Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mutaatiot WNT /beeta-kateniinin reitin ovat läsnä useimmissa kaikkien satunnaista peräsuolen syövät (CRC), ja histonideasetylaasi inhibiittorit indusoivat apoptoosin CRC solujen tällaisia ​​mutaatioita. Tämä apoptoosi on torjua (1) signalointi heterogeenisyys CRC solupopulaatioiden, ja (2) eloonjäämisreittejä aiheuttama mitogeenien erittyy apoptoottisia soluja. Ilmiöt signaloinnin heterogeenisyys ja apoptoosin aiheuttaman selviytymisen muodostavat välittömän resistenssimekanismeihin histonideasetylaasi estäjiä, ja luultavasti muiden kemoterapia-aineiden. Olemme tutkineet strategiaa kohensi CRC solukuoleman estämällä kaikki eloonjäämisreittejä aiheuttama pro-apoptoottisen aine LBH589, histonideasetylaasi- estäjä: AKT, JAK /STAT, ja ERK signalointi. Apoptoosin parantaa kykyä cocktail synteettisten estäjien proliferaatiota verrattiin vaikutuksia luonnon tuotteen propolis. Hyödynsimme suolen kasvainten, huumeiden herkkä ja lääkkeille vastustuskykyisiä kolorektaalisyöpää solujen arvioida apoptoottisen potentiaalia yhdistelmähoidot. Tulokset viittaavat siihen, että tehokas lähestymistapa CRC yhdistelmähoito on yhdistää apoptoosia indusoivien lääkkeiden (esim histonideasetylaasi- inhibiittorit, kuten LBH589) aineilla, jotka poistavat korvaavat eloonjäämisreittejä indusoi apoptoosin aikana (kuten cocktail estäjien apoptoosi- liittyvä leviämisen). Sama paradigma voidaan soveltaa CRC ehkäisyyn lähestymistapaa, koska apoptoottinen vaikutus butyraatti, ruokavalio johdettu histonideasetylaasi-inhibiittori, on täydennetty muilla ravinnon aineita, jotka moduloivat eloonjäämisreittejä (esim kittivaha ja kahviuute). Siten ravintolisiä koostuu käymiskelpoista kuitua, propolis, ja kahviuute voi tehokkaasti ehkäistä neoplastisen kasvun paksusuolessa.

Citation: Bordonaro M, Drago E, Atamna W, Lazarova DL (2014) Comprehensive Tukahduttamista Kaikki Apoptosis aiheuttama proliferaatio Pathways kuin Ehdotettu lähestymistapa peräsuolen syövän ehkäisy ja hoito. PLoS ONE 9 (12): e115068. doi: 10,1371 /journal.pone.0115068

Editor: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, Italia

vastaanotettu: 11 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 18 marraskuu 2014; Julkaistu 11 joulukuuta 2014

Copyright: © 2014 Bordonaro et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Institutes of Health (1R15CA152852-01, Lazarova). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: M. Bordonaro, W. Atamna, ja E. Drago ole kilpailevia intressejä. Darina L. Lazarova on saanut tutkimusrahoitusta manuka Health Uusi-Seelanti, Ltd, ja hän on keksijä ja patenttihakemuksen PCT /NZ2014 /000060 jätetty kautta Patenttiyhteistyösopimus puolesta Manuka Health Uusi-Seelanti, Ltd, ”Therapeutics koostumuksia ja niiden käyttöjä ”. Darina L. Lazarova ei ole taloudellisia intressejä tässä patenttihakemuksessa. Ei ole konsulttiyrityksiä, työsuhteita, kehitteillä tai kaupan tuotteiden julistaa. Ilmoitettu kilpailevat edut eivät muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

parantaminen syövän ennaltaehkäisy- ja hoitostrategioiden on vähentynyt syöpään liittyvien kuolemia 20% viimeisen 20 vuoden aikana [1]. Lisäksi käsite onkogeenin riippuvuuden [2] kannustanut kehitystä molekyylirakennetta suunnattu hoitoja. Kuitenkin suurin osa näistä hoidoista pidentää elämää syöpäpotilaiden keskimäärin muutaman kuukauden [3]. Syy tähän tulos on, että kasvaimet esiintyy lääkeresistenssi mutaatioita, jotka ovat joko ennalta olemassa matalalla syöpäsolujen määrää ennen hoitoa, tai hankitaan lääkkeen annon jälkeen [3]. Puuttuessa resistenssin antavia mutaatioita, syöpäsolut myös sopeutua selektiivinen lääke paine sopeuttamalla signaloinnin tasoa. Esimerkiksi

BRAF

-mutant melanoomasolujen altistetaan vemurafenib kehittää resistenssin aine säätelemällä niiden BRAF ilmaisun [4]. Samoin, EGFR-mutantti keuhkosyöpä käsiteltyjen solujen EGFR-inhibiittorin downregulate PTEN ja lisätä AKT selviytymisen signalointi [5]. Siksi suunnittelu syöpälääkkeiden olisi otettava huomioon paitsi mutaatioprosessiin maiseman kasvaimen, mutta myös solun signalointi heterogeenisuus, joka on olemassa jopa kesken geneettisesti identtisiä syöpäsoluja [6]. Signalointi heterogeenisuus on osa välittömän resistenssin (IMR): nämä ovat muutokset signa- jotka tapahtuvat 24 tunnin kuluessa hoidon ja mahdollistaa murto syöpäsolun väestön hengissä lääkehoitoa.

