Krooninen sairaus

tiivistelmä

Wnt7a tiedetään olevan tuumorisuppressorina joka katoaa NSCLC, mutta mitään mekanismia menetyksestä on perustettu. Metylointi promoottorialueille on perustettu yhteinen mekanismi menetyksen tuumorisuppressorin ilmentymistä NSCLC. Olemme aiemmin osoittaneet, että menetys Wnt7a ei-transformoitu keuhkon epiteelisolujen linjojen lisännyt solujen kasvuun, muuttunut 3-D viljelmän kasvun, ja lisääntynyt maahanmuutto.

Wnt7a

promoottori on suurempi osuus metylaation NSCLC kasvainkudoksessa verrattuna vastaaviin normaaleihin keuhkokudoksessa ja metylaation promoottorialueen johtaa aktiivisuuden vähenemistä. Me käsitellään H157 ja H1299 NSCLC solulinjoja 5-atsa-2′-deoksisytidiini ja havaita menetys

Wnt7a

promoottori metylaatio, lisääntynyt Wnt7a ilmaisua, ja lisääntynyt aktiivisuus Wnt7a keuhkojen signalointireitin. Kun DNMT1 ilmentyminen tippuu alas shRNA, ilmaus Wnt7a lisääntynyt ja metylointi vähentynyt. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että NSCLC, Wnt7a menetetään metylaation osajoukko kasvaimia ja että tämä metylaatio on ylläpitää DNMT1. Palauttaminen Wnt7a ilmaisun demetylaatio voisi olla tärkeä terapeuttinen lähestymistapa hoitoon NSCLC.

Citation: Tennis MA, VanScoyk MM, Wilson LA, Kelley N, Winn RA (2012) metylointi

Wnt7a

moduloi DNMT1 ja Cigarette Smoke lauhde in ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 7 (3): e32921. doi: 10,1371 /journal.pone.0032921

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 elokuu 2011; Hyväksytty: 06 helmikuu 2012; Julkaistu 5 maaliskuuta 2012

Copyright: © 2012 Tennis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoitti NIH R21 palkinto (CA153268-01). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on edelleen johtava syy syövän kuoleman, minimaalisella vaihtoehtoja kasvainten hoitoon diagnosoidaan tyypillisesti myöhäisvaiheissa. Olemme kiinnostuneita rooli kaanoniin Wnt signalointi kuin pieni keuhkosyöpä (NSCLC), nimenomaan kasvain tukahduttava toimintaa Wnt7a ja sen reseptori Frizzled 9 (Fzd9). Wnt7a on erittäin ilmaistaan ​​alkion keuhkojen ja on mahdollista säilyttää normaalin epiteelin fenotyypin aikuisten keuhkojen [1], [2]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että Wnt7a usein menetetään NSCLC ja että palauttaminen Wnt7a ilmaisun johtaa väheni muuttaneet kasvuun NSCLC solulinjoissa [2]. NSCLC solujen reexpression of Wnt7a ovat vähentyneet leviämisen laski ankkurointi riippumatonta kasvua, ja palauttaminen epiteelin fenotyypin [2]. Wnt7a sijaitsee kromosomissa 3p25, mikä on ”hotspot” poistettaviksi olemme kuitenkin epäillään, että Wnt7a ilmentymistä NSCLC voidaan säädellä epigeneettisestä mekanismilla [3].

metylointi tuumorisuppressorigeenin promoottorien NSCLC on raportoitu yli 40 geenejä, jotkut taajuuksilla jopa 100% [4]. Ilmaisun puuttumista geenejä, kuten p16 /INK4a metylaation aikaisin kehittämisessä NSCLC on ehdotettu biomarkkerina varhaisen havaitsemisen [5]. Metylointi geenien kuten FHIT ovat korreloineet tuumorin luokitus ja ennusteeseen NSCLC [6]. Erot metylaatio liittyy kasvainhistologiaa on tunnistettu geenejä, kuten RASSF1A ja p16 /INK4a [7], [8]. Associations välillä tupakansavu ja poikkeava metylaatio on havaittu p16, RASSF1A, ja RARβ2 mm [9], [10], [11]. Välinen yhteys altistuminen tupakansavulle karsinogeenien ja metylaatio saattaa olla olemassa DNA metyylitransferaaseja (DNMT), jotka aktivoituvat nämä karsinogeeneja. Jos tavoitteet DNMTs vastaa DNA: n korjaukseen tullut sopimattomasti inaktivoidaan metylaation, vauriot johtuvat karsinogeeneja voi jatkua, mikä johtaa kasvaimien syntyyn [12].

