Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpäsolut on korkea rauta vaatimus ja monet kokeelliset tutkimukset, sekä kliinisissä tutkimuksissa, ovat osoittaneet, että rautakelaattorit ovat mahdollisia syöpälääkkeet. Ligandi, 2-bentsoyylipyridiinijoh- 4-etyyli-3-tiosemikarbatsonia (Bp4eT), osoittaa sekä voimakas anti-neoplastisia ja anti-retrovirus- ominaisuuksia. Tässä tutkimuksessa Bp4eT ja äskettäin tunnistettu amidratsoni ja semikarbatsoniryhmän aineenvaihduntatuotteita tutkittiin ja verrattiin suhteessa niiden antiproliferatiivista aktiivisuutta syöpäsolujen (HL-60 ihmisen promyelosyyttileukemian, MCF-7 ihmisen rinta- adenokarsinooma, HCT116 ihmisen paksusuolen syöpä ja A549 ihmisen keuhkojen adenokarsinooma), ei-syöpäsolujen (H9c2 vastasyntyneen rottaperäinen cardiomyoblasts ja 3T3 hiiren alkion fibroblasteissa) ja niiden vuorovaikutus solunsisäisen rautaa altaat. Bp4eT osoitettiin olevan erittäin tehokas ja selektiivinen kasvainten vastaisen aineen, joka indusoi S vaihe solusyklin pysähtymiseen, mitokondrioiden Depolarisaatio ja apoptoosin MCF-7-soluissa. Sekä semikarbatsoniryhmän ja amidratsoni aineenvaihduntatuotteiden osoittivat ainakin 300-kertaisesti alentunut sytotoksisen aktiivisuuden kuin Bp4eT kohti sekä syövän normaalia solulinjoissa. Metaboliitit myös menettäneet kyvyn:

(1) B edistää redox pyöräily rautaa;

(2) B-sitovat ja liikkeelle rautaa labiilin solunsisäistä altaat; ja

(3) B estää

59Fe talteenoton

59Fe-leimattu transferriini by MCF-7-soluissa. Näin ollen tämä tutkimus osoittaa, että erittäin aktiivinen ligandi, Bp4eT, metaboloituu ei-myrkyllisiä ja farmakologisesti inaktiivisia analogeja, jotka todennäköisimmin edistävät sen suotuisa farmakologinen profiili. Nämä havainnot ovat tärkeitä jatkokehityksen huumeiden ehdokas ja auttaa ymmärtämään rakenteen ja aktiivisuuden välisiä suhteita näiden aineiden.

Citation: Potůčková E, Roh J, Macháček M, Sahni S, Stariat J, Šesták V, et ai. (2015)

In vitro

karakterisointi farmakologiset ominaisuudet Anti-Cancer kelatoija, Bp4eT, ja sen vaiheen I Metaboliitit. PLoS ONE 10 (10): e0139929. doi: 10,1371 /journal.pone.0139929

Editor: Ashley I. Bush, University of Melbourne, AUSTRALIA

vastaanotettu: 1. kesäkuuta, 2015 Hyväksytty: 19 syyskuu 2015; Julkaistu: 13 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Potůčková et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Tšekin tiedesäätiön (avustus 13-15008S; www.gacr.cz). D.R.R. kiitos National Health ja Medical Research Council Australian Senior Principal Research Fellowship ja hankeavustuksista. DSK arvostaa NHMRC RD Wright Training Fellowship ja Project Grant (www.nhmrc.gov.au).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Rauta on keskeinen kofaktori aktiivisuuden monien entsyymien ratkaisevan tärkeää solujen lisääntymisen, mukaan lukien ribonukleotidireduktaasi, joka katalysoi nopeutta rajoittava vaihe DNA-synteesin [1]. Koska syöpäsolut ovat yleensä metabolisesti aktiivisia kuin niiden normaalit kollegansa, ne vaativat suurempia määriä rautaa [2]. Näin ollen, kohdistaminen rautaa syöpäsolujen käyttäen spesifisiä kelaattoreita on lupaava strategia kehittää uusia syöpälääkkeitä [3]. Tiosemikarbatsonia luokka rautakelaattorit ovat osoittaneet korkea antineoplastisia tehokkuutta sekä

in vitro

ja

in vivo

tutkimuksissa ja jotkut aineet ovat myös vaiheen I ja II kliinisissä kokeissa [4,5, 6,7].

ligandi, 2-bentsoyylipyridiinijoh- 4-etyyli-3-tiosemikarbatsonia (Bp4eT, kuvio 1), oli alun perin syntetisoitiin ja karakterisoitiin West

et ai

. [8]. Myöhemmin osoitettiin olevan rautakelaatti joka hänellä on pieni, positiivinen Fe

3 + /2 + redoxpotentiaalin [9], mikä johti muodostumista myrkyllisten reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) sekä liuoksessa [9] ja syöpäsoluissa [10]. Itse asiassa, Bp4eT osoittivat korkeaa anti-proliferatiivista aktiivisuutta ihmisen SK-N-MC-neuroepithelioma soluja, joilla on alhainen myrkyllisyys normaaleille ihmisen MRC-5-fibroblasteja [10]. Sen lisäksi syövän vastainen vaikutus, Bp4eT osoitti voimakas inhibitio HIV-1 transkription tehokkuuden, joka on verrattavissa kliinisesti käytetty antiretroviraalisten aine, roscovitin, ja esillä sytotoksisuus ihmisen T-solu lymfoblastien solulinja, CCRF- CEM [11].

