Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tuumorisoluja ominaista nopean kasvun liittyy yleensä säädellään ylöspäin polkuja, jotka lopulta lisätä määrä ATP tuotantoa. Nämä solut voivat kärsiä aineenvaihdunnan uudelleenohjelmointi, jolloin erillisiä bioenergisesti fenotyyppejä, yleensä parantaa Glykolyysivaiheen kanavoituu laktaatin. Tässä työssä me osoitimme aineenvaihdunnan uudelleenohjelmoinnin avulla estäjiä histonideasetylaasi- (HDACis), natriumbutyraattia ja trikostatiini. Tämä käsittely pystyi siirtämään energia-aineenvaihdunnan aktivoimalla mitokondrioiden, kuten Hengitysketjun ja oksidatiivisen fosforylaation että suurelta osin tukahdutettu vuonna käsittelemättömiin kontrolleihin.

Menetelmät /Principal Havainnot

Various solu- ja biokemiallisten parametrien arvioitiin keuhkosyövän H460-soluja käsiteltiin histonideasetylaasi-inhibiittorit (HDACis), natriumbutyraattia (NaB) ja trikostatiini-A (TSA). Nab ja TSA vähennetään glykolyyttiset flux, analysoituna laktaatti vapautumista H460 soluja pitoisuutena riippuvaisella tavalla. NaB esti ilmaus glukoositransportterin tyypin 1 (GLUT 1), mutta huomattavasti mitokondrioita sidottu heksokinaasilla (HK) aktiivisuus. NAB aiheuttama lisäys HK aktiivisuus liittyi isoformiin HK I ja siihen liittyi 1,5-kertainen nousu HK I mRNA: n ilmentymisen ja sukulais proteiinibiosynteesin. (LDH) ja pyruvaattikinaasia (PYK) toimet eivät muuttuneet HDACis viittaa siihen, että kasvu HK aktiivisuutta ei kytketty glykolyyttisiä muutostilassa. Korkean resoluution respirometria on H460-solujen paljasti NaB riippuva korotukset hapenkulutuksen kytketty ATP synteesi. Metabolomic analyysi osoitti, että NaB muuttaneet glykolyyttisissä metaboliitteja koskemattomien H460 soluja. Samanaikaisesti olemme havainneet aktivointi pentoosifosfaattireitin (PPP). Korkea O

2 kulutus NaB käsiteltyjä soluja osoitettiin olevan liity mitokondrioiden biogeneesin koska sitraattisyntaasin (CS) aktiivisuus ja määrä mitokondrio-DNA pysyi ennallaan.

Johtopäätös

Nab ja TSA aiheuttama kasvu mitokondrioiden toimintaan ja oksidatiivisen aineenvaihdunnan H460 keuhko- kasvainsolujen kanssa samanaikaisesti vähemmän proliferatiivisen solun fenotyyppiin.

Citation: Amoedo ND, Rodrigues MF, Pezzuto P, Galina A da Costa RM, de Almeida FCL, et ai. (2011) energia-aineenvaihduntaa H460 Lung Cancer Cells: Effects of histonideasetylaasin estäjät. PLoS ONE 6 (7): e22264. doi: 10,1371 /journal.pone.0022264

Toimittaja: Alicia J. Kowaltowski, Instituto de Química – Universidade de São Paulo, Brasilia

vastaanotettu: 01 helmikuu 2011; Hyväksytty: 20 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 18 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Amoedo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Fundação do syöpä, Brasilian Institute of Neuroscience – IBNnet FINEP, INCT – Eksitotoksisuus ja Neurosuojaus # 01.06 0,0842 ja INCT – syöpä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

valitsematta leviämisen ja invaasion tyypillisiä syöpäsolujen ovat prosesseja, jotka voidaan säilyttää vain, jos on riittävästi energiahuolto, ominaisuus, joka osoittaa esiintyminen transformoiduissa soluissa erillisten fenotyyppien että välttämättä liity elementtejä välittäjän aineenvaihduntaa. Kiinteissä kasvaimissa on osoitettu, Otto Warburg, että solut ovat sopeutuneet luottaa anaerobisen Glykolyysivaiheen strategiana säilyttää vallitsevan anabolinen tila [1]. Kuitenkin säätelyä Glykolyysivaiheen näytteillä syöpäsolut ei välttämättä merkitse tiukkaa anaerobinen fenotyyppi eikä huonosti oksidatiivinen fosforylaatio järjestelmä (OXPHOS). Pikemminkin, uskotaan, että normaali välisestä vuorovaikutuksesta glykolyysin sytosoliin ja OXPHOS mitokondrioissa häiriintyy tai ohjelmoida uudelleen kasvainsoluissa. Crabtree vaikutus havaittiin syöpäsolujen tai nopeasti lisääntyviä soluja ilmentää läheinen yhteys Glykolyysivaiheen ja oksidatiivisen aineenvaihdunnan [2].