Koska useimmat Wnt ja Wnt-sukuinen proteiini opintoja syövän liittyvät kanoninen signalointi tunnistaminen Wnt-spesifisten metylaatio ei ole yleinen. Metylaatio tiedetään olevan mekanismi tappion muiden tuumorisuppressorien NSCLC, mutta useimmat tutkimukset Wnt metylaation keuhkoissa kohde Wnt antagonisteja kanoninen Wnt signalointireitille. Muutama tutkimuksissa on todettu hypermetylaatiota Wnt5a ja Wnt9a epiteelin syövät ja hypermetylaatiota Wnt7a on havaittu osajoukko tiehyen haimasyövän [13], [14], [15], [16]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että menetys Wnt7a on merkittävä tapahtuma keuhkojen epiteelisolujen ja että tämä menetys johtuu metylaation kautta DNMT1 toiminnan osajoukko NSCLC.

Tulokset

menetys Wnt7a ilmentyminen keuhkoissa soluissa johtaa transformoidun fenotyypin

Olemme aiemmin osoittaneet, että Wnt7a ilmaisu muuttaa muuttaneet ominaisuudet NSCLC soluja. NSCLC solut uudelleen Wnt7a ovat vähentyneet leviämisen laski ankkurointi riippumatonta kasvua, ja palauttaminen epiteelin fenotyypin. Käänteinen menetys Wnt7a ei-transformoitu epiteelisolujen, voidaan olettaa johtavan lisääntymiseen ominaisuudet transformoitujen solujen. Tässä tutkimuksessa käytimme shRNA lähestymistapa kaataa mRNA ilmentymistä Wnt7a kahden ei-transformoitu keuhkon epiteelisolujen linjat, HBEC ja Beas2B (B2B), ja vahvisti kaataa mukaan QPCR ja western blot (kuvio. 1A). Vähentynyt Wnt7a ilmentyminen lisäsi solujen proliferaatiota B2B-soluissa, osoittaa 6 päivän solukasvumäärityksessä (Fig. 1 B). HBEC soluproliferaatiota lisääntyi myös menetyksen Wnt7a mitattuna MTS-määrityksellä (tuloksia ei ole esitetty). B2B soluissa muuttunut kasvu Matrigel 3D kulttuurin havaittiin 5 päivää menetys Wnt7a ilmaisun (Fig. 1 C). Lisääntynyt soluvaelluksen naarmu määrityksessä 24 tunnin havaittiin menetys Wnt7a ilmaisua, jossa nuolet osoitti reunat käyttöön tyhjästä (Fig. 1 C).

A) ilmentyminen Wnt7a mitattiin QPCR vuonna HBEC ja B2B solut jälkeen vakaa transfektio Wnt7a shRNA tai negatiivinen shRNA. Aineisto esitetään fold-muutos Wnt7a ilmaisun normalisoitu GAPDH. Virhe palkit ovat SE kolminkertaisten kokeiluja. Wnt7a kaataa vahvistettiin myös Western blot kanssa β-aktiini latauskontrollina. B) Solujen lisääntyminen mitattiin 2-B-soluja, jotka ilmentävät Wnt7a shRNA tai negatiivinen shRNA. Solut analysoitiin 6 päivän kasvun määrityksessä. C) 2-B-soluja, joilla on Wnt7a shRNA analysoitiin 3D dosviljelmämäärityksessä käyttäen matrigeeliä ja jälkeen havaittiin 5 päivää kasvun muutokset morfologiassa verrattuna negatiiviseen shRNA valvontaa. B2B solut Wnt7a shRNA analysoitiin myös tyhjästä migraatiokokeessa ja havaittiin 24 tuntia kulkeutumista käyttöön naarmu verrattuna negatiiviseen shRNA kontrolli. Nuolet osoittavat reunat tyhjästä. Kuvat ovat rinnakkaisessa kokeessa.

Wnt7a metyloidaan ihmisen NSCLC solulinjoissa ja kudoksissa

Kysymys siitä, miten Wnt7a ilmaisun katoaa voitaisiin käsitellä monella tavalla.

