Krooninen sairaus

tiivistelmä

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin maligniteetti maailmassa. Kuolemanriski korreloi vaiheeseen CRC aikaan ensisijainen diagnoosi. Sen vuoksi on olemassa pakottava tarve tunnistaa veren biomarkkereita, jotka voivat mahdollistaa varhainen havaitseminen CRC. Käytimme kvantitatiivisen proteomic lähestymistavan isobaaristen merkintöjä (iTRAQ) tarkastella muutoksia plasman proteomiin 10 potilasta, joiden CRC kuin terveillä vapaaehtoisilla. Entsyymi-Immunosorbnent (ELISA) ja Western blot käytettiin lisävalidointia. Meidän kvantitatiivinen proteomiikka-analyysi, havaitsimme 75 ihmisen plasman proteiineihin yli 95%: n luottamusväli käyttäen iTRAQ merkintöjä yhdessä microQ-TOF MS. 9 säädelty ja 4 alassäädetty proteiinit havaittiin CRC ryhmässä. ORM2 taso plasmassa vahvistettiin selvästi kohonneet potilailla, jotka kärsivät CRC kontrolleihin verrattuna. ORM2 ilmentyminen CRC kudoksissa lisääntyi merkitsevästi verrattuna vastaaviin viereiseen normaaliin limakalvojen (

P

0,001). ITRAQ yhdessä Q-TOF /MS on herkkä ja toistettavissa tekniikka kvantitatiivisen proteomiikka. Muutos ilmentyminen ORM2 viittaa siihen, että ORM2 voidaan käyttää mahdollisena biomarkkerina diagnosoinnissa CRC.

Citation: Zhang X, Xiao Z, Liu X, Du L, Wang L, Wang S, et ai. (2012) mahdollista vaikutusta ORM2 kehittämiseen peräsuolen syövän. PLoS ONE 7 (2): e31868. doi: 10,1371 /journal.pone.0031868

Editor: Anthony W. I. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 07 marraskuu 2011; Hyväksytty: 13 tammikuu 2012; Julkaistu: 21 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Sopimus apurahan sponsori: National Clinical Key Specialty Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

vuonna 2009 American Cancer Society arvioi yhteensä 146970 uutta peräsuolen syöpä (CRC) tapauksessa ja 40% kuolemista Yhdysvalloissa. CRC odotetaan olevan kolmanneksi yleisin syöpä Amerikassa. Vuodesta 1975 on ollut huomattava parannus suhteellisessa CRC 5 vuoden eloonjäämisluvut, seurauksena aikaisemmin diagnoosi ja parantaa hoitojen [1]. Sigmoidoskopia paransi merkittävästi havaitsemismäärä CRC. Kuitenkin sen laaja soveltaminen on edelleen rajoitettu korkeiden kustannusten vuoksi ja vaivaa. Siten spesifisten-pohjainen kasvainmerkkiaineet varhaisen diagnoosin ja ennusteen tarvitaan.

Plasma /seerumin merkkiaineet (esim Karsinoembryonaalinen antigeenin, CEA) on yleisimmin käytetty ja luotettava kasvainmerkkiaineet CRC, koska ne ovat helposti kvantitatiivisesti mitataan , toistettavissa ja kustannustehokas. Vaikka nykyinen suuntaviivojen American Society of Clinical Oncology (ASCO) suosittelevat, että CEA tulee seurata 2-3 kuukauden välein vähintään 2 vuotta post diagnoosi, ei ole selvää yksimielisyyttä pätevyyteen CEA valvonta [2]. Useat tutkimukset [3] – [5] kyseenalaisti arvo CEA markkerina CRC toistuminen, erityisesti potilailla, joilla on normaali ennen leikkausta CEA tasolle. Näiden ongelmien vuoksi, uudet biomarkkerit parantamiseksi tarvitaan varhaista havaitsemista ja ennustamista toistumisen kaikenlaisille CRC. Eri proteomic kuvioita seerumin läsnä uusia mahdollisuuksia kehittää uusia, erittäin herkkä diagnostisia työkaluja varhaiseen toteamiseen syöpien [6].

