Krooninen sairaus

tiivistelmä

Micro RNA: t (miRNA) ovat luokan pieni, ei-koodaavan RNA lajeja että kriittisiä rooleja koko solujen ja sääntelyä. miRNA ekspressiokuvioiden otettu eri kudostyypeistä viittaavat usein solun sukujuuret yksittäisen kudostyypin, jolla se on enemmän invariantti tunnusmerkki kudostyypin. Viimeaikainen tutkimus on osoittanut, että nämä miRNA ilmaisua malleja voidaan luokitella kasvainsoluihin, ja että tämä luokittelu voi olla tarkempi kuin luokituksen aikaan käyttämällä lähetti-RNA geeniekspressiomalleja. Yksi osa miRNA biogeneesiä, joka tekee niistä erityisen houkuttelevia biomarkkerina on se, että ne säilytetään suojatussa tilassa seerumin ja plasman, jolloin havaitsemisen miRNA ekspressiokuvioiden suoraan seerumista. Tämä tutkimus on keskittynyt arviointiin miRNA ilmentymismalleja ihmisen seerumissa viiden tyyppisiä ihmisen syövän, eturauhasen, paksusuolen, munasarja-, rinta- ja keuhkosyöpä, käyttäen yleiseurooppalainen ihmisen microRNA, tiheän microarray. Tämä mikrosirun alusta mahdollistaa samanaikaisen analyysin kaikista ihmisen MikroRNA joko fluoresoivia tai sähkökemialliset signaaleja, ja voidaan helposti uudelleen sisältämään vastatunnistetun miRNA. Osoitamme, että riittävä miRNA ovat läsnä yhdessä millilitrassa seerumia havaita miRNA ilmentymismalleja, ilman vahvistusta tekniikoita. Lisäksi voimme käyttää näitä ilmaisua kuvioita oikein syrjiä normaalin ja syöpäpotilaan näytteitä.

Citation: Lodes MJ, Caraballo M, Suciu D, Munro S, Kumar A, Anderson B (2009) Detection syövän kanssa Serum miRNA on oligonukleotidin Microarray. PLoS ONE 4 (7): e6229. doi: 10,1371 /journal.pone.0006229

Editor: Alfredo Herrera-Estrella, Cinvestav, Meksiko

vastaanotettu: 03 helmikuu 2009; Hyväksytty 4. kesäkuuta 2009; Julkaistu: 14 heinäkuu 2009

Copyright: © 2009 Lodes et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Combimatrix on kaupallinen voittoa yhtiö, joka rahoitti tutkimusta. Keskeiset tutkijat ovat yhtiön toimihenkilöitä. Lupa yhtiön laillinen ja talousosastot saatiin esittää julkaisun ja lupaa valvojien saatiin aloittaa tutkimuksen. Tieteellinen henkilöstö suunniteltu tutkimus, kerätään ja analysoidaan tietoja ja kirjoitti käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: CombiMatrix on kaupallinen voittoa yritykselle ja keskeiset tutkijat ovat yhtiön toimihenkilöitä. Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että mikään muu kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat yksijuosteisia RNA-molekyylejä noin 21-23 nukleotidin pituisia, jotka toimivat säätelyssä geeni ilmaisu. miRNA ilmaistaan ​​osana ensisijainen transkriptien muodossa hiusneulat, jossa signaalit dsRNA-nukleaasi katkaisun ribonukleaasi Drosha yhdessä RNA-sitova proteiini. Sen jälkeen, kun prekursori miRNA vapautuu noin 70 nt RNA, se kuljetetaan tumasta sytoplasmaan Exportin-5, ja sitten pilkotaan Dicer RNaasi III muodostaa kaksijuosteisen RNA: ta. Dicer aloittaa muodostumista RNA-indusoidun hiljentäminen kompleksi (RISC), joka on vastuussa geenien havaittiin johtuen miRNA ilmaisun ja RNA-interferenssi [1], [2], [3].

