Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kohonnut mikrosatelliittimerkkien muutokset valituissa tetranucleotide toistoja (EMAST ) on geneettinen allekirjoitus havaittiin 60% satunnaista paksusuolen ja peräsuolen syöpiä (CRC). Toisin mikrosatelliittimarkkereita epävakaa CRC jossa hypermetylaatiota DNA mismatch korjaus (MMR) geeni

hMLH1 n

promoottori on kausaalinen, tarkka syy EMAST ei ole selvästi määritelty, mutta pistettä kohti

hMSH3

puute.

Tavoite

tutkivat,

hMSH3

puute aiheuttaa EMAST, ja tutkia mekanismeja sen puute.

Methods

mitataan -4 emäsparin framshifts osoitteessa

D8S321

ja

D20S82

loci sisällä EGFP-elementin sisältävät rakennelmat määrittää EMAST muodostumista MMR-taitavia,

hMLH1

– /-

,

hMSH6

– /-

, ja

hMSH3

– /-

CRC soluja. Havaitsimme solunsisäisen sijainnin hMSH3 hapettava stressi.

Tulokset

D8S321

mutaatioita esiintyi 31-ja 40-kertainen ja

D20S82

esiintyy mutaatioita 82-ja 49-kertainen

hMLH1

– /-

ja

hMSH3

– /-

soluja, vastaavasti kuin

hMSH6

– /-

tai MMR-taitavia soluissa.

hMSH3

Knockdown MMR taitavia solujen aiheuttamat korkeammat

D8S321

mutaationopeudet (18,14 ja 11,14 x 10

-4 mutaatiot /solu /sukupolven kaksi itsenäistä kloonia) kuin salattu valvonta (0 ja 0,26 x 10

-4 mutaatiot /solu /sukupolven;

p

0,01). DNA: n sekvensointi vahvisti odotetun lukukehysmutaatioita todisteet jatkuvan mutaatioiden konstruktioita. Koska EMAST-positiivisia kasvaimia liittyy tulehdukseen, me altistetaan MMR-taitava solujen oksidatiivista stressiä kautta H

2O

2 tutkia sen vaikutusta

hMSH3

. Käännettävä ydinvoima-to-sytosolin siirtymiseen hMSH3 havaittiin upon H

2O

2 hoitoa.

Johtopäätös

EMAST riippuu MMR tausta, jossa

hMSH3

– /-

alttiimpia lukukehysmutaatioita kuin

hMSH6

– /-

vastapäätä lukukehysmutaatioita havaittu mononukleotidi toistoja.

hMSH3

– /-

jäljittelee täydellinen MMR epäonnistuminen (

hMLH1

– /-

) asiakkuutta EMAST. Ottaen huomioon havaitut heterogeeninen ilmentymisen hMSH3 in CRC kanssa EMAST,

hMSH3

-puutos näyttää olevan tapahtuman, joka alkaa EMAST. Oksidatiivisen stressin, joka aiheuttaa siirtymä hMSH3 n subsellulaarinen sijainti, saattavat osaltaan hMSH3 menettämisestä toiminnon fenotyypin sitomalla se sytosoliin.

Citation: Tseng-Rogenski SS, Chung H, Wilk MB, Zhang S, Iwaizumi M, Carethers JM (2012) Hapettavat stressi indusoi Nuclear-to-sytosolin Shift of hMSH3 potentiaalinen mekanismi EMAST kolorektaalisyövässä solut. PLoS ONE 7 (11): e50616. doi: 10,1371 /journal.pone.0050616

Editor: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, Korean tasavallan

vastaanotettu: 12 elokuu 2012; Hyväksytty: 25 lokakuu 2012; Julkaistu: 30 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Tseng-Rogenski et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Yhdysvaltain Public Health Service (DK067287 ja CA162147) ja SDSU /UCSD Kattava Cancer Center Partnership (CA132379 ja CA132384). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

DNA mismatch korjaus (MMR) toimintahäiriö vie prosessia Mikrosatelliittimarkkerien epävakaus (MSI), havaittiin lähes kaikissa Lynch oireyhtymä kolorektaalisyövissä (CRC) ja 15-20% satunnaista CRC [1]. MSI on havaittu, kun molempien alleelien suuren DNA-MMR-geeni on inaktivoitu mutaatiolla Lynch kasvaimia tai hypermetylaatiota satunnaista kasvaimissa, mikä aiheuttaa MMR-proteiinin tuotanto tai toiminta epäonnistuu, ja mahdollistaa lukukehyksen esiintyvän DNA mikrosatelliitti-sekvenssien koko genomin [1] – [3]. Classic MSI määräytyy esiintyminen lukukehyksensiirtojen mono /dinukleotidi markkereita, ja on määritelty paneeli, jota varten verrata tutkimuksia [4]. Tämä paneeli, tai muunnelmia näistä mono /dinukleotidi markkereita, helposti tunnistaa