Kirjallisuudessa proteomiikan tekniikoita on käytetty tutkimaan CRC seerumin biomarkkereita. Näissä tutkimuksissa, proteomiikka strategiat, kuten kaksiulotteinen polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (2-D PAGE), kaksiulotteinen fluoresenssi-ero geelielektroforeesi (2-D DIGE), pinta-parannettu laser- desorptio /ionisaatio lentoaika-massaspektrometrialla (SELDI -TOF MS) -tekniikkaa ja proteiinijärjestelmien on käytetty, mutta kukaan ei voi tarkasti arvioida tasoa ylös- tai alaspäin säätely ehdotetun biomarkkereita. Siksi on vaikea määrittää niiden erityispiirteet ja pätevyyttä sokaissut tutkimuksissa näytteistä [7], [8]. Löytääkseen uusia plasma biomarkkerit, uusi lähestymistapa isobaaristen Tägit Suhteellinen ja absoluuttinen kvantitointi (iTRAQ) on sovellettu [9]. Vakaa sisällyttäminen isotooppien amiiniksi koodaus reagenssi on mukana tämän kemikaalin merkinnät menetelmällä. Käyttämällä massaspektrometriaa, proteiinit voidaan luotettavasti havaita ja anna vertailevaa kvantitointi on multiplex tavalla. Ydin Tämän menetelmän on multipleksoitu joukko isobaaristen reagenssien, joiden avulla saadaan amiini derivatisoitu peptidejä. Derivatisoitu peptidit ovat erottamattomat MS, mutta niillä intensiivistä pienimassaisia ​​MS /MS allekirjoituksen ioneja, jotka tukevat kvantitointiin. Tämä menetelmä saa aikaan massan erotuksen perusteella kvantitoimiseksi mittaamalla suhteellinen piikkien pinta-MS ja /tai MS /MS-massaspektrit. Nykyisin kaupallisesti saatavissa 4-Plex ja 8-Plex reagensseja voidaan käyttää merkitsemään proteiinia näytteiden korkoa trypsiinihajotus. Eri isobaaristen tagit Tässä menetelmässä viittaavat siihen, että yhdessä massaspektrometrianalyysissä, jopa 4 tai 8 erilaista näytettä, joista yksi on viittaus, voidaan samanaikaisesti tutkitaan. Kun otetaan huomioon tämän vuoksi iTRAQ lähestymistapaa ehdotetaan erittäin lupaavia löytö biomarkkereita näytteissä, joissa on laaja valikoima plasma, kehon nesteissä ja kudoksissa.

Tässä tutkimuksessa, iTRAQ kytkettiin microQ-TOF /MS havaita ero ilmaistaan ​​proteiineja plasmassa CRC potilaiden ja verrokkien. Niiden proteiinien, jotka kohosivat CRC plasman, 9 proteiinit säädelty, ja 4 alassäädetty. Keskustelimme niiden mahdolliset tehtävät ja todentaa ORM2 joka voi olla mahdollinen serologinen biomarkkeri (the) CRC potilaille. Erityinen tehtävä tämä proteiini ei ole vielä määritetty; kuitenkin, ORM2 näyttää toimivan moduloimaan aktiivisuutta immuunijärjestelmän aikana akuutin vaiheen reaktio, joka ehkä olla mahdollinen rooli varhaisessa kehitysvaiheessa CRC. Kasvava näyttö osoittaa, että kasvaimeen liittyvät tulehdus voi ajaa kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen, kun taas kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen voi aiheuttaa tulehduksen, joka voi olla keskeinen rooli kaikissa vaiheissa kasvaimien syntyyn. Tällaisia ​​tulehduksellinen molekyylejä voidaan havaita verinäytteistä cancaer potilaista ja voi olla olla potentiaalinen rooli havaitsemalla syöpä varhaisessa vaiheessa. Tässä tutkimuksessa ylös-säätely ORM2 varmistettiin ELISA plasmassa potilailla, joilla on suoliston sairaus.

Tulokset

tunnistaminen ehdokas biomarkkereiden mukaan microQ-TOF MS

for microQ-TOF MS-proteiinin profilointi, plasmanäytteistä 10 CRC potilaista ja 10 henkilöä kontrolliryhmässä kerättiin (2 ml plasmaa kunkin yksittäisen) ja sekoitettiin sitten muodostaa näytteen allas lisätestejä. 100 ui yhdistettyä näytettä kustakin ryhmästä oli immunodepleted 12 runsas plasmaproteiinien immunoaffiniteettipylvästä tekniikkaa, kuten on kuvattu menetelmät.