MikroRNA on löydetty kudosten ja myös seerumin ja plasman, ja muiden kehon nesteiden, stabiilissa muodossa, joka on suojattu endogeenisen RNaasi-aktiivisuuden (yhdessä RISC, joko vapaasti veressä tai eksosomeiksi (endosomissa johdettuja organelles)). Tutkimukset Lu et al [4] osoitettiin toteutettavuus ja hyödyllisyys seurannan ilmentymisen miRNA ihmisen syöpäkudoksessa. He löysivät korkeatasoista monimuotoisuuden miRNA ilmaisun poikki syöpiä, ja havaitsi, että noin 200 miRNA voisivat riittää luokitella ihmisen syövissä. Tam [5] lisää, että koska miRNA toimivat johtajat geeniregulatiivista verkoissa, ne eroavat muista biomarkkerit, koska niillä on patogeeninen rooli taudin kulkuun ja ei sivutuotteita tautitilan. Koska miRNA toiminto erityisillä sitoutuvat kohteisiinsa, polymorfismit (SNP) puitteissa sekvenssin miRNA tai niiden kohde-mRNA: iden voi johtaa taudin, kuten syövän. Nämä miRNA-spesifinen SNP: t voivat vaikuttaa riskiä taudin ja voidaan käyttää myös diagnostiikassa näiden tautien [6]. Vapautettiin miRNA on kuvattu useista ihmisen syövissä kuten rinta-, keuhko-, paksusuoli-, munasarja-, ja eturauhassyöpää. Mitchell et al [7] mukaan miRNA peräisin eturauhassyöpäkudoksen laskea liikkeelle ja sitä voidaan käyttää erottamaan potilaille, joilla on eturauhassyöpä terveistä valvontaa ja perusti veripohjaisten PCR lähestymistapa havaitsemiseen ihmisen eturauhassyövän. Samanlaista lähestymistapaa käytettiin seerumin miRNA munasarjojen syöpäpotilaiden [8]. Taylor ja Gercel-Taylor [9] tutki käyttö kiertävän eksosomeiksi on syövän diagnoosissa. He havaitsivat, että miRNA sisältö munasarjojen kasvainsolujen ja kiertävien eksosomi oli samanlainen ja voidaan käyttää erottamaan syövän potilaiden, joilla on hyvänlaatuinen munasarjojen sairaus ja normaalit kontrollit.

miRNA allekirjoituksia normaaleista ja syöpä- kudoksia käytetty luokitella useiden syöpätyyppien ja voi myös sallia lääkärit määrittää hoitojakson perustuu alkuperäiseen kudostyyppi. Se voi myös olla mahdollista käyttää miRNA ekspressiokuvioiden biomarkkerina seurata vaikutusta hoidon syövän etenemiseen [2]. Koska miRNA ekspressioprofiileja samansuuntainen kehitykselliset alkuperää kudosten ja koska suhteellisen harvat miRNA voidaan tehokkaasti kirjoittaa kudoksiin, ne ovat potentiaalisesti parempia markkereita kuin RNA: iden syövän diagnosointiin [4]. Mahdollisen käytön seerumin miRNA biomarkkereina taudin ja tavoitteita terapeuttisten on lupaava [10], koska se tarkoittaa ei-invasiivisia, tarkka testi syövän. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että seerumin miRNA voidaan syrjiä syöpäpotilaan seerumista ja normaalin luovuttajan seerumista, käyttämällä yksinkertaista mikrosirulla määritys, joka ei vaadi vahvistusta vaiheessa.

Tulokset

Serum microRNA louhinta

Olemme todenneet, että riittävä määrä miRNA on läsnä alle 1 ml ihmisen seerumia tuottamaan havaittavan signaalin microarray fluoresenssi tai sähkökemialliset tunnistus (ECD). Käyttämällä yksinkertaista uutetaan fenoli /kloroformilla protokollaa, me talteen noin 1,3 ug seerumin RNA: ta kustakin 800 ul: aan seerumia (keskiarvo 18 näytteen; keskihajonta 0,3). Tuloksena kuvio miRNA ilmaisua voitaisiin käyttää erottamaan syöpäpotilaiden ja normaalien luovuttajien.

arvioitu koko pienen RNA: iden talteen plasmasta määritettiin eristämällä suuri RNA-fragmentit (alhainen etanolipitoisuus) ja pieniä RNA-fragmentteja (korkea etanolipitoisuus) käyttäen Invitrogen PureLink miRNA eristyspakkausta, kun happo uutetaan fenoli /kloroformilla ja sademäärä. Kaksi RNA koko Fraktioinnit leimattu biotiinilla (Mirus) ja hybridisoitiin mikrosirun. Tulokset (ei esitetty) osoittivat, että valtaosa signaali oli pienestä RNA osa, joka oli samanlainen kuin signaalin un-fraktioitu näyte.

DNA-kontaminaation ja uutettiin seerumin nukleiinihapon tutkittiin vertaamalla uuttonäytteenä joka oli jaettu, ja puolet käsiteltiin DNaasi I Merkittyäsi sekä käsitellyt ja käsittelemättömät näytteet biotiinin kanssa ja hybridisoitumaan eri sektoreiden saman 4 × 2K matriisi, hyvin pieni ero näkyi välillä käsiteltyjen ja käsittelemättömien näytteiden (r

2 = 0,9 ja 0,96 vastaavasti kaksi toistoa) osoittaa, että pieni DNA saastuttaa näytteistä (tuloksia ei ole esitetty).

