria (150 mM Tris pH 6,8, 30% glyserolia, 3% SDS, 15 mg ml

-1 bromifenoli väriainetta, ja 100 mM 2 merkaptoetanoli), näytteitä elektroforeesi polyakryyliamidigeelissä. Proteiinit siirrettiin PVDF-kalvolle, ja immunoblotattiin. Vasta-aineita, käytetään immunoblottauksella olivat: anti-EGF-reseptori-vasta-aineen (# 2232), anti-Akt-vasta-ainetta (# 9272), anti-fosfo-Akt (Thr308) vasta-aineen (# 9275), anti-fosfo-Akt (Ser473) vasta-aineen (# 9271), anti-c-Jun-vasta-ainetta (# 9165), anti-fosfo-p38-vasta-ainetta (# 9211), anti-MAPK (ERK 1/2) vasta-aineen (# 9102), anti-fosfo-MAPK (ERK 1/2 ) vasta-aine (# 9101) (Cell Signaling); anti-c-Fos-vasta-ainetta (sc-7202), anti-p38-vasta-ainetta (sc-7972), anti-p21-vasta-ainetta (sc-397) (Santa Cruz Biotechnology); anti-fosfo-tyrosiini-vasta-aine (05-321) (Upstate); anti-fosfo-c-Jun-ainetta (558036) (BD Pharmingen); anti-β-aktiini-vasta-aine (A5316) (Sigma).

Tilastollinen

Yksisuuntainen ANOVA määrittämiseen käytettiin merkittäviä eroja aikasarjatietoja sarjaa. Pearsonin korrelaatiokerroin käytettiin varmistamaan toistettavuus tietojen. Nämä tilastolliset analyysit laskettiin käyttäen R (www.r-project.org/).

Verkko vähennyksen perustuvat kemiallisen biologian

Allekirjoitettu suunnattu verkosto pääteltiin erilaisesta proteiinin fosforylaatioon tai ekspressiotasot välillä valehoidettujen ja estäjä käsiteltyjen tietojen mukaan säännön kuvassa 3. Tämä sääntö sisältää kolme yksinkertaista oletuksia, joita käytetään yleisesti kemiallisen biologian: a) että on olemassa positiivinen sääntely molekyylin X molekyylin Y kun taso molekyylin Y: n läsnä ollessa sekä EGF: n ja inhibiittorin X on yli 50% pienempi kuin EGF-käsiteltyjen tilassa; b) On olemassa negatiivinen sääntely molekyylin X molekyylin Y kun taso molekyylin Y läsnä sekä EGF ja estäjä X on yli 50% suurempi kuin EGF-käsiteltyjen kunnossa; c) On olemassa negatiivinen sääntely molekyylin X molekyylin Y kun taso molekyylin Y läsnä ollessa estäjä X on suurempi kuin puolet tason EGF-käsiteltyjen kunnossa. Tietojenkäsittely, joka lopuksi tulostaa reitin tiedot koostuvat lähdesolmun, tavoite solmu, ja sääntelyn tyyppiä (positiivinen tai negatiivinen) suoritettiin käyttäen R. Tämä tiedosto tuodaan Cytoscape ohjelmisto (www.cytoscape.org/), ja signalointireittiin kartat syntyi. Vertailu koulutusjakson topologian myös suoritetaan käyttämällä Cytoscape kehittyneitä verkon yhdistämisen plugin.

tukeminen Information

Kuva S1.

edustaja immunoblot kuvat esitetään kuviossa 1. (a) A431-solut, (b) EC109 soluja, ja (c) TT-soluja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0096776.s001

(PDF)

Kuva S2.

edustaja immunoblot kuvat on esitetty kuvassa 2. (a) A431-solut, (b) EC109 soluja, ja (c) TT-soluja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0096776.s002

(PDF)

Taulukko S1.

arviointi aikajana vaikutusten inhibiittoreina.

doi: 10,1371 /journal.pone.0096776.s003

(DOCX)

Taulukko S2.

Yhdiste pitoisuuksia ja tavoitteet esto Tässä tutkimuksessa käytetyt.

doi: 10,1371 /journal.pone.0096776.s004

(DOCX) B