Immunodepleted plasmanäytteiden pilkottiin trypsiinillä, merkitty ainutlaatuinen isobaaristen tag, yhdistettiin ja samanaikaisesti analysoitiin microQ-TOF MS: llä. CRC ryhmä leimattiin iTRAQ-114 ja terveen kontrolliryhmän leimattiin iTRAQ-117 ja sitten erottaa vahva kationinvaihtokromatografialla ja C18 fraktiointiin. 75 proteiinit tunnistettiin microQ-TOF MS ≥95%: n varmuudella. Tässä ryhmässä, 13 ilmentyvät eri proteiineja valittiin perustuen 1,5-kertainen yliekspressio ja 1,5-kertainen alle-ilmaisun CRC potilailla verrattuna terveisiin vapaaehtoisiin. Yhdeksän proteiinit 13 ilmentyvät eri proteiineja säädellään ylöspäin (taulukko 1). Kolme proteiinit havaittiin merkittävästi koholla CRC ryhmässä (suhteissa 1,3-4,4). Neljä proteiinit säädellä vähentävästi CRC potilailla, ja niiden ekspressiotasot on esitetty taulukossa 2. Tilastollinen varianssi kasvain ja normaalissa suhteet oli sisällä 95. luotettavuustasolla (P = 0,05).

mittaus ORM2 plasmanäytteissä

Kuten kuviossa. 1, plasman ORM2 tasot log mittakaavassa Rasia ja hiuksenhienosti tontteja, mediaani plasmassa ORM2 pitoisuudet olivat merkitsevästi korkeammat CRC verrattuna normaaliin colorectum, hyperplastic polyyppi, ja adenooma (kaikki P 0,001, tässä järjestyksessä). Plasman ORM2 taso oli tilastollisesti merkitsevästi suurempi potilailla, joilla IBD kuin normaalissa colorectum, peräsuolen hyperplastic polyyppi ja adenooma (kaikki P 0,001, vastaavasti) ja se oli tilastollisesti merkitsevästi suurempi potilailla, joilla IBD kuin CRC (

P

0,05).

tähti (tähdet) kuvassa tarkoittaa merkki tilastolliseen analyysiin. Yksi tähti merkitsee P 0,05 ja merkin kolme tähteä tarkoittaa P 0,001. CRC on tilastollisesti eroaa normaalin colorectum, hyperplastic polyyppi ja adenooma (kaikki P 0,001, tässä järjestyksessä); IBD on tilastollisesti erilainen kuin normaali colorectum hyperplastic polyyppi ja adenooma (kaikki P 0,001, tässä järjestyksessä). IBD on tilastollisesti erilainen kuin kolorektaalisyövän (P 0,05).

arvioitava plasma ORM2 mahdollisesti erottaa CRC hyvänlaatuisesta peräsuolen sairauksia. Me etsitään korrelaatiota (ikä, sukupuoli, TNM ja histologinen luokka) plasman ORM2 tasoja ja CRC potilaan kliinis parametrit (taulukko 3). Mitään merkittävää assosioitunut plasman ORM2 pitoisuuksien ja ikä, sukupuoli, TNM tai histologisia laatu.

mittaus ORM2 kudosnäytteistä

Western blot analyysiä käytettiin määrittämään ilmaus ORM2 kudoksissa. Kun proteiinin ekspressio mitattiin densitometrillä, mediaani tiheysmittari arvo ORM2 CRC syövän kudoksissa oli merkittävästi suurempi kuin se, joka vastaa vierekkäisten normaaleissa limakalvojen (

P

0,01) (Fig. 2).

