Krooninen sairaus

tiivistelmä

Koska niiden itseuudistumiseen ja tuumorigeeniset ominaisuudet, kasvaimen aloittamista solujen (-lämpökameroissa) on arveltu olevan tärkeitä tavoitteita peräsuolen syöpä (CRC). Kuitenkin tutkimus -lämpökameroissa vaikeuttaa se, että tunnistaminen ja viljely -lämpökameroissa on edelleen aiheena laajaa keskustelua. Kelluva kolmiulotteinen sferoidiviljelmiä (SC), jotka kasvavat seerumittomassa väliaineessa, johon oli lisätty kasvutekijöitä tarkoitus rikastettu -lämpökameroissa. Me tuotettu SC tuoreista kliinisistä kasvain näytteet ja verrattiin niitä SC eristetty CRC solulinjoja sekä Läpinäkyvät eriytetty kollegansa. Potilaasta johdettujen SC näyttö kyky uusiutua ja voi aiheuttaa sarja transplantable kasvaimista immuno-hiirillä, mikä muistuttaa fenotyypiltään kasvain on peräisin. Lisäksi alkuperäisessä kasvain kudosten ja perustettu SC säilyttää useita samankaltaisia ​​CRC-asiaa mutaatioita. Ensisijainen SC ilmaista avain stemness proteiineja, kuten Sox2, Oct4, Nanog ja LGR5 ja tärkeintä näyttää lisääntynyt chemoresistance kyky verrattuna niiden kiinnittynyt eriytetty kollegansa ja solulinjaa johdettu SC. Silmiinpistävän, peräisin olevia soluja sferoidiviljelmiä tai liittyvät erottaa viljelyolosuhteet näkyvät samanlainen kyky uusiutua ja yhtä muodostunut kasvaimia immuuni-hiirillä, mikä viittaa siihen, että itseuudistumiseen ja kasvaimen aloittaminen kapasiteetti -lämpökameroissa ei rajoitu fenotyypiltään kypsymättömiä pallomainen soluja, joita me kuvata olevan erittäin muovia ja pystyy rakentaa uudelleen kantasolujen piirteitä pitkienkin erilaistumisprosesseissa. Lopuksi tunnistettiin kaksi geeniä joukossa pallolla geeniekspressiota allekirjoitus, jotka ennustavat taudin uusiutumisen CRC potilailla. Tässä ehdotamme, että SC peräisin tuoreesta potilaan kasvainkudoksen esillä mielenkiintoisia fenotyypin ominaisuuksia, jotka saattavat olla kliinistä merkitystä chemoresistance ja taudin uusiutumisen ja siksi se on arvokas väline testata uusia CRC-hoitoja, jotka voittavat lääkeresistenssi.

Citation : Qureshi-Baig K, Ullmann P, Rodriguez F, Frasquilho S, Nazarov PV, Haan S, et ai. (2016) Mitä me oppia Sferoidiviljelmiä Culture Systems? Oivalluksia Tumorspheres johdetut Colon Cancer Tissue. PLoS ONE 11 (1): e0146052. doi: 10,1371 /journal.pone.0146052

Editor: Alessandro Datti, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, CANADA

vastaanotettu: 11 elokuu 2015; Hyväksytty 11 joulukuuta 2015 Julkaistu: 8. tammikuuta 2016

Copyright: © 2016 Qureshi-Baig et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja. Kaikki geenien ilmentyminen tiedostot ovat saatavilla ArrayExpress tietokannasta hakunumerolla E-MTAB-3575.

Rahoitus: Kirjoittajat kiittää Fondation Cancer (myöntää F1R-LSC-PAU-13HY2C) rahoitusta tämän tutkimuksen ja Fonds National de la Recherche (FNR) tukemiseksi KB ja PU alla AFR tukijärjestelmän. Kiitämme myös Integrated Biopankkiverkosto Luxemburgin (IBBL) tukemiseksi tässä tutkimuksessa. Kirjoittajat ovat myös kiitollisia Fondation du Pélican de Mie et Pierre Hippert-Faber johdolla Fondation de Luxembourg tukemiseksi KB ja PU. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Lyhenteet : 5-FU, 5-fluoriurasiili; CRC, peräsuolen syöpä; TIC, kasvainta aloittamista solu; CSC, syöpä kantasolujen; SC, sferoidiviljelmiä; SFC, pallo muodostavat solu; TIC, kasvainta aloittamista solun

Johdanto

kolorektaalisyöpää (CRC) on kolmanneksi useimmin diagnosoitu syöpä tyyppi sekä miesten ja naisten toiseksi yleisin syy syövän kuolleisuus länsimaissa [ ,,,0],1]. Huolimatta suuri edistyksestä viime vuosikymmeninä paljon polemiikkia edelleen yli taustat syövän puhkeamista, etäpesäke ja CRC etenemistä. Kaksi hallitseva käsitteet syövän postulate stokastisen (klonaalinen evoluutiomalli) ja hierarkkinen (syöpä kantasolujen malli) järjestäminen kasvaimia. Mukaan jälkimmäinen, osajoukot solujen, ns kasvaimen aloittamista soluja (-lämpökameroissa) tunnetaan myös syövän kantasoluja (CSCS) ovat vastuussa kasvaimen kehittyminen [2].