Mielenkiintoista, anaerobinen fenotyyppi näytteillä syöpäsoluja voi nimittäin aiheuttaa pikemmin kuin seurauksena adaptiivisen painetta. Tarkastelemalla että glykolyyttisissä kytkin tyypillistä syöpäsolujen hankitaan aivan puhkeamista syövän, heräsi ajatus, että muutoksia glykolyyttisellä reitti voi altistaa solut pahanlaatuisiksi [3], [4]. Valikoiva etuja transformoidut solut voivat johtua erilaisista ominaisuuksista. Esimerkiksi tiedetään, että hypoksia-indusoituva tekijä-1 (HIF-1α) suuresti stimuloi ilmaus glukoosin ja monokarboksylaatti kuljettavan, glykolyyttisiä entsyymejä ja indusoi alas asetuksen pyruvaattidehydrogenaasikompleksi [5]. Lisäksi kasvainsolut esittelevät isoformin HK, joka sitoutuu mitokondrion huokosia muodostavan proteiinin jännitteestä riippuva anioni kanava (VDAC). Estämällä vuorovaikutusta pro-apoptoottisten proteiinien kanssa mitokondrioissa sitoutuneen entsyymin toimii pääasiallisesti anti-apoptoottisen aineena. Itse asiassa on osoitettu, että vapautumisen apoptoottisten proteiinien, kuten sytokromi

c

riippuu eheyden N-terminaalista osaa VDAC [6]. Koska on osoitettu, että HK ja Bcl-2 pystyivät antavat suojan apoptoosia vuorovaikutuksessa VDAC 1 N-terminaalista aluetta, osallistumista HK II edistäjänä solujen erilaistumisen vahvistettiin.

entsyymit glykolyyttisellä ja hapettumalla ovat, kuten proteiineja yleensä rohkaistaisiin geenin ilmentymisen säätelyyn tasolla kromatiinin. Chromatin rakenteet vuorotellen tiivistetään ja rento konformaatioita, jotka puolestaan ​​ovat riippuvaisia ​​asetylaatio ja deasetyloiminen histoni proteiinin ytimen. Entsymaattinen käyttöä näissä prosesseissa ovat histonien asetyyli transferaasit (HAT), jotka lisäävät asetyyli ryhmiä lysiinitähteet ja histonideasetylaaseja (HDAC: t), jotka poistaa ne. Tiivistetään ja rento kromatiini on yhdistetty geenin ilmentymisen repression ja aktivoitumisen, vastaavasti. Vaikka histones pitää ensisijaisena substraatteja Hattujen ja HDCAs, muut ei-histoni proteiineja, kuten transkriptiotekijöitä-p53, pRb retinoblastoomaproteiiniin ja HIF-1α; chaperones (HSP90), metabolisia entsyymejä (pyruvaattikinaasi, asetyyli-CoA syntaasi) ja steroidi reseptorit myös asetyloitu /deasetyloidulle näiden entsyymien. Siksi, hattuja ja HDAC voi vaikuttaa laaja kirjo biologisia prosesseja, jotka ovat kasvu pidätys, DNA korjaus, solu bioenergetiikan, solukuolemareittejä (apoptoosin, ja autophagy), mitoosia, sukupolvi reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), vanhenemista ja angiogeneesi [7 ], [8]. Koska sen sortotoimille, HDAC ovat mielenkiintoisia kohteita lääkkeiden kehittämisessä, jotka voivat hakea kyky transformoitujen solujen apoptoosiin. Tällä hetkellä useat HDAC-inhibiittorit (HDACis) saatu luonnon tai synteettisistä lähteistä on ominaista. Ne on ryhmitelty viiteen kemialliset luokat, jotka sisältävät hydroksaamihappoyhdisteitä ja johdettujen yhdisteiden, bentsamidit, sykliset peptidit, lyhytketjuisia rasvahappoja ja ketonit.

Kuten edellä mainittiin, HDACis muuttaa useita toimintoja normaaleissa ja transformoiduissa soluissa, joka tekee vaikea sanoa vaikutusmekanismi näille lääkkeille. Useat raportit olemassa esittää toiminnan HDACi on solusyklin ja apoptoosin. Tässä työssä on leikellään nämä laajoja toimia keskittymällä energia-aineenvaihduntaa ja osoitetaan, että HDACis voi vaikuttaa lisääntymistä vaikuttamalla yksittäisiä entsyymejä glykolyyttisen ja hapettumalla. Käytettävissä olevat tiedot toistaiseksi tutkii mitokondrioiden rotan maksasta käsitelty lyhytketjuisen rasvahapon johdannainen valproaatti (VPA) ovat osoittaneet, että se estää rasvahappojen β-hapettumista ja yleensä painaa solujen oksidatiivista metaboliaa, joka johtaa laskuun molemmat, nopeus O

