Krooninen sairaus

tiivistelmä

Taustaa ja tavoite

koskeva tutkimus B7 -H1 ilmentyminen peräsuolen syövän solut on varhaisessa vaiheessa. On epäselvää, B7-H1 ilmentyminen voi olla diagnostista tai prognostista arvoa kolorektaalikarsinoomasta. Lisäksi, kuinka B7-H1 liittyy kliinisiä piirteitä kolorektaalisyöpää ei ole tiedossa. Tutkiakseen suhdetta B7-H1 ja peräsuolen syövän, analysoimme B7-H1 ilmaisun ja sen vaikutus kliinisissä näytteissä ja HCT116-soluissa.

Methods

parafinoidut yksilöitä 143 oikeutettu potilaat käytettiin ilmentymisen tutkimiseksi CD274 immunohistokemiallisesti. Olemme tutki myös B7-H1 itse voi liittyä solujen lisääntymistä, apoptoosin, muuttoliike ja hyökkäyksen paksusuolensyöpä HCT116-soluissa.

Tulokset

Tuloksemme osoittavat, että B7-H1 on erittäin ilmaistu kolorektaalisyöpää ja oli merkitsevästi yhteydessä solujen erilaistumista asema ja TNM (kasvain etäpesäke) vaiheessa. Potilaat, joilla on positiivinen B7-H1 ilme osoitti suuntaus lyhyempi elinaika. Monimuuttujamenetelmin, osoitamme, että positiivinen B7-H1 ilme on itsenäinen ennustaja kolorektaalikarsinooma ennustetta. Tuloksemme osoittavat, että B7-H1 hiljentäminen siRNA estää solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion. Lisäksi solujen apoptoosin kasvattivat myös B7-H1 eston.

Johtopäätökset

Positiivinen B7-H1 ilme on itsenäinen ennustaja kolorektaalisyövän ennusteen. Lisäksi knockdovvn B7-H1 voi estää solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion.

Citation: Shi S-J, Wang L-J, Wang G-D, Guo Z-Y, Wei M, Meng Y-L, et al. (2013) B7-H1 ilmentyminen liittyy huonon ennusteen kolorektaalikarsinoomasta ja säätelee leviämisen ja invaasion HCT116 peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 8 (10): e76012. doi: 10,1371 /journal.pone.0076012

Editor: John Souglakos, University General Hospital Heraklionin ja laboratorio kasvain solubiologian, School of Medicine, University of Kreeta, Kreikka

vastaanotettu: kesäkuu 7, 2013; Hyväksytty: 19 elokuu 2013; Julkaistu: 04 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 shi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (No.30873004, 30973000 ja 81171924) ja Natural Science Foundation of Shan xi maakunta (No.2011JM4006). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kolorektaalisyöpää on kolmanneksi useimmin diagnosoitu maligniteetti maailmassa ja viides johtava kuolinsyy syöpäpotilaiden Kiinassa [1]. Riittämättömän tehokkaan diagnostisten merkkiaineiden, useimmat peräsuolen syöpä potilaat ovat kaukaisia ​​etäpesäkkeitä (vaihe IV) diagnoosi. Tehokkain peräsuolen syövän hoito on leikkaus. Kuitenkin ei ole tarkkaa prognoosimarkkereina vaikea ennustaa potilaan elinaika leikkauksen jälkeen. Niinpä uusia ja tehokkaita merkkiaineita diagnoosin ja ennusteen tarvitaan klinikalla.

kostimuloivana molekyyliä B7-homologi 1 (B7-H1 tai CD274) on äskettäin tunnistettu ligandi yhteistyössä estävä reseptorin ohjelmoitu kuolema -1 (PD-1 tai CD279) [2,3]. B7-H1 ekspressoidaan T-soluissa, B-solujen, makrofagien ja dendriittisolujen. Ekspression B7-H1 voidaan edelleen voimistuvan aktivoinnin tai läsnä on IFN-γ [2-4]. Lisäksi lymfosyytit, B7-H1 on havaittu myös alhaisilla tasoilla sydämen endoteeliin, mikroverisuonten endoteelisolut, haiman saarekkeiden ja syncytiotropho-blasteja istukan [5,6]. Perinteisesti, toiminta B7-H1 antigeeniä esittelevien solujen saavutetaan sitova PD-1 T-solujen, jonka uskotaan olevan tärkeä rooli induktioon ja ylläpitoon immuunitoleranssi [7-9].