Wnt7a

voitaisiin poistaa, mutatoitunut tai metyloidut, joukossa muita mekanismeja. Vaikka kromosomi sisältää

Wnt7a

(3p25) on usein poistetaan NSCLC, tämä mekanismi menetyksen ohella geenimutaatio, tarjoaa tällä hetkellä juurikaan terapeuttisen intervention [17]. Läsnäolo epigeneettiset mekanismi metylaation tarjoaisi mahdollisuuden käyttää nykyisten kliinisten interventioiden hoitoon NSCLC. Käsittelimme HBEC ja B2B solujen tupakan karsinogeeni NNK, jonka tiedetään johtavan kertymistä DNMT1 ja lisääntynyt tuumorisuppressoriproteiinia hypermetylaation NSCLC [18]. Käsitellyissä soluissa havaitsimme väheneminen Wnt7a mRNA-ilmentymisen QPCR käsittelemättömiin soluihin verrattuna (kuvio. 2A). Metylointi analyysi osoitti, että Wnt7a promoottorin B2B ja HBEC solut on kasvanut metylaatio altistumisen jälkeen 10 uM NNK (kuvio 2A). Tämä viittasi siihen, että

Wnt7a

on metyloitu altistuminen tupakansavulle ja se voi olla mekanismi tappiota tupakkaan liittyvän NSCLC. Sen määrittämiseksi, onko metylaatio

Wnt7a

oli läsnä ihmisen keuhkojen kasvainkudoksessa, mittasimme metylaation CpG-saari-promoottorin 82 paria ihmisen keuhkojen kasvainkudoksen ja vastaaviin normaaleihin keuhkokudoksessa. Tarkoittaa prosenttia metylaatio 13 CpG sivustoja mitattu määrä oli merkitsevästi suurempi kasvainkudoksessa verrattuna normaaliin kudokseen, kun analysoitiin parillista t-testiä (Fig. 2B). Taulukko S1 esittää prosenttia metylaatio kussakin CpG analysoidaan ja verrataan kasvaimen ja normaaleissa kudoksissa. Mikään yksittäinen CpG analysoitu voidaan tunnistaa kriittisiä inaktivointi

Wnt7a

promoottori kuitenkin näyttää olevan suuntaus kohti kasvoi metylaation kasvaimia CpG sivustoja lähempänä transkription aloituskohdasta. Kaksi solu- NSCLC solulinjoissa, H157 ja H1299, tunnistettiin kätkeminen

Wnt7a

promoottori metylaation pyrosekvensointi ja käytettiin myöhemmin in vitro kokeissa (Fig. 2B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että menetys Wnt7a ilmentymisen metylaatio tapahtuu osajoukko NSCLC.

A) 2-B ja HBEC soluja käsiteltiin 10 uM NNK: ssa 2 tuntia ja Wnt7a ilmentyminen mitattiin QPCR verrattuna käsittelemättömään kontrolliin . Virhe palkit ovat SEM kolminkertaisten kokeiluja. Prosenttia metylaatio B2B ja HBEC solut analysoitiin käyttämällä metyyli Profiler järjestelmää, kun 2 tunnin 10 uM NNK hoitoon verrattuna käsittelemättömiin soluihin. B) keskimääräinen prosenttia metylaatio Wnt7a promoottorin mitattiin pyrosekvensointi NSCLC kudosten ja verrattuna vastaaviin normaaleihin viereiseen keuhkokudoksesta parillista t-testiä. Mean prosenttia metyloinnin B2B, H157, ja H1299 solulinjat mitattiin pyrosekvensointi. C) Wnt7a promoottori lusiferaasia muutettiin SSSI, Hpall, ja Hhal metyloinnin entsyymien ja transfektoitiin väliaikaisesti B2B ja HBEC solulinjoissa. Fold-muutos lusiferaasiaktiivisuus mitattiin verrattuna modifioimattomaan Wnt7a promoottorin lusiferaasiaktiivisuus. Virhe palkit ovat SE kolminkertaisten kokeita.

Euroopan Wnt7a promoottori deaktivoida metylaatio palautettu 5-atsa-2 ’deoksisytidiinin hoito

Koska metyloinnin

Wnt7a

ei ole aikaisemmin tutkittu, halusimme varmistaa, että metylaatio promoottorialueen johtaisi inaktivointi promoottorin.