Bp4eT, 2-bentsoyylipyridiinijoh- 4-etyyli-3-tiosemikarbatsoni; Bp4eA;

N

3

etyyli

N

1

– [fenyyli (pyridiini-2-yyli) metyleeni] formamidrazone; Bp4eS, 2-bentsoyylipyridiinijoh- 4-ethylsemicarbazone.

Mitä sen farmakokinetiikkaa, Bp4eT osoitettiin helposti läpäistä konfluentteja yksisolukerroksissa Caco-2-solut, joissa läpäisevyys on samanlaiset ominaisuudet yhteisiä oraalisesti annettavat lääkkeet, mikä osoittaa hyötyosuus tällä terapeuttinen reittiä [12,13]. Merlot

et al

. paljasti, että soluunottoa

14C-Bp4eT SK-N-MC-neuroepithelioma solujen välittämä passiivisella diffuusiolla ja että Fe-Bp4eT kompleksi erottautuvat soluissa suuremmassa määrin kuin vapaa Bp4eT ligandin [14,15 ]. Lisätutkimukset paljastivat, että

14C-leimattu Bp4eT erittyi nopeasti hiiristä

kautta

virtsaan ja erittyi hitaammin

kautta

ulosteet, jossa keskeiset paikat

14C Bp4eT laskeuma on liittyvä elin eritys

e

.

g

., sappirakko, ohutsuoli ja paksusuoli [15].

metabolia ja farmakokinetiikka Bp4eT oli edelleen tutkittiin rotilla käytettäessä herkkää LC-MS -menetelmää [16,17,18]. Ensin osoitettiin, että Bp4eT olemassa seoksena kaksi toisikseen

E

ja

Z

-isomeerit sekä vesiväliaineessa ja plasma, kun taas

Z

muotoon oli hallitseva SSD [16,17,18]. Toiseksi Bp4eT osoitettiin metaboloidu

kautta

hapettamalla sen tiokarbonyyli osan sekä

in vitro

ja

in vivo

, jolloin sukupolven semikarbatsoniryhmän analogisen (2- bentsoyylipyridiinijoh- 4-ethylsemicarbazone, Bp4eS, kuvio 1) ja amidratsoni johdannainen (

N

3

-ethyl-

N

1

-[phenyl(pyridin-2-yl)methylene]formamidrazone; Bp4eA, kuvio 1) [17]. Amidratsoni metaboliitti edelleen Hydroksyloituneet

in vivo

, mutta erityinen lokalisoinnin hydroksyyliryhmän fenyylirenkaassa ei ole voitu tunnistaa [17].

Bp4eS metaboliitti havaittiin kahtena

E Twitter /

Z

isomeerien, jotka olivat, toisin kuin emoyhdisteen ei-toisikseen [18]. Farmakokineettiset tutkimukset osoittivat, että suonensisäisen Bp4eT, altistuminen rotat metaboliitiksi, Bp4eS, oli vain vähäinen suhteessa Bp4eT [18]. Päinvastoin, metabolisen konversion annettiin Bp4eT on Bp4eA metaboliitin näytti olevan tärkeä biotransformaatio, koska sen altistus oli 20% siitä emoyhdisteen [18].

tutkiminen biologiset ominaisuudet lääkeaineen aineenvaihduntatuotteiden on tärkeä askel lääkekehitykseen, metaboliitteja voi merkittävästi edistää farmakologisista ominaisuuksista kantalääkkeestä [19,20] ja ne voivat myös olla kiinnostavia uusia lääkekehityksen. Siksi paremmin luonnehtia Bp4eT lupaavana lääkeainekandidaatti, arvioimme

in vitro

sytotoksiset toimintaa Bp4eT itse ja sen kaksi päämetaboliittien, Bp4eA ja Bp4eS, neljällä ihmisen syöpäsolujen linjat ja kaksi ei-syöpäsolujen linjat. Kuten rautakelaattikromatografia- on keskeinen piirre vaikutusmekanismi Bp4eT, tutkimme kyky Bp4eT ja sen metaboliittien:

(i) B sitoa rautaa labiilin rauta allas (LIP) syöpäsolujen;

(ii) B mobilisoida cellular

59Fe; ja

(iii) B estää ottoa solun sisään

59Fe iältään

59Fe

2-transferriini. Kyky raudan kompleksien Bp4eT ja sen metaboliittien edistää ROS muodostumista tutkittiin myös käyttäen askorbaatti hapettumista määrityksessä. Lisäksi solusyklin etenemistä ja tilan solukuoleman jälkeen altistumisen Bp4eT ja sen aineenvaihduntatuotteet määritettiin myös.