lisäksi ilmaisu lymfosyyteissä ja normaalin kudoksen, poikkeava B7-H1 ilmentymistä on myös havaittu useissa erilaisissa ihmisen syöpäsairauksia. Kasvaimen muodoissaan, mukaan lukien okasolusyöpää keuhkojen, ruokatorven, pään ja kaulan, ja muita karsinoomia, kuten munasarjojen, virtsarakon, rintasyöpä, melanooma ja gliooma myös ilmaista B7-H1 [10-16]. Ilmentyminen kasvaimeen liittyvien B7-H1 korreloi huonon ennusteen ja korkea pahanlaatuisuuden asteen. Salpaus kasvaimeen liittyvien B7-H1 on osoitettu edistävän kasvaimen taantumiseen in vivo useissa hiiren kasvaimen elinsiirrot [10,12,17,18]. PD-1-ekspressiota säädellään lisäävästi kasvaimen tunkeutuvia lymfosyyttejä, ja on ehdotettu, että B7-H1 ilmentyy syöpäsoluissa voi estää toiminnan tunkeutuvia lymfosyyttejä [16]. On myös osoitettu, että kasvaimeen liittyvän B7-H1 voi indusoida CTL, joka myöhemmin johti paeta T-soluvälitteinen immuunivaste valvonta [8,10]. Edellisessä tutkimuksessa maksettu liikaa huomiota toiminnan kasvaimeen liittyvien B7-H1, joka voimaan ligandina PD-1 tai CD80, mutta jättää huomiotta vaikutus kasvaimeen liittyvien B7-H1 itse kasvainsolujen. Tutkimus koskee vaikutusta kasvaimeen liittyvien B7-H1 kasvainsolujen on vielä lapsenkengissä. Siten kasvaimeen liittyvien B7-H1 voivat toimia yhdessä muiden alipaineensäätöventtiileillä T-solujen aktivaation vaimentaa isännän antituumorivaikutuksen immuunivasteen [19], myös suuri mahdollisuus, kasvaimeen liittyvien B7-H1 voi vaikuttaa prosessin syövän etenemisen kautta häiritsee toiminta syöpäsolun.

ilmentyminen B7-H1 peräsuolen karsinoomat on epäjohdonmukainen. Dong et ai. ei tunnistanut B7-H1 ilmentyminen normaaleissa paksusuolessa kudoksissa, mutta ilmaus B7-H1 todettiin suhteellisen suuri osa (10/19) paksusuolisyövän potilaista [10]. Kuitenkin toinen ryhmä tunnistaa ilmentymisen B7-H1 mRNA-tasolla, mutta myös ei havaita pinnalla ilmenemisen B7-H1in paksusuolen epiteelisolut terveiden verrokkien [20]. Koskeva tutkimus B7-H1 ilmentymistä peräsuolen syövän solut on varhaisessa vaiheessa. On epäselvää, B7-H1 ilmentyminen voi olla diagnostista tai prognostista arvoa kolorektaalikarsinoomasta. Lisäksi, kuinka B7-H1 liittyy kliinisiä piirteitä kolorektaalisyöpää ei ole tiedossa. Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmaus profiilia B7-H1 5 normaalissa paksusuolen kudoksiin, 143 peräsuolen syöpä kudoksiin ja 44 viereisten kudosten. Olemme myös arvioineet ennustearvo B7-H1 ennusteen peräsuolen syövän potilaiden ja tutki kasvaimeen liittyvien B7-H1 itse voi suoraan moduloida peräsuolen syövän etenemisen sijaan sitoutumalla PD-1 T-solujen.

materiaalit ja menetelmät

2.1: potilaat ja seuranta

Kuten aiemmin on kuvattu, tämä hyväksyi tutkimuksen eettinen komitea neljännen Military Medical University ja kaikkien osallistuvien potilaiden ovat kirjallisesti tietoinen suostumus tiedoksi ja kudosnäytteitä voidaan tallentaa tietokantaan Xijing sairaalan ja käytetään tutkimukseen [21]. . Retrospektiivinen kohortti me investigatedincluded143 potilaalla on mahdollisesti kokoisen kolorektaalisyöpää diagnosoitu helmikuun 2006 joulukuussa 2007. potilaita kerättiin Department of ruuansulatuskanavan leikkauksen, Xijing Hospital, neljäs Military Medical University. Poissulkemisperusteita rekrytoinnin tässä tutkimuksessa ovat seuraavat: vastaanottava adjuvanttihoitoa ennen leikkausta, diagnoosi mahasuolistrooman kasvain tai lymfooma, diagnoosi ylimääräisiä syöpien, ja potilaalla, joka kieltäytyy suostumusta. Kliiniset näytteet noudetaan kudoksesta arkisto patologian osaston, Xijing Hospital, neljäs Military Medical University. Seuranta-tiedot kaikkien osallistujien päivitettiin 3 kuukauden välein puhelimitse. Yleinen eloonjääminen määritettiin aikana kulunut leikkauksen kuolemaan. Tiedot kuoleman potilaista oli kysynyt heidän perheensä.