keskustelu

viime vuosina proteomiikka perustuu biomarkkereiden löytö seerumista /plasma on vahvistunut. Useat tutkimukset ovat pyrkineet käyttämään proteomic lähestymistapoja löytämään uusia biomarkkereita CRC potilaille [10] – [14]. Tutkimukset by Yong-Sam Kim [10] paljasti 26 ehdokasta biomarkkereita CRC yhdistetyllä 2-DE ja nano-LC-FT-ICR /LTQ MS. Ma et al [11] tunnistettiin 4 proteiinien diagnostisia mahdollisuuksia SELDI tutkimalla seerumi proteomiin 62 CRC potilaista ja 31 ei-syöpäpotilailla. Kuitenkin kysymyksiä monimutkaisuuden ja dynamiikan osatekijän proteiineja ovat vaikeuttaneet saada merkityksellisiä tietoja tulkintaa. Sekä seerumi ja plasma osoittavat valtavaa vaihtelua yksittäisten proteiinia runsaasti. LC-MS /MS lähestymistapoja analyysin seerumin /plasmanäytteistä varaa paremman dynaamisen alueen ominaisuuksia. Lisäksi iTRAQ reagenssit ovat saaneet etuja tällä alalla hyödyllisenä työkaluna proteiinia biomarkkereiden löytö. Se on ensimmäinen tutkimus yhdistää iTRAQ Q-TOF /MS plasmassa yksilöitä CRC potilaiden löytää mahdollisia biomarkkereita CRC. 13 proteiinit eri ilme kuvioita CRC plasma onnistuneesti tunnistettu. Näistä 13 proteiineja, oli useita kiinnostavia proteiineja, kuten ORM2, Serpin peptidaasi estäjä (haaran D), NADH dehydrogenaasi alayksikkö 5 (ND5) ja vitamiini sitovan proteiinin 4 (RBP4), joka valittiin hyödyllinen ehdokkaille ja se voi olla edelleen tutkittu. ORM2 (alfa-1-glykoproteiiniin), jäsen akuutin faasin proteiinin perheen havaittu liittyvän suoliston sairaus [15] – [18], valittiin jatko- tarkastusta ja tutkinta.

on tunnettua, että syöpien liittyy lukuisia systeeminen fysiologisia ja biokemiallisia muutoksia, mukaan lukien glykosylaatio joka on yksi tärkeimmistä translaation jälkeisiä modifikaatioita proteiineja. Yhä useammat huomio ovat maksetaan opiskelusta poikkeava glykosylaatio aikana eri patofysiologisia valtiot, mukaan lukien tulehdus [19], niveltulehdus [20], [21], ja syöpä [22], [23]. Aikana järjestäminen tietojemme, löysimme useita serologisia glykosyloituja proteiineja kuten ORM2, EpCAM muuttuvat tasolle vuoden syövän kehitystä. Tässä alustavassa tutkimuksessa, kerroimme ORM2 uutena jäsenenä näistä syöpään liittyvien glykoproteiineja. Wandall [24] käytetään uutta O-Glycopeptide microarray seuloa seromic profilointiin potilailla, joilla on paksusuolen ja peräsuolen cancer.Dai [25] erikseen kuvata glykoproteiinien muutosta epäsuorasti. Nämä raportit kannustavat toisesta kulmasta löytää kliininen biomarkkereita diagnoosin ja ennusteen.

On olemassa useita raportteja ORM2 suoliston sairaus ja syövät [15] – [18], [26]. ORM2 katsottiin liittyvän kapillaaripermeabiliteetti [15]. Toiminta orosomukoidiin on raportoitu olevan yhteydessä tulehduksen ja syövän. Pitoisuus S-orosomukoidiin havaittiin lisääntynyt potilailla, joilla on Crohnin tauti [16]. Vertaamalla virtsarakon syöpäpotilaat terveillä verrokeilla oli merkittäviä eroja, paljon enemmän orosomukoidiin ilmaistaan ​​syöpä ryhmä [17]. Samanlaisia ​​ilmiö voitaisiin myös todettu potilailla, joilla on keuhkoputken syöpä [18]. Käyttäen 2-D DIGE ja edelleen analysoitiin MALDI-TOF-massaspektrometrialla potilailla, joilla on krooninen tulehduksellinen demyelinoiva polyneuropatia, merkittäviä ylössäätöä alfa-1 glykoproteiiniin 1 esiaste todettiin [26]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että CEA samanlainen alfa-1-glykoproteiiniin (orosomukoidiin) immunologian oletetaan kuin biosynteettinen esiaste alfa-1-glykoproteiiniin [27].