Wnt7a

promoottorilusiferaasivektorissa käsiteltiin SSSI, Hpall, ja Hhal metylaasit vaikutuksen määrittämiseksi metylaation on

Wnt7a

promoottorialueen. SSSI vaikuttaa kaikkiin CpG sivustoja, Hpall vain CpG 5 ”CCGG ja Hhal vain CpG sisällä 5’GCGC. Transfektio

Wnt7a

promoottorilusiferaasivektorissa osaksi B2B ja HBEC solulinjat osoittivat, laski lusiferaasiaktiivisuutta käsittelyn jälkeen kaikilla kolmella metylaasit verrattuna käsittelemättömään

Wnt7a

promoottorin lusiferaasi, joka osoittaa, että jopa rajoitettu metylaatio inaktivoi

Wnt7a

promoottorin (Fig. 2C). Meillä oli määritellyt kaksi NSCLC solulinjoja metylaatio

Wnt7a

promoottorialue, H157 ja H1299, ja halusi määrittää vaikutus hoidon demetyloivan agentti, 5-atsa-2 ’deoksisytidiini (5 atsa). Soluja käsiteltiin 6 uM 5 Aza 1-4 tuntia ja ilmentymistä Wnt7a mitattiin QPCR ja western blot. Altistusta 5 Aza lisäsi ekspressiota Wnt7a mRNA: ta ja proteiinia (Fig. 3A ja B). Kuten odotettua, 5 Aza myös vähensivät metylaatio

Wnt7a

promoottorialue (Fig. 3d). Wnt7a tiedetään signaalin kautta reseptorin Fzd9 alavirran kohde PPARy, joten käsitellään H157 ja H1299-solujen kanssa 5 Aza sekä ohimenevä transfektion Fzd9, ja analysoitiin aktiivisuus Wnt7a signalointireitin [19]. PPAR-vaste-elementti lusiferaasi (pPre), joka aktivoituu PAPRγ, osoitti lisääntynyttä aktiivisuutta sen jälkeen, kun solut denaturoidulla

Wnt7a

altistettiin 5 Aza ja ilmentäminen Fzd9 (Fig. 3C). Nämä tiedot osoittavat, että farmaseuttinen hoito NSCLC-soluja voidaan kääntää metyloidut tila

Wnt7a

promoottori.

A) 157 ja 1299-soluja käsiteltiin 5 Aza 2 tuntia ja Wnt7a mitattiin QPCR verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. Virhe palkit ovat SEM kolminkertaisten kokeiluja. B) 157 ja 1299-soluja käsiteltiin 5 Aza 1, 2 ja 4 tuntia, ja käsittelemättömiin soluihin verrattuna. Wnt7a proteiinin ilmentyminen mitattiin immunoblottauksella β-aktiini latauskontrollina. C) 157 ja 1299-soluja transfektoitiin ohimenevästi Fzd9 ja pPre lusiferaasi ja 48 tuntia sen jälkeen, kun oli käsitelty 5 Aza 2 tuntia. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin ja käsiteltyjä soluja verrattiin tyhjä kontrolli. Virhe palkit ovat SE kolminkertaisten kokeiluja. D) 1299-soluja käsiteltiin 5 Aza 2 tuntia ja prosenttia metylaatio Wnt7a promoottorin mitattiin metyyli-Profiler-järjestelmä. Käsiteltyjä soluja verrattuna käsittelemättömään kontrolliin. Virhepalkin on SE kolminkertaisten kokeita.

Wnt7a promoottori metylaatio moduloidaan DNMT1

DNA metyylitransferaaseja (DNMT) moduloida DNA metylaatio ja niiden yli-ilmentyminen on yhdistetty keuhkosyöpään [4 ]. DNMT1 tiedetään kertyvän tumaan NSCLC-solujen vastauksena altistuminen tupakansavulle karsinogeeni NNK; Olemme havainneet, että altistuminen NNK vähentynyt ilmentyminen Wnt7a mRNA mitattuna QPCR (Fig. 2A) [18]. Kun me pudotti ilmentymistä DNMT1 vuonna Wnt7A metyloituja solulinjoissa H157 ja H1299 käyttäen shRNA, ilmaus DNMT1 vähentynyt ja ilmaus Wnt7a vastaavasti kasvoi QPCR (Fig. 4A). Vähentynyt DNMT1 proteiinin ekspressio ja lisääntynyt Wnt7a ekspressiota havaittiin myös H1299-soluissa (kuvio. 4A). Kuten odotettua, metylaatio Wnt7a että DNMT1 kaataa H1299 solut vähenivät mitattuna pyrosekvensointi (Fig. 4B). Samanlainen tutkimus Kassis et al. että löytyi vähentynyt proliferaatio kanssa RNAi ehtyminen DNMT1 havaitsimme lasku kyky muodostaa klooneja in H1299 solujen kaataa of DNMT1 verrattuna tyhjä ja negatiivisten shRNA transfektioiden (Fig. 4C). Havaitsimme myös paluuta kyky muodostaa klooneja tyhjän transfektion lisäämällä Wnt7a shRNA on DNMT1 shRNA käsiteltyjen solujen. Tämä vähentynyt kyky muodostaa klooneja havaittu DNMT1 shRNA käsittely jäljittelee vähenee leviämisen havaittu palauttaminen Wnt7a ilmaisun aiemmissa tutkimuksissa [2]. Tämä yhdistettynä lisääntyneeseen kyky muodostaa klooneja havaittu lisäämällä Wnt7a shRNA, viittaa siihen, että menetys Wnt7a ilmaisun voisi olla osittain vastuussa kielteiset vaikutukset liittyvät DNMT1 yliekspressio NSCLC [20]. Knock alas DNMT3a tai 3b H1299 solut eivät johda lisääntynyt Wnt7a ilmaisua, viittaa siihen, että DNMT1 vastaa