CRC-solut altistettiin histonideasetylaasi-estäjät (HDACis) osoittavat myös IMR. Olemme esittäneet näytön siitä HDACis apoptoosia CRC solujen osittain kautta hyperactivation of WNT /kateniinin signalointi [7]. Kuitenkin CRC solupopulaatioiden ovat heterogeeniset WNT /kateniinin tasoja, ja solut, jotka eivät ole hyperinduce koulutusjakson, hengissä altistuminen HDACis [7], [8]. Signalointi heterogeenisyys solupopulaatioiden ei johdu olemassaoloa solualapopulaatioiden ennalta määrätty taso WNT /kateniinin aktiivisuutta. Näin ollen meidän on virtaussytometria-lajiteltu yhden CRC soluja korkea WNT /kateniinin signalointi tasoilla, ja totesi, että tuloksena klonaalisia populaatioita ovat heterogeenisiä WNT signalointi tasolle kuin vanhempi väestö (tietoja ei julkaista). Tämä heterogeenisuus on todennäköisesti ylläpitävät sivusuunnassa esto [9], adoptiota tietyn kohtalon muutaman solun ryhmä vastaavia soluja [10]. Tässä prosessissa, stokastinen vaihtelut reseptorin ekspression taso ja sen ligandien viereisten solujen monistetaan kautta solu-solu-vuorovaikutuksiin. Välinen vuorovaikutus NOTCH ja sen ligandien johtaa vapauttamaan niiden solunsisäisten domeenien. Solut korkeasti NOTCH solunsisäisen domeenin tukahduttaa WNT toimintaa; katsoo, solut korkeampi NOTCH ligandeja lisätä WNT toimintaa [9]. Normaalissa suoliston soluista, sivusuunnassa esto vaikuttaa terminaaliin erilaistumista [11]; kuitenkin CRC soluissa, sivuttainen esto tukee signalointia heterogeenisyys ilman terminaalista erilaistumista. Vastaavia signalointi heterogeenisyys on havaittu

in vivo

[12] – [15].

toinen komponentti IMR on apoptoosi-indusoitua proliferaatiota, ilmiö tukee apoptoottisia soluja, jotka erittävät mitogeeneille. Nämä mitogeenit stimuloida eloonjääneiden solujen tahansa apoptoottisen väestöstä [16] – [21]. Olemme havainneet, että CRC solupopulaatiot olevien HDACi laukaisema apoptoosin, on lisääntynyt ilmentyminen mitogeenien ja myöhemmin induktio useita selviytymisen signalointireittien [9], [22]. Kirjoittajat raportoivat strategiaa estävän kattavasti kaikki eloonjäämisreittejä ja parantaa apoptoottista vastetta CRC solujen sekä synteettisiä ja ruokavalio-johdettu HDACis (esim LBH589 ja butyraatti).

Materiaalit ja menetelmät

1. Soluviljely, yhdistelmä-DNA-plasmideja, ja kemikaalit

Ihmisen CRC solulinja HCT-116 saatiin American Type Culture Collection (Rockville, MD). HCT-116-solulinja genotyyppi lyhyillä tandem uusintaa. Sama analyysi HCT-R-solujen vahvistettiin, että nämä solut liittyvät vanhempien HCT-116-solut. Solulinja HCT-R oli peräisin HCT-116 viljelemällä vanhempien soluja kasvavien pitoisuuksien butyraatti kuten aikaisemmin on kuvattu [8]. HCT-116 ja HCT-R solulinjoja kasvatettiin alfa-MEM-elatusainetta, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Ihmisen paksusuolen microadenoma LT 97 soluja ystävällinen lahjoitus tri B. Marian (Institute of Cancer Research, Medical University Vienna, Itävalta). LT 97-soluja viljeltiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [23], [24]. Seuraavat solulinjat viljeltiin alfa- MEM 10% FBS: ihmisen pienisoluinen karsinooma lisämunuaisen /kuorikerroksen SW13 soluja (miinus fenotyyppi, eristetään laimentamalla kloonaamalla heterogeenisen näytteen ATCC CCL105 laboratoriossa tohtori Elizabeth Hull, Midwestern University , AZ), ihmisen hermostopienasta johdettuja ei-hermosolujen kantaisä LA1-5s solut (saatiin tri R. Ross, Fordham University, NY), ihmisen normaalista koolonsolut CCD841CoN ((ATCC CRL-1790), ihmisen alkion munuaisen epiteelisolujen HEK293T-soluja (ATCC CRL-1573), ja hiiren alkion fibroblasteissa CCL92 (ATCC CCL-92). Natriumbutyraattia saatiin Sigma, kofeiinihapon fenetyyliesteri (KAP) -enhanced propolis (Propolis kanssa Cyclopower, Cape 6 mg /g ) alkaen Manuka terveys New Zealand Ltd, AZD6244, LBH589 ja MK2206 alkaen Selleck Chemicals, pyridoni 6 Santa Cruz Biotechnology, pakastekuivattuja pikakahvia (The Daily Chef, Sam West, Inc.). Kaikki aineet paitsi butyraattia suspensoitiin dimetyylisulfoksidiin ja kantaliuokset pidettiin -80 ° C: ssa. Butyraattia liuotettiin veteen ja varastoidaan 1,0 M varastosta 4 ° C: ssa. Mock hoito sisältyvät dimetyylisulfoksidi tilavuudessa yhtä suuri kuin tämä hoitoja aineilla, liuotetaan dimetyylisulfoksidiin.