hMLH1

– ja

hMSH2

-puutos (kuten toimintahäiriö näiden kahden proteiinien täysin tehottomaksi DNA MMR), ja joskus

hMSH6

-puutos [1], [4]. MSI paneeli ei ole erityisiä havaita

hMSH3

-puutos luonteen vuoksi korjaus, että tämä proteiini osallistuu MMR, joka perustuu hiivan tutkimuksissa [5], [6]. DNA MMR on entsyymi järjestelmää, jonka pääasiallisena solujen tehtävänä on korjata nukleotidin mispairs ja lisäys /poisto silmukoita (IDLs) aikana DNA: n replikaatiota. Spesifisyys epäsuhta tunnustamista on ohjannut hMutSα ja hMutSβ; hMutSα (hMSH2-hMSH6 heterodimeeri) sitoutuu yhden mispairs ja pieni IDLs (≤2 nukleotidia), kun taas hMutSβ (hMSH2-hMSH3 heterodimeeri) sitoutuu suurempi IDLs [1], [5] – [7]. Me ja muut ovat havaittu DNA vaurion sitoutumisspesifisyys puhdistetulla hMutSα ja hMutSβ sekä tehnyt erityisiä huomautuksia sitoutumisen käytetään ihmisen CRC soluja erilaisten DNA MMR-puutosta taustat kätkeminen, jotka sisälsivät määritelty pituus IDLs tai nukleotidin mispairs [8] – [12] .

Äskettäin uusi muoto MSI on kuvattu jopa 60% satunnaisissa paksusuolen [13] – [15] ja yli 30% peräsuolen syöpiä [16]. Toisin kuin klassiset MSI, kohonnut mikrosatelliitti muutokset on valittu tetranucleotide toistoja (EMAST) määritetään paneeli tetranuleotide merkkiaineiden [13] – [17]. EMAST näyttää olevan yleisempää kuin klassinen MSI ja näyttää olevan hankittu ominaisuus liittyy tulehdus CRC [14], [16]. CRC potilailla, joilla on EMAST-positiivisia kasvaimia on huonompi ennuste kuin ei-EMAST tai MSI kasvainten [16], [18]. EMAST on havaittu erilaisten kasvainten, mukaan lukien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, [17], virtsarakon [19], munasarjasyöpä [20], eturauhassyöpä [21], ihon [22], ja peräsuolen [13] – [16], mutta nämä tutkimukset eivät anna täyttä todisteita syy EMAST. Alkuperäisessä raportit EMAST peräsuolen syöpiä, kirjoittajat havaittu ydin- heterogeenisyys hMSH3 sisällä EMAST-positiivisia kasvaimia [13], [14]. Tuloksemme yhdistettynä hiivan [5], [6], ja muut ihmisillä tehdyt tutkimukset [13] – [16], viittaavat siihen, että

hMSH3

-puutos ehkä kuljettajaa EMAST vuonna CRC.

sen testaamiseksi, mikäli

hMSH3

-puutos on pääasiallinen syy EMAST, me syntyy tetranucleotide toistaa sisältäviä rakenteet, jotka fuusioitiin out-of-runko EGFP, niin että kun frameshifted mukaan -4 emäsparin ( eli poistetaan yhden tetranucleotide yksikkö), EGFP olisi ilmaistu. Tämä sallittu havainto sukupolven EMAST reaaliajassa, ja tarjonnut meille mahdollisuuden laskea mutaatio taajuuksia ja mutaationopeudet useita MMR-puutosta taustoja. Tässä raportissa tuloksemme osoittavat selvästi, että

hMSH3

-puutos on syy EMAST ihmisen CRC soluissa ja olemme edelleen tarjota mahdollinen mekanismi, joka voi edistää hankitun

hMSH3

-puutos vuonna ihmisen CRC.

tulokset

perustaminen mittausjärjestelmän EMAST Tetranucleotide kehyksenvaihtoja

Koska jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että EMAST liittyy heterogeeninen ilmaus hMSH3 vuonna Kolorektaalituumorien [13 ] – [16], meidän lähestymistapamme oli tuottaa järjestelmän, jolla mitataan EMAST kvantitatiivisella tavalla keinona suoraan tarkastella, jos

hMSH3

-puutos on syy EMAST. Ihmisen tetranucleotide

D8S321

ja

D20S82

loci sekvenssit (jotka sisältävät 12 ja /tai 16 toistoa AAAG, vastaavasti) ovat osoittaneet korkeimman taajuudella -4 emäsparin lukukehyksen Kolorektaalituumorien [14], [16]. Nämä kaksi geenit pystyttiin siis valittu tutkimus käyttäen CRC soluja erilaisilla MMR geneettiset taustat selvittää myöhemmin mutaatio. Olemme aiemmin perustaneet vastaavat kokeelliset järjestelmä, jossa poistetaan 1 bp (A)

n johtaisi ilmentymistä reportterigeeni EGFP kun konstruktio asetettiin +1 emäsparin out-of-frame [10] – [12 ].