Pitoisuus herkkyyttä ja vakautta

herkkyys meidän miRNA määrityksen määritettiin lisäämällä laimennoksia synteettinen RNA-oligonukleotidi meidän määrityksen aikana seerumin uuttamalla. Pystyimme havaitsemaan noin 4000 kopiota seerumin MikroRNA mikrolitraa kohti seerumia (kuvio 1). Tämä havaitseminen taso on samankaltainen kuin Mitchell et al [7] eturauhassyövän erityinen microRNA miR-141 käyttäen TaqMan määrityksiä. miRNA mikrosirut ovat suhteellisesti herkempiä kuin normaali ilmaus mikrosiruja koska pienet oligonukleotidien yleensä parempi hybridisaatio kinetiikkaa kuin suurempien RNA tai DNA-molekyylejä. Sillä miRNA, sekä niiden suojelua ruoansulatus eri solujen tekijät, ja niiden pieni koko edistää niiden havaitseminen seerumissa mikrosiruissa tasoilla, jotka ovat alhaiset kuin havaitut menetelmät, jotka muutoin katsotaan herkemmäksi.

RNA-miRNA analoginen oligonukleotideja, konsentraatioilla alueella 0-40 miljoonaa kappaletta mikrolitraa kohti, oli oli lisätty 400 ui seerumin lisäämisen jälkeen RLT-puskuria. RNA uutettiin sitten seerumista käyttämällä fenoli /kloroformi-uuttoa ja etanolisaostusta. Sitten näytteet merkitty ja hybridisoitiin on microarray. Pystypalkit osoittavat array signaali intensiteettiä tietyn miRNA koettimet edustavat villityypin sekvenssi (Wild) ja antureilla kaksi sisäistä mutaatiota (mut) varten (A) airo | miR-431 ja (B) airo | miR-127. Asteikot 4000 ja 0 kopiota datapisteitä (pakattuna vasen paneelit) laajennetaan oikeaan paneelit: (C) airo | miR-431, ja (D) airo | miR-127.

Olemme myös todenneet, että kerätyt tiedot saman seeruminäytteistä jälkeen jäädytettiin -80 ° C: ssa 1 viikko sen jälkeen, kun ensimmäisen microRNA määrityksissä, oli samanlainen kuin alkuperäinen data. MikroRNA alkaen alikvootteja 2 seeruminäytteiden syöpäpotilailla (1 eturauhas- ja 1 paksusuolen) poimittiin, merkitty ja hybridisoitiin paneelit, ja sen jälkeen yksi jäädytys /sulatus tapauksessa uusi alikvootteja uudelleen uutetaan, merkitty ja hybridisoitiin toisen array. Tietokokonaisuudet, mistä uudelleen analysoitiin eturauhassyöpä näyte 811 ja paksusuolen näyte 792, osoitti vahvaa korrelaatiota, kun raaka array tietoja verrattiin (r

2 = 0,94 ja 0,96 vastaavasti). Tämä tulos osoittaa, että määritys on toistettavissa ja ajan kuluessa vakaita.

Serum microRNA tietojen analysointi

Useat eturauhas-, munasarja-, paksusuoli-, rinta- ja keuhkosyöpä seeruminäytteiden sekä normaali miehen ja naisen luovuttajasta sera on analysoitu yleiseurooppalaiseen miRNA microarray selvittämään seerumin miRNA profiilit ja vahvistaa spesifisyyden profiileja eri syöpien ja normaaleista luovuttajista. Useita data-analyysimenetelmiä on testattu määrittääkseen olennaisimmat menetelmä syrjintä syövän vs. normaali. Saat alustavan analyysin, me log

2-transformoidut seerumin miRNA koetin signaaleja normaalista luovuttajan ja verrattiin näitä tietoja kirjautua

2-transformoidut koetin dataa eturauhassyöpä potilas ja siitä eturauhassyöpäsolulinja. Vaikka sekä eturauhassyövän seeruminäytettä ja eturauhassyövän solulinja (22Rv1) näyte osoitti ylössäätöä verrattuna normaaliin seeruminäyte, ne eivät näytä paljon samankaltaisuutta toisiinsa. Tässä vaiheessa emme yksinkertaisesti todeta suhteellinen ylössäätöä seerumin miRNA syövän verrattuna seerumin normaaleilta luovuttajilta (kuvio 2).

Log muuttaneet normaalin luovuttajan seerumista miRNA signaaleja (sininen viiva) verrattiin miRNA array signaaleja eturauhassyövän solulinja 22Rv (avoimet neliöt) ja eturauhassyövän potilaan (suljetut vinoneliöt). Yleensä syöpä ja solulinjaa miRNA näyttävät olevan säädelty verrattuna normaaleihin luovuttajan seerumista miRNA.