de novo

ja ylläpito metylaation

Wnt7a

promoottori (Kuva S1).

A) 1299-soluja transfektoitiin ohimenevästi DNMT1 shRNA ja verrataan tyhjä ja shRNA negatiivisen kontrollin-transfektoiduissa soluissa. DNMT1 ja Wnt7a mRNA ilmentyminen mitattiin QPCR ja esitetään kertamuutosta verrattuna tyhjän valvontaa. Virhe palkit ovat SE kolminkertaisten kokeiluja. DNMT1 shRNA ja shRNA negatiivisen kontrollin transfektoitiin stabiilisti osaksi 1299 soluihin ja DNMT1 ja Wnt7a proteiini mitattiin immnoblot kanssa β-aktiini latauskontrollina. B) transfektoitiin ohimenevästi 1299-soluja analysoitiin Wnt7a promoottorin metylaation käyttäen pyrosekvensointi. DNMT1 shRNA ja negatiivinen shrNA kontrolli transfektoituja soluja verrattuna tyhjiin soluihin. Virhe palkit ovat SE kolminkertaisten kokeiluja. C) 1299 solua ohimeneviä DNMT1 shRNA ja /tai Wnt7a shRNA ilmaisun verrattiin tyhjän ja negatiiviset shRNA kontrolli on kyky muodostaa klooneja määrityksessä. Solut värjättiin sen jälkeen 4 päivää kasvun, kuvattuna, ja laskettiin kloonaamiseksi tehokkuutta. Virhe palkit ovat SE päällekkäisiä kokeita.

Cigarette savukondensaatiksi altistuminen aiheuttaa Wnt7a promoottorin metylaation

metylointi on osoitettu korotettava altistuminen tupakansavulle karsinogeeneja, joten olimme kiinnostuneita vaikutuksessa tupakansavun lauhde (CSC) on metylaatio

Wnt7a

promoottori [20]. Olemme kasvoi ei-transformoitujen solulinjojen HBEC ja B2B 1% CSC median 12 viikkoa ja sitten uutettiin RNA, DNA: ta ja proteiinia. QPCR analyysissä havaittiin vähentynyt ilmentyminen Wnt7a molemmissa solulinjoissa jälkeen 12 viikkoa altistuksen CSC (Fig. 5A). Lisääntynyt DNMT1 proteiinin ilmentyminen vahvistettiin B2B solujen CSC altistuksen (Fig. 5B). Kuten odotettua, lisääntynyt metylaatio

Wnt7a

promoottorialue tunnistettiin myös molemmissa solulinjoissa (kuvio. 5C). Altistuminen keuhkojen epiteelin syöpää tupakansavun liittyy lisääntynyt metyloinnin ja sitä seuraavan vähentynyt ilmentyminen Wnt7a.

A) HBEC ja B2B-soluja käsiteltiin 1% CSC solukasvun median 12 viikkoa ja Wnt7a ilmentyminen mitattiin QPCR. Virhe palkit ovat SE kolminkertaisten kokeiluja. B) ilmentäminen DNMT1 mitattiin western blot B2B soluissa, joita käsiteltiin 1% CSC 12 viikkoa. Kuormituksen valvonta on β-aktiini. C) HBEC ja B2B-soluja käsiteltiin 1% CSC 12 viikkoa analysoitiin Wnt7a promoottorin metylaation verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin käyttämällä metyyli-Profiler-järjestelmä. Virhe palkit ovat SE kolminkertaisten kokeita.