Tämä on ensimmäinen raportti ylös-asetuksen of ORM2 CRC plasmassa. Lisäksi säätely ylöspäin ORM2 varmistettiin ELISA plasmassa potilailla, joilla on suoliston sairaus. Havaittiin, että ORM2 lisääntyivät merkitsevästi potilailla, jotka kärsivät CRC ja IBD verrattuna normaalien yksilöiden ja potilailla, joilla on hyperplastic polyyppi ja adenooma. ORM 2 on keskeinen akuutin vaiheen plasman proteiineihin tulehdus, joten tämä proteiini luokitellaan akuutin vaiheen reaktantin. Tietty toiminto on tämän proteiinin ei ole vielä määritetty, mutta ORM2 näyttää toimivan moduloimaan aktiivisuutta immuunijärjestelmän aikana akuutin vaiheen reaktio. Tämä voi toimia mahdollisena välittäjänä immuuni paeta CRC ja havaitsemiseen ORM2 voi olla merkittävä erottava peräsuolen syövän synnyn IBD.

lähteen määrittämiseksi ORM2, CRC kasvain kudosten ja vastaavien viereisten normaali limakalvojen arvioitiin Western blot. Tulokset osoittivat, että ilmentyminen tasolla ORM2 CRC syövän kudoksissa havaittiin olevan suurempi kuin normaalissa kudoksessa. Siksi ehdotetaan, että ORM2 mahdollisesti liittyi syövän syntymistä potilaalla on CRC syöpä.

Tämä tutkimus osoittavat myös ORM2 tasot CRC potilaat saattavat olla hyödyllisiä biomarkkerina diagnoosin. Seerumin CEA määrityksiä ei suositella seulontaan oireettomilla potilailla syöpään. Yksi syy on se, että plasma CEA määritys ei diagnostinen riitä syrjiä lokalisoitu pahanlaatuisia kasvaimia ja hyvänlaatuisia häiriöitä. Tutkimuksessamme havaitseminen ORM2 ELISA ja Western blot on lupaava. Plasmassa ORM2 pitoisuudet olivat merkitsevästi korkeammat CRC verrattuna normaaliin colorectum, hyperplastinen polyyppi, ja adenooma (P 0,001). Siksi käytetään ORM2 seurata mahdollisia CRC potilailla voi olla hyvä tapa vahvistaa, onko ORM2 voidaan käyttää seulontaan oireettomilla potilailla. On kuitenkin tärkeää analysoida tarkemmin diagnostinen merkitys ORM2 suuri määrä potilaita monikeskuksisuus ennen lopullista kliinistä hakemuksen CRC diagnoosia.

Serpin peptidaasi estäjä, haaran D (hepariini kofaktori), koodatun tuotteen hepariini kofaktori, joka jakaa homologian antitrombiini III: n ja muiden jäsenten alfa-1-antitrypsiini superperheen voi nopeasti estää trombiinin hepariinin läsnä ollessa. Viat SERPIND1 ovat suurin syy hepariinin kofaktori II puutos, ja hepariini kofaktori II puute voi johtaa lisääntyneeseen trombiinin muodostumista ja a-liikahyytymistilan. Tämä on epäedullista syövän kehittymiseen. On olemassa useita raportteja haaran A ja E syövissä [28], [29], mutta harvat haaran D. Samanlaisia ​​proteiini tunnistettiin myös Alpha-1-antikymotrypsiini esiaste. Alfa-1-antikymotrypsiini kuuluu serpin perhe, ilmentyy vahvasti astrosyytit ja on todettu rooleja patogeneesissä klassisen plakkeja Alzheimerin taudit. Koska akuutin faasin tekijä, se voi inhiboida makrofagien ectoenzymes ja matriksimetalloproteinaasi-9 aikana ihon haavan paranemisen [30], mutta indusoi TNF-α tuotannon tutkimus mikrogliasolujen solulinjojen [31]. Tämän tyyppinen proteaasi-inhibiittorin on raportoitu muodostavan komplekseja kallikreiinin perheen, kuten HK3 (tunnetaan myös eturauhasen-antigeeni), hK2 ja hK6, ja niitä voidaan soveltaa diagnosointiin eturauhasen syöpien [32].

joukossa alassäädetty proteiineja, ND5 olennainen alayksikön osa koko mitokondrion kompleksin I [33], [34], on tärkeä rooli oksidatiivisen fosforylaation prosessista sekä karsinogeneesissä. Kirjallisuutta osoitti, että ND5 voivat aiheuttaa hepatoomat [35]. Mitokondriaalisen DNA (mtDNA) mutaatioita on raportoitu monenlaisia ​​syöpiä. mtDNA geeni vikoja olla mukana patogeneettisiä mekanismeja kohtalokas osoitus [36]. Heistusmutaation in ND5 geenien on raportoitu maksasolukarsinoomassa, ja myös esiuudiskasvuisissa vaurioita ruoansulatuskanavan [37]. Tässä tutkimuksessa tunnistimme ND5 (67 kDa) mahdollisena, mutta sen tarkka asema karsinogeneesis- vielä lisätutkimuksia, erityisesti mutaatiot.