2. Western blot -analyysit ja vasta-aineet

Western blot-analyysit suoritettiin, kuten on raportoitu aiemmin [25]. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: n vasta-fosfo-p44 /42 MAPK (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204) (# 4370, Cell Signaling Technology), tunnistavaa vasta-ainetta fosfo-Stat3 (Tyr705) (# 9145, Cell Signaling Technology ), anti-Ser473-fosforyloituu AKT (sc-7985, Santa Cruz Biotechnology), anti-AKT (sc-8312, Santa Cruz Biotechnology), anti-beeta ACTIN (A5441, Sigma-Aldrich), anti- ERK (# 9102, Cell Signaling Technology), anti- STAT3 (# 9139, Cell Signaling Technology), anti-pcJUN ja c-Jun (sc-16312-R ja sc-45, Santa Cruz Biotechnology). Kaikki vasta-aineet hyödynnetään työskentelevät laimentaminen 1:1,000, paitsi anti-Actin vasta-ainetta käytettiin klo 1:5,000 laimennus. Lysaatit saatiin kahdella eri menetelmällä: hyödyntämällä natriumdodekyylisulfaatti sisältävä lyysipuskuria ja määrällisesti proteiinipitoisuus [25], tai hajottamalla vastaava määrä soluja (10

6) suoraan Laemmli-puskurissa. Rutiininomaisesti, solut maljattiin päivää ennen käsittelyä, ja altistettiin 17 tai 20 h LBH589 (50 nM), MK2206 (1 uM), AZD6244 (0,5 uM), pyridoni 6 (1 uM), kahvin uute (1 mg /ml), propolis (100 ug /ml), tai butyraatti (5 mM). Kvantifiointi western blot kuvia suoritettiin ImageJ ohjelmisto (public domain kehittämiä ohjelmistoja Research Services Branch National Institute of Mental Health, Bethesda, MD, USA).

3. Apoptoottisten ja klonaalisen kasvun määritykset

CRC-solut maljattiin 24 tuntia ennen analyysien 24-kuoppalevyille 70000 per kuoppa, ja altistettiin hoitoja 24 tunnin ajan (esim LT97 ja HCT-116-solut) tai 48 tunnin (HCT-R soluissa). Kaikki solut (kelluva ja liitteenä) kerättiin ja värjättiin apoptoottisten ja nekroottista markkereita PE anneksiini V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, # 559763). Virtaussytometria analyysit suoritettiin FACS Aria II ja DiVa ohjelmistot; analysoimme yhteensä 50.000 tapahtumaa näytettä kohti. Prosentuaalinen apoptoosin laskettiin jakamalla apoptoottisten solujen kokonaismäärä analysoitiin solujen ja kertomalla suhteen 100. klonaalisen kasvun analyysit, yhden solut maljattiin 100-200 solua kuoppaa kohti kuuden kuoppalevylle ja käsiteltiin aine (et) 24 tuntia. Pesäkkeet laskettiin 14-20 päivää poistamisen jälkeen aineen (s). Kaikki kokeet suoritettiin neljästä kuuteen kertaa kolminkertaisia ​​näytettä koetta.

4. Tilastot

Kaikki tiedot esitettiin keskiarvona ± standardipoikkeama vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta. Parittomia opiskelija T-testiä analyysiä käytettiin määrittämään merkitystä tilastollisia eroja. Eroja pidettiin merkittävinä P 0,05. Klonaalisia kasvu ja apoptoottisten analyysit, tilastollisia eroja ryhmien keskiarvojen määritettiin yksisuuntaisella-of-varianssi (ANOVA), jossa GraphPad Prism 6 ohjelmisto, ja testin jälkeen laskelmia että käytetty Bonferronin korjauksen säätämään useita vertailuja 95 % varmuudella.