Keskustelu

Tutkimuksen tuloksien tukea rooli Wnt7a tuumorisuppressorina keuhkojen epiteelisoluissa ja korostavat Wnt7a vuonna ylläpitää epiteelin fenotyyppi aikuisten keuhkokudoksessa. Wnt7a näyttää olevan ainutlaatuinen kirjallisuudessa tähän mennessä, koska mitään muuta Wnt on todettu NSCLC tuumorisuppressorina tai merkitystä ylläpitämistä keuhkoepiteelisolujen fenotyyppi. Wnt5a tiedetään antagonisoida β-kateniinin signaloinnin ruokatorven syöpään, mutta NSCLC ilmaus Wnt5a näyttää lisäävän leviämisen [13], [21], [22]. Huomattavasti haitallinen vaikutus menetys Wnt7a keuhkon epiteelisolujen motivoituneita meidän määrittämisen mekanismin menetyksen. Merkittävää on myös mahdollisuuksia puuttua hoitostrategioita työllistää reexpression of Wnt7a.

Usein menetys Wnt7a in NSCLC on kuvattu aikaisemmin ja nykyisessä tutkimuksessa, esitimme tukevat tiedot merkitys ilmaus Wnt7a keuhkoon epiteelin [2]. Kun Wnt7a ilmentyminen häviää kuin transformoitu keuhkon epiteelisolujen linjat, soluja hankkia ominaisuudet transformoitujen solujen ja alkaa muistuttamaan enemmän NSCLC solulinjojen proliferaation nopeuden, 3D viljelmän kasvun, ja muuttoliike. Jos tämä menetys Wnt7a tapahtuisi ihmispotilaalle yhdessä lisääntynyt aktiivisuus onkogeenien, vaikutukset voivat johtaa kehitystä keuhkojen kasvain, joka on tehty EMT, joka liittyy huonompi ennuste [23].

DNMT1 on ajateltu olevan vastuussa siitä, että metylaation ja sen kohonnut ilmentyminen on tunnistettu ennustetekijä NSCLC etenemistä [24]. Olemme havainneet, että kun DNMT1 ilmentyminen vähenee, Wnt7a metylaatio vähenee ja ilmentyminen lisää. Olemme myös osoittaneet, että Wnt7a on vastuussa osa laski solun kasvua havaittu DNMT1 menetys. Tyypillisesti ylimääräinen DNMT osallistuu tiettyjä de novo-geenin promoottori metylaatio, vaikka DNMT1 ylläpitää tätä metylaatio. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet, että DNMT1 myös

de novo

metyylitransferaasin aktiivisuus CpG alueilla [12]. Meidän todetaan, että menetys DNMT3a tai 3b ilmaisua ei johda lisääntyneeseen Wnt7a ilmentymistä H1299-soluissa viittaa siihen, että DNMT1 voi olla ainoa DNMT vastaavan promoottorin metylaation Wnt7a. Jos näin on, tämä voi tehdä terapeuttista demetylaation

Wnt7a

vähentämällä DNMT toiminnan vähemmän monimutkaisia ​​kuin vain yksi DNMT olisi kohdennettu ja seurataan.

Altistuminen tupakansavulle karsinogeenien in vitro ja in vivo on liitetty muutoksiin DNMT aktiivisuuden ja epigeneettiset muutokset [11], [18], [25], [26]. Tutkimuksessamme hoitoon ei-transformoitujen keuhkojen epiteelisolujen CSC lisäsi metylaatiolla Wnt7a ja vastaavan vähennyksen ilmaisua. Aiemmassa tutkimuksessa on Liu et al. löydetty laski Wnt7a ilmaisun array jälkeen CSC altistus [11]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet lisääntynyttä DNMT1 proteiinin ilmentymisen tai keskittymisen ja lisääntynyt metylaatio spesifisten geenien jälkeen altistuminen tupakansavulle karsinogeeneille [18], [25], [26]. Menetys Wnt7a ilmaisun on todettu yleinen tapahtuma NSCLC, mutta tämä tutkimus on ensimmäinen, joka ehdottaa mekanismia menetyksen ja osoittaa, että tupakan syöpää aiheuttaville aineille saattavat vaikuttaa tämän menetyksen [2].