RBP4, sytokiiniä jota rasvakudos, on uusi adipokine linkitetty lihavuus ja insuliiniresistenssi ja tyypin 2 diabetes. RBP4 on myös osoitettu olevan osallisena, jossain määrin, kehittämiseen tulehduksen ja syövän. Esimerkiksi, RBP4 metylaatio tutkittiin ruokatorven okasolusyöpä [38]. Vuonna kolorektaalikarsinooma taso RBP pienenee [39]. Tutkimuksessamme tunnistimme RBP4 mahdollisena ehdokkaana, mutta lisätutkimuksia sen toiminnan synnyssä syövän kehityksen vaaditaan.

Tässä alustavassa proof-of-periaatteen tutkimuksessa, taulukko 1 ja taulukko 2 lista 13 ehdokasta biomarkkereita CRC. Useimmat näistä ei ole raportoitu syöpä biomarkkereita, jotka ovat osoittaneet, että iTRAQ yhdessä Q-TOF /MS on herkkä, toistettavissa, vankka tekniikka tunnistaa tilastollisesti merkitseviä eroja proteiinin ilmentymisen betweenCRC potilaiden ja terveillä verrokeilla plasmanäytteiden. Vuodesta todentaminen ORM2, todettiin, että ORM2 voi olla mahdollinen biomerkkiaine erottaa CRC IBD. Jatkossa tutkimuksissa, suurempi näyte väestöissä vaaditaan vahvistamaan näitä mahdollisia biomarkkereita. Tutkimuksessamme, ORM2 ensiksi tunnistetaan eri säännellyn proteiinin CRC potilailla verrattuna normaaliin säätimet proteomiikka seulonta. Se kuitenkin vaatii paljon penkin kokeet ja kliiniset kokeet ennen ORM2 voidaan käyttää luotettavana biomarkkereiden. Jatkamme tutkimusta ORM2 kahdella tavalla. Ensinnäkin, me luotiin pohjaa erottaa ja analysoida osuvien erillisten tasojen glukosylfosfatidyl kuvio muutokset eri vaiheita tautien kehitys, joka perustuu ORM2. Samaan aikaan olemme myös hyvin kiinnostuneita toiminta ORM2 kasvaimen etenemisen vuoksi se säätelee lipidien homeostaasiin ja proteiinia laadunvalvonta Endoplasmakalvosto kalvo.

Methods

näytteen valmistus

tutkimus hyväksyttiin ja valvoo eettinen komitea Qilu sairaalan Shangdongin yliopisto. Plasma näytteitä proteomiikan 10 CRC potilaiden ryhmässä ja 10 tervettä kontrolliryhmässä kerättiin (taulukko 4). Jokaiselle henkilölle, 2 ml verta saatiin laskimopunktiolla ja kerättiin putkeen EDTA, ja plasma valmistettiin suositteli HUPO Plasma Proteome Project [40]. Oli yhteensä 419 aiheita ELISA, jotka luokiteltiin viiteen ryhmään tavanomaisilla kliinisillä, radiologisia endoskooppinen ja histologisten kriteerien: normaali kontrolli (n = 65), hyperplastisessa polyyppi (n = 59), tulehduksellinen suolistosairaus (IBD) (n = 62), adenooma (n = 53) ja CRC (n = 180). Western blot, yhteensä 41 peräkkäisten potilaiden diagnosoitu CRC arvioitiin. Kasvain näytteet ja vastaavat viereisen normaali limakalvojen ( 5 cm marginaalista kasvaimen) kerättiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Ei potilasta tässä studyreceived tahansa hoitoa, kuten säteily tai kemoterapiaa.