tulokset

1. Kehittäminen inhibiittoricocktailia apoptoosin aiheuttaman lisääntymistä (ICAP) B

Olemme osoittaneet, että HDACis apoptoosia CRC solujen mutaatioita WNT /kateniinin reitin [7], ja tasot solukuoleman pahentavat tukahduttamalla induktio AKT signaloinnin [22], [26]. Analysoida kaikkia eloonjäämisreittejä aiheutettiin apoptoottisen CRC solupopulaatioiden, käytimme HCT-R soluissa, jotka ovat suhteellisen HDACi kestäviä verrattuna vanhempien HCT-116-soluissa [8]. Me määritetään kyky estäjän cocktail apoptoosin liittyvän leviämisen (ICAP) laajentaa apoptoosin CRC solupopulaatioiden altistetaan LBH589, joka on HDACi joka on kliinisissä tutkimuksissa. Sen varmistamiseksi kliinistä merkitystä aikaisempien havaintojen [22], [26], käytimme farmakologisesti asiaankuuluvat pitoisuudet LBH589 (50 nM) ja inhibiittorit eloonjäämisreittejä [27], [28]. HCT-R solut altistetaan LBH589 ilmeni kohonneita tasoja kolme selviytymisen teille, joita välittävät fosforyloidun AKT, STAT3 ja ERK1 /2 molekyylejä (1A). LBH589-käsitellyt solut osoittivat 15,5 ± 2,8% apoptoosin, ja lisäksi MK2206, joka on Pakt estäjä, lähes kolminkertaiseksi tasot apoptoosin 42,5 ± 8,6%, P = 0,007 (kuvio 1 B). Tämä havainto on yhtäpitävä havaintojen että tukahduttaa Pakt tasoilla MK2206 tai kofeiinihappoa fenetyyliesteri täydentää apoptoosin CRC soluissa [22]. Lisäämällä pyridoni 6, joka on JAK /STAT estäjä, ja AZD6244, adenosiini trifosfaatti-kilpailukykyisiä estäjä MEK1 /2 [29], [30] nousi apoptoosin entisestään. Altistuminen ICAP yksin johti apoptoosin 14,0 ± 4,0%, verrattuna 7,1 ± 2,0%: n aiheuttamaa apoptoosia mock hoitoa. Tavallinen yksisuuntainen ANOVA paljasti tilastollisesti merkitseviä eroja ryhmä tarkoittaa, F (5,12) = 38,56, P 0,0001. Post-testi laskelmat Bonferroni korjaus säätää useita vertailuja 95% luottamusväli osoitti tilastollisesti merkitseviä eroja (P 0,05) apoptoottisten tasojen mock käsittely ja kaikki kolme yhdistelmä hoitoja LBH589, välillä sekä LBH589 hoito ja kaikki kolme yhdistelmän hoitoja LBH589. Ei ollut tilastollisesti merkittäviä eroja apoptoottisten tasojen jäljitellyistä, LBH589-, ja ICAP – käsiteltyjä soluja. Ei ollut tilastollisesti merkitseviä eroja indusoiman apoptoosin LBH589 + MK2206 ja kaksi muuta yhdistelmä LBH589 hoitoja, sekä välillä LBH589 + MK2206 + pyridone6 ja LBH589 + ICAP.

. Western blot-analyysit HCT-R CRC-solut altistettiin pilkkaatte (C) käsittely, 50 nM LBH589 (L), 1 uM MK2206 (M), 0,5 uM AZD6244 (A), tai 1 uM pyridonin 6 (P) 20 tuntia. Sama määrä solut hajotettiin suoraan Laemmli-puskuriin ja analysoitiin ekspressiotasot fosforyloidun ja yhteensä tason AKT: n, ERK1 /2, ja STAT3. B. apoptoottiset analyysit HCT-R soluja altistetaan 48 h kuvatuista menetelmistä (A). Tähti osoittaa tilastollisesti merkitseviä eroja (P 0,05) välillä apoptoottisen tasoa. Muita tilastollisesti merkittäviä eroja on merkitty tekstissä.