2 kulutus kytketty ATP synteesi ja sytokromioksidaasi toimintaa [9], [10], [11]. Peräsuolen adenokarsinoomat (HT29), käsiteltiin butyraatti, toinen lyhyen ketjun rasvahapon luokan HDACi, inhiboi glukoosin soluunottoa ja hapettumisen, sekä riboosi synteesi ja lisääntynyt

de novo

rasvahappojen synteesi yhdessä aktivointi PPP. Kuitenkin MIA soluja, butyraatti kestävä haiman adenokarsinooma, ei osoittanut mitään muutoksia metabolointiprofiilista hoidon jälkeen. Aineenvaihduntamuutoksia korreloisi induktion erilaistumisprosesseihin välittävät butyraattia ja näin ollen sen estäviä vaikutuksia kasvuun. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, jotka oli altistettu TSA [12], [13]. Myelomasoluista The HDACis VPA ja suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA) aiheuttama lasku glukoosin oton, GLUT 1 ilme ja HK toimintaa, mikä johtaa apoptoosin kasvainsoluissa. Lisäksi nämä inhibiittorit lisäsi aminohappo kataboliaa [14].

Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin rooleja NaB ja TSA useista parametreistä, biokemiallisia ja morfologisia, että H460 solulinjan keuhkosyövän soluja voidakseen selventää, miten nämä HDACis häiritsee kasvainsolujen homeostaasiin. Tiedot osoittivat vakuuttavasti, että hoito NaB 24 tunnin johtavat yleensä tehostetun oksidatiivisen aineenvaihdunnan selvästi viittaa siihen, että HDACis voivat ylittävät niiden kanoninen asema on kromatiinin tasolla.

Methods

Cell Culture

H460, ihmisen keuhkojen syöpäsolu (ATCC, kerrostetaan AF Gazdar, 1982), pidettiin RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), pH 7,4 37 ° C: ssa kostutetussa inkubointikammiossa kanssa 5% CO

2. Soluja sub-viljeltiin 2 päivän välein, ja käytetään kokeisiin, kun ne oli 85% konfluenssin. H460-solut genotyypattiin laboratoriossamme käyttämällä 8 loci plus amelogenin. Kaikki loci Hyväksytty ATCC DNA STR profiilin.

elinkykyyn ja Citotoxicity Pitoisuus

Niille määrityksiä soluja kasvatettiin 24 ja 96 kuoppaisille levyille. 24 h maljaamisen jälkeen, soluja inkuboitiin kolmella eri pitoisuuksia NaB (1, 3 ja 10 mM) ja TSA (0,02, 0,2 ja 1 uM) enintään 48 tunnin ajan. Kunkin hoidon jälkeen, solujen elinkykyisyys käsiksi käyttämällä MTT-määritystä, kuten aiemmin on kuvattu [15], ja trypaanisinisen väriaineen ekskluusiomääritystä. Citotoxicity määritettiin laktaattidehydrogenaasin (LDH) vapautumista, kun NaB hoitoon käytetään CytoTox96 Ei-radioaktiivinen Sytotoksisuusmääritvs Kit (Promega).

Cell Cycle Analysis

DNA värjäys H460-soluja kasvatettiin 6-kuoppaisissa levyt ja käsiteltiin 3 tai 10 mM NaB ja 0,2 uM TSA: ssa 24 tuntia. Solut pelletoitiin (1000

xg

5 min. 4 ° C) ja ressuspended 500 ui PI-värjäyksellä liuosta, joka koostuu 50 ug /ml propidiumjodidia (PI), 1 mg /ml RNaasia ja 0,2% Triton X-100. Näytteitä inkuboitiin jäillä 15 min. pimeässä ja sitten analysoitiin FACSCalibur-virtaussytometrillä (Becton Dickinson) käyttäen CellQuest -ohjelmistoa (Becton Dickinson), vastaavasti, tietojen hankintaa ja solukierron-analyysillä.

kinetiikka Lactate vapautumisesta Kasvualustat

käsittelyn jälkeen eri pitoisuuksilla NaB ja TSA: ssa 24 tuntia, elatusaine korvattiin tuoreella RPMI 1640-alustassa ilman fenolipunaista ja FBS: ää. Ilmoitettuina aikoina (0, 15, 30, 40, 50 ja 60 min.), Alikvootit elatusaineesta kerättiin arvioida laktaatin vapautumisen kautta entsymaattinen määritys: laktaatti mittaus suoritettiin hydratsiini /glysiini-puskuriin (pH 9,2), joka sisältää 5 mg /ml β-NAD

+ ja 15 yksikköä /ml laktaattidehydrogenaasia. Absorbanssi muodostumisen takia NADH seurattiin mikrolevylukijalla (SpectraMax M5, Molecular Devices) 340 nm: ssä, ja korreloi läsnä laktaatin näytteiden standardikäyrästä [16].