2.2: n immunohistokemiallinen (IHC) värjäystä ja arviointia

Parafiini upotettujen leikkeiden normaalien ja kasvaimen kudokset värjättiin B7-H1 ilme. Immuunihistokemialliset värjäytyminen B7-H1 suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu pieniä muutoksia [22]. Lyhyesti, diat poistettiin parafiini ksyleenillä ja niihin lisätään asteittaisella alkoholi sarjan ennen endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus estettiin 3% H

2O

2. Kaikki ei-spesifinen sitoutuminen proteiineihin estettiin käyttäen valmiiksi immuuni kanin seerumia. Ensisijainen vasta-aine B7-H1 (Abcam, ab58810) laimennettiin mukainen suositeltu konsentraatio (5 ug /ml), ja leikkeitä inkuboitiin yön yli kostutetussa kammiossa 4 ° C: ssa. Leikkeitä pestiin 3 kertaa PBS: llä, ja sitten biotinyloidun sekundaarisen vasta-ainetta lisättiin ja inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Signaali visualisointi suoritettiin käyttämällä DAB kromogeeniä varten 2-3 min. Negatiivinen värjäytyminen kontrolli tehtiin korvaamalla primaarinen vasta-aine, jossa esi-immuuni kanin seerumia. B7-H1 värjäys pisteytettiin itsenäisesti kahdessa patologit sokkoutettu kliinisen potilaiden ominaisuuksiin. Pisteytysjärjestelmään ylentää B7-H1 ilmentyminen oli kuvattu aiemmin [23]. Kasvaimet vahvojen ja kohtalainen immunovärjäämällä intensiteetti luokiteltiin positiivisia (+) lauseke, kun taas kasvaimissa, joissa poissa ja heikkoja immunovärjäys luokiteltiin negatiivisia (-) lauseke.

2.3: Soluviljely

ihmisen paksusuolen syöpä HCT116-solut saatiin Cell Bank of Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina), joissa ne oli ominaista Mycoplasma havaitseminen, DNA -Fingerprinting, isoentsyymin havaitseminen ja solujen elinvoimaisuus havaitsemiseen. Tämä solulinja on välittömästi laajennettiin ja pakastettiin, jotta soluviljelmät voidaan käynnistää uudelleen joka 3-4 kuukautta samasta erästä jäädytettyjen injektiopulloa. HCT116-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (HyClone, Logan, UT), ja niitä viljeltiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

2.4: siRNA transfektion ja geenin hiljentäminen

hiljentäminen B7-H1 soluissa, pieni häiritsevä RNA (siRNA) transfektoitiin soluihin. SiRNA-dupleksit (5′-GGCUGCACUAAUUGUCUAUTT-3 ’ja 5′-CCAGCACACUGAGAAUCAATT-3′), kohdennettu B7-H1-geenin. Negatiivinen kontrolli duplex (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’), jotka kohdistuivat epäspesifinen sekvenssin. SiRNA: t syntetisoitiin Sangon Biotech (Shanghai, Kiina). SiRNA-dupleksit (100 nmol /L) transfektoitiin HCT116-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. HCT116 Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen tarkempaa analysointia varten. Esto tehokkuus tunnistettiin Western blot (kuvio S1).

2.5: RT-qPCR (käänteistranskriptio-kvantitatiivinen PCR) B

Yhteensä solun RNA eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan protokollan. Tämän jälkeen RNA käänteistranskriptio Palauta-Aid

TM First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Sankt Leon-Rot, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden. Käänteisen transkription-kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktion (RT-qPCR) suoritettiin käyttäen CFX96

TM Real-Time PCR -järjestelmää (Bio-Rad, Valencia, CA), jossa SYBR Green reagenssien (# DRR041A; Takara Bio, Japani) mukaan valmistajan ohjeita. RT-qPCR-analyysi suoritettiin kokonaistilavuudessa 20 ui seuraavat vahvistus vaiheet: ensimmäinen denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä denaturointi 95 ° C 15 s ja venymä 55 ° C 30 sekuntia. RT-qPCR geenin ilmentyminen normalisoida ihmisen β-aktiini. Käytetyt alukkeet real-time PCR tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: 5′-TCAATGCCCCATACAACAAA -3 ’(sense) ja 5′-TGCTTGTCCAGATGACTTCG -3′ (antisense) ja B7-H1; 5’-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3 ’(sense) ja 5′-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3’ (antisense) ja β-aktiini.