Materiaalit ja menetelmät

Chemicals

Bp4eT syntetisoitiin Kalinowski

et al

. [9] ja sen metaboliitit syntetisoitiin, kuten on kuvattu Stariat

et ai

. [17,18]. Osatekijöiden eri puskureita ja muita kemikaaleja (

e

.

g

., Eri rautasuoloja) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) tai Penta (Praha, Tsekin tasavalta) ja olivat korkeimman farmaseuttisen tai analyysilaatua käytettävissä.

Soluviljely

ihmisen MCF-7 rinta adenokarsinoomasolulinja ostettiin European Collection of Cell Cultures (ECACC; Salisbury, UK). Ihmisen HL-60-promyelosyyttinen leukemia-solut, ihmisen HCT116 kolorektaalikarsinooma soluja, ihmisen A549 keuhkoadenokarsinooma solujen H9c2 solulinja, joka on johdettu alkion rotan sydänkudoksen, ja hiiren 3T3-alkion fibroblasteja hankittiin American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA). MCF-7, HCT116, A549, 3T3 ja H9c2 solutyyppejä viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM; Lonza, Basel, Sveitsi). Siinä tapauksessa, MCF-7-soluissa, DMEM käytettiin ilman fenolipunaista. DMEM täydennettynä 10% (tilavuus /tilavuus) lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS; Lonza), 1% penisilliini /streptomysiiniliuosta (Lonza) ja 10 mM HEPES-puskuria (pH 7,0-7,6; Sigma-Aldrich). HL-60-solulinjaa ylläpidettiin RPMI (Sigma-Aldrich), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä ratkaisu. Kaikkia solulinjoja viljeltiin 75 cm

2 kudosviljelypulloihin (TPP, Trasadingen, Sveitsi) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Sub-konfluentteja tarttumattomat solut, tai keskeyttäminen HL-60-solujen, oli osa-viljeltiin joka 3-4 päivä.

Sytotoksisuus tutkimukset

sytotoksisuus kokeissa, syövän soluja ympättiin tiheydellä 5000 (MCF-7), 10000 (HL-60) tai 2000 solua /kaivo (HCT116 ja A549) 96-kuoppalevyillä (TPP) 24 h /37 ° C: ssa ennen lisäämistä tutkitaan aineita. Ei-syöpäsoluja, 3T3 ja H9c2-soluissa, viljeltiin 24 h /37 ° C: ssa 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 10000 solua /kuoppa, väliaine vaihdettiin sitten serum- ja pyruvaatti-DMEM: llä (Sigma- Aldrich) ja inkuboitiin solujen kanssa vielä 24 h /37 ° C. Sytotoksisia vaikutuksia Bp4eT ja sen metaboliittien tutkittiin eri pitoisuuksina jälkeen 72 h /37 ° C: ssa inkuboinnin jälkeen. Auttamiseksi liukenemista lipofiilisen ligandien, 0,1% dimetyylisulfoksidia (v /v) (DMSO, Sigma-Aldrich) oli läsnä viljelyalustassa kaikkien ryhmien. Tässä pitoisuudessa, DMSO ei vaikuttanut solujen lisääntymisen tai elinkelpoisuutta.

Solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTT-määritystä (Sigma-Aldrich) mukaan aiemmin vakiintuneiden menetelmien [21,22]. Optinen tiheys liukoisen MTT mitattiin λ = 570 nm, vähentämällä λ = 690 nm tausta käyttäen Tecan Infinite 200M (TECAN Group, Männedorf, Sveitsi). Elinkelpoisuutta ja jakaantumista kokeellisen ryhmien ilmaistiin prosentteina käsittelemättömien kontrollien (100%).

Calcein-AM määritys arvioimiseksi nopeudella solukalvon läpäisy ja pääsy labiili rauta altaan

Nämä kokeet suoritettiin Glickstein

et al

. [23] pienin muutoksin. MCF-7-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (10000 solua /kuoppa) ja annettiin kiinnittyä 24 h /37 ° C. Solut ladattiin rautaa käyttäen solun raudan luovuttajan, ferriammoniumsitraattia (530 ug /ml), [24], 24 h ennen koetta, ja sitten pestiin. Estämään mahdollinen häiriö, etenkin eri hivenaineiden, väliaine korvattiin ADS puskurilla (valmistettu käyttäen Millipore vettä täydennetty 116 mM NaCl, 5,3 mM KCI, 1 mM CaCI