valmistaminen mitokondrio ja Sytosoliset Protein Fraktiot

H460 solupelletti sekoitettiin hajotuspuskuria, joka sisälsi 10 mM Tris-HCI, pH 7,4, 0,25 M sakkaroosi, 20 mM NaF, 1 mM DTT: tä, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF ja proteaasi-inhibiittoreita cocktail (kymostatiini, leupeptiiniä antipaiini, pepstatiini A – Sigma-Aldrich). Solususpensio siirrettiin homogenisaattorilla (Wheaton Potter-Elvehjem) solujen hajoamista. Suspensiota sentrifugoitiin 100

x g

5 min. 4 ° C: ssa, pelletti, jossa roskat heitettiin pois ja saatu supernatantti sentrifugoitiin 10000

x g

15 min. 4 ° C: ssa. Sitten supernatantti (sytosolifraktion) käytettiin mittaukseen talteen toiminnan HK, PYK, LDH ja glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasin (G6PDH) ja pelletti (mitokondriofraktiosta) käytettiin mittaukseen talteen toiminnan mt-HK ja CS. Nämä uutteet käytettiin western blotting ja entsyymiaktiivisuus määrityksissä. Proteiinipitoisuus suoritettiin käyttäen Bradfordin menetelmällä.

entsymaattisen aktiivisuuden määritykset

entsymaattinen toiminta mitattiin käyttäen seuraavia reaktio media: (a) HK, 20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 10 mM MgCl

2, 1 mM β-NAD

+, 1 yksikkö /ml G6PDH: ta (

Leuconostoc mesenteroides

), 0,1% Triton X-100, 2 mM ATP: tä ja 5 mM glukoosia. (B) PYK, 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 5 mM MgCl

2, 50 mM KCI, 0,2 mM β-NADH, 2,5 mM ADP, 0,1% Triton X-100, 5 mM fosfoenolipyruvaattia, 0,5 yksikköä /ml laktaattidehydrogenaasia. (C) LDH, 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,2 mM β-NADH, 0,1% Triton X-100, 1 mM pyruvaattia. (D) G6PDH, 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 5 mM MgCl

2, 0,1% Triton X-100, 2 mM glukoosi-6-fosfaattia ja 0,2 mM β-NADH. Reaktiot aloitettiin lisäämällä 20-140 ug proteiinia HK ja 10 ug proteiinia PYK, LDH ja G6PDH ja suoritettiin 37 ° C: ssa 5 minuutin ajan. Inkuboinnin jälkeen näytteet välittömästi keitettiin ja pantiin jäihin. Absorbanssi mitattiin 340 nm: ssä, ja arvo, jota käytetään laskemaan spesifinen aktiivisuus entsyymien määritelty substraatin määrä on muodostettu milligrammaa proteiinia per minuutti. (E) CS, 50 mM Tris-HCI, pH 8,1, 0,3 mM asetyyli-CoA, 0,1% Triton X-100, 0,1 mM DTNB, 0,5 mM oksaaliasetaatti. Reaktio käynnistettiin lisäämällä 10 ug proteiinia, ja suoritettiin 30 ° C: ssa 5 min. Absorbanssi mitattiin 412 nm: ssä. (F) sukkinaattidehydrogenaasi (SDH), 50 mM fosfaattipuskuria (pH 7,4), 0,1% Triton X-100, 0,8 mM KCN, 0,06 mM 2,6-dikloorifenoli (DCIPIP), 1,1 mM fenatsiinia (PMS) ja 100 ug -proteiinin reaktio suoritettiin 25 ° C: ssa 7 minuuttia ja pysäytettiin 10 mM malonaatti. Vähentäminen DCPIP seurattiin aallonpituudella 600 nm.

Western-blottaus

25 ug proteiinia uutteet erotettiin tavallinen SDS-PAGE ja siirrettiin nitrocelulose kalvoja elektroblot puskurissa, joka koostuu 39 mM glysiini , 48 mM Tris-emäs, 0,037% SDS ja 20% metanolia. Western-blottaus suoritettiin käyttäen primaaristen vasta-aineiden laimennettu TBS, 0,1% Tween 20: tä ja 5% BSA: ta. Ensisijainen vasta-aineita HK I HKII ja VDAC 2 (Abcam) käytettiin.