Voit luoda kokeellinen konstruktioita, lisäsimme

D8S321

(D8) ja

D20S82

(D20) loci kuin 60-meerejä, jotka sisältävät tetranucleotide toistoja ja ympäröivä nukleotidin heti EGFP aloituskodonista [Taulukko S1]. Kokeellinen konstruktioita [D8-OF (D8-out-of-frame) ja D20-OF] tehtiin +1 emäsparin out-of-frame siten, että poistettaisiin yksi AAAG toista siirtyy EGFP lukukehyksen (+1 ep ​​-3 bp) oikeaan kehykseen aiheuttaa EGFP ilmentymisen. Mutaatio resistenttejä (MR) plasmidit (MR-D8 ja MR-D20), jotka toimivat negatiivisina kontrolleina, rakennettiin korvaamalla keskellä AA nukleotidin sisällä AAAG toistaa C /G nukleotidin joka kolmannessa AAAG katkaisten sarja tetranucleotide toistaa sen estää lukukehysmutaatioita. MR-D8 ja MR-D20 plasmidit laitettiin out-of frame (OF; D8 /D20-MR-OF) ja /tai kehyksen (IF; D8 /D20-MR-IF) käytettäväksi negatiivisen ja positiivisen säätimet EGFP ilmaisun (myös katso materiaalit ja menetelmät). Nämä rakenteet transfektoitiin ihmisen CRC solulinjoihin eri MMR geneettiset taustat ja stabiileja solulinjoja perustettiin kautta hygromysiini B valinta. Yhden solun klooneja myöhemmin asettaa. DNA sekvensointi käytettiin oikein vahvistaa transfektoidun EMAST konstruktioita (taulukko S1). Kuten odotettua, jotka kantavat MR-IF (positiivinen kontrolli) olivat EGFP positiivisia, kun taas solut, jotka sisältävät MR-OF (negatiivinen kontrolli) olivat EGFP negatiivisia.

Voit testata

hMSH3

-puutos voi aiheuttaa EMAST, ei-fluoresoiva, jotka kantavat eri transfektoitu stabiilisti EMAST konstruktiot lajiteltu virtaussytometrialla ja eksponentiaalisesti kasvanut neljästä kuuteen viikkoa. Joka viikko, solut analysoitiin kahtena virtaussytometrialla EGFP ilmaisun, oletettavasti tuloksena poistetaan yhden AAAG toista transfektoiduista

D8S321

ja /tai

D20S82

loci. EGFP positiivisia soluja alkoi kehittyvien heti viikon kuluttua EGFP negatiiviset solut lajiteltiin ja maljattiin (tuloksia ei esitetty). Varmistaa, että kokeellinen järjestelmä antoi meille mahdollisuuden arvioida oikein esiintyminen EMAST, EGFP negatiivisia ja positiivisia soluja

hMLH1

– /-

ja /tai

hMSH3

– /- solut kätkeminen kokeellinen konstruktioita (D8-OF ja D20-OF) on lajiteltu eristämiseksi genomista DNA sekvensointia varten. Kuten odotettua, olennaisesti kaikki kloonit (yli 96%) peräisin EGFP negatiiviset solut säilyvät villityypin (WT) sekvenssit kullekin

D8S321

ja

D20S82

loci sekä

hMLH1

– /-

ja

hMSH3

– /-

solulinjoissa, kun taas kloonit EGFP positiivisia soluja hankitaan poistettaisiin yksi AAAG toista (kuvio 1A ja kuvio S1A ja S1B). Havaitsimme myös laajeneminen lukukehysmutaatioita kussakin lokuksessa DNA-sekvensoinnilla (sisältyy ”muut” kuviossa 1A). Yleisin yksi (vaihtelee 12,5%: sta jopa 30% kaikista EGFP-positiiviset solut) oli lisätään kaksi AAAG toistaa [(AAAG)

12 (AAAG)

14]

D8S321

joka muutti lukukehys +1 bp +9 bp (lueteltu ”muut” kuviossa 1A ja kuvio S1A). Lisäksi useampi kuin yksi AAAG toista poisto (esim. 4 tai 10 AAAG toista poistetaan) oli harvoin ( 8% koko, on lueteltu ”muut” kuviossa 1A). Tärkeää on, poisto /lisäys mutaatiot aina havaitaan mikrosatelliittimerkki sekvenssit taas ei mutaatiota tapahtunut reunustavat sekvenssit ympäröivän AAAG repeat (kuva S1). Nämä havainnot osoittavat, että olemme luoneet luotettavaa kokeellista valvontajärjestelmän esiintymisen EMAST CRC soluissa.