-lämpökameroissa on ensin kuvattu runko hematopoieettisten maligniteettien [3]. Muutamaa vuotta myöhemmin, -lämpökameroissa havaittiin myös monenlaisia ​​kiinteiden kasvainten, kuten rintasyövän [4,5], iho [6], aivot [7-9], haima [10], keuhko [11] ja paksusuolen [ ,,,0],12,13]. -lämpökameroissa Määritellään niiden (1) itseuudistumisen, (2) erottamalla ja (3) kasvain-aloittamisen kapasiteettia. Ne on kuvattu levittää kasvaimia, jotka pystyvät pääpiirteittäin heterogeenisyys primaaristen kasvainten [3]. Korkea Tuumorigeenisuustutkimuksissa -lämpökameroissa pahentaa vahvaa vastustuskykyä radio- ja chemo-terapia. -lämpökameroissa Pystyvät kiertämään DNA-vaurioita aikana säteily ja kemoterapiaa pelkistämällä ROS ja tehostetun aktiivisuutta DNA tarkistuspiste kinaasien [14]. Loput osajoukko -lämpökameroissa saattaa aiheuttaa muodostuu uusia kasvaimia, mikä johtaa nopeaan pahanlaatuisen sairauden uusimisesta [15]. Tämän seurauksena TIC-erityisiä hoitoja voi johtaa pienempi riski kasvaimen uusiutumisen ja parannettu ennusteen CRC potilaille. Kiinnostavaa kyllä, useissa tuoreissa tutkimuksissa tukevat kliinistä merkitystä kohdistaminen TIC liittyvien geenien [16].

Vaikka merkittäviä edistysaskeleita paksusuolen TIC tutkimukseen, eristäminen, tunnistus ja luonnehdinta paksusuolen -lämpökameroissa edelleen epätäydellisesti perustettu. Erilaisia ​​strategioita voidaan hyväksyä saada paksusuolen -lämpökameroissa pois kasvainkudoksen. Eristäminen tekniikoita -lämpökameroissa perustuvat joko niiden immunogeenisiä tai toiminnalliset ominaisuudet [17]. Antigeeninen lähestymistapa hyödyntää erilaisia ​​solun pinnan markkereita, esimerkiksi prominin-1 (tunnetaan yleisesti CD133), CD44, CD34, CD24, epiteelin-antigeenin (EpCAM /ESA), CD166, CD29, Lgr5, CD49f ja ALDH -1 [17]. Toiminnallinen eristäminen -lämpökameroissa perustuu erilaisiin ominaisuuksiin, kuten ankkurointi riippumattoman kasvun, chemoresistance, itseuudistumisen, epäsymmetrinen jako, ja pluripotenttisuuden. Viime vuosina sferoidiviljelmiä (SC), jotka tukeutuvat kiinnittämisestä riippumaton kasvu ominaisuudet kantasoluja, on käytetty rikastamiseksi -lämpökameroissa aivoissa [18,19], rintojen [5,20], ja paksusuolen [12,21 22] kudosta. On hyvin hyväksyttyä, että SC säilyttää enemmän uskollisesti ominaisuudet alkuperäisen kasvaimia, mukaan lukien geenien ilmentyminen, kasvaimen heterogeenisyys ja kasvaimen morfologia, verrattuna tavalliseen adherenttiviljelmiä [12,19,21-25]. Lisäksi sferoidit peili 3D Matkapuhelinyhteydessä ja asiaan patofysiologisia kaltevuudet

in vivo

kasvaimissa [26]. Kuitenkin, missä määrin pallo muodostumisen määritykset suosivat rikastaminen -lämpökameroissa ei ole täysin selvä vielä. Ensinnäkin on huomattava, että palloset sisältävät myös eriytetty tuumorisoluja [21,22,27,28]. Toiseksi jotkut tutkimukset CRC voisi todellakin osoittaa, että SC hallussaan TIC ominaisuudet [12,21,29-31], kun taas toiset löytäneet rikastamiseen verrattaessa niitä Läpinäkyvät eriytetty kulttuureissa [31-36]. Tärkeää useimmat edellä mainituista tutkimukset perustuvat solulinjoissa. Voidaan arveltu, että ristiriidassa havaintoihin solulinjoihin saattaa johtua fenotyyppisen eroista valittujen kloonien voinut tapahtua pitkän ajan soluviljelmässä [37].