Oxygen kulutus Ehjä ja Digitonin-läpäiseviksi H460-solujen

O

2 kulutus mitattiin polarographically käyttäen korkean resoluution respirometria (Oroboros Oxygraph-O2K). Käsittelyn jälkeen ajanjakson, väliaine poistettiin ja solut joko suspendoitiin RPMI (11,1 mM glukoosia ja 2 mM glutamiinia) tai glukoosi DMEM mittauksista O

2 kulutusta ehjien solujen tai hengityksen alustan pH 7,0 (0,25 M mannitolia, 10 mM MgCI

2, 10 mM KH

2PO

4, 10 mM HEPES, 0,08 mM EDTA, 1 mM EGTA ja 0,1% rasvahappo vapaa BSA) arvioimiseksi hengitysteiden komplekseja läpäiseviksi solujen . Rutiini kulutus, oligomysiini riippumaton hengitystä (protoni vuoto) ja FCCP-stimuloiduista hengitystä (enintään hengitys) mitattiin ehjät H460-soluissa, kuten aiemmin on kuvattu [17]. NAB vaikutuksia hengityselinten komplekseja 0,003% digitoniinia-läpäiseviksi H460-soluissa suoritettiin lisäyksen jälkeen erilaisia ​​alustoja /modulaattorit kuten 10 mM pyruvaattia + 10 mM malaatti (kompleksi I-sidottu alustoille), 10 mM sukkinaattia (kompleksi II-sidottu alustaan) , 0,5 uM rotenonin, 100 uM ADP. Kun määrittämällä tila 3 aiheuttama 2-deoksiglukoosi (2-DOG), 10 mM 2-DOG lisättiin. DatLab ohjelmisto (Oroboros Instruments, Innsbruck, Itävalta) käytettiin tiedonkeruu ja analyysi.

RNA Extraction ja cDNA Synthesis

Yhteensä RNA eristettiin H460-soluihin käyttämällä TRIzol reagenssia (Invitrogen) mukaan valmistajan ohjeita. Kokonais-RNA kvantitoitiin spektrofotometrisesti ja 1 ug käsiteltiin 1 U DNAse RNAasi-vapaata 30 min. 37 ° C: ssa. Reaktiot pysäytettiin lisäämällä 1 ui 20 mM EDTA: ta ja kuumentamalla 10 minuutin ajan. 65 ° C: ssa. cDNA-synteesi tehtiin käyttämällä DNAasi käsitellyn RNA mukainen High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems.

Real Time PCR

Geenien ilmentyminen analyysi suoritettiin käyttäen 7500 Real Time PCR (Applied Biosystems) ja teho SYBR-GREEN PCR master MIX (Applied Biosystems). Tätä testiä alukeparia syntetisoitiin perustuen GenBank sekvenssien mRNA. Sekvenssit alukkeet esitetään taulukossa S1. Vertailevaa Ct menetelmää käytettiin vertaamaan muutoksia geenien ekspressiotasot [18]. Aktiini käytettiin endogeenista ohjaus.

Electron Microscopy

Solut pestiin kerran lämpimällä PBS: ssä ja kiinnitettiin liuoksessa, pH 7,2, joka sisälsi 2,5% glutaraldehydiä, 0,1 M natrium- kakodylaattipuskurissa, post kiinteät 1% OsO

4 (osmiumtetroksidia) 0,1 M natriumkakodylaattipuskurissa. Myöhemmin solut pestiin PBS: llä, kuivattu asetonilla ja upotettiin Epon. Ultra-ohuita leikkeitä (70 nm) värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijyn sitraatti, ja havaittiin Zeiss 900 elektronimikroskoopilla. Sillä mitokondriot morfometria, kaksikymmentä nimikroskooppikuvia otettiin kustakin näytteestä ja analysoitiin morfologian. Mittaukset kunkin mitokondrioissa profiilit alueella hyvin ohuita leikkeitä tehtiin käyttämällä Image J (NIH) -ohjelmisto.

Ydinmagneettinen Ressonance (NMR) varten Metabolomic Analysis

Metabolomic seulonta H460-solujen suoritettiin, kuten on kuvattu [19] kanssa vähäisin muutoksin. Lyhyesti, elatusaineet ei-käsiteltyjen ja NaB käsiteltyjen H460-solut korvattiin glukoosin DMEM: ää, johon oli lisätty D- [U

13C] 5 mM glukoosi ja soluja inkuboitiin 1 h ajan. Inkuboinnin jälkeen väliaine poistettiin ja noin 3 x 10

7-solut suspendoitiin glukoosin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% deuteriumoksidia. Yksiulotteinen

13C-spektrit koskemattomien H460-solujen aineenvaihduntatuotteet saatiin 25 ° C: ssa. Spectra of H460-solujen aineenvaihduntatuotteet hankittu Brucker DRX 400 MHz käyttäen kolmoisresonanssimittapäätä (TXI). Spectra käsittely ja analyysi suoritettiin käyttäen Topspin 2.0 ja aineenvaihduntatuotteen toimeksianto tehtiin kemiallisen siirtymän vertaamalla tunnettujen metaboliittien talletetaan Human Metabolomi Database v 1.0.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Graph pad Prism 5. tulokset ilmaistiin keskiarvoina ± SEM

n

itsenäisestä kokeesta. Tilastollinen merkittävyys määritettiin opiskelijan

t

testi,

yksisuuntainen

ANOVA ja

kaksisuuntainen

ANOVA.