(A) Perimän DNA eristettiin EGFP-negatiivisten ja positiivisten solujen kuljettaa kokeellinen konstruktioita (D8-OF ja /tai D20-OF) käytettiin monistamaan DNA-fragmentteja, jotka sisältävät EMAST loci tutkia, jos lukukehysmutaatioita oli tapahtunut. (B) Mutaatiotaajuuden laskettiin jakamalla prosenttiosuus EGFP positiivisia väestöstä koeryhmässä (OF), jonka osuus EGFP positiivisten sen negatiivinen kontrolli (MR-OF) laskea korotuksen EGFP-positiivisten väestön taittuu. Oli huomattavasti enemmän EGFP-positiivisten solujen

hMLH1

– ja

hMSH3

vajausta soluja verrattuna MMR-taitavia ja /tai

hMSH6

vajausta soluja. *: P 0,05.

lukukehysmutaatioita at Tetranucleotide toistot on

D8S321

ja

D20S82

Loci ovat riippuvaisia ​​MMR Background

tutkia vaikutus MMR tausta lukukehysmutaatioita on tetranucleotide

D8S321

ja

D20S82

loci, laskimme mutaatio taajuudet markkereita vertaamalla kunkin koeryhmän (oF) sen negatiivisen kontrollin (MR -of) käyttäen seuraavaa kaavaa: ”(EGFP positiivisia soluja /yhteensä elävien solujen välillä OF) /(EGFP positiivisia soluja /yhteensä elävien solujen MR-OF)”.

hMLH1

– /-

soluja (täysin vailla DNA MMR aktiivisuuden) ja

hMSH3

– /- solut osoittivat 7-12 kertaa suurempi mutaatio taajuuksia verrattuna säätimet molemmat loci (kuvio 1 B). Erityisesti mutaation taajuudet havaittiin

hMSH3

– /- olivat verrattavissa

hMLH1

– /- sekä loci (kuvio 1 B). -4 Emäsparin mutaatio hinnat sekä lokusten kussakin MMR taustalla laskettiin myös (taulukko 1). Täysin MMR-puutos (

hMLH1

– /-

), mutaatio hinnat sekä lokuksille 27 ja 56 x 10

-4 mutaation /solu /sukupolven. Vastaavasti

hMSH3

– /-

soluja tuotetaan 33 ja 34 x 10

-4 mutaatiot /solu /sukupolven. Siten mutaationopeudet kanssa

hMSH3

-puutos ovat hyvin vastaavat kuin täydellinen MMR-puutos. Tämä on jyrkässä ristiriidassa

hMSH6

-puutos ( 1 x 10

-4 mutaation /solu /sukupolven), pääosin sama MMR-taitavia soluissa. Nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen,

hMSH3

-puutos on kuljettajan EMAST muodostumista.

Suora knockdovvn hMSH3 Expression MMR taitavia Cells Syyt EMAST

Vahvista roolin hMSH3 vuonna EMAST, me pudotti

hMSH3

ilmentymistä MMR-taitavia solujen kätkeminen

D8S321

-EGFP rakentaa transfektoimalla plasmideja

hMSH3

erityisiä shRNA ja /tai sekoitetun ohjaus, mitattiin sitten

D8S321

tetranucleotide lukukehysmutaatioita kuten edellä. Ennen shRNA transfektion, hMSH3 ekspressiotasot valittu MMR-taitavia kloonit olivat vertailukelpoisia keskenään (kuva S2). Generoinnin jälkeen shRNA stabiilien solulinjojen (yksisoluklooneista), hMSH3 ilmentyminen väheni merkittävästi

hMSH3

shRNA transfektoiduissa soluissa (kuvio 2, vaihdellen 26-34% proteiinista tasojen sekoituskoodin kontrollit).

hMSH3

shRNA transfektion onnistuneesti ja erityisesti vähentää hMSH3 ekspressiotasot CRC-solukloonien. Huomaa, että ekspressiotasot muita DNA-yhteensopimattomuuden korjauksen geenit säilyvät ennallaan.

käyttäminen shRNA stabiilisti transfektoituja soluja, jotka sisälsivät

D8S321

lokuksen, tutkimme solulinjoja esiintymisen EMAST virtaussytometrialla. EGFP-positiivisesta populaatiosta esiintyi soluissa, joissa

hMSH3

ilme joka pudotettiin.

hMSH3

KD-solut osoittivat 5-kertainen (klooni 1) ja 6-kertainen (klooni 2) kasvaa mutaatio taajuuksilla (kuvio 3A) verrattuna salattu shRNA kontrollisoluihin. Väheneminen hMSH3 ilmaisun huomattavasti lisääntynyt mutaationopeudet että

D8S321

rakentaa 12,7 ja 18,4 x 10

-4 mutaation /solu /sukupolven verrattuna 1 x 10

-4 mutaation /solu /sukupolven in ryntäily valvonta (taulukko 2). EGFP-negatiivisia ja positiivisia solut erotettiin pois DNA: n sekvensointia tutkia lukukehysmutaatioita. Sekä klooneja, on suurempi kuin 90% EGFP-negatiiviset solut säilyvät WT-sekvenssi [(AAAG)

12], kun taas noin 90% EGFP-positiivisissa soluissa paljasti poistetaan yksi toistaa AAAG (kuvio 3B). Laajennus mikrosatelliittimerkkien toistojen havaittiin myös (sisällytetään ”muut” kuvassa 3B). Kaiken havaintomme että suora KD

hMSH3

aiheuttaen

hMSH3

-puutos yksin pystyy tuottamaan EMAST aiemmissa MMR-taitavia CRC soluissa.