2. Propolis täydentää indusoiman apoptoosin LBH589 tai 5-fluorourasiilin CRC-soluissa

propolis, joka on mehiläisen tuote, täydentää indusoiman apoptoosin ruokavaliossa johdettu HDACi butyraatti kautta osittainen poistaminen AKT ja JAK /STAT signalointi [26]. Siksi me perusteltu, että propolis saattaa vahvistaa LBH589 indusoiman apoptoosin samalla mekanismilla. Vertaamaan kykyä propolis ja ICAP tukahduttaa apoptoosin aiheuttaman eloonjäämisreittejä, otimme esiin HDACi kestävä HCT-R solut pilkata hoitoon, LBH589, LBH589 + kittivahaa tai LBH589 + ICAP. Lisäksi propolis lisätyn LBH589 indusoiman apoptoosin 16,5 ± 2,0%: sta 30,1 ± 4,5%, P = 0,013 (2A); katsoo, lisäys ICAP tehostetun LBH589 indusoiman apoptoosin 16,5 ± 2,0%: sta 60,0 ± 10,6%, P = 0,004 (2A). Tavallinen yksisuuntainen ANOVA paljasti tilastollisesti merkitseviä eroja kaikkien ryhmä tarkoittaa, F (5,12) = 39,35, P 0,0001. Post-testi laskelmat Bonferroni korjaus säätää useita vertailuja 95% luottamusväli paljasti tilastollisesti merkitseviä eroja (P 0,05) apoptoottisten tasojen mock hoitoa ja kaksi LBH589 yhdistelmä hoitoja, mutta ei LBH589 yksin. Merkittäviä eroja havaittiin myös, että apoptoottinen tasot aiheuttama LBH589 ja LBH589 + ICAP, sekä LBH589 + kittivahaa ja LBH589 + ICAP. Ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa apoptoosin solujen altistuvat pilkattavaksi kittivahaa tai ICAP hoitoa. Western blot analyysit paljastivat, että LBH589 hoidetuilla HCT-R soluissa, co-hoito kittivahaa laski pSTAT3 tasoja kuusinkertaiseksi ja Pakt tasolla 1,7-kertaiseksi; katsoo, co-hoito ICAP johti havaittavissa tasoilla sekä pSTAT3 ja Pakt (kuvio 2B). Suurin ero näiden kahden yhdistelmä hoitoja LBH589 oli, että verrattuna altistuminen LBH589 yksin, lisäksi propoliksen lisäsi pERK1 /2-pitoisuutta 20%; katsoo, ICAP laski pERK1 /2 tasoa kahdeksankertaiseksi (kuvio 2B).

. HCT-R tai HCT-116-solut altistettiin 48 h tai 24 h vastaavasti pilkatakseen (M), 50 nM LBH589 (L), LBH589 ja 100 ug /ml propolis (LP), LBH589 ja ICAP (LC), 100 ug /ml propolis (P), tai ICAP yksin (C). B. HCT-R solut altistettiin kuvatuista menetelmistä A 17 tuntia. ja kokosoluliuotteista analysoitiin western-blottauksella. C. HCT-R ja HCT-116-solut altistettiin 48 h tai 24 h vastaavasti pilkatakseen (M), 10 uM 5-fluorourasiilia (F), 5-fluorourasiili ja 100 ug /ml propolis (FP), 5- fluorourasiili ja ICAP (FC), propolis (P), tai ICAP yksinään (C).

HCT-R solut ovat suhteellisen resistenttejä apoptoottisen vaikutusten HDACis osittain johtuu niiden ilmen- tymisen lisääntymisen selviytymisen signalointi jopa ilman hoitoa [8], [22]. Arvioida merkitys eloonjäämisreittejä in HDACi herkkien CRC-solut, käytimme HCT-116-solut, joista HCT-R-solut olivat peräisin [8]. HCT-116-solut, käsittelemällä LBH589 yksinään johti kuuden-kertainen apoptoosin (mock-hoito johti 10,4 ± 1,8% apoptoosin ja LBH589 altistuminen 50 nM johti 64,2 ± 10,0% apoptoosin, P = 0, Fig. 2A). Lisäksi propolis tai ICAP laajennettu entisestään apoptoottisen vaikutuksen LBH589: altistusta LBH589 + kittivaha johti 81,3 ± 6,3% apoptoosin (P = 0,072), ja LBH589 + ICAP johti 96,0 ± 1,5% apoptoosin (P = 0,006), 2A. Yksisuuntainen ANOVA paljasti tilastollisesti merkitseviä eroja ryhmä tarkoittaa, F (5,12) = 162,1, P 0,0001. Post-testi laskutoimituksia Bonferronin osoitti tilastollisesti merkitseviä eroja (P 0,05) apoptoottisten tasojen mock käsittely ja kaikki kolme hoitoa, joka sisälsi LBH589. Samalla merkittäviä eroja ei havaittu, että apoptoottisten tasot indusoitiin kittivaha ICAP, ja kaikki kolme hoitoja, jotka sisältyvät LBH589. Ei ollut tilastollisesti merkittävää eroa apoptoottisten solujen tasoilla alttiina pilkattavaksi kittivahaa tai ICAP hoitoon.