Tulokset

natriumbutyraatilla ja trikostatiini inhiboivat H460-solujen ja indusoi morfologisia muutoksia yhteensopiva erilaistumista prosessi

Aluksi teimme määrityksiä arvioida NaB ja TSA vaikutukset solujen elinkelpoisuuteen määrittää paras koeolosuhteet tutkia HDACis vaikutuksia energia- aineenvaihduntaan ilman aiheuttamia häiriöitä sytotoksisuutta. Kuten havaitaan faasikontrastimikroskopiassa, H460-soluja käsiteltiin NaB esillä erillisiä eroja verrattuna kontrollisoluihin. Morfologia havaittiin soveltui että erilaistuneita soluja, mikä viittaa siihen, että NaB saattanut torjua säätelyreittejä että kasvainsoluissa johtaisi erilaistamattomuuden. Tulokset kuviossa 1 osoittavat, lisäksi, että käsittely 10 mM NaB tuotettu solut, jotka olivat vähemmän konfluentteja ja ovat hieman pitkänomainen kuin käsittelemättömän ne (kuvio 1C ja D). Mielenkiintoista, morfologia H460 NaB käsiteltyjen solujen muistuttivat A549-solut, eriytetympää keuhkosyöpäsolua joka ei näytä morfologisia muutoksia upon NaB hoitoon (kuva 1A ja B). Nämä muutokset solun muoto oli mahdollisesti yhteydessä tukirankansa uudelleenjärjestely, sillä solujen käsittely NaB tuotti selvästi uudelleenjako F-aktiini kuten paljasti värjäämällä rhodamine- leimatun phaloidin (kuva S1; Method S2). Perustuen tähän havaintoon kysymys siitä 10 mM NaB voinut olla sytotoksisia vaikutuksia kulttuureissa nostettiin. Kokeista, joissa yksinkertainen solumäärä suoritettiin 24 ja 48 tuntia, osoitti annoksesta riippuva vaikutus proliferaatioon (kuvio S2A). 24 h hoito 10 mM NaB indusoi pieneni 50% yli soluja ei ole altistettu HDACi. 48 h inkubaation elävien solujen lukumäärä on 10 mM NaB oli noin 10%. H460-soluja inkuboitiin NaB konsentraatioissa 1, 3 ja 10 mM testattiin sitten elinkelpoisuus käyttäen MTT-määritystä. Tulokset (kuvio S2B) osoitti kohtalainen vaikutus 24 tunnin, jolloin saatiin lähes 80% elinkelpoisuuden 10 mM NaB ja noin 30% elinkelpoisuus 48 tunnin kuluttua inkubaation samassa konsentraatiossa. Pohjimmiltaan, samat tulokset saatiin, kun nämä kokeet toistettiin TSA, käyttäen pitoisuuksia ulottuu 0,02-1 uM, paitsi että on korkein pitoisuus, TSA näytti olevan enemmän myrkyllisiä kuin NaB (kuvio S2D-E). Nämä tulokset osoittivat, että NaB ja TSA, vaikka kuuluvat eri kemiallisiin luokkiin, yhteinen samanlaisia ​​vaikutuksia. Vaikka solujen lukumäärä väheni selvästi, koska seurauksena NaB ja TSA toiminta, tärkeimmät vaikutukset kahta inhibiittoria voitaisiin parhaiten tulkita siten, että proliferaation esto, pikemminkin kuin suoraan myrkyllinen vaikutus. Sen testaamiseksi, onko käsitelty solut vaurioitua HDACis, laktaattidehydrogenaasin vapautuminen määritettiin hoidon jälkeen 24 ja 48 h NaB ja TSA (kuvio S2F) useissa pitoisuuksissa. Laktaattidehydrogenaasi vapautuminen ei vaikuttanut merkittävästi NaB 24 h (kuvio S2C). 48 h ja vain pitoisuutena 10 mM ja teki NaB hoitoon merkittävästi indusoi laktaattidehydrogenaasin vapautuminen. Lisäksi tarkastus käsiteltyjen solujen fluoresenssimikroskopian värjäyksen jälkeen DAPI (kuva S1) paljasti ehjä ydinten ja chromatin, tulos, joka olisi vastustavat soluvaurioita. Koska laaja kirjo toimintaa Nab, kokeita tarkistaakseen, onko hoito H460-solujen kanssa tämän estäjä voisi vaikuttaa solun jakautuminen pitkin tärkeimpiä vaiheita solusyklin. Nämä kokeet suoritettiin mittaamalla käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen avulla fluoresenssiaktivoidulla solulajittelulla. Tulokset kuviossa S3A osoittavat, että sen jälkeen, kun 24 tuntia hoitoa, useimmat solut, noin 80%, havaittiin G0 /G1 vaiheen solusyklin kanssa samanaikaisesti vähentäminen S-vaiheessa. Inkubointi solujen kanssa 0,2 uM TSA 24 h tuotti samanlaisen profiilin (kuvio S3B). Ottaen huomioon nämä tulokset, hoito 10 mM NaB 24 tuntia aiheuttama erilaistumista ja solujen kasvun esto, mutta ei ollut myrkyllistä H460 soluihin. Siten kokeista, joissa pitkäaikainen inkubointi solujen kanssa HDACis ei ole jatkettu 24 h.

Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2 ja valokuvattiin Kirkas käyttäen dokumentointi järjestelmä käänteismikroskoopilla Nikon TS100. (A) A549-soluja ei-käsitelty. (B) A549-soluja käsiteltiin 10 mM NaB 24 tuntia. (C) H460-soluja. (D) H460-soluja käsiteltiin 10 mM NaB 24 tuntia.

Natriumbutyraattia laski laktaatti vapautumisen H460-solujen, vähentää ilmentymistä GLUT 1 ja lisääntynyt GLUT 3 ilmentymisen

Mitä energia-aineenvaihdunnan, yksi tärkeimmistä piirteistä erittäin lisääntyvät solut, mukaan lukien kasvainsolut, on niiden siirtyminen anaerobisen glykolyysin [3], [20], [21]. Selektiivinen paine tarvittaessa tällaisten muuntunut fenotyyppi on seurausta sääntelymekanismeja että jotenkin pystyvät aistimaan energia tilan soluja. Siksi ensimmäinen askel kohti paljastamaan metaboliareitit vaikuttavat NaB ja TSA, kysyimme, ovatko nämä HDACis voivat suoraan vaikuttaa glykolyyttisissä vuon H460 soluja. Tämä koesarja alkoi mittaamalla laktaatin määrä elatusaineessa jälkeen solujen kanssa inkuboinnin 3 ja 10 mM NaB 24 tuntia. Laktaatin määrä vapautetaan sitten seurata säännöllisin väliajoin aikana 60 min. Tulokset on esitetty kuviossa 2A. Arvot havaittu laktaatti julkaisu olivat samanlaiset kuin noudatettava Pereira da Silva [19]. Voidaan nähdä, että NaB vähentää laktaattia vapautumista annoksesta riippuvaisella tavalla. Samanlainen inhibitio laktaatin vapautumisen jälkeen saatiin solujen inkubaation 0,2 uM TSA 24 h (kuvio S4A). 60 minuutin jälkeen. Inkuboinnin TSA-käsitellyt solut vapautetaan noin 60% laktaatin määrä vapauttaa valvontaa. Laktaatti vaihtelut voi esiintyä seurauksena häiriöitä missään vaiheessa glykolyyttisen reitin. Ottaen huomioon, että esillä olevassa työssä kokeet suoritettiin solujen kulttuuriin, laktaatti kierrätyksen kautta glukoneogeneesiä hylättiin. Yksi mahdollinen kohtalo laktaatti voi olla solujen oksidatiivista metaboliaa, olettaen tietenkin, että mitokondriot tuumorisolujen olivat toiminnallisia. Näin ollen, laktaatti vapautuminen määritettiin inkuboinnin jälkeen H460-solujen NaB 24 tuntia, minkä jälkeen lisättiin antimysiiniä Tulokset ilmaistaan ​​suhde laktaatin vapautumista läsnä ollessa ja puuttuessa antimysiini A, on esitetty kuviossa 2B. 60 minuutin jälkeen. jossa NaB ja Antimysiini-, laktaatti julkaisu tasaantui ulos näytteille kaksinkertaistui yli käsittelemättömistä soluista. 0,2pM TSA tuotti samanlaisen vastauksen Antimysiini- jälkeen 60 min. Inkuboinnin (Kuva S4b). Sen lisäksi, osoittaa, että oksidatiivista metaboliaa on toiminnassa H460-soluissa, ja oletettavasti lisääntynyt HDACi käsitellyissä soluissa, nämä tulokset tukevat myös tulkinnan, NaB ja TSA todellakin vaikuttaa glykolyyttisessä muutostilassa. Kuitenkin glukoosin sisäänottoa kasvainsolut voisi itse olla sydämentahdistimen koko glykolyyttisen reitin. Siksi kokeet suunniteltiin testaamaan onko NaB ollut mitään vaikutusta ilmaisun GLUT 1 ja GLUT 3 käyttäen qRT-PCR. Tulokset Kuviossa 2C esittää, että NaB inkuboitiin 3 ja 10 mM aikana 24 h vähentää ilmentymistä GLUT 1 (1,6 ja 4, vastaavasti) ja lisääntynyt GLUT 3: n ekspressio (2.9X) H460-soluissa.

jälkeen 24 h hoidon 3 mM tai 10 mM NaB, H460-soluja inkuboitiin glukoosi-täydennetty väliaine. Alikvootit supernatantit kerättiin 10 minuutin välein, ja inkuboitiin hidrazine pH 9,2, ylimäärän kanssa NAD