( A) SW480-solut (MMR taitavia) kuljettaa EMAST konstruktio (D8-OF tai D8-MR-OF) transfektoitiin

hMSH3

shRNA rakentaa (

hMSH3

KD) tai scramble ohjaus (ryntäily ) erikseen. Kaksi itsenäistä

hMSH3

ja ryntäily KD klooneja sekä vanhempien solut olivat mukana tutkimuksessa. EMAST mutaatio taajuudet laskettiin, kuten on kuvattu kuviossa 1B vanhempien, ryntäily, ja /tai

hMSH3

KD soluja. Oli huomattavasti enemmän EGFP-positiivisten solujen

hMSH3

KD soluja verrattuna vanhemman ja /tai scramble ohjaus soluja. *: P 0,001; **: P 0,05. (B) EGFP-negatiivisten ja positiivisten solujen

hMSH3

KD kantavien solujen D8-OF lajiteltiin genomista DNA eristys tutkia lukukehysmutaatioita sekvensoimalla.

Oksidatiivinen stressi aiheuttaa Subsellulaariset compartmental Shift hMSH3 tumasta sytosoliin

EMAST on havaittu tiukasti liittyy heterogeenisten menetys hMSH3 ilmentymisen sekä ydin- heterogeeninen ilmaisu (Haugen

et ai

., 2008; Lee

et al

., 210, Devaraj

et al

., 2010). Tutkimuksemme edellä lisäksi osoitettava, että vähentäminen hMSH3 ilmaisun yksinään voi aiheuttaa EMAST ihmisen CRC soluissa. Aloimme tutkia, miten hMSH3 voisi tulla puutteellinen EMAST-positiivisia kasvaimia havaitun vähennys kokonaan heterogeeninen ilme. CRC, EMAST liittyy tulehdussolujen [13], [14], [16], jotka voivat helpottaa oksidatiivista stressiä, joka on osoitettu heikentävän MMR-toiminto [23]. Käyttämällä H

2O

2 korvikkeena, tutkimme vaikutus (t) oksidatiivisen stressiä hMSH3 ilme. MMR-taitavia soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla H

2O

2 (50 uM -500 pM) enintään 24 tuntia. Emme havainneet mitään vähennyksiä yhteensä hMSH3 proteiinin tasot kaikissa olosuhteissa yritimme (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin kun käsittelemällä soluja 50 uM H

2O

2 4 tuntia, hMSH3 havaittiin homogeenisesti sekä tuman ja sytosolin on merkittävä osuus solujen (40-60%; toinen paneeli sarake kuviossa 4A). Silmiinpistävän, hMSH3 havaittiin täysin luovuttamaan tumien joissakin soluissa [10-20% kaikista soluista (kolmas paneeli sarake kuviossa 4A], jyrkässä ristiriidassa käsittelemättömistä soluista, joissa hMSH3 pääasiassa pysyi tumassa (vasemmanpuoleiset paneelit kuviossa 4A ). siirtyminen on hMSH3 lokalisointi voitiin havaita heti, kun 2 tunnin kohdalla hoidon, ja vaikutus oli huipussaan välillä 4 ja 8 tuntia sen jälkeen, kun H

2O

2-hoidon aloittamista (tuloksia ei ole esitetty). Toisin kuin hMSH3, hMLH1: n, hMSH2, ja hMSH6 eivät muuttaneet solusijaintipaikan ja pysyi ytimet (kuva 4B ja kuva S3A, S3B, ja S3C). solufraktioinnin erottaa ydin- ja solulimafraktiot Hyväksytty meidän immunosolukemialliset havainnot (kaistat 1-3 ja 5-7 kuvassa 4B).