ensimmäinen esitetyn määritellä minimaalinen sarja koettimia, joka antaisi meille mahdollisuuden syrjiä eturauhasen ja normaali seerumi näytteitä. Signaalin kultakin miRNA koetin oli ensimmäinen taustakorjatut käyttämällä negatiivista kontrolli koettimia. Tämän jälkeen, kukin miRNA koetin ilmaistuna luonnollisen logaritmin suhteen itsensä ja saman koettimen normaalin ihmisen uros seeruminäyte. Tämä antaa arvo 0 kaikille base seerumi näytteenottimet ja ylös tai alas sääntelyn suhteen, että näyte (normaali) kaikkien muiden näytteiden (normaali ja syöpä). Kuvio 3 esittää suhteet osajoukko koettimia, jotka ovat läpäisseet useita ehtoja. Kaikki eturauhassyöpä koetin tietokokonaisuuksien suodatettiin poistamaan kaikki antureista, joiden täydellinen ottelu signaalia ei ollut suurempi kuin sen mutantti signaali. Viisitoista miRNA havaittiin yli-ilmentynyt seerumissa kaikki vaiheen 3 ja 4 eturauhassyöpäpotilailla (miR-16, -92a, -103, -107, -197, -34b, -328, -485-3p, -486 -5p, -92b, -574-3p, -636, -640, -766, -885-5p) suhteessa 8 normaaleihin kontrolleihin (kuva 3). Tämä analyysi osoitti myös hieman korkea signaali miR-141 vaiheessa 3 ja 4 eturauhassyöpä potilaiden seerumit (keskiarvo = 829, STD = 201) yli normaalin luovuttajan seerumia (keskiarvo = 555, STD = 64); joka on yhtä mieltä ilmoittamien tietojen Mitchell et al [7] käyttämällä RT-PCR.

Kun datajoukon normalisointi, luonnollinen lokia suhde signaalin tietyn koetin samalla koetin normaalista seeruminäyte otettiin. 15 miRNA osoitti ylössäätöä kaikissa vaiheessa 3 ja 4 eturauhassyöpänäytteissä verrattuna sera normaaleista miehen luovuttajilta. Nämä miRNA on lueteltu ennen kutakin tietokokonaisuutta. Viisi vaihetta 3 ja 4 eturauhassyövän seerumia (keltainen), ja 8 normaalilla miespuolisella luovuttajan seerumia (punainen) analysoitiin. Pystysuuntaiset viivat osoittavat plus tai miinus yksi standardipoikkeama keskiarvosta.

Kuvassa 4, olemme piirretty z-pisteet-korjatun signaalin intensiteettejä kolme hybridisaatioita. Z-score normalisoinnin laskettiin vähentämällä signaali kunkin koettimen keskiarvolla mittapäät koko muusta hybridisaatio, ja sitten, jakamalla että arvo keskihajonta signaalin poikki mittapäät, jokaisen eri hybridisaatio. Tämä normalisointi saannot koettimen signaalit, jotka on keskitetty ja normalisoitiin keskiarvo on 0 ja keskihajonta 1,0. Kunkin koealan, signaali lajiteltiin suurimmasta pienimpään intensiteettiä, ja piirretään yhtenäisellä viivalla. Täydellinen ottelu /epäsuhta (pm /mm) suhde piirrettiin avoimet kolmiot yli signaalin voimakkuuden linja. On selvää, koettimet korkeammat intensiteetit ovat merkittävästi korkeammat pm /mm suhteet. Jotta signaalin miRNA katsotaan olevan merkittäviä, sopimaan täydellisesti (villin tyypin anti-sense) anturivirta on oltava suurempi kuin sen kaksinkertainen mutantti negatiivinen kontrolli (mm) anturi. Tarkemmin sanottuna pm /mm suhde on oltava suurempi kuin 1,5 (piirretty oikealla puolella y-akseli). Tällä metrinen, vähintään 34 koettimet pidettiin merkittävinä normaalin seeruminäytettä (kuvio 4A). Eturauhasen syövän solulinja 22Rv1 näytteen ja eturauhassyövän seeruminäytettä (kuvio 4 B ja C) oli 57 ja 62 merkittävää koettimia vastaavasti. Yksinkertaisimmillaan se, että suurin osa antureista, joilla on suuri signaali myös korkea pm /mm suhdeluvut, osoittaa, että signaalit luemme ovat todellisia. Olemme myös suorittaa useita ei-miRNA negatiivinen kontrolli hybridisaatioita. Näiden hybridisointeja, vaikka jotkut antureista on korkeampi signaali kuin toiset, tämä ei liity vastaava lisäys pm /mm suhteet (ei kuvassa).

(A) analyysi signaalin normaalista seerumista; (B) analyysi signaalin 22Rv1 soluviljelmästä; ja (C) signaalin eturauhassyövän potilaan seerumissa. Z-score (siniset viivat) määritettiin vähentämällä signaali kunkin koettimen keskiarvolla mittapäät koko muusta hybridisaatio, ja sitten jakamalla saatu arvo keskihajonta signaalin poikki mittapäät, koko hybridisaatio.

Hierarkkinen klusterointi.