2, 1,2 mM MgSO

4 , 1,13 mM NaH

2PO

4, 5 mM D-glukoosia, ja 20 mM HEPES, pH 7,4). Sitten soluihin lisättiin 2 uM solun läpäisevän calcein vihreä asetoksimetyyliesteri (kalseiini-AM; Molecular Probes, Oregon, USA) 30 minuuttia /37 ° C ja pestään. Cellular esteraasit pilkkovat asetoksimetyyli kanssa muodostaen solukalvon läpäisemätön yhdiste, calcein vihreä [23]. Fluoresenssi kalseiinin vihreä sammutetaan sitoutumisen rauta [23]. Solunsisäisen fluoresenssin (λ

ex = 488 nm; λ

em = 530 nm) kalseiini vihreä Sitten seurattiin ajan funktiona (10 min kuluttua lisäämällä 10 uM Bp4eT tai sen aineenvaihduntatuotteiden) 37 ° C käyttäen Tecan Infinite 200M levy lukija. Rauta chelation tehoa aineenvaihduntatuotteiden soluissa ilmaistiin prosentteina tehoa vanhemman kelaattorin Bp4eT (100%).

valmistaminen

59Fe

2-transferriini

Ihmisen transferriiniä (Sigma) leimattiin

56Fe tai

59Fe (PerkinElmer, Massachusetts, USA) tuottamaan

56Fe

2-transferriini tai

59Fe

2-transferriini (

59Fe

2-Tf), tässä järjestyksessä, joiden lopullinen spesifinen aktiivisuus 500 pCi /pmol Fe, kuten aiemmin on kuvattu [24,25]. Sitoutumattoman

59Fe poistettiin tyhjentäviä vakuumissa dialyysillä suuri ylimäärä 0,15 M NaCl, joka on puskuroitu pH-arvoon 7,4 1,4% NaHCO

3 standardimenetelmillä [24,25].

vaikutus Bp4eT ja sen aineenvaihduntatuotteiden käyttöön cellular

59Fe.

tutkia kykyä tutkittiin yhdisteiden mobilisoida cellular

59Fe MCF-7-solut, rauta efflux kokeet suoritettiin käyttäen vakiintuneita tekniikoita [21,22] . Lyhyesti, sen jälkeen, kun ennalta merkinnät konfluentteja MCF-7-solujen 6-kuoppaisilla levyillä 0,75 uM

59Fe

2-Tf 3 h /37 ° C, solut pestiin neljä kertaa jääkylmällä PBS: llä ja sitten sen jälkeen inkuboitiin 25 uM Bp4eT tai sen metaboliittien 3 h /37 ° C. Päällä olevaan väliaineeseen, joka sisälsi julkaisi

59Fe dekantoitiin sitten soluista. Radioaktiivisuus mitattiin sekä solujen ja supernatantti käyttäen γ-tuikelaskimella (Wallac Wizard 3, Turku, Suomi).

vaikutus tutkittujen tekijöiden ehkäisyyn cellular

59Fe talteenoton

59Fe

2-transferriini.

kyky kelaattorien estää solujen

59Fe talteenoton

59Fe

2-transferriini tutkittiin käyttäen standardimenetelmiä [26,27]. Lyhyesti, konfluentit MCF-7-solujen 6-kuoppaisilla levyillä inkuboitiin 0,75 uM

59Fe

2-Tf 3 h /37 ° C, kun läsnä on Bp4eT tai sen aineenvaihduntatuotteiden (25 uM). Sitten solut pestiin neljä kertaa jääkylmällä PBS: llä ja taso internalized

59Fe määritettiin inkuboimalla yksisolukerros 30 min /4 ° C: ssa yleisen proteaasin, pronaasia (1 mg /ml; Sigma-Aldrich ). Solut poistettiin sitten yksikerroksinen muovisella lastalla jäällä ja sentrifugoitiin 1 min /12000 x

g

/4 ° C: ssa. Supernatantti edustaa kalvoon sitoutuneen, Pronaasilla herkkä

59Fe joka julkaisi proteaasin, kun Pronaasilla herkkä osa edustaa sisäistetään

59Fe [21,26,27]. Määrä internalized

59Fe ilmaistiin prosentteina

59Fe sisäistää ohjaus (käsittelemättömät) soluihin.

Askorbaattioksidaasitesti hapetus määritys

askorbaatti hapettumista määritystä käytettiin arvioimaan redox aktiivisuus raudan kompleksit kelaattorien käyttäen vakiintunutta protokollaa [26,28]. Lyhyesti, 100 uM askorbiinihappo valmistettiin välittömästi ennen koetta, ja niitä inkuboitiin joko yksin tai, kun läsnä oli 10 uM FeCI

3 50-kertainen molaarinen ylimäärä (500 uM) sitraattia ja kelaattoreita. Kelaattorit analysoitiin at rauta-sitovia vastineet (PPS) 0,1 (liikaa rautaa), 1 (täysin koordinoidusta rauta-kelatoiva kompleksit) ja 3 (ylimäärä vapaata kelatoiva). Lasku absorbanssin λ = 265 nm: ssä mitattiin sen jälkeen, kun 10 ja 40 min inkuboinnin jälkeen huoneenlämpötilassa käyttäen Tecan Infinite 200M levylukijalla. Absorbanssin alenemista kahden ajankohtina laskettiin ja ilmaistiin prosentteina kontrollista ilman kelaattoria.