(A) MMR-taitavia SW480-soluja pidettiin seerumin puutteessa 24 tunnin ajan ja käsiteltiin sitten 50 uM: H

2O

2: ssa 4 tuntia. kiinnityksen jälkeen solut värjättiin anti-hMSH3 vasta-aineella ja sen jälkeen Alexa 488 konjugoidun anti-hiiri-vasta-ainetta tarkkailla solunsisäisen sijainnin hMSH3. Testata, jos vaikutus oli palautuva, soluja viljeltiin vielä 24 tunnin kuluttua poistamisen H

2O

2. (B) SW480-soluja seerumin puutteessa 24 tunnin ajan ja sitten se käsiteltiin H

2O

2 4 tuntia (-FBS + H

2O

2). Vanhempien soluja (Lapsilukko) ja solut, jotka oli seerumin puutteessa ilman myöhempää H

2O

2 hoitoa (-FBS) käytettiin kontrolleina. Cellular proteiinit erotettiin ydin- ja solulimafraktiot käyttäen ydinvoiman fraktiointia kit. Yhtä suuri tilavuus proteiinien kussakin ryhmässä käytettiin SDS-PAGE ja sitä seuraava Western-blottaus tarkistaa tasoa hMSH3. Anti-histoni H3 käytettiin tumafraktios- lastaus-arvoa, ja tubuliinia käytettiin sytosolifraktion lastaus-arvoa.

Jotta voidaan tutkia, jos vaikutuksen H

2O

2 hMSH3 oli palautuva meidän korvattu H

2O

2, joka sisältää media tuoreella median 4 tunnin kuluttua hoidon. hMSH3 havaittiin olevan ydinaseiden 24 tuntia poiston jälkeen H

2O

2 (oikea paneeli kuviossa 4A ja kaistat 4 ja 8 kuviossa 4B). Tämä tulos saattaa osoittaa, että vaikutus H

2O

2 hMSH3 oli palautuva, jossa hMSH3 sallitaan palata tumaan kerran oksidatiivisen stressin laantunut. Vaihtoehtoisesti hMSH3 joka oli sytosoliin voivat olla vaurioituneet ja huonontuneen ja siten oli kykenemätön palaamisessa tumiin, ja saattavat osoittaa, että havaitut ydinvoiman hMSH3 oli vastikään synteeseillä. Voit selvittää, mikä skenaario voisi olla oikea, käsittelimme solut 20 ug /ml sykloheksamidin poistettaessa H

2O

2 pysähtyä proteiinisynteesiä 24 tuntia. hMSH3 todettiin tumassa (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että hMSH3, joka oli siirtynyt sytosoliin oli todellakin pystyy palaamaan tumaan.

Keskustelu

DNA MMR tutkimukset bakteereista ja hiivasta osoittavat hMutSβ, heterodimeeri hMSH2 ja hMSH3, sitoo ja ohjaa korjaus pistoasenteisen poisto silmukoita ± 2 nukleotidin [1], [5], [6]. Siten

hMSH3

-puutos olisi odotettavissa, jotta suuri sisäänviennin poistetaan loop lukukehysmutaatioita, joka on erittäin suositeltavaa, aiemmissa tutkimuksissa [13] – [16]. Määritetään seurauksena

hMSH3

-puutos ollut aikaisemmin ensiarvoisen tärkeää, koska ei ole koskaan kuvattu ituradan mutaatio

hMSH3

aiheuttaa Lynch oireyhtymä, eikä ollut mitään korrelaatiota satunnaista CRC kunnes kuvaus EMAST in CRC [13] – [16]. Nostolaite on EMAST Epäyhtenäisiin menetys hMSH3 ilmaisun satunnaisesti kulutustarviketta ehdotti, että tämä DNA MMR proteiini voisi ajaa EMAST. Tutkimuksessamme ryhdyimme testata tämän luomalla ihmisen solumallin mitata EMAST muodostumista kvantitatiivisella tavalla. Tutkimuksemme osoittaa, että (a) EMAST muodostuminen riippuu MMR taustalla, jossa

hMSH3

-puutos matching täydellinen MMR-puutos aiheuttaa EMAST, (b)

hMSH3

-puutos mutaatio hinnat EMAST muodostuminen on selvästi korkeampi verrattuna

hMSH6

-puutos (pääasiassa nolla ja EMAST muodostuminen), (c) pudotus on

hMSH3

yksin aloittaa muodostumista EMAST, ja (d) oksidatiivisen stressin voi olla yksi tekijöistä aiheuttavat puutos hMSH3, koska tämä MMR proteiini siirtää sen subsellulaarinen sijainti H

2O

2. Kaikkiaan Tutkimuksemme tarjoaa vahvan tuen käsitteeseen, että

hMSH3

-puutos ajaa EMAST muodostumista ja tarjoaa mahdollisen mekanismin, jotka saattavat edistää hMSH3-puutos ihmisen CRC.