Kun tarkastellaan näitä ristiriitaisia ​​tuloksia, päätimme luonnehtia SC eri alkuperää valossa TIC rikastamiseen. Toisin kuin perinteiset solulinjoja, potilaasta peräisin primäärisistä viljelmistä heijastavat heterogeenisuutta tuumoribiologiassa, sellaisena kuin se esiintyy potilailla. Siten tärkeä tämä tutkimus on kuvata tuotettu SC suoraan tuoreesta kirurgisista näytteistä ja verrata niitä heidän kiinnittynyt eriytetty vastine sekä SC johdettu CRC solulinjoista. Haluamme selvittää, onko SC näytteille ominaisuuksia stemness, kuten itseuudistumisen, kantasolujen merkki ilmaisun, erilaistumisen potentiaalin, vastustuskykyä kemoterapiaa ja tuumorigeenisyystesti

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

Generation ensisijaisen SC ja niiden eriytetty kollegansa

Ihmisen paksusuolen kudosnäytteiden kerättiin integroidun Biopankkiverkosto Luxemburgin (IBBL, www.ibbl.lu) mukaisesti institutionaalisten ohjeiden. Kaikki ihmisen käytettyjen näytteiden kuulu tämän työn lahjoitti vapaasti ja kirjallinen suostumus saatiin luovuttajan käytön tämän otoksen tutkimukseen. Eettinen hyväksyntä saatiin Comité National d’Ethique de Recherche, Luxemburg (viite 201009/09). Tuore resektoitiin paksusuolen kasvain kudosta 35 CRC potilaista kerättiin ja välittömästi käsitellään kulttuuriin. Tissue pestiin useita kertoja seerumittomassa Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), -F12 täydennetty antibiootti-antimykoottista ainetta (Invitrogen). Näytteet jauhettiin 1-2 mm

3 kappaletta seurasi inkubointi kollagenaasi tyyppi IV (0,05 mg /ml, Invitrogen) ja hyaluronidaasia (2 ug /ml; Sigma) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Yksisoluinen suspensio saatiin sekoittamalla 15 minuutin välein ja suodattamalla 70 um: n solusiivilän (BD Biosciences). Ensisijainen paksusuoli SC pidettiin ultra-low kiinnitys (ULA) soluviljelmäastiat (Corning) seerumivapaassa kantasolu alustaa, joka sisälsi DMEM-F12 täydennetty B-27 (1 x) ja N-2 (1 x) täydennykset (Invitrogen), BSA: ta (4 mg /ml; Roth), ei-välttämättömiä aminohappoja (1 x; Sigma), glukoosia 0,15% (Sigma), insuliini (4 U /l; Sigma), hepariinia (4 ug /ml), N-asetyylikysteiini ( 1 mM, Sigma), EGF (20 ng /ml; Biomol), bFGF (20 ng /ml; Miltenyi Biotec), ja penisilliiniä /streptomysiiniä (1x, Lonza). Tämä väliaine edelleen kutsutaan kantasoluja väliaineessa (SCM). Karakterisointia varten, me vain käyttää aikaisin kulku SC tässä tutkimuksessa (enintään 15 kohdat).

syntyy tarttuu kasvava eriytetty kulttuureissa SC hyvin varhaisessa kohtia. Tätä varten erottaa olosuhteissa sovellettiin: varhainen sferoidit hajotettiin ja viljeltiin DMEM-F12, johon oli lisätty 10% FCS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä säännöllisesti soluviljelmäastiat. Toisin kuin SC, eriytetty viljelmät kasvavat tarttuvien solujen. Näitä viljelmiä ylläpidettiin erottaa olosuhteissa vähintään 5 kohdat ennen kuin niitä käytetään kokeisiin.

Sferoidiviljelmiä peräisin CRC solulinjojen

HT29, HCT116, LS174T, SW480 ja SW620 CRC solulinjoja saatiin joko American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, USA) tai Saksan kokoelma mikro-organismien ja Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Saksa) ja ylläpidetään suositellut viljelyolosuhteet. Viljelyä varten SC, solulinjoja kasvatettiin seerumivapaassa DMEM-F12 täydennetty B-27 (1 x; Invitrogen), insuliini (4 U /l; Sigma), hepariinia (4 ug /ml; Sigma), EGF ( 20 ng /ml; Biomol), bFGF (20 ng /ml; Miltenyi Biotec), ja penisilliiniä /streptomysiiniä (1x, Lonza). Solulinja identiteetti varmistettiin lyhyen tandem repeat genotyypitys DSMZ.

3D sferoidiviljelmiä invaasiomääritys

5000 solua SC maljattiin pyöreäpohjaisessa 96-ULA levyille 100 ul DMEM- F12 -alustassa, jossa 1% penisilliini /streptomysiiniä. 3 päivän kuluttua pallo muodostumista, 10% FCS: ää ja 1,25 mg /ml kollageenia (PureCol, CellSystems) lisättiin. 1 tunnin jälkeen ja kiinteytymisen pallomainen /kollageeni suspensio peitettiin 100 ul /kuoppa DMEM-F12, jossa oli 10% FCS: ää. Invasion seurattiin mittaamalla maksimaalinen sferoidi seuraus halkaisija jälkeen 7 päivää.