Wnt7a on merkittävä säilymistä normaalin epiteelin fenotyyppi keuhkokudoksessa. Sinänsä menetys Wnt7a voisi olla suuri vaikutus kehitykseen keuhkosyövän, varsinkin yhdistettynä säätelyä vaikutusvaltainen onkogeeni. Tässä tutkimuksessa tarkastellaan tärkeän kysymyksen siitä, miten Wnt7a ilmaisun menetetään ja miten sen ilmentymistä voidaan palauttaa vaivaa hoitoon keuhkosyöpään. Palauttaminen Wnt7a ilmentyminen voi myös olla potentiaalisia käyttömahdollisuuksia muissa epiteelisyövissä tai keuhkosairauksia. Terapeuttinen palauttaminen Wnt7a signaloinnin NSCLC voitaisiin saavuttaa aineilla, jotka ovat jo kliinisessä käytössä, kuten demetyloimalla aineet ja prostasykliinin analogi Iloprost, jota äskettäin tunnistettu aktivaattori on Wnt7a signalointireitin [27]. Lisäksi työ tehdään perustaa ajoituksen Wnt7a menetys ja mahdolliset in vivo hoidon vaikutuksia varten

Wnt7a

metylaatio. Tiedot tästä tutkimuksesta aiheutuu merkittävä ja aikaisemmin aiemmin kuvaamaton askel kohti kehittäminen terapeuttisen Wnt7a strategioiden NSCLC.

Methods

Cell Culture, Human Tissue, ja reagenssit

NSCLC ja Beas2B solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa. HBEC (ihmisen keuhkoputken epiteelisolut) solulinjaa viljeltiin keuhkoputken epiteelisolujen Basal Media 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa. Solulinjat saatiin ATCC (www.atcc.org), paitsi HBEC solulinja, joka saatiin vuonna 2009 Dr. Robert Doebele yliopistossa Colorado Denver [28]. Morfologia kaikkien solujen linjat tarkkailtiin kahdesti viikossa ja varastojen solulinjoja siirrostettiin enintään kymmenen kertaa käytettäväksi kokeissa. RNA ja DNA 82 paria ihmisen keuhkokudoksen ja viereisen normaalin keuhkokudoksen saatiin Coloradon yliopiston Cancer Center SPORE Lung Cancer Pathology Core. NNK (Sigma) käytettiin 10 uM: ssa 2 tunnin ajan solujen elatusaineeseen. Soluja käsiteltiin 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5 atsa) (Sigma), 6 uM solujen elatusaineeseen 1-4 tuntia riippuen määrityksessä. Tupakansavu lauhde (CSC) (Murty Pharmaceuticals) levitettiin tasaisella 1%: n pitoisuus solussa kasvualustojen varten 12 viikon ajan.

Knockdown tutkimuksia, leviämisen, 3D kulttuuri, ja tyhjästä määritys

Wnt7a ilmentyminen pudotettiin vakaasti HBEC ja B2B solulinjoissa käyttämällä lentiviraalinen shRNA järjestelmä Open Biosystems kanssa puromysiiniselektion. Dnmt ilmentyminen pudotettiin käyttäen Sure-hiljentäminen shRNA päässä SABiosciences hygromysiinillä stabiilin valinnan ilmaisun. Ohimenevä kolhi alas Wnt7a saavutettiin retrovirus- shRNA järjestelmän Open Biosystems. Leviämisen analyysi suoritettiin B2B-soluissa käyttäen 6 päivän solujen määrä, joissa on yhtä monta solua maljataan kuusi kuoppaa ja yksi hyvin lasketaan päivittäin. Vuonna HBEC soluissa, Cell Titer vesiliuosta määritystä (Promega) käytettiin ja solut analysoitiin 24 tunnin välein 72 tunnin ajan. 1299-soluja, kyky muodostaa klooneja määritystä käytettiin, jossa 1000 solua maljattiin normaali kasvu median ja värjättiin kristallivioletilla klooni kasvu päivänä 4. Pesäkkeet kuvattiin ja laskettiin kloonaamiseksi tehokkuutta. Kloonaus tehokkuus on pesäkkeiden lukumäärä jaettuna solujen päällystetty. Kolmiulotteinen tyvikalvon perustettiin viljelmät kuten aikaisemmin on kuvattu [29]. Lyhyesti, 5000 solua /kuoppa kasvatettiin 2% Matrigel (BD Bioscience), jossa EGF on 50% Matrigel pohjakerros. Sillä naarmu määritystä soluja kasvatettiin täydellisessä kasvualustassa kunnes 90-100% konfluentteja. 3 mm: n tila otettiin halkaisijan poikki kunkin levyn. Hetkellä nolla solut käsiteltiin 1 ug /ml mitomysiini inhiboida soluproliferaatiota. Solumigraation kirjattiin 24 tuntia. Kuvat otettiin käyttäen 40 × linssi valomikroskoopilla ja digitaalikamera.