Solusyklianalyysiä

vaikutuksen tutkimiseksi, että agentit solusyklin, MCF -7-soluja ympättiin 60 mm: n petrimaljoille tiheydellä 240,000 solua /malja ja inkuboitiin Bp4eT tai sen metaboliittien 72 h /37 ° C. Solut kerättiin sitten, kiinteät etanolilla ja värjättiin propidiumjodidilla (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 30 minuuttia /37 ° C: ssa, kuten aiemmin on kuvattu [29]. Solut analysoitiin Accuri C6 virtaussytometrillä (Becton Dickinson and Company, San Jose, CA USA). Propidiumjodidia viritettiin λ

ex = 488 nm ja fluoresenssi analysoitiin λ

em = 585 nm (FL-2), joissa on yhteensä 10.000 tapahtumaa kerättiin analyysiä kohti.

Fluoresenssimikroskopia arvioinnit

Merkit käytetään arvioitaessa autophagy /apoptoosin /nekroosin MCF-7-solujen ja muutoksia lysosomaalisen ja mitokondrioiden morfologia havaittiin käyttämällä Eclipse Ti käänteinen epifluoresenssimikroskooppia (Nikon, Tokio, Japani), joka oli varustettu jäähdytetty digitaalinen kameran Zyla 5.5 sCMOS (Andor Technology, Belfast, UK), ja NIS-Elements C 4.1-ohjelmisto (Laboratory Imaging, Praha, Tsekin tasavalta). MCF-7-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille, joissa kansi liukuu pohjalla tiheydellä 150,000 solua /kuoppa ja niitä inkuboitiin edellä kuvatulla tavalla läsnä ollessa tai poissa ollessa 10 tai 100 nM Bp4eT.

arvioitava mekanismi solukuoleman inkubaation jälkeen Bp4eT, kolminkertainen värjäys monodansyl kadaveriinia (MDC, 50 uM; λ

ex = 390 nm; λ

em = 455 nm; Sigma-Aldrich), anneksiini V-FITC ( 5 ul /ml; λ

ex = 495 nm; λ

em = 519 nm; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ja propidiumjodidia (5 ug /ml; λ

ex = 560 nm; λ

em = 630 nm) käytettiin. MDC on merkkiaine autophagosomes ja lysosomeihin ja aiheuttaa sinisellä fluoresenssi [30,31]. Positiivisena kontrollina autophagy, MCF-7-soluja inkuboitiin 1 nM rapamysiiniä (Sigma-Aldrich) 30 min /37 ° C, joka on perustettu indusoi autophagy [30]. Anneksiini V on suuri affiniteetti fosfatidyyliseriiniin, joka kulkeutua pintaan sekä varhaisen ja myöhäisen vaiheen apoptoottiset solut [32,33]. Näin ollen, anneksiini V-FITC: llä toimi markkerina apoptoosin, kun apoptoottisten solujen oli vihreä fluoresoiva sytoplasmamembraaneilla. Propidiumjodidia on nekroottista markkeri tai markkeri myöhäisessä vaiheessa apoptoosin, koska se ei ole tunkeutumaan soluihin ja ehjät sytoplasmamembraaneilla [34]. Soluja inkuboitiin näillä koettimilla 10 min /37 ° C: ssa, pestiin tuoreella viljely- väliaineen ja otettujen kuvien mikroskoopilla edellä kuvatulla tavalla.

vaikutuksen määrittämiseksi Bp4eT mitokondrion morfologia, soluja inkuboitiin jossa MitoTracker

® Green FM (0,25 uM; λ

ex = 490 nm; λ

em = 516 nm; Molecular Probes) 10 min /37 ° C. Sitten solut pestiin tuoreella elatusaineella ja otettujen kuvien mikroskoopilla edellä on kuvattu.

Western blot-analyysi

perustettu protokollia valmistamiseen käytettiin solulysaateista ja suorittaa immunoblot-analyysillä [35]. Ensisijainen vasta käyttää, ovat: kanin LC3 (Cat. #: MBPM036; 1: 2000) alkaen Abacus (Brisbane, Australia) ja hiiren β-aktiini (Cat. #: A1978, 1: 10,000) Sigma-Aldrich. Seuraavat sekundäärisiä vasta-aineita käytettiin: piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua anti-kani (Cat. #: A6154, 1: 1,0000) ja anti-hiiri (Cat. #: A4416, 1: 10000) vasta-aineet Sigma-Aldrich . Tasapuolisen lastaus proteiinien, kalvot koetettiin varten β-aktiini.

kaspaasiaktiivisuus arvioinnit

arvioimiseksi vaikutusta yhdisteiden kaspaasiaktiivisuus, MCF-7-soluja inkuboitiin 100 nM Bp4eT tai sen metaboliittien 3, 24 tai 72 h /37 ° C: ssa 96-kuoppalevyillä, kuten edellä on kuvattu. Sitten solut hajotettiin lisäämällä 100 ui kylmää hajotuspuskuria (100 mM HEPES, 10 mM CHAPS, 10 mM D-L-ditiotreitolia, pH 7,4) ja 100 ul: aan kunkin kaivon alusta. Lysaatit pakastettiin välittömästi -80 ° C: ssa. Sulanut lysaatit käytettiin arvioimaan kaspaasiaktiivisuus käyttäen luminescent sarjoja caspases 3/7, 8 ja 9 (Promega, Madison, WI, USA). Luminesenssi mitattiin käyttäen Tecan Infinite 200M levy lukija. Kaspaasiaktiivisuus koeryhmissä korjattiin mukaan solujen elinkelpoisuuden kunkin ryhmän ja ilmaistiin prosenttiosuutena aktiivisuudesta käsittelemätön kontrolli (100%).