LBH589 on erittäin tehokas apoptoosin CRC solujen mutaatioita WNT /kateniinin koulutusjakson Kuitenkin aine on edelleen kliinisissä tutkimuksissa. Siksi me kysytään propolis ja ICAP augment indusoiman apoptoosin 5-fluorourasiili, merkittävä osa nykyisestä anti-CRC lääkehoidossa. 5-fluorourasiili (5-FU) indusoi vähäistä apoptoosin HCT-116-solujen saavuttamaton

in vivo

10 uM (mock-soluilla 10,4 ± 1,8% apoptoosin, ja 5-FU-käsiteltyjen solujen – 33,1 ± 3,2% apoptoosin, P = 0, kuvio 2C. samaan keskittymä agentti ei aiheuta merkittävää apoptoosin HCT-R solut: valehoidettujen soluilla 7,1 ± 1,8% apoptoosin, ja 5-FU-käsiteltyjen solujen – 9,5 ± 1,3% apoptoosin, P = 0,14, kuvio 2C. yhdistetty altistuminen HCT-116 soluja 5-FU + kittivahaa 5-FU + ICAP ei noussut merkittävästi apoptoottisten tasot verrattuna hoitoon 5-FU alone: ​​5-FU altistus johti 33,1 ± 3,2% apoptoosin, 5-FU + kittivahaa hoito johti 33,2 ± 3,8% apoptoosin, ja 5-FU + ICAP – 35,5 ± 9,0% apoptoosin (kuvio 2C). Tavallinen yksi- tapa ANOVA paljasti tilastollisesti merkitseviä eroja ryhmä tarkoittaa, F (5,12) = 18,31, P 0,0001. Post-testi laskelmat Bonferroni korjaus säätää useita vertailuja 95% luottamusväli osoitti tilastollisesti merkitseviä eroja (P 0,05) apoptoottinen tasojen mock käsittely ja kaikki kolme hoitoa, joka sisälsi 5-FU. Samaa merkitsevä ero havaittiin apoptoottisen tasot indusoitiin kittivaha ICAP verrattuna kaikkiin kolmeen hoitoja, jotka sisältyvät 5-FU.

Sekä propoliksen ja ICAP kaksinkertaistui apoptoottisen vasteen HCT-R-soluja ja 5-FU: verrattuna 5-FU yksin, 5-FU + propolista käsittely johti 23,1 ± 3,6% apoptoosin, P = 0,003, ja 5-FU + ICAP – 22,3 ± 2,2% apoptoosin, P = 0,001, kuvio 2C. Yksisuuntainen ANOVA apoptoottisten tasojen HCT-R solut altistuvat yhdistelmä hoitojen kanssa 5-FU: n ja ICAP tai propolis paljastanut tilastollisesti merkittäviä eroja ryhmä tarkoittaa: F (5,12) = 28,81, P 0,0001. Post-testi laskutoimituksia Bonferroni korjaus osoitti tilastollisesti merkitseviä eroja (P 0,05) apoptoottisten tasojen mock hoito ja 5-FU + kittivahaa, välillä mock hoito ja 5-FU + ICAP, ja välillä 5-FU hoitoa ja yhdistelmähoidot 5-FU + kittivahaa ja 5-FU + ICAP. Ei ollut tilastollisesti merkittävää eroa apoptoottisten tasojen mock ja 5-FU hoidossa.

3. Targeting apoptoosiin liittyviä proliferaatio paksusuolensyöpä ehkäisevää lähestymistapaa

katsoo kliinisen soveltaminen ICAP ja kittivaha täydennys laajentaa syöpälääkkeiden vaatii validointi kautta satunnaistetussa kliinisessä tutkimuksessa, soveltamalla ruokavalioon perustuva lisä CRC ennaltaehkäisy on konkreettinen. Butyraatti, käymistuote kuitua paksusuolen ja HDACi, indusoi apoptoosin useimmissa CRC solulinjoissa, ja tämä vaikutus saattaa selittää osittain suojaava rooli kuitua vastaan ​​CRC [31]. Samanlainen indusoiman apoptoosin LBH589, apoptoosin alulle butyraatti on torjua eloonjäämisen signalointi. Siksi CRC ennaltaehkäisevä lähestymistapa voi yhdistää butyraatti kanssa estäjiä eloonjäämisreittejä. Propolis täydentää butyraatti aiheuttaman apoptoosin tukahduttamalla kaksi eloonjäämisreittejä: AKT ja JAK /STAT [26]; kuitenkin, meidän analyysit LBH589 käsiteltyjen CRC soluja, kittivaha paitsi ei tukahduttaa, mutta itse asiassa täydennetty pERK1 /2 tasoa. Koska tukahduttaminen ERK signaloinnin jonka MEK1 /2-estäjän AZD6244 parannettu apoptoottisen vaikutuksen LBH589 (kuvio 1 B), päättelimme, että butyraatti /kittivaha aiheuttama apoptoosin voitaisiin samalla täydennetty kohdistamalla ERK signalointi ruokavalion peräisin olevat yhdisteet. Perustuu kirjallisuudesta, keskityimme useita raportoitu ruokavalioon johdettu ERK1 /2-estäjät, joita olivat muun muassa ursolic, curcumin, sulforaphane, ja kahvi. Seulotaan yhdisteitä yksikään tukahdutetaan pERK1 /2 tasoa butyraatti /kittivaha käsitellyn CRC soluissa; kuitenkin, lisäämällä kahviuutetta tehostetun apoptoosin HCT-R-solut (3A). Yksisuuntainen ANOVA paljasti tilastollisesti merkittäviä eroja ryhmä tarkoittaa: F (7,25) = 50,96, P 0,0001, (3A). Post-analyysit Bonferroni korjaus tehtiin kaikille kahdeksalle ryhmille hoitoja; olemme kuitenkin keskittyneet joko lisäämällä Kahviuutteiden aiemmin tunnettu ja raportoineet meille ruokavalion aineet vaikuttivat apoptoottista tasoja HCT-R soluissa. Niinpä huomasimme, että siellä oli tilastollisesti merkitseviä eroja (P 0,05) apoptoottisten tasojen seuraavista hoidoista: butyraatti versus butyraatti + kahvi, butyraatti + kittivahaa versus butyraatti + kittivahaa + kahvia, ja propolis vs. propolis + kahvia. Kaksi esilääkityksenä indusoi korkeimman apoptoosin HCT-R soluissa, propolis + kahvi ja butyraatti + propolis + kahvi, vähensi pSTAT3 on havaittavissa tasolle ja Pakt tasoilla kolminkertaiseksi (Kuviot 3A ja 3D).