Hierarkkinen klusterointi käytettiin ryhmään näytteitä eri sairauksien ja normaalia tilaa (kuva 5). Aineiston käytetään klusterointi sisälsi 35 seeruminäytteitä, jotka olivat seosta normaalin seerumin ja syövän seeruminäytteistä monentyyppisiä ja vakavuus (vaiheet) (katso taulukot 1 ja 2). Koska suurin osa miRNA käytetään microarray ei ole läsnä havaittavia määriä useimmissa seeruminäytteissä, klusterointi oli vain suoritettiin osajoukko miRNA. Tämä alaryhmä vedettiin ryhmästä miRNA jotka katsottiin olevan merkittäviä. Vain signaali alkaen miRNA koetin asetetaan, jotka todettiin olleen merkittäviä vähintään 5 hybridisointeja koko datasarja otettiin ja käytettiin lisäanalyysiä. Signaali testi antureista (villin tyypin anti-sense) oli log

2-muuttunut. Nämä koettimet normalisoidaan sitten konversio Z-score. Vain testi antureista, ei mitään negatiivisessa kontrollissa tai piikki-ins, käytettiin tähän laskentaan. Signaali sitten kynnysarvo perustuu merkitystä. Hierarkkinen klusterointi suoritettiin käyttäen ohjelmaa kirjoitettu talon, joka käyttää Spearmanin etäisyyden funktiona. Tuotos rahoitus on dendrogrammimuodossa joka oli näytössä käyttäen ohjelmaa Puunäkymäikkuna [11]. Clustering osoittaa erottamaan selkeästi toisistaan ​​normaalin ja useimmat syöpänäytteissä (kuva 5).

Syöpä näytteitä ja normaali luovuttajanäytteessä (suluissa) ryhmittyivät käyttäen hierarkkinen klusterointi ohjelma osoittaa näytteen ja näytteen suhteita. Näyte leimoja ovat luovuttajan ehto (syöpätyypin tai normaali), näyte erän numero (kolme viimeistä numeroa), sukupuoli, ja syövän vaihe (2-4 tai 0 normaali). Tarrat merkitty tai b osoittavat uusintatestauksen samasta näytteestä.

Lämpökartta Analysis.

Tutkimaan edelleen miRNA vastuussa klusterointi, Heat kartat käytettiin etsimään yhtäläisyyksiä miRNA ekspressiokuvioiden kussakin näytteessä. Tämä menetelmä on tehokkain, kun rivit ja sarakkeet tilataan jotta nämä mallit voidaan tunnistaa helposti. Klusterointi käytettiin näin ollen antaa tämän tilata (tunnistamalla miRNA jotka ovat samanlaisia ​​ilmaisua malleja, ja järjestää ne lähellä). Tämä data on siirretty avoimen lähdekoodin ohjelma, Cluster [12]. Raakadata sekä näytteen ja miRNA signaali otettiin mediaani keskitetty ja sitten aihekokonaisuuksien käyttämällä keskimääräistä sidos, Spearmanin kerroin etäisyytenä funktiona. Heatmaps olivat esillä käyttäen Puunäkymäikkuna [11]. Tämä menetelmä johti selkeä tilaus otettujen näytteiden meidän testi-set (kuvio 6). Näytteet leimattiin yksilöllinen tunniste. Seeruminäytteet potilailta paksusuolen, eturauhasen, munasarja-, rinta- ja keuhkosyövän sairauden eri vaiheissa ja hoito käytettiin tässä aineisto. Tämä analyysi johti kahteen päähaaraan: yksi suuri klusterin sisältävät sekvenssit useimpien syöpänäytteissä, ja toinen haara, joka sisältää normaalin ryhmä yhdessä toisen syövän ryhmään (kuva 6).

joukko miRNA käytettyjen analyysiä varten valittiin perustuen merkitystä vähintään 5 hybridisaatioita. Koetin-set arvioitiin merkittävä, jos suhde täydellinen-ottelun (PM) /täsmää (MM) antureista oli suurempi kuin 1.5.For kunkin hybridisaatio analyysissa, ainoa merkittävä signaali käytettiin klusterointi. Signaali niille miRNA jonka signaali arvioitiin merkittäviksi PM /MM-suhteet olivat Log 2 muunnetaan. Sitten signaali oli mediaani normalisoitu yli että hybridisaatio- ja Keskimäärin Kytkös Clustering suoritettiin käyttäen Spearmanin. Klusterointi visualisoitiin käyttäen ohjelmaa TreeView [12]. Vihreä ilmaisee, negatiivisten arvojen ja Punainen osoittaa positiivisia arvoja. Näytteet tunnistettava joko normaalin (sininen palkki) tai syöpä (keltainen bar) yläosassa kuvassa. miRNA nimet on listattu oikealle ja näytteen tunnuksilla lueteltu edellä.

päätöksen Tree Analysis.