Solun kasvun ja lisääntymisen

Adherentit solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja SC ULA 6-kuoppalevyille omilla välineellä. 5 päivän jälkeen solut hajotettiin yhden solususpensiota, värjättiin trypaanisinisellä ja laskettiin solun laskenta laite (CEDEX, Roche).

In vitro

rajoittavan laimennuksen pallo muodostumisen määritykset

SC hajotettiin vuonna TrypLE Express (Gibco) pipetoimalla ylös ja alas 1 minuutti, inkuboitiin 37 ° C: ssa 3 minuuttia ja johdettiin 40 pm solusiivilän (BD Biosciences) saada yksisolususpensioi-.

Yhden solun määrityksessä

: Solut ympättiin tiheydellä 1 solu kuoppaa kohti 96-kuoppalevyllä lopullisessa tilavuudessa 100 ui. Yhden solun kylvö tehokkuus oli noin 30%, ja vain kaivot, jotka alun perin sisälsi yhden soluja arvioitiin myöhemmin analyysejä. Sferoidit laskettiin 10-14 päivää, riippuen kasvuvauhti eri ensisijainen SC. 50-60 single solua edellytys analysoitiin pallo muodostumista ja on vain palloja suurempi kuin 50 um sisällytettiin analyyseihin. Äärimmäinen rajoittavan laimennuksen analyysin ELDA ohjelmisto (https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/) [38], käytettiin määrittämään arvioitu kantasolujen taajuus yhden solun määrityksissä.

1000 soluanalyysissä

: 1000 solua /kuoppa siirrostettiin käytettäessä ULA 6-kuoppalevylle ja pallosia laskettiin 7 päivän kuluttua.

Immunofluoresenssikoe

Immunofluoresenssikoe suoritettiin cytospins ( EZ Cytofunnels) (Thermo Scientific) SC ja coverslip varten kiinnittynyt soluviljelmissä. Näytteet kiinnitettiin jääkylmällä metanolilla 10 minuuttia -20 ° C: ssa, blokattiin 3% BSA /PBS-liuosta, mitä seurasi inkubointi yön yli 4 ° C: ssa primaarisen vasta-aineen. Toissijainen vasta-ainetta 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa; Näytteet asennettu DAPI sisältävien Fluoromount G (Southern Biotech) ja analysoitiin -konfokaalimikroskoopilla (Zeiss LSM 510 Meta). Todistetaan, että värjäytyminen oli positiivinen koko sferoidi, z-pinot tehtiin. Käytetyt vasta-aineet on lueteltu S1A taulukossa.

Fluoresenssi solulajittelulla ja virtaussytometria

virtaussytometrialla, näytteet valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu (Shmelkov et ai, 2008) ja ajettiin FACS Canto II. Ensisijainen käytetyt vasta-aineet on lueteltu S1B taulukossa.

Reaaliaikainen qPCR

AllPrep (Qiagen, Hilden, Saksa) käytettiin purkaa RNA. cDNA saatiin käänteistranskriptiolla käyttäen suuren kapasiteetin cDNA käänteistranskription Kit (Applied Biosystems). Absolute Blue qPCR SYBR Green Low ROX Mix (Thermo Scientific), 2,5 pmol kutakin aluketta ja 5 ng cDNA kohti reaktiota käytettiin ja reaktiota ajettiin 7500 FAST Reaaliaikainen PCR Detection System (Applied Biosystems) cycler seuraavilla asetuksilla : 40x (95 ° C 30 sekuntia, 60 ° C 30 sekuntia ja 72 ° C 30 s). Ekspressiotasot kiinnostavan geenin normalisoitiin vastaan ​​useita viite geenejä [39], käyttämällä Qbase + ohjelmisto [40], mukaan MIQE suuntaviivoja. Käytetty viite geenit olivat: EFF1A1, B-Actin, 28S, YWHAZ. Käytetyt alukeparit RT-qPCR esitetään S1C taulukossa.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Solut johdettu SC tai eriytetty viljelmiä ympättiin eri tiheyksillä 250, 100, 50, 20 solua /hyvin erottamaan seerumia sisältävää elatusainetta. 10 päivän jälkeen pesäkkeet värjättiin ja laskettiin mikroskoopilla.