Transfektio

reportteriplasmidilla PPAR Response Element lusiferaasi (pPre) (3 ug), Fzd9 plasmidi, ja Wnt7a -luciferase transfektoitiin soluihin käyttäen Lipofectamine-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Solut kerättiin, pestiin PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen Luciferase Reporter Lysis Buffer (Promega). Tiedot esitetään fold-muutos suhteellisessa valossa yksikköä /milliyksiköiksi β-galaktosidaasin ja edustavat keskiarvoa kolmesta itsenäisestä kokeesta. Muuttaminen Wnt7a lusiferaasin suoritettiin SSSI, Hpall, ja Hhal mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti (New England Biolabs). Ohimenevä tai pysyvän transfektion DNMT ja Wnt7a shRNA suoritettiin käyttäen Sure-hiljentäminen shRNA päässä SABiosciences tai retroviruksen shRNA Open Biosystems ja Attractene transfektio Reagent (Qiagen).

Kvantitatiivinen PCR

RNA uutettiin solut AllPrep DNA /RNA Mini Kit (Qiagen) ja 5 ug RNA: ta muutettiin cDNA: ksi. PCR suoritettiin käyttäen SABioscience RT

2 alukkeilla ja master mix. GAPDH käytettiin normalisoimaan kaikki näytteet. QPCR data esitetään taitettavan muutokset normalisoidut mRNA tasot ohjaus vs koenäytteiden ja ovat keskimäärin vähintään kolmesta kokeesta keskivirheen esitetään virhejanoina.

immunoblottianalyysi

Cells otettiin talteen ja proteiini-uutteet valmistettiin käyttämällä karttaa kinaasipuskuria. Proteiinit havaittiin kemiluminesenssin ja ChemiDoc järjestelmä (BioRad). Seuraavia vasta-aineita käytettiin immunoblottauksella: Wnt7A (R & D Systsems), DNMT1 (Abcam) ja β-aktiini (Abcam). β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

DNA metylointianalyysi

DNA eristettiin solulinjoista ja kasvainnäytteissä käyttämällä AllPrep DNA /RNA Mini Kit (Qiagen) ja modifioitu käyttämällä EZ DNA metylointi-Gold kit (Zymo Research). 1 ug DNA: ta käytettiin pyrosekvensointi varten

Wnt7a

määrityksessä suunnitellut ja suoritti Epigendx. Tiedot pyrosekvensointi esitetään keskimääräinen prosentuaalinen metylointi, joka on keskiarvo prosentin metylaation 13 CpG sivustoja sisällä CpG-saarekkeen, että Wnt7a promoottori. Metyyli-Profiler järjestelmän SABiosciences käytettiin mittaamaan Wnt7a metylaation 5-atsa ja CSC käsiteltyjen solujen. Tiedot esitetään prosentteina metyloitua DNA sisällä Wnt7a promoottori.

tukeminen Information

Kuva S1.

ilmentyminen Wnt7a ei kasvanut DNMT3A tai 3B knockdown. QPCR käytettiin mittaamaan mRNA tasojen DNMT3A tai 3B ja Wnt7a in H1299 solujen knockdovvn DNMT3A tai 3B. shRNA tietoja verrataan negatiiviseen kontrolliin ja esitetään kertamuutosta normalisoitu GAPDH.

doi: 10,1371 /journal.pone.0032921.s001

(TIF)

Taulukko S1.

metylointi ihmisen keuhkojen kasvain kudos analysoitiin käyttäen pyrosekvensointi. Jokainen kasvain analysoitiin 13 CpG sivustoja

Wnt7a

promoottori. Prosentuaalinen kasvaimia metyloitu suurempi kuin 0% DNA: sta on osoitettu alareunassa taulukon kunkin sivuston. Metylointi normaalin keuhkokudoksen sovitettu tuumorikudoksista taulukossa S1 analysoitiin pyrosekvensointi. Kukin näyte analysoitiin 13 CpG sivustoja Wnt7a promoottori. Prosentuaalinen näytteiden metylaation on suurempi kuin 0% on merkitty alareunassa taulukon kunkin sivuston.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0032921.s002

(PDF)