Immunodepletion korkean runsaasti plasman proteiineihin

Plasma näytteet 10 CRC potilaista ja 10 yksilöiden valvonta ryhmä kerättiin (2 ml plasmaa kustakin yksilöstä) ja sekoitetaan muodostaa näyte allas lisätestejä. Yhdistettiin plasmanäytteet köyhdytettyä top 12 runsain proteiineja (albumiini, IgG, IgA, IgM, Transferrin, fibrinogeeni, α

2-makroglobuliini, α

1-antitrypsiini, haptoglobiini, α

1-Acid glykoproteiini, apolipoproteiini AI ja apolipoproteiini A-II) käyttämällä valmiiksi pakattu 2 ml Seppro ™ MIXED12 affiniteetti LC sarake (Genway Biotech, San Diego, CA) Agilent 1100 sarjan HPLC-järjestelmää (Agilent, Palo Alto, CA) suositeltuun valmistajan menettelyä.

Kun ehtyminen, saostunut proteiinit liuotettiin hajotuspuskuria (6 M urea, 4% CHAPS, 1 mM PMSF, 2 mM EDTA). Proteiinikonsentraatiot määritettiin 2D Quant Kit (GE Healthcare, USA), käyttäen albumiinia vertailustandardina (1 ug /ul-10 ug /ul). Mitattiin 4,83 ug /ul (CRC ryhmä) ja 2,27 ug /ul (terve ryhmä).

Trypic digeston ja iTRAQ reagenssi merkintöjä

Hienonnuksen (10 mM DTT, 100 mM NH4HCO3, 56 ° C, 45 min) ja alkylointi (55 mM IAA, 100 mM NH4HCO3, 45 min), jolloin kukin näyte (100 ug) pilkottiin trypsiinillä ja merkitty iTRAQ reagensseja. Nämä näytteet digestoitiin dissosiaation puskurissa (trypsin:protein = 01:30), yön yli 37 ° C: ssa. Peptidit leimattiin iTRAQ reagenssit (114 CRC-ryhmä, 117 terveen ryhmä).

Strong kationinvaihtokromatografiaa ja C18 fraktiointi pylväässä

Strong kationinvaihto- kromatografiaa käytetään poistamaan tarpeeton iTRAQ reagenssit ja häiritseviä aineita, jotka voivat vaikuttaa MS-analyysiä. Leimatut näytteet lisättiin 10 x puskuria A (10 mM KH2PO4 25% asetonitriili, pH 3,0). Korkean resoluution kationinvaihtokromatografialla suoritettiin sitten erottaa leimatut näytteet 10 jakeet. Peptidit eluoitiin lineaarisella gradientilla 0~500 mm KCI (25% v /v ACN, 10 mm KH2PO4, pH 3) 15 minuutin aikana virtausnopeudella 1 ml /min, ja fraktiot kerättiin 1-min välein. Näytteet poistettiin suolat ja edelleen fraktioitiin käyttämällä C18 pylvästä nano- HPLC (PROXEOME, America) ja sen jälkeen MS-analyysillä. Gradientti oli 5~40% ACN 70 min.

Matrix laserdesorptio -ionisaatio lennon (MALDI-TOF) /TOF ja microQ-TOF-analyysi

Koneen parametrit asetettiin , ionilähteen 25 kV positiivinen matriisin tekijöihin jako (PMF) ja 8,0 kV tandem MS /MS heijastin 26,3 kV PMF ja 29,5 kV tandem MS /MS, objektiivi 9,5 kV PMF ja 3,5 kV tandem MS /MS, nosta 19,0 kV ja spektrit saatiin heijastusmoodissa MALDI TOF /TOF kanssa massa-alue 700~4000. Huiput suhteella S /N yli 5 olivat automaattisesti leimattiin FlexAnalysis (Bruker, Saksa). PMF huiput massa voimakkuus on yli 5000 valittiin edelleen MS /MS. Spektrit hankittiin positiivisionisella tilassa microQ-TOF kanssa massa-alue 50~3000 ja kuiva kaasu ja sumutinta kaasun asetettiin 3 l /min, ja 2 l /min, tässä järjestyksessä. Lämpötila ruiskutuskammioon asetettiin 150 ° C: ssa, ja vahvuus sähkökentän asetettiin 1400 V, törmäys energia asetettiin 35% ajoitus alhainen ionin massa ja 65% ajoitus suuri ionin massan. Muut parametrit asetettiin oletuksena.