Kemosensitiivisyys määrityksissä

Sen arvioimiseksi chemoresistance haimme eri määrityksiä. Ensimmäinen määritys perustuu 3D pallomainen järjestelmä, jossa solut, jotka ovat peräisin SC tai eriytettyä vastaavien ympättiin pyöreäpohjaisessa 96-ULA levyyn tiheydellä 5000 solua /kuoppa seerumivapaassa DMEM-F12, johon oli lisätty 1% penisilliini /streptomysiiniä. Jälkeen 3 päivää pallomaisten muodostumista, 5-fluorourasiili (5-FU) (Sigma) lisättiin eri pitoisuuksina. Sphere koko mitattiin 24 tunnin välein 5 päivän ajan, ja alalla kutistuminen arvioitiin määrittämällä suhteellinen alalla koko ohjaus ja käsiteltiin olosuhteissa. Toinen määritys perustuu 2D yksikerroksisen järjestelmän avulla soluproliferaation reagenssin WST-1 (Roche, Saksa). Tämän, 30,000 solut sekä SC ja eriytetyn vastaavien maljattiin 96-kuoppaisille levyille 200 ul: aan DMEM-F12 -alustassa, johon oli lisätty 10% FCS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä väliaineen kanssa tai ilman 50 uM 5-FU. WST-1 lisättiin 1:10 lopullinen pitoisuus sen jälkeen, kun 5 päivää ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja suhteellinen eloonjääminen määritettiin. Lisäksi teimme yhden solun ja pesäkkeitä muodostavien määrityksissä, kun läsnä on 5 uM 5-FU arvioimiseksi chemoresistance.

in vivo

kasvaimen muodostumisen määritykset

Ei-liikalihava diabeettinen /vaikeaa-yhdistetty immuunivajavaisiin (NOD /SCID) hiiriä hankittiin Harlan Laboratories Alankomaat ja kokeet suoritettiin kaikki sovellettavat lait ja asetukset jälkeen hyväksynnän laitoksen eläinten hoito ja eettinen komitea yliopiston Luxemburg (Luvan numero: 14-MDM -02). Kasvainta aloittamista kapasiteetti SC NOD /SCID-hiirissä arvioitiin valmistamalla sarjalaimennoksia soluja (10 000, 1000, 100 ja 10 solua, 5-6 injektiota /solu annos). Yhden solut suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan 1: 1 sekoitettu seerumittomalla alustalla ja matrigeeliä (BD Biosciences) ja injektoidaan ihonalaisesti kylkeen 6-viikon ikäisiä hiiriä. Kasvaimen kasvu seurasi 1-2 kertaa viikossa ja tuumorin tilavuus laskettiin kaavalla L * W

2/2. Jokainen hiirille osoittaa vakavaa merkkejä laihtuminen tai kärsimystä tai kasvaimen kokoa saavuttaa 1000 mm

3 poistettiin tutkimuksesta ja lopetettiin välttää tarpeetonta kipua ja epämukavuutta mukaan eettisten ohjeiden. Sarja- elinsiirtoihin, kasvaimet eksplantoitiin Dissosioidut kulttuuriin ja injektoidaan uudelleen toisessa saajahiiret. Jaksot syntyy ksenografteja värjättiin eosiinilla ja hematoksyliinillä ja analysoitiin patologi. Vertailla suoraan SC niiden eriytetty vastine, päätimme pienin testattu annos (10 solua /injektio T20 ja 100 solua /injektio HT29; n = 5) ja solut ovat peräisin Vaihtelevan tai sferoidiviljelmiä ruiskutettiin oikealla ja vasemmalla kylki vastaavasti .

mikrosirut ja mutaatio profilointi

mikrosiruja tehtiin Luxemburgin Institute of Health (LIH) jälkeen RNA: laatu ja puhtaus tarkastus käyttäen 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Affymetrix geenilastuun Human Gene ST v2.0 taulukot oli laadittu standardin protokollaa. Microarray tietoja esikäsitellyt käyttämällä Robust Multiarray Analysis (RMA) algoritmi GC-korjaus käyttäen kaupallista ohjelmistoa Partek Genomic Suite (versio 6.6, Copyright 2015 Partek Inc., St. Louis, MO, USA). Kolme rinnakkaista ajettiin kaikille edellytykset mikrosiruja paitsi T18 josta meillä juoksi 4 teknisiä rinnakkaista. Meidän piti peruuttaa yksi näyte HCT116 solulinjan, sen huono laatu hybridisaation jälkeen. Tiedot analysoitiin ja tulokset visualisoitiin R /Bioconductor (versio 3.1.2). Microarray tiedot ovat saatavilla ArrayExpress tietokannassa hakunumerolla E-MTAB-3575. Top mutaatioita arvioitiin käyttäen TruSeq Amplicon-Cancer paneeli (TSACP) kanssa MiSeq alustan mukaan Illumina suuntaviivat seuraavat kriteerit: syvyys 1000 ja variantti taajuus 0,05. Eettisistä varten emme voineet sisällyttää mutaatiostatuksesta profiilin potilaalle T6.