A-C. Solut altistettiin pilkattaa (M), 5 mM butyraattia (B), 1 mg /ml paahdettu kahvi uute (R), 100 ug /ml propolis (P), butyraatti ja kahviuute (BR), butyraatti ja propolis (BP) , kittivaha ja kahviuute (PR), tai butyraatti, kittivaha ja kahviuute (BPR). Apoptoosi mitattiin virtaussytometrillä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. D-F. Solut altistettiin hoitoja kuten edellä on kuvattu 17 tunnin ajan, ja kokosoluliuotteista analysoitiin western-blottauksella.

HCT-R-solut edustavat todennäköisesti loppuvaiheissa neoplastisten kehityksen, kun lääkeresistenssi perustettu. On kuitenkin enemmän merkitystä testanneet CRC ehkäisevä strategia soluissa, jotka edustavat aikaisemmin neoplastisia vaiheissa. Näin ollen, olemme analysoineet vaikutuksia ruokavalioon peräisin aineina LT97 solulinja perustettiin ihmisen paksusuolen microadnoma [23], [24], ja HCT-116-paksunsuolen karsinoomasoluja, jotka ovat herkkiä kemoterapeuttisten. Verrattuna HCT-R-solut, sekä LT97 ja HCT-116-solulinjat ovat herkempiä butyraatti-indusoitua apoptoosia; Siksi mittasimme apoptoosin 24 tuntia annon jälkeen eri hoito. HCT-116-solut, butyraatti hoito johti 36,8 ± 3,4% apoptoosin verrattuna mock soluja, jotka osoittivat 8,8 ± 0,4% apoptoosin (3B). Korkeimman apoptoosin saavutettiin yhdistelmät butyraatti + propolis (46,0 ± 2,0%), butyraatti + kahvi (65,8 ± 3,5%), ja butyraatti + propolis + kahvi (73,9 ± 3,7%); sama aineiden yhdistelmien tukahdutti myös tasot pSTAT3 (Fig.3E). Yksisuuntainen ANOVA pitoisuuksien apoptoosin HCT-116-solut altistettiin ravinnon tekijöille paljasti tilastollisesti merkittäviä eroja ryhmä tarkoittaa: F (7,23) = 168,7, P 0,0001. Post-testi laskelmat Bonferroni korjaus säätää useita vertailuja 95% luottamusväli osoitti tilastollisesti merkitseviä eroja (P 0,05) apoptoottisten tasojen kaikkien hoitojen paitsi butyraattia hoitoon verrattuna voihappoon + propolis, butyraatti kohtelu verrattuna propolis + kahvi, ja butyraatti + kahvi hoitoon verrattuna voihappoon + kahvi + kittivahaa.

Olemme aiemmin todettu, että LT97 solut ovat erittäin herkkiä Wnt signalointia hyperactivation ja solujen kasvun pysähtymisen läsnäollessa butyraatti [32]; näissä soluissa, mock hoitotuloksia 12,2 ± 0,7% apoptoosin, ja butyraatti altistus 27,8 ± 5,0% apoptoosin. Altistaminen LT97 solujen kittivaha + kahvi tai propoliksen + butyraatti johti tilastollisesti vertailukelpoiset apoptoosin: 22,1 ± 4,7% ja 25,6 ± 2,1%: lla. Korkeimman apoptoosin saavutettiin yhdistelmähoidot butyraatti + kahvi (34,7 ± 5,7%) ja butyraatti + kahvi + propolis (47,9 ± 8,2%), ja ei ollut tilastollisesti merkittävää eroa apoptoottisten tasot saavutetaan kahdessa käsittelyssä ( P = 0,08). One-Way ANOVA tasojen apoptoosin LT97 soluja altistetaan ravinnon tekijöille paljasti tilastollisesti merkittäviä eroja ryhmä tarkoittaa: F (7,16) = 22,57, P 0,0001. Post-testi analysoi hoitoja, jotka sisältyvät kahviuute osoitti, että ei ollut tilastollisesti merkittäviä eroja apoptoottisten solujen tasoilla alttiina butyraatti vs. butyraatti + kahvia, ja propolis vs. propolis + kahvi; oli kuitenkin tilastollisesti merkitsevä ero indusoiman apoptoosin butyraattia + propoliksen ja butyraatti + propolis + kahvi (P 0,05). Käytetyissä olosuhteissa, emme pystyneet havaitsemaan pSTAT3 tasolle LT97 soluissa; kuitenkin, altistuminen voihappoon + propolis + kahviuute nousi Perk havaittavia määriä verrattuna valehoidettujen soluja (Fig.3F). Samoin altistuminen HCT-116-solujen voihappoon + propolis + kahviuute kasvoi Perk tasoja kaksinkertaiseksi; kuitenkin, tällainen vaikutus ei havaittu HCT-R soluissa (Kuviot 3A, B). Olemme myös analysoineet tasoja pc-kesäkuu, koska tämän reitin voi vaikuttaa apoptoosia ja solujen eloonjäämistä. Kaikissa soluissa, yhteensä c-kesäkuu nousivat hoitoja, ja pc-kesäkuu tasot heijastuvat tarkasti korotuksen (Figs.3D, E, F).