Tietojen analysointi ja tilastot

SigmaStat varten Windows 3.5 (Systat Software, San Jose, CA, USA) tilastollinen ohjelmistopaketti käytettiin analysoimaan tuloksia. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD tietyn määrän kokeita. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA kanssa Bonferronin

post-hoc

testi tai opiskelijan

t

-testi. Tuloksia pidettiin tilastollisesti merkitsevä, kun

p

0,05. IC

50-arvot laskettiin käyttäen CalcuSyn- 2.0 -ohjelmisto (Biosoft, Cambridge, UK). Solusyklianalyysiä arvioitiin käyttämällä multicycle AV Software (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, USA).

Tulokset ja keskustelu

Bp4eT metaboloituu yhdisteet, joilla on vähintään 300-kertainen pieneneminen in sytotoksisuus sekä syövän ja ei-syöpäsolujen

sytotoksinen aktiivisuus Bp4eT verrattiin Bp4eA (käytetään seosta,

E

ja

Z

-isomeerit) ja Bp4eS (kahdessa isomeerisiä muotoja:

E-

Bp4eS ja

Z-

Bp4eS).

E

ja

Z

isomeerien Bp4eS tutkittiin erikseen, koska ne olivat molemmat havaitaan

in vivo

aiemmissa tutkimuksissa [18], ja siten, ovat biologisesti merkittäviä. Kuitenkin, näiden kahden isomeerin ei toisikseen, ja ovat erillisiä yhdisteitä, jotka voidaan eristää ja analysoida [18]. Sen sijaan Bp4eA helposti konvertoi välillä

E

ja

Z

isomeeristen todetaan [18], ja tämän vuoksi luontainen fysikaalinen ominaisuus, vain seoksen näiden isomeerit voidaan arvioida. Näissä tutkimuksissa vaikutukset aineiden syöpäsoluihin tutkittiin käyttäen ihmisen HL-60-promyelosyyttinen leukemia, ihmisen MCF-7-rinta-adenokarsinooma, ihmisen HCT116 kolorektaalisyövän ja ihmisen A549 keuhkoadenokarsinooma solulinjoissa, sekä kaksi ei-syöpä solu- tyyppiä, nimittäin rotan H9c2 cardiomyoblasts, ja hiiren 3T3-fibroblasteissa.

jälkeen 72 h inkubaation kantayhdisteen, Bp4eT, osoitti erittäin voimakas sytotoksinen vaikutus HL-60, MCF-7 ja HCT116-soluja, jossa IC

50-arvot vaihtelivat 3-15 nM (taulukko 1 ja kuvio 2A). Syövän vastaista aktiivisuutta Bp4eT kohti näistä solulinjoista oli huomattavasti suurempi kuin kliinisesti käytettyjen kelaattorit, deferoksamiini tai deferasiroksi, joilla on IC

50-arvot uM välillä syöpäsoluja vastaan ​​[9,36,37,38] . IC

50 arvo Bp4eT A549-soluissa oli kohtalainen (IC

50 = 0,593 ± 0,148 uM) ja oli verrattavissa sytotoksisten vaikutusten Bp4eT vastaan ​​H9c2 cardiomyoblasts (IC

50 = 0,524 ± 0,157 uM; Pöytä 1). IC

50 arvo Bp4eT vastaan ​​3T3 fibroblastisoluja (IC

50 = 1,309 ± 0,337 uM, taulukko 1) oli kaksi kertaa suurempi kuin mitä havaittiin H9c2 soluihin. Itse asiassa, 3T3 fibroblastit olivat resistenttejä kaikkien solutyyppejä jokaiseen agentti tutkittu. Lisäksi sytotoksisuuden Bp4eT vastaan ​​3T3-fibroblastit oli samanlainen kuin havaittiin aiemmin ihmisen MRC-5 fibroblastisoluissa, IC

50-arvot vaihtelevat 0,7 6 uM [9,10,39].

määrittämiseksi antiproliferatiivinen aktiivisuus, syöpäsolun linjat (

i

.

e

., HL-60, MCF-7, HCT116 ja A549) ja ei -cancer solulinjoja (

i

.

e

., H9c2 ja 3T3) inkuboitiin aineita 72 h /37 ° C ja leviämisen jälkeen arvioitiin käyttämällä MTT-määritystä. Tulokset ovat keskiarvo ± SD (

n

≥ 4 koetta).