Differential geenien ilmentymisen ja eloonjääminen analyysi

mikrosirut (ArrayExpress tietokannan hakunumero E-MTAB-3575) tehtiin standardin mukaisesti protokollien (ks oheismateriaali ja menetelmät -osiossa). Ilmentyvät eri geenien välillä SC ja vastaavien eriytetty kollegansa määritettiin käyttäen lineaarista mallinnus empiirinen Bayes lähestymistapa toteutuu

Limma

paketti (https://www.bioconductor.org/packages/julkaisu /bioc /html /Limma. html). Yhteinen pallo geeni allekirjoitus välillä ensisijainen ja solulinja SC määritettiin risteyksessä up-geenien kanssa FDR 0,05 ja log-kertainen muutos log2FC 0,6. Kaksi itsenäistä julkisesti saatavilla aineistoja kokoelmasta tietokannassa PROGgeneV2 [41], joka sisältää tiedot eloonjäämisaste CRC potilasta käytetään tuottamaan eloonjäämiskäyrien: GSE17536 [42] koostuu 177 potilaan näytteitä ja GSE29621 [43], joka koostuu 64 potilaalle näytteet. Löysimme merkittävää yhteyttä huono elossaololuku näissä 2 aineistot keskuudessa kokoelma saatavilla edellä mainitussa työkalu. Aineisto GSE39582 [44], joka koostuu 566 potilaan näytteitä käytettiin vaikutuksen tutkimiseksi tunnistettujen pallon geeni allekirjoitus tautivapaan elinajan.

Tilastollinen

GraphPad Prism 5 ohjelmistoa käytettiin tilastollisiin analyyseihin. Käytimme parittomia Student t-testi verrata 2 ehtoja ja 2-tie ANOVA testi Bonferronin post-testit verrata hoidon vaikutuksia ajan mittaan. Kaikki kokeet suoritettiin vähintään 3 itsenäisen kokeen, ellei toisin mainita.

Tulokset

Generated SC johdetut kasvainkudoksessa säilyttävät ominaisuudet alkuperäisen kasvainten

Ensin arvioitiin kyvyn rikastamiseksi -lämpökameroissa CRC näytteitä käyttäen useita aikaisemmin raportoitu mahdollisten pinnan markkereita. Ilmaus oletetun kantasolujen merkkiaineita CD44, CD24, EpCAM, CD166 ja CD133 analysoitiin virtaussytometrialla. Huomasimme, että potilas koepaloja ovat erittäin heterogeeniset fenotyyppisten markkerien (S1 kuvio), kyseenalaistaa niiden luotettavuutta tunnistamiseen -lämpökameroissa. Meidän päätti lisäksi lajitella soluja suoraan potilaaseen tai solulinjasta johdettuja SC niiden CD133 ilmaisun ja suorittaa toiminnallinen yhden solun määrityksissä. Pallo muodostava solu (SFC) frekvenssi oli samankaltainen kaikissa CD133 alhaisen, keskisuuren ja korkean väestö (S1 kuvio), mikä viittaa siihen, että CD133 ilmentyminen ei korreloi tehostetusti palloja muodostavan kapasiteetin. Samaa linjaa, useat

in vivo

tutkimukset osoittavat, että CD133 + ja CD133- solut muodostavat kasvaimia samanlaisella tehokkuudella [34,45,46]. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että otaksuttu TIC markkereita eivät ole luotettavia tunnistamiseksi -lämpökameroissa järjestelmässämme.

SC voi heijastaa kasvaimen heterogeenisyys sellaisena kuin se esiintyy potilailla ja on kuvattu rikastettu -lämpökameroissa. Keräsimme tuore paksusuolensyöpä kudosta 35 potilailla, jotka eivät olleet saaneet kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen leikkausta. Sen jälkeen entsymaattisesti, yksittäinen solususpensio maljattiin SCM edistämiseksi pallomainen kasvua. Kasvain yksilöitä 5 out of 35 potilaalla (15% tehokkuus) johti vakaa ensisijainen SC että pystyimme ylläpitämään viljelmässä pitkiä käytäviä (yli 20 kanavat) (kuvio 1

ja S2 taulukko). Loput paksusuolensyöpä kudokset eivät johtaneet alalla muodostumiseen tai menettäneet palloja muodostavan kapasiteetin muutaman siirrostuksen jälkeen. On huomionarvoista, että onnistumisprosentti havaittu on vertailukelpoinen muiden pyrkimykset luoda SC välillä peräsuolen kasvainkudoksen [47,48]. Koepaloja joka johti vakaa SC olivat eri histologisia vaiheissa CRC (S2 taulukko). Kolme ensisijaista SC T6, T18 ja T20, jotka edustavat vaihe IIIC, vaihe II A ja vaiheessa IVA CRC vastaavasti valittiin kuvaamista (S2 taulukko). Mielenkiintoista, SC johdettu T6 ja T20 potilailla havaittiin suurentunut invasiivisen kapasiteettia verrattuna T18 sferoidi kulttuuria, joka oli peräisin aikaisemmassa vaiheessa, eli vaiheen II (kuvio 1