vaikutuksen testaamiseksi kahvin eri tasoilla, olemme alttiina HCT-116-solut 0,25, 0,5 ja 1 mg kahviuutetta millilitrassa väliainetta. Suuren annoksen yhden milligramman millilitrassa perustui kahvia saannin tutkimuksissa ileostomy vapaaehtoisille [33], ja keskimääräinen yhdistetty tilavuus nesteitä mahassa, ohutsuolessa, ja paksusuolen [34]. 1 mg /ml, kahviuutetta johti 23,7 ± 4,6% apoptoosin verrattuna mock hoitoon, 8,4 ± 0,4% apoptoosin (P = 0,001), 4A. Solujen käsittelyn kanssa butyraatti + propoliksen johti 39,3 ± 5,1% apoptoosin, ja lisäksi 0,25, 0,5 tai 1,0 mg /ml kahviuute lisääntynyttä apoptoosia 51,8 ± 5,7% (P = 0,017), 64,8 ± 3,2% (P = 0), tai 77,4 ± 4,1% (P = 0), vastaavasti, 4A.

. HCT116-solut altistettiin 24 tunnin pilkattaa (M), 1 mg /ml paahdettu kahvi uute (R), 5 mM butyraattia ja 100 ug /ml propolis (BP), tai butyraatti /kittivahaa ja kasvavia pitoisuuksia kahviuutetta: 0,25, 0,5 tai 1,0 mg /ml. Apoptoosi mitattiin virtaussytometrillä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. B. HCT-116-soluja käsiteltiin kuten kohdassa (A), 17 tuntia ja kokosoluliuotteista analysoitiin western-blottauksella. C. HCT-116 ja LT 97 solut altistettiin 20 h, ja HCT-R solut altistettiin 42 tuntia pilkattavaksi (M), 0,5pM AZD6244 (A), yhdistelmä; 5 mM butyraattia, 100 ug /ml propoliksen, 1 mg /ml paahdettu kahvi uute (BPR), tai BPR ja 0,5 uM AZD6244 (BPR-A). Apoptoosi mitattiin virtaussytometrillä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tilastollisesti merkitseviä eroja apoptoottisten tasot huomattava tähdellä (P 0,05). D. Klonaaliset kasvun määrityksissä. Prosenttia kloonikasvuun laskettiin jakamalla solujen pesäkkeiden useissa päällystetty solujen ja kertomalla 100. suhdeluvut kloonikasvuun laskettiin jakamalla prosentin klonaalinen kasvu valehoidettujen näytteissä prosentuaalinen klonaalinen kasvu agentti- käsiteltyjen näytteiden. Kokeet toistettiin neljästä kuuteen kertaa kanssa triplikaattinäytteet koetta kohti. Tilastollisesti merkittäviä eroja solulinjoja niiden keskimääräiset suhteet määritettiin yksisuuntaisella ANOVA. Jotta solut altistuvat butyraatti, F (6,31) = 10,26, P 0,0001; soluille altistuvat kittivaha ja kahviuute, F (6,28) = 5,493, P = 0,0007, ja solut altistettiin butyraatti, kittivaha ja kahviuute, F (6,26) = 10,56, P 0,0001. Testin jälkeinen laskelmia käytettiin Bonferronin korjauksen säätämään useita vertailuja 95%: n varmuudella. Solujen joukossa altistettiin butyraatti, tilastollisesti merkitseviä eroja (P 0,05, CI 95%) havaittiin HCT116 vs. CCL92, HCT116 vs. HEK293, HCT116 vs. SW13, HCT116 vs. LA1-5s, HCT116 vs. HCT-R , CCD841CoN vs. HEK293, ja CCD841CoN vs. HCT-R soluissa.