Tetranucleotide kehyksenvaihtoja jotka määrittävät EMAST CRC kasvaimia voi tapahtua insertiolla tai deleetiolla tetranucleotide toistuu. Meidän kokeissa olemme suunnitelleet konstruktit havaitsemaan -4 bp: n poistuman, mutta kun DNA-sekvensointi joitakin lisäyksiä (laajennus) on mikrosatelliitteihin myös havaittu. Itse asiassa suurin osa lukukehysmutaatioita havaittu kokeissa johtui poistetaan yhden AAAG (kuvio 1A ja 3B). Valitsimme

D8S321

ja

D20S82

loci for kokeissa, koska poistetaan yksi AAAG yksikön oli osoitettu olevan kaikkein vallitsevan mutaatio joukossa loci käyttää havaitsemaan EMAST [14], [16 ]. Koska järjestelmä on suunniteltu havaitsemaan vain yhdenlaisia ​​mutaatio, meidän hinnat lasketaan todennäköisesti aliarvioimiselta mutability näiden lokusten

hMSH3

-puutos. Yksittäiset sekvenssikontekstissa ja viereiset sekvenssit voivat myös edistää eri lopputulokseen mutaation (esim. Lisäys vs. poistetaan) [11], [12], [24]. Tällä

D20S82

lokuksen, vain noin kolmasosa EGFP-positiivisten

hMSH3

– /-

soluja osoitti yhden AAAG yksikkö poistetaan, ja tämä voi johtua tämän nimenomaisen kloonin, joka sisältää useita kopioita konstruktin. Tämä on vastakohtana yli 70% EGFP-positiivisten solujen, joilla on samat konstruktin

hMLH1

– /-

esittää poistetaan yhden AAAG yksikön, joka osoittaa konstrukti käyttäytyi kuin on suunniteltu. Sillä

hMSH3

– /-

soluja, mutaatio yhdellä kopioiden johtaisi EGFP ilmaisua, kun taas loput pysyi WT, sekoittavat Sekvensointianalyysin. Tämä ei kuitenkaan ei vaikuta Mutaatiofrekvenssi ja mutaatio vauhtia kuin laskelma perustuu lukumäärän EGFP-positiivisia soluja.

Ei ole täysin selvä EMAST-positiivisten kasvainten miten

hMSH3

on vaimentua aloittaa EMAST. On selvää näyttöä, että EMAST-positiivisia kasvaimia liittyvät vahvasti tulehdussolujen etenkin sisällä epiteelin komponentit kasvain ja strooman ympäröivä kasvain (niin kutsuttu ”kasvain pesät”) [16]. Siten yksi hypoteesi on, että tulehdus laukaisee hankittu vähentäminen hMSH3, joka myöhemmin ajaa EMAST. Mielenkiintoista, H

2O

2 hoitoa (simuloi oksidatiivisen stressin) johtaa siirtymiseen hMSH3 sytosoliin pois sen toiminnallinen sivuston tumassa heikentämättä sen yleistä ekspressiotasoja. Lyhytaikaisia ​​H

2O

2 hoitoa, emme voineet osoittaa havaittavia määriä EMAST muodostumisen mallissamme (tuloksia ei ole esitetty). Pidempi ja johdonmukainen läsnä oksidatiivisen stressin voi olla tarpeen aloittaa EMAST, ottaen huomioon EMAST näyttää liittyvän krooniseen tulehdukseen ja kehittyneitä histologia kasvainten [14]. Vaihtoehtoisesti, muut tulehduksen ja /tai kasvaimen miljöön voi toimia synergistisesti oksidatiivisen stressin aiheuttamaan EMAST. EMAST näyttää olevan huono prognostinen tekijä potilailla, joilla on CRC [16], [18]. Tämä on toisin kuin klassinen MSI, johon potilaat CRC on parempi eloonjääminen samaan lavastettu kasvain potilaiden kanssa MSS kasvaimia [1]. On vielä määrittää, jos tämä on olennainen tyyppi MPR vika (

hMLH1

vs.

hMSH3

) tai jonkin muista tekijöistä, kuten aste tai tyyppiä tulehduksen kasvain.

Yhteenvetona osoitamme luomalla uusi solumallin että

hMSH3

-puutos ajaa EMAST. Tuloksemme voimakkaasti täydentää havainto heterogeeninen menetys hMSH3 ilmentymisen EMAST-positiivisia kasvaimia, ja viittaa siihen, että hankitut

hMSH3

-puutos vetämänä oksidatiivisen stressin, voi olla yleisin DNA MMR vika joukossa ihmisen CRC.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja reagenssit

ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa, HCT116 (

hMLH1

– /- hMSH3

– /-

), DLD-1 (

hMSH6

– /-

), HCT116 + CH 3 (

hMLH1-

palautuu, mutta

hMSH3

– /-

), ja SW480 (MMR-taitavia)-soluja viljeltiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [10]. HCT116, DLD-1, ja SW480 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia). HCT116 + CH3 solut ystävällisesti Dr. Minoru Koi, Baylor University Medical Center, Dallas, TX [10]. Anti-hMLH1, hMSH2, hMSH3, ja hMSH6 vasta-aineet hankittiin BD Pharmigen (San Diego, CA). Anti-tubuliinin vasta-aine oli yhtiöltä Sigma (St. Louis, MO). HRP-konjugoitua anti-hiiri-vasta-aine hankittiin Cell Signaling (Danvers, MA). Alexa 488 konjugoidun anti-hiiri-vasta-aine oli yhtiöltä Invitrogen (Grand Island, NY).

kloonaus pIREShyg2-

D8S321

-EGFP ja pIREShyg2-

D20S82

-EGFP Plasmidit

kahdesta ihmisen lokusten

D8S321

ja

D20S82,

on raportoitu olevan korkeimman mutaation taajuus EMAST paksusuolen kasvaimissa [13] – [16], ja ne on valittu rakentaa plasmideja.