Kunkin miRNA kypsän alueen, kaksi verrokkia kirjoitettu siru: tunne villi tyyppinen anturi (t), anti-sense villityypin (PM) muoto ja kaksinkertainen mutantti ohjaus (MM). Tämä koetinsarjaa käytettiin arvioimaan merkitystä sekä intensiteetti kunkin miRNA kypsän muodon. Kunkin hybridisaatiota, raaka signaali uutettiin ja koettimet ryhmitelty miRNA että ne on suunniteltu. PM signaali oli log

2 muuttaneet, ja Z-normalisoitu. Sillä luokittelija ja kohdennettua syövän ja normaalissa hierarkkinen klusterointi, käytimme yksinkertaista heuristista onko koetin oli todellakin läsnä. Jokaista miRNA että arvioitiin, laskimme signaali merkittävä, jos signaali PM /KK 1,0. Jos näin on, niin Z-normalisoitu log

2 (signaali) käytettiin että miRNA, muuten anturin tiedot kyseiselle koetin ei käytetty. Normalisointi oli siis suoritettiin yli anti-sense villityypin koestusjohtimia siru; kuitenkin ainoastaan ​​tietoja merkittävistä koettimia käytettiin klusterointi ja luokittelu.

Data Mining suoritettiin käyttäen WEKA paketti [13]. Normalisoitu luminoivan data muunnettiin ARFF muotoon ja syöttää WEKA ohjelmaan. Hybridisaatiot ryhmiteltiin kahteen luokkaan, ”syöpä” ja ”normaali”. Käytimme CfsSubsetEval rutiini valita miRNA: n (määritteitä). Tämä menetelmä antoi parhaan aineiston luokittelu kahteen luokkaan. Tämä rutiini arvioi ennustavaa kykyä kutakin ominaisuutta sekä aste irtisanomisten keskenään miRNA. Se suosii määritteet, jotka korreloi kussakin luokassa, mutta se on alhainen välinen korrelaatio. Valinta attribuutteja suoritettiin käyttämällä 10-kertaisesti ristivalidointi, ja valinta 28 parhaat puolet perustui niiden ollessa valittu vähintään 30% ajasta.

seuraavalle poimittua signaali kustakin hybridisaatio vain tämä valittuihin miRNA: n. Kuvassa 7A, kahta eri luokittelijoiden käytettiin erottamaan syövän vs. normaali näytteitä. Bayes-verkon ja esimerkiksi perustuvaa menetelmää kutsutaan K * [14] pystyivät selvästi erottamaan kaksi luokkaa kuluessa 36 näytettä. Klusterointi oli seuraava suoritetaan käyttäen Cluster ohjelmaa Eisen et al. [12]. Keskimäärin sidos käytettiin puiden rakennuksen kriteerit ja Spearmanin käytettiin etäisyyden funktiona. Kuvio 7 B esittää paljon parempi erottaminen normaalista vs. syöpäpotilaan näytteitä.

Data Mining suoritettiin käyttäen WEKA paketti [13]. miRNA koettimet (attribuutteja) valittiin käyttäen määrite valinta rutiinia kutsutaan CfsSubsteEval. (A) 28 miRNA löydettiin tätä menetelmää käyttäen. Kaksi erillistä luokittelija menetelmiä, sekä Bayes-verkon toteuttaminen ja K * menetelmiä [14] pystyivät oikein luokitella näiden näytteiden (käyttäen 10-kertainen ristivalidointi). Tulokset Sekä luokittelija ajojen näytetään sekaannusta matriisi oikealla. (B) Hierarkkinen klusterointi normaalin ja syövän näytteitä suoritettiin käyttämällä signaalia näistä 28 miRNA. Punainen estää ovat hyvin ilmaistu, vihreä pidetään alassäädetty ja musta lohkot ovat ei-merkitsevä arvioituna PM /MM kuvatut kriteerit tekstissä. Näytteet tunnistettava joko normaalin (sininen palkki) tai syöpä (keltainen bar) yläosassa kuvassa. miRNA nimet on listattu oikealle ja näytteen tunnuksilla lueteltu edellä.

Analyysi koodattuja näytteitä.

miRNA microarray tietoja syöpäpotilaista ja normaali luovuttajan seerumit koodattiin poistaa viitteitä tautinsa ja lähettää analysoitavaksi. Käyttäen osajoukko määritteitä edellä kuvatun ja kuviossa 7, 16 single-sokaissut näytteet lisättiin tietoaineiston ja analysoitiin luokittelija. K-tähden luokittelija pystyi soittamaan 16/16 näytteitä oikein joko syöpäpotilaista tai terveillä luovuttajilla, kun taas Bayes Network luokittelija tuotettu 3 luokitusvirheitä ulos 16 (tuloksia ei esitetty).