B

ja 1

C

). Tämä tulos viittaa siihen, että SC johdetut kasvaimet voivat säilyttää invasiivisia ominaisuuksia niiden kasvain alkuperää. Tämä havainto on vielä käsiteltävä paljon suurempi kohorttitutkimuksiin. Varsinkin useita CRC-asiaa mutaatiot havaittavissa kasvain alkuperän olivat läsnä myös ensisijaisen SC (S2 Kuva). Olemme lisäksi perustettu kiinnittynyt eriytetty kollegansa ensisijaisen SC (kuvio 1

ja Materiaalit ja menetelmät -osiossa). Vertailu SC omien eriytetty kollegansa samasta potilaasta voisi mahdollistaa opiskelun SC-erityisiä ominaisuuksia osalta -lämpökameroissa. Läsnäollessa seerumin, SC muuttavat fenotyyppiä ja kasvaa kiinnipysyväksi solun kerroksen. Mielenkiintoista, joka tarttuu eriytetty kollegansa näytti lisääntyvän leviämisen verrattuna SC (S3 kuvassa). Sen lisäksi käyttämällä ensisijaista kasvainkudoksen, testasimme myös kykyä CRC solulinjojen muodostamiseksi SC. HT29, HCT116, LS174T, SW480 ja SW620 solulinjoja synnytti aloilla useiden kohtia samalla säilytetään SCM (kuvio 1A ja tuloksia ei esitetty). Johdonmukaista SC johdetut kudoksesta, HT29- ja HCT116- johdettu SC näkyy alemman leviämisen nopeudella verrattuna niiden vanhempien kiinnittynyt vastine (S3 kuvassa). Tämä havainto, joka on yhdenmukainen aiempien tutkimusten kanssa [35,36], paljastaa, että kun eriyttäminen, -lämpökameroissa skannata lisääntynyt proliferatiivisia ominaisuuksia. Seuraavissa kokeissa olemme keskittyneet laaja luonnehdinta 3 SC perustetaan ensisijaisesti potilaan materiaalista ja 2 SC johdettu CRC solulinjoista, eli HT29 ja HCT116.

(

) Morfologiset ominaisuudet 2 CRC solulinjoista (HT29, HCT116) ja 3 ensisijainen potilaan kasvaimet (T6, T18, T20) kasvatettiin SC (S, vasen paneeli) ja niiden eriytetty kollegansa (

D

, oikea paneeli). (

b

) 3D pallojakaantuminen invaasiomääritys SC johdetut kasvainkudoksen T6, T18 ja T20. Edustavia kuvia sulautettujen pallosia 7 vuorokauden hyökkäystä. (

c

) kvantifiointi maksimaalisesta pallomainen seuraus halkaisija (um) 7 vuorokauden hyökkäystä. Edustava 3 itsenäisen kokeen, asteikko bar = 100 pm. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD (n = 8); * P 0,05, ** P 0,01.

Sferoidiviljelmiä osoittavat ilmentymisen stemness proteiinien

Tutkiakseen tarkemmin fenotyyppisiä eroja SC ja vastaavien eriytetty kollegansa , olemme analysoineet ilmentymisen avaimen stemness proteiineja, kuten Sox2, Oct4, Nanog ja LGR5 sekä CK20 keskeinen epiteelin erilaistumista merkkiaine. Transkriptiotekijöille Oct4, Sox2 ja Nanog kutsutaan master sääntelyviranomaisten pluripotenttisuuden ja ylläpitämisestä vastaa eriyttämätön valtio [49] sekä suosimalla kyky uusiutua ja -lämpökameroissa [50]. SC näkyy korkeita stemness proteiinien taas CK20 oli tuskin ilmenee (kuvio 2

). Tärkeää on, että tarttuu eriytetty kollegansa ilmaisi CK20 ja menetti ilmaus keskeisten stemness proteiineja. Samoin proteiinin tasoja, ekspressiota avaimen stemness geenien lisääntynyt SC verrattuna eriytetty viljelmät (kuvio 2

B

). Mielenkiintoista on, että

LGR5

ilmentyy voimakkaasti ensisijainen SC, toisin kuin SC peräisin CRC solulinjojen (kuvio

2A ja 2B

). Olemme myös arvioinut ilmaus β-kateniinin, toimiva markkeri CRC stemness, ja löysi korkeampi ilmaisun SC (kuvio 2

B

). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat, että SC näyttö korkeampi stemness ja alempien epiteelisolujen erilaistumisen markkereita.

(

) immunofluoresenssi SC paljastaa lisääntyneen ilmentymisen avaimen stemness proteiinien Sox2, Oct4 ja LGR5, sekä vähentynyt ilmentyminen CRC differentiaatiomarkkeri CK20 verrattuna kiinnittynyt eriytetty kollegansa. NTERA-2 ihmisen alkion karsinooma-soluja käytettiin positiivisena kontrollina värjäystä ja osoitti vastaavia signaalin voimakkuuden kaikille arvioidaan pluripotenttisuuden markkereita (tietoja ei esitetä). Suurennos 40x. (

b

) Geenien ilmentyminen keskeisiä stemness geenien SC ja eriytetyn kollegansa. Edustava 3 riippumattoman kokeen. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD, * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, ns = ei merkitsevä.