D8S321

ja

D20S82

sekvenssit sisältävät 12 ja /tai 16 toistoa AAAG, vastaavasti. Sense ja anti-sense sisältävien oligojen

D8S321

tai

D20S82

, ympäröivän sekvenssit sekä

Pme

I ja

Asc

I kloonauspaikkoja (taulukko S1) syntetisoitiin (Integrated DNA Technologies, Inc., San Diego, CA) ja suoritettiin T4-polynukleotidikinaasia reaktioita fosforyloida 5-päät (Invitrogen). Sense- ja anti-sense-oligoja annettiin pariutua ja kloonattiin pIREShyg2-EGFP plasmidit kautta

Pme

I

Asc

I -kohdat heti aloituskodonin EGFP-geenin, kuten on kuvattu aiemmin [ ,,,0],10] – [12], [24]. Kokeellinen plasmidit rakennettiin +1 emäsparia ulos runko, niin että yksi deleetio tetranucleotide toista sisällä

D8S321

tai

D20S82

(-4 ep lukukehyksen) siirtäisi lukukehyksen oikeaan kehys mahdollistaa EGFP ilme. Mutaatio kestävä plasmidit [MR-out-of-frame (OF)] rakennettiin käyttämällä sense ja anti-sense oligoja jossa kaksi nukleotidia joka kolmas mallikerran AAAG muutettiin estämiseksi lukukehysmutaatioita. Mutaatio kestävä kehyksessä (MR-D8-IF) plasmidilla, positiivisena kontrollina EGFP ilmaisun rakennettiin poistamalla 1 ep

D8S321

sekvenssin MR-D8-plasmidien avulla QuikChange II site-directed mutageneesi (Stratagene, La Jolla, CA).

hMSH3

shRNA Hakemisto Rakentaminen

hMSH3

shRNA rakentaa ja sen pariksi tyhjän vektorin oli ystävällisesti toimittanut Dr. Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Dallas, TX. GFP-sekvenssi tätä konstruktia poistettiin digestoimalla konstrukti

Apa

I ja

Pac

I, täyttö-käyttäen Klenow-fragmenttia, jolloin muodostuu tasaiset päät, ja sen jälkeen suorittamalla tylpän pään ligaatiota. Jotta salattu ohjaus, GFP-sekvenssin tyhjän vektorin ensimmäisen poistettiin edellä kuvatulla tavalla ja sekoitetun sekvenssin, poistettiin kaupallisesti saatavilla konstruktio (GeneCopoeia, Rockville, MD), oli pujotettu vektorin kautta

EcoR

I ja

Xho

I sivustoja. Olemassaolo ja tarkkuutta ryntäily ja /tai

hMSH3

shRNA sekvenssit plasmidit varmistettiin DNA-sekvensoinnilla.

transfektio ja Generation Stabiilin solulinjojen

Soluja transfektoitiin eri pIREShyg2-

D8S321

-EGFP ja pIREShyg2-

D20S82

-EGFP plasmidit (kuvattu taulukossa S1) käyttämällä Nucleofector sarjat (Amaxa, Köln, Saksa). Vakaa solulinjat perustettiin hygromysiini B (Invitrogen) valinta. Kukin solulinja alistettiin yhden solun lajittelua käyttämällä FACS ARIA (Becton Dickinson, San Jose, CA) perustaa yksittäisiä klooneja. Kaikki yhden solun klooneja tutkittiin DNA-sekvensoinnilla varmistaa olemassaolon ja tarkkuuden EMAST konstruktin he kantoivat.

hMSH3

taintumisen (KD) solut, MMR-taitavia soluja (SW480) kuljettavat D8-OF ja /tai D8-MR-OF rakenteet transfektoitiin plasmideilla kätkeminen ryntäily tai

hMSH3

erityisiä shRNA käyttäen Fugene 6 (Roche, Mannheim, Saksa), jonka jälkeen puromysiini (Invitrogen) valinta vakaan linjat. Kaksi itsenäistä kloonia kustakin ryhmästä käytettiin tutkimuksissa.

Mutaatioanalyysi Flow Cytometry

neljä tuhatta ei-fluoresoiva vakaa-transfektoidut solut lajitellaan päällekkäin hyvin 6-kuoppaisille levyille