Keskustelu

miRNA lauseke allekirjoitukset on mahdollinen rooli diagnostiikassa, ennusteen ja hoidon ihmisen sairauksien, kuten syövän, sydäntautien, virusinfektiot ja tulehdussairauksien [1] – [4], [10], [15] – [25 ]. Vapauttaminen miRNA syövän voi johtua kromosomihäviämiä, monistukset ja alueelta toiselle siirtäminen; by hypermetylaatiota CpG saaria; ja transkription säätelyyn ja transkription jälkeisen käsittely [1], [2], [23]. Poikkeava ilmentyminen miRNA voi vaikuttaa syövän etenemistä vaikuttamalla ilmentyminen onkogeenien tai tuumorisuppressorien, ja miRNA, kuten miR-17-92 klusteri, voi toimia suoraan onkogeenien [1], [2], [23]. miRNA ovat mukana myös syövän kautta niiden vaikutus solusyklin, apoptoosin, etäpesäke, ja angiogeneesi [1], [2], [23].

Useat tutkimukset ovat yksityiskohtaisia ​​miRNA, jotka liittyvät syöpiin [ ,,,0],15], [23], [26] – [32]. Useimmat näistä tutkimuksista ovat käyttäneet biopsianäytteissä, arkistointia kudoksia tai syöpäsolujen [5], [33] – [37]; tai on käytetty miRNA uutetaan parafiiniin tai formaliinilla kudoksissa [38]. Vertaamalla ei-syöpä ympäröiviin kudoksiin syöpäkudokset, tai normaali luovuttajien versus syöpäpotilaita, ne miRNA jotka ovat ylös tai alas säädellään voidaan tunnistaa, usein PCR-monistamisen jälkeen. Monissa tutkimuksissa on julkaistu kuvaavat spesifisyys miRNA eri syöpien, syövän vaiheissa ja syöpähoitojen ja useita arvioita on julkaistu, että yhteenveto viimeisimmät tiedot roolit miRNA syövässä [1], [2], [5 ], [6], [15], [23], [25], [32]. Nämä tutkimukset osoittavat, hyödyllisyys miRNA sekä diagnoosin ja ennusteen useiden syöpien ja myös erottamaan syövän ja hyvänlaatuinen häiriöt [34]. Vaikka useat tutkimukset ovat johtaneet ymmärrystä miRNA klo kudoksen tai solun tasolla, käytettävissä on vain vähän tietoja seerumin tutkimuksissa vaikeuttavat niiden käyttöä rutiini diagnoosi.

Äskettäin sarjan tutkimuksia on suoritettu miRNA läsnä seerumin [7] – [9], [39] – [41]. Tuoreessa raportissa, miRNA osoitettiin selvästi kohonneet raskaana olevilla versus ei- raskaana [40]; ja toisessa tutkimuksessa, istukan miRNA osoitettiin olevan läsnä äidin plasmassa [42]. Näissä tutkimuksissa miRNA havaittiin olevan hyvin stabiili varastoinnin, sekä lisäksi kaikkia RNaasi hajoamista. miRNA on äskettäin osoitettu Mitchell et al [7] kiertää seerumissa eturauhassyövän potilailla [7]. Erityisesti, miR-141 voisi erottaa eturauhassyövän potilaat normaaleista yksilöistä [7]. Teoksessa Taylor ja Gercel-Taylor [9], verenkierrossa kasvain eksosomeiksi eristettiin seerumista munasarjasyöpä potilaiden käyttäen magneettisia helmiä ja antiEpCAM vasta-aine. miRNA uutettiin sen jälkeen, merkitään ja havaita mikrosirujen. Tämä lähestymistapa, käyttäen suurempia määriä seerumissa, osoitti, että kahdeksan diagnostiset miRNA olivat säädellään ylöspäin syövän eksosomeiksi: miR-21, miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-200b, miR-203, miR-205, ja miR-214. Tähän mennessä ei kuitenkaan ole rutiini määritys on saatavissa tutkimalla miRNA allekirjoituksia seerumista tai plasmasta syöpäpotilailla.

Yksi asia, joka esiintyy näissä tutkimuksissa on se, että miRNA ekspressiokuvioita nähdään seerumin eivät ole identtisiä niitä ilmenee miRNA otettu suoraan syöpäsolulinjoista. Tutkimuksessamme havaitsimme, että vaikka sekä eturauhassyövän seeruminäytettä ja eturauhassyövän solulinjaa (22Rv1) näyte osoitti ylössäätöä verrattuna normaaliin seeruminäyte, ne eivät näytä paljon samankaltaisuutta toisiinsa. Tämä näennäisestä ristiriita voitaisiin tapahtuu useista syistä. Selvin, joka on mahdollista, että näytteet on otettu solulinjat eivät itse edustavat mitä tulee seerumin. Voimme spekuloida, että kaikkein ilmeisin lähde miRNA jotka näkyvät seerumin on tuote kasvainsolujen hajoamista; kuitenkin, se voi myös olla mahdollista, että niiden esiintyminen seerumissa on tuote aktiiviseksi liikenteen joissa muodostetaan eksosomeiksi (36). Tämä hämmentää suoran vertailun miRNA ilmaisu patters johdettu solusta-linjan ja kasvainten kanssa, jotka ovat seerumiperäisiä.