+ ja laktaattidehydrogenaasin (LDH) mittaamiseksi laktaatin vapautetaan. (A) kinetiikka laktaatin vapautumisen ja edustus laktaatin vapautumisen jälkeen 60 minuuttia (upotus). (B) 30 minuutin inkubaation glukoosia, 2 ug /ml Antimysiini- lisättiin viljelmään. Alikvootteja supernatanttia otettiin 10 minuutin välein ja laktaatti vapautetaan mitattiin. Jälkeen laktaatintuotantovaiheessa suhde H460-solujen läsnä ollessa ja puuttuessa Antimysiini- todistaa stimulaation laktaatin, kun oksidatiivinen fosforylaatio inhiboitui lisäämällä tämän lääkkeen (merkitty mustalla nuolella). Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM; N = 4, * P 0,05. (C) Soluja käsiteltiin 3 mM tai 10 mM NaB 24 tuntia ja GLUT 1 ja (D) GLUT 3: n ekspressio määritettiin Real Time PCR. Aktiini normalisointiin käytettiin cDNA: n määriä. Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM; N = 3, * P 0,05; ** P 0,01.

Natriumbutyraattia lisääntynyt mitokondrioiden sidottu heksokinaasilla aktiviteetti

Havaittu väheneminen GLUT 1 ja lisääntyneen ilmentymisen GLUT 3 (kuvio 2C) ehdotti, että korvaava mekanismi glukoosin oton oli käytössä soluissa. Niinpä kysyttiin HK toimintaa, tärkeä tekijä kinetiikka glukoosin sisäänoton ja glykolyyttiset flux, voisi olla rooli. Tämän tutkimiseksi HK aktiivisuus tehtiin ja ilmentyminen HK isoformeja arvioitiin qRT-PCR. Kuvio 3A osoittaa, että seurauksena inkuboitu H460-solujen kanssa 10 mM NaB 24 tuntia, aktiivisuus mitokondrioiden sitoutuneen HK kasvoi kaksi kertaa niin paljon kuin käsittelemättömien kontrollien. Sen sijaan, NaB ei vaikuta toimintaan sytosolin HK. Solunsisäinen sijainti HK Olin myös vahvistanut immunofluoresenssilla. Tulokset on esitetty (kuvio S5; Method S2). Näissä kokeissa havaitaan mitofusin (MFN) I ja II, proteiineja, jotka on ankkuroitu mitokondrioita ja osallistua ylläpito niiden morfologia ja fuusio, suoritettiin sama valmiste, jotta saadaan markkereina organelles. Vertailu Suosituimmuustullin levyjen (värjätty punaisella) HK (värjätty vihreällä), osoitti, että molemmat proteiinit yhdessä lokalisoitu mitokondrioissa. Korkeampi havaittu entsymaattinen aktiivisuus kuviossa 3A voinut näkyy lisääntynyt ilmentyminen HK indusoi jälkeen pitkän aikavälin inkubointi solujen kanssa NaB. Tämä mahdollisuus tutkittiin määrittämällä HK I ja HK II ilmentyminen käyttäen qRT-PCR: n H460-soluissa altistuvat 3 ja 10 mM NaB 24 tuntia. Tulokset on esitetty kuviossa 3B. Molemmat pitoisuudet NaB merkittävästi lisääntynyt ilmentyminen HK I. Käänteisesti, NaB indusoi lasku ilmentymisen HK II. Kokeissa mittaamalla HK II ilmentymistä (kuvio 3B), saadut arvot inkuboinnin jälkeen soluja 3 ja 10 mM NaB eivät olleet merkittävästi erilaiset. Vahvistus, että NaB indusoi lisääntyneen ilmentymisen HK I saatiin kokeista kulloinenkin määrä käännettyä HK avulla Western blot. Tulokset on esitetty kuviossa 3C. Voidaan nähdä, että hoito H460-solujen kanssa 10 mM NaB 24 h selvästi lisääntynyt intensiteetti ja kaistan alueesta vastaavan HK I liittyvät mitokondriot. Kuitenkin, mitään muutosta ei havaittu määrä HKII. Sen sijaan, soluliman HK I ja II olivat tuskin havaittavissa valvontaa ja käsiteltyjen solujen. Mitä suurempi määrä HK kuvassa 3C ei voitu selittää lisääntynyt saatavuus mitokondrioiden heksokinaasi hyväksyjä, The VDAC, koska määrät tätä proteiinia ei muuttunut merkittävästi käsittelemällä NaB. Vaikka vaikutus NaB ekspressioon HK isoformien on selvästi osoitettu, inhibiittori ei vaikuta aktiivisuuteen joko PYK tai LDH. Tulokset on esitetty taulukossa 1. Se, että 10 mM NaB ei vaikuta näihin glykolyyttisten entsyymien vahvistaa sitä ajatusta, että HDACi on osittain vaikutukseltaan valikoiva moduloimiseksi HK aktiivisuutta isoformeja.