Terapeuttinen indeksi laskettiin jakamalla IC

50 normaaleissa soluissa IC

50 saatu neoplastisten solujen ja tätä indeksiä toimi mittana selektiivisyys aineen syöpäsolujen (taulukko 2). Tärkeää on, että terapeuttiset indeksit Bp4eT kohti HL-60, MCF-7 ja HCT116 syöpäsolujen olivat korkeat (34,9-436,3; taulukko 2), mikä osoittaa, selektiivisyys Bp4eT näitä syöpää tyyppejä. Tämä on yhtäpitävä aikaisempien tutkimusten osoittaa tehokas ja selektiivinen antineoplastisia of Bp4eT [9,40]. Kuten edellä on kuvattu, selektiivisyys Bp4eT A549-soluja oli alhainen, mikä johtaa terapeuttisen indeksin 0,9-2,2 (taulukko 2).

Bp4eT metaboliitit osoitti vähentyneen merkittävästi sytotoksisuutta sekä syövän ja muiden -cancerous solulinjoja (taulukko 1 ja kuvio 2) ja niiden IC

50-arvot olivat 300-kertainen suhteessa alkuperäiseen agentti. Amidratsoni, Bp4eA, joka on tunnistettu päämetaboliitti Bp4eT [18], on yleensä sytotoksinen syöpäsoluja vastaan ​​(lukuun ottamatta HCT116-solut) kuin semikarbatsoniryhmän metaboliitti, Bp4eS. IC

50-arvot Bp4eA syöpäsoluja vastaan ​​vaihtelivat 52-207 uM (taulukko 1). Lisäksi sytotoksisuuden Bp4eA vastaan ​​ei-syöpäsoluja oli pienempi verrattuna syöpäsoluihin tutkittiin, IC

50-arvot 416,1 ± 122,1 uM ja 1027,4 ± 203,9 uM H9c2 ja 3T3-soluja, vastaavasti. Tämä heijastui myös terapeuttinen indeksit Bp4eA, jotka vaihtelivat 2,0-19,7 (taulukko 2). Tärkeää on, että myrkyllisiä pitoisuuksia Bp4eA normaaleja soluja ei saavutettu plasmassa aikana edellisessä farmakokineettisessä tutkimuksessa, jossa korkein pitoisuus Bp4eA saavutti oli 1 uM jälkeen 300 minuutin post

i

.

v

. anto Bp4eT [18]. Tämä viittaa selvästi siihen, että Bp4eA plasmassa olivat myrkytön pitoisuuksia.

Sekä ei-toisikseen

E

ja

Z

isomeerien Bp4eS metaboliitin oli aiemmin tunnistettu pieninä pitoisuuksina (alle 0,02 uM) plasmassa [18]. Tuloksemme osoittivat, että Bp4eS olivat yleensä huonompi anti-proliferatiivista aktiivisuutta kuin Bp4eA (taulukko 1 ja kuvio 2), jossa IC

50-arvot vaihtelivat välillä 46-536 uM syöpäsoluja ja 343 uM ja 1 mM ei-syöpä H9c2 ja 3T3-soluja, vastaavasti. Yllättäen kukin solulinja osoitti ero herkkyys

E

ja

Z

isomeerien Bp4eS. Vaikka HL-60 ja H9c2 solut olivat merkitsevästi (

p

0,001) herkempiä

Z

isomeeri HCT116 ja A549-solut olivat huomattavasti (

p

0,01) herkempi

E

isomeeri Bp4eS (taulukko 1). Sen sijaan, MCF-7-solut olivat noin yhtä herkkiä sekä

E

ja

Z

isomeerien Bp4eS (taulukko 1). Suhteessa Bp4eT, terapeuttinen indeksit

E

ja

Z

isomeerien Bp4eS ovat yleisesti heikkoja, etenkin vastaan ​​H9c2 soluja ja vaihteli välillä 0,6 21,6 (taulukko 2). Koska

E

ja

Z

isomeerien Bp4eS havaittiin vain hyvin pieninä pitoisuuksina plasmassa [18], ja koska niiden sytotoksisia vaikutuksia esiintyy ainoastaan ​​suurilla pitoisuuksilla, se voidaan ehdotti, että Bp4eS osoittaisi matala antiproliferatiivinen aktiivisuus syöpäsoluja vastaan ​​ja myrkyllisyyttä normaalisoluille

in vivo

.

kyky Bp4eT aineenvaihduntatuotteiden kelatoimiseksi rautaa labiili rauta-allas, mobilisoida cellular