Tietokantahaku

Spektrit prosessoidaan microQ-TOF ohjaus 3.0 (Bruker, Saksa) käyttäen oletusasetuksia, paitsi että parametrit siirron suppilo RF ja törmäys solun RF asetettiin 120 Vpp ja 600 Vpp, vastaavasti. Myöhempi data-analyysi suoritettiin käyttäen Data Analysis 4.0 Biotools 3,0 (Bruker, Saksa), WARP-LC 2.0 (Bruker, Saksa), ja Mascot 2,2 (Matrix Science, London, UK), tässä järjestyksessä. Proteiini tunnistus suoritettiin etsimällä Swiss-Prot Human2009-12 tietokanta edeltäjä ionin ja fragmentti massa suvaitsevaisuutta sekä asettaa 0,04 Da. Carbamidomethylation kysteiinin asetettiin kiinteä muutos, ja hapetus metioniinit, iTRAQ 8 Plex muuttaminen N-päästä, K ja Y pidettiin muuttuja muutoksia vastaavasti. Yksi suurin mis-pilkkominen hyväksyttiin. Ioni pisteet cutoffs asetettiin 25 peptidien ja 68 proteiinien. Peptidi tunnistuksiin hyväksyttiin, jos ne voidaan koota yli 90,0% todennäköisyydellä määrittelemällä tavalla PeptideProphet algoritmilla. Proteiini tunnistuksiin hyväksyttiin, jos ne voidaan koota yli 90,0% todennäköisyydellä tai sisälsivät ainakin 2 tunnistettu peptidejä. Proteiineja, jotka sisälsivät samanlaiset peptidit ja ei voi eriyttää perustuu MS /MS-analyysi yksin ryhmiteltiin tyydyttää periaatteita parsimony. Luokittelun, geeni ontologian (GO) symbolit tunnistettujen proteiinien kuratoinut käyttäen XREF tietokantaa, ja kysyi geeniä vastaan ​​ontologian tietokantaan käyttäen GoMiner työkalun (https://discover.nci.nih.gov/gominer/index.jsp ). Prediction alkuperän proteiinien tuntematon sijainti solussa suoritettiin käyttäen PSORT II (https://www.psort.org/).

Kaikki proteiini iTRAQ suhteet transformoitiin perustaa 2 logaritmin arvoja. In base 2 logaritmin tilaa, 2-kertainen muutos tasojen ilmoitettiin 1 tai -1 jopa säädelty ja alassäädetty muutoksia vastaavasti.

Elisa varten ORM2

ORM2 tasot plasman kvantifioitiin käyttämällä kaupallisesti saatavilla ELISA kit (Groundwork Biotechnology Diagnosticate, San Diego, CA), mukaan valmistajan ohjeiden.

Western blotting varten ORM2

kasvain kudosten ja vastaavien viereisten normaali limakalvojen suspendoitiin uudelleen jääkylmään radioimmunosaostuksella (RIPA) puskurin tuhoutumisen. BCA-proteiinin määritys kit (Beyotime, Biotechnology, Kiina) käytettiin proteiinin määritykseen. Noin 25 ug proteiinia näytteitä oli ladattu, erotettiin 9,0% Tris-Glycine-SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja sen jälkeen elektro-siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvoja. Sen jälkeen kun esto 5% rasvatonta maitoa, kalvoja inkuboitiin ORM2 Ab (1:150, Yueyan Biotekniikka, Shanghai, Kiina) tai anti-β-aktiini hiiren monoklonaalinen vasta-aine (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) yön yli 4 ° C: ssa. Membraanit inkuboitiin edelleen polyklonaalisen hiiren anti-vuohen HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) tai polyklonaalisella vuohen anti-hiiri-HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 2 tuntia huonelämpötila. Vyöhykkeet havaittiin käyttäen kemiluminesenssidetektiolla (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Voimakkuus kunkin kaistan kvantitoitiin käyttäen ImageJ 1,32 ohjelmistoa (National Institutes of Health, Bethesda, MD) jälkeen densitometristä skannausta elokuvista.

Tilastollinen

Kolmogorov-Smirnov testi suoritettiin määrittää jakelu näytteiden kunkin ryhmän. Tiedot ilmaistiin mediaani (inter-neljänneksessä alue, 1IQR). Ei-parametrinen testi (Kruskal-Wallisin testi) levitettiin analysoida eroja CRC ja muut ryhmät. P 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS ohjelmistoversio 13.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, USA).

Kiitokset

Kiitos tohtori Edward C. Mignot, entinen Shandongin yliopistossa, kielellistä neuvoja .