Tiedot käytöstä miRNA biomarkkereina on pääosin liittyy tutkimuksia kudosnäytteitä tai syöpäsolu linjat. Erilliset mallit miRNA ilmaisun pystyvät erottamaan solutyypin ja vaihe eri syöpiä. Tämä lupaa hyvää ja ennustavia sovelluksia miRNA profiileja. Se osoittaa myös on selvästi tarpeen määritellä ilmaisun profiilit miRNA seerumissa syöpäpotilaiden ja verrataan sitä profiilien havaittiin seerumissa yksilöiden edustavat erilaisia ​​sairaan ja terveen toteaa. On odotettavissa, että miRNA profiilit seerumissa on potentiaalia olla aikaisin markkereita syövän havaitsemiseen ja myös tärkeä rooli seurannassa tautinsa kemoterapian aikana.

Tässä tutkimuksessa olemme selvittäneet, että riittävä määrä of miRNA on läsnä millilitrassa ihmisen seerumin tuottamiseksi havaittavan signaalin microarray fluoresenssi tai sähkökemialliset havaitsemiseen. Yksinkertaisimmillaan tämä tutkimus on osoittanut, että seerumin miRNA ovat säädelty syöpäpotilailla verrattuna normaaleista luovuttajista. Kun verrataan vaiheissa 3 ja 4 eturauhassyövän seerumeista ja normaalin luovuttajan seerumin miRNA tasoilla havaittiin, että 15 miRNA (miR-16, -92a, -103, -107, -197, -34b, -328, -485-3p , -486-5p, -92b, -574-3p, -636, -640, -766, -885-5p) oli säädelty seerumissa eturauhassyöpään potilaista verrattuna normaaliin luovuttajan seerumista.

Lämpökartta ja klusterin analyysit osoittavat, että seerumin miRNA allekirjoitukset voidaan myös käyttää erillisiä syöpäpotilaiden ja normaalien luovuttajien useimmissa tapauksissa. Kuusikymmentäviisi miRNA (katso kuva 6) käytettiin Heat Map analyysi, joka eristettiin 21 syöpänäytteissä, plus 3 uudelleen analysoitiin näytteitä, normaaleista näytteistä. Kuusitoista syöpänäytteissä ryhmittyivät yhteen, kun taas viisi syöpänäytteissä muodostivat erillisen klusterin sisällä normaalissa näytteessä klusterin. Cluster-analyysi (katso kuvio 5) käytettiin myös erottamaan 21 syövän näytteitä 12 normaalia näytettä. Kolme syöpänäytteissä että analysoitiin uudestaan ​​jälkeen pakastamalla ja sulattamalla ja varastointi, myös ryhmittyneet kanssa syöpänäytteissä

Olemme myös osoittaneet, että seerumin miRNA voidaan havaita tasolle samanlainen kuin raportoitu TaqMan PCR seerumista, noin 4000 kopiota ul [7], ja että määritys on vakaa toistuvaan pistokoemenettelyllä varastoinnin jälkeen. Suhteellinen herkkyys miRNA mikrosiruja yli standardin ilme paneelit voisi johtua hybridisaatio kinetiikkaa pienten oligonukleotidien. Pienet molekyylit yleensä parempi hybridisaatio kinetiikkaa kuin suurempien RNA tai DNA-molekyylejä. Itse asiassa suurin osa termodynaamisen mallit ennustavat DNA-hybridisaatiolla käyttäytymistä kehitettiin käyttämällä lyhyitä oligonukleotideja [43]. Monet johtopäätökset tällaiset tutkimukset eivät ole voimassa, kun suuremmat molekyylit käytetään sekundaarisen rakenteen, epäspesifisen sitoutumisen, ja erilaisia ​​muita ennakoimattomia vaikutuksia häiritsevät ennustettu hybridisaatiota käyttäytymistä. Sillä miRNA, sekä niiden suojelua ruoansulatus eri solujen tekijät, ja niiden pieni koko edistää niiden havaitseminen seerumissa mikrosiruissa tasoilla, jotka ovat alhaiset kuin havaitut menetelmät, jotka muutoin voidaan pitää herkempiä, kuten RT-PCR. Herkkyys mikrosirun alusta käytetään tässä on antanut meille mahdollisuuden seurata miRNA pienestä määrästä seerumia ja luokitella seerumit joko normaaleista luovuttajista tai syöpäpotilaista.

tulokset yleisesti sopia monissa tapauksissa aiemmin julkaistuihin tutkimuksiin.