Sferoidiviljelmiä ja tarttuu eriytetty kollegansa esiintyä vastaavia itse- uudistaminen ja kasvaimen aloittaminen kapasiteetin

Olimme kiinnostuneita määritettäessä toiminnallisten erojen osalta TIC ominaisuuksien välillä SC ja tarttuu eriytetty kollegansa. Aluksi yritimme suorittaa alalla muodostumisen määritykset pinnoittamalla eri solujen tiheydet. Useat tutkimukset -lämpökameroissa osoittavat kyky uusiutua käyttäen alalla muodostumista määrityksiä kylvämällä suuri määrä solua kuoppaa kohti. Kuitenkin kokemuksemme ja kuten jo mainittiin muiden [33], pinnoitteen korkea solutiheydet johtaa alalla käytössään muodostuminen aggregaatiota ja fuusion seurasi myöhemmin leviämisen sijaan kyky uusiutua solun siten väärentäminen alalla muodostavan kapasiteetin tuloksia ( S4A kuvio). Siten voidaan varmistaa todellinen klonaalisuuden eikä fuusio tai yhdistäminen solujen suoritimme pallo muodostumisen määritykset yhteismarkkinavaiheessa solutasolla. 3 vakaa ensisijainen SC ja 2 SC johdettu CRC solulinjoista kaikki näkyvissä itseuudistuvien kapasiteettia, jota pidettiin useiden kohtien (kuvio 3

). Potilaan T6 oli 1 pallo muodostavien solujen (SFC) in 9.14 solujen passage 1, 1 SFC 7,51 solujen kulkua 2, ja 1 SFC 11.66 solujen kulkua 3 (S3 taulukko). Silmiinpistävän, T20, joka on peräisin potilaasta, jolla oli jo metastaasit aikaan resektio, todettiin olevan suurentunut SFC taajuus verrattuna T6 ja T18 (S3 taulukko). Mielenkiintoista, SFC taajuus nousee alussa käytäviä (passage 5) myöhäiseen kohtia (passage 15-25), mikä viittaa siihen, että viljelmät ylläpidetään kantasolujen rikastuttava olosuhteet osoittavat lisääntynyt TIC käyttäytyminen ajan (kuvio 3

B

). Senkin jälkeen pitkän aikavälin kulttuurin SCM, SC, jotka siirretään erottaa viljelyolosuhteet on edelleen kyky tarttua ja morfologisesti muistuttavat eriytetty vastine tai emosolulinjassa (kuvio 1

ja S5d kuvassa).

(

) Sphere yhdisteiden muodostumista määritettiin useiden sukupolvien (gen.) ymppäämällä yksittäiset solut varhaisen passage SC kasvanut primäärikasvain kudoksesta ja CRC solulinjoissa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. (

b

) kyky uusiutua varhaisen (passage 5) ja myöhäinen (passage 15-25 riippuen kasvain) SC alkutuotannosta kasvainkudoksessa. Tiedot esitetään keskiarvona 95%: n luottamusväli.

Seuraavaksi tutkimme Tuumorigeenisuustutkimuksissa SC. Ensisijainen SC syntyvät kasvainkudoksessa potilaiden T6, T18 ja T20 kykenivät indusoimaan kasvaimen muodostumisen NOD /SCID hiirten solujen määrä vaihtelee 10.000 soluista 10 solua injektiota kohti (kuvio 4

). TIC taajuus vaihtelivat 1 6-1 22 sferoidiviljelmiä soluissa kulloisenkin potilaan näytteestä (S4 taulukko). Samoin SC johdettu CRC solulinjoista myös käynnistänyt kasvaimen kasvua hiirissä solujen määrä vaihtelee 10.000 solujen 100 solua (S6A kuvio ja S4 taulukko), vaikkakin HCT-116 SC oli alempi kasvaimen esiintymistiheys verrattuna ensisijaisen SC (S4 taulukko) . Molemmissa tapauksissa kasvaimen paino hienosti korreloi pistetään solujen määrä (kuvio

4B

ja S6b kuvassa). Mielenkiintoista, ensisijainen SC perustetaan tuumorinäytesylinterin potilaan T20 kykenivät indusoimaan hiirille kasvainmuodostusta paljon nopeammin korkeampi kasvaimen esiintymistiheys verrattuna T6 ja T18 SC (kuvio 4

ja S4 taulukko). Fenotyyppi T20-johdettujen SC, jolle on ominaista korkea SFC taajuus, kasvaimen esiintymistiheys ja kasvaimen leviämisen alleviivauksineen ja yhteenveto siitä aggressiivinen luonne primaarikasvaimen potilaan T20. Kuudesta viiteentoista viikon kuluttua ensisijainen elinsiirron, kasvaimet eksplantoitiin, hajotetaan yksittäisiksi soluiksi ja sarjoittain istutetaan toissijainen saajahiiret. Injektioita 10.000 ja 1000 solua annettiin muodostumista kasvaimen toisen vastaanottajan hiirillä. Histologia arviointi tuloksena ensisijainen ja toissijainen ksenografteissa patologi vahvisti muistuta alkuperäisen primaarikasvaimen paitsi että T20 menettänyt erilaistumista potentiaalia sarjasiirteillä (kuvio 4

C

). 0,05.