59Fe ja estää solujen

59Fe talteenoton

59Fe

2-transferriini on vähäistä verrattuna Bp4eT

kyky Bp4eT ja sen aineenvaihduntatuotteiden kelatoimiseksi rautaa LIP MCF-7-solut tutkittiin tässä tutkimuksessa käytetään kalseiinipitoiset AM määrityksessä, kuten rautakelaattikromatografia- ja ehtyminen uskotaan rooli syövän vastaista aktiivisuutta tiosemikarbatsonien [3,9]. Kantayhdisteen, Bp4eT (10 uM), osoitti ajasta riippuva fluoresenssin kasvu, koska kyky Bp4eT kelatoida rautaa kalseiini-AM MCF-7-soluissa (kuvio 3A). Sen sijaan lisäämällä Bp4eT metaboliiteilla lähes mitään vaikutusta kalseiini-AM fluoresenssi (kuvio 3A). Kun ilmaistaan ​​prosentteina Bp4eT fluoresenssin

t

= 600 s, metaboliitti, Bp4eA, osoitti vain 5,9%: n kelatoinnin tehokkuutta Bp4eT, kun taas molemmat isomeerit Bp4eS osoitti ≤1.0%: n fluoresenssin Bp4eT (kuvio 3B).

tehoa Bp4eT tai sen metaboliittien kelatoimiseksi rautaa LIP MCF-7-soluihin mitattiin käyttäen kalseiini-AM määrityksessä. (A) Fluoresenssi vapaa kalseiinin lisäämisen jälkeen 10 uM Bp4eT tai sen aineenvaihduntatuotteiden 10 min /37 ° C. (B) fluoresenssin voimakkuus vapaata kalseiinin läsnä metaboliittien osoitteessa

t

= 600 s ilmaistiin prosentteina fluoresenssin vapaan kalseiini läsnä Bp4eT. Tulokset (A) ja (B) ovat keskiarvo ± SD (

n

= 6 koetta). Tilastollinen merkitys (ANOVA): ***

p

0,001 verrattuna Bp4eT. (C) ulosvirtaus

59Fe välittämien ohjaus väliaineessa tai väliaineessa, joka sisältää aineet (25 uM) jälkeen 3 h /37 ° C inkuboinnin MCF-7-solujen esimerkittyyn kanssa

59Fe-transferriini. (D) otto

59Fe päässä

59Fe

2-transferriinin MCF-7-soluissa, kun läsnä on ohjattu keski- tai väliaineessa, joka sisältää aineet (25 uM) määritettiin sen jälkeen, kun 3 h /37 ° C inkuboinnin jälkeen. Tulokset (C) ja (D) ovat keskiarvo ± SD (

n

≥ 3 koetta). Tilastollinen merkitys (ANOVA): ***

p

0,001 verrattuna kontrolliin (käsittelemätön) ryhmä. (E) askorbaatin hapetus määritystä käytettiin tutkimaan muodostumista redoksiaktiivinen komplekseja. Bp4eT ja sen aineenvaihduntatuotteet analysoitiin rauta sitovia vastaavana (PPS) 0,1 (liikaa rautaa kelatoiva); 1 (täysin valmis koordinointi kuori); ja 3 (yli kelaattorin silittää). Kelaatinmuodostajat, DFO ja EDTA, käytettiin anti-oksidatiivisen tai pro-oksidatiivisen valvontaa, vastaavasti. Tiedot ilmoitetaan prosentteina kontrolliryhmän ilman kelaattoria samalla PPS (100%). Tulokset (E) ovat keskiarvo ± SD (

n

≥ 3) kokeissa. Tilastollinen merkitys (ANOVA): ***

p

0,001 verrattuna kontrolliryhmään (rautaa askorbaatti) samassa IBE. (F) MCF-7-soluja inkuboitiin 72 h /37 ° C ja 100 nM Bp4eT tai sen metaboliittien, Bp4eA ja Bp4eS. Solusyklianalyysiä käsitelty virtaussytometrialla käyttämällä propidiumjodidia. Vaihe kvantifiointi arvioitiin käyttämällä multicycle AV Software. Tulokset (F) ovat keskiarvo ± SD (

n

≥ 3 koetta). Tilastollinen merkitys (ANOVA): *

p

0,05, **

p

0,01, ***

p

0,001 verrattuna kontrolliryhmään.

Lisäksi Bp4eT osoitti korkea

59Fe mobilisointi tehoa ja pystyi välittävän vapauttamista 46,4% koko solun

59Fe (kuvio 3C). Kumpikaan Bp4eT aineenvaihduntatuotteiden johti merkittävään vapautumisen cellular

59Fe ja olivat verrattavissa käsittelemätön kontrolli (3,5% koko

59Fe; Kuva 3C).

Kyky Bp4eT ja sen aineenvaihduntatuotteiden estää solun oton

59Fe iältään

59Fe

2-transferriini jälkeen 3 h /37 ° C inkubaation tutkittiin myös MCF-7-soluissa. Tärkeää on, että vanhempi kelaattorin Bp4eT, osoitti korkea

59Fe chelation tehoa ja esti sisäistetään

59Fe ottoa 11,5%: n ohjaus (kuvio 3D). Kuten havaittiin

59Fe ulosvirtausta määritys, sekä Bp4eA ja Bp4eS osoittivat huono

59Fe chelation tehoa ja niiden kyky estää

59Fe sisäänotto verrattavissa käsittelemätön kontrolli (kuvio 3D).