2,6: Western blot

Solut kerättiin lyysipuskuriin (50 mM NaCl, 50 mM EDTA, 1% Triton X-100), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseosta (Roche, Indianapolis, IN, USA). Solulysaatit (30 ug) erotettiin käyttämällä 10% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin sitten nitroselluloosakalvoille (Millipore, Bedford, MA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa laimennettiin PBS: ssä 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ennen kuin lisättiin sopivan primaarisen vasta-aineen. Vasta-aineet, joita käytetään tässä tutkimuksessa olivat anti-B7-H1 (1: 400; Abcam, ab58810) ja anti-GAPDH (1: 2000, Abcam, mAbcam9484). Sitten membraanit pestiin PBS: llä, joka sisälsi 0,05% Tween ja inkuboitiin sopivan HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (1: 10000, Abcam) 1 h huoneen lämpötilassa. Vyöhykkeet visualisoidaan kemiluminesenssimittaus reagenssia (New England Nuclear, Boston, MA).

2,7: MTT-määritys

Solulisääntyminen analysoitiin in vitro kanssa tetratsoliumsuolaa 3- (4, 5 -dimethylthiazol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) reagenssi. HCT116-solut transfektoitiin erityisiä siRNA (si-sekoituskoodin tai si-B7-H1) 24 tuntia, ja sitten proliferaatiota tutkittiin. Lyhyesti, 2000-solut kustakin ryhmästä (emo, si-sekoituskoodin tai si-B7-H1) maljattiin kuhunkin kuoppaan viidessä 96-kuoppaisille levyille 200 ul: aan väliainetta. Analysoida solujen lisääntymistä, 20 ui MTT substraatin konsentraatiossa 2,5 mg /ml PBS: ssä, lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyt palautettiin sitten standardin kudoksen inkubaattorissa vielä 4 tuntia. Sitten väliaine poistettiin ja solut liuotettiin 150 ui: aan dimetyylisulfoksidia varten kolorimetrinen (aallonpituus 490 nm). Yksi levy analysoitiin heti solujen kiinnittynyt (noin 4 h kuluttua pinnoitus). Sitten, yksi levy per päivä tutkittiin seuraavan 4 peräkkäisen päivän ajan.

2,8: Virtaussytometrinen analyysi tunnistaa apoptoosin

HCT116-solut transfektoitiin erityisiä siRNA (si-sekoituskoodin tai Si- B7-H1) 48 tuntia, ja sitten solut suspendoitiin inkubointipuskuriin tiheydellä 1 x 10

6 solua /ml. Soluja inkuboitiin anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidilla (BD Bioscience, San Jose, CA) 15 minuutin ajan pimeässä huoneenlämmössä. Solujen apoptoosi analysoitiin sitten käyttäen virtaussytometrillä (BD FACS Aria).

2,9: Muuttoliike ja invaasiomääritys

Solun maahanmuutto- ja invaasion kapasiteettia mitattiin in vitro käyttäen transwell muuttoliikkeen määrityksiä (Millipore, Billerica , MA). HCT116-solut transfektoitiin erityisiä siRNA (si-sekoituskoodin tai si-B7-H1) 48 tuntia ja suspendoitiin DMEM, jossa on 10 g /l BSA: ta, jonka tiheys on 50 solua /ml. Sitten solususpensioita (200 ui) siirrostettiin ylemmässä kammiossa aporous kalvolla päällystetty (varten siirtokuoppaan invaasiomääritys) tai ilman (migraatiokokeessa) matrigeelin (BD Bioscience, San Diego, CA). Houkutella solut, 500 ui DMEM, jossa 10% seerumia lisättiin alaosaan. Sen jälkeen, kun solut vaeltavat 24 h tai hyökätä 48 tuntia, tunkeutuneiden solujen suodattimet fiksattiin kuivattiin metanolilla ja värjättiin 4 g /l kristalliviolettia. Numerot siirtynyt tai invasiivisia solut määritettiin viiden satunnaisen kentät mikroskoopin avulla (Olympus) on x 10 suurennuksella.

2,10: Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen IBM SPSS tilasto-ohjelmalla ( versio 20.0). Survival käyrät arvioitiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmällä, ja jakaumat arvioitiin pitkän rank testi. Coxin suhteellisen vaaran malleja liittyvien tekijöiden selviytymisen käytettiin laskettaessa tuntia ja tunnistaa tekijät, jotka vaikuttavat selviytyminen. Erot ominaisuuksiin 2 ryhmän välillä tutkittiin jonka χ

2 testiä ja Fisherin testiä. Kaikki

P

-arvot määritettiin 2-puolinen testejä, ja tilastollinen merkitsevyys perustui

P

-arvo 0,05.

Tulokset

3.1: Clinical merkitys positiivisten B7-H1 ilmentymistä kolorektaalisyövässä kudoksessa

Voit selvittää esiintyvyys ja kliininen merkitys B7-H1 ilmaisun kolorektaalikarsinoomasta, arvioimme B7-H1-proteiinin tason immunohistokemia retrospektiivinen kohortin 143 peräsuolen syöpäpotilaiden jälkeen kasvaimen resektiota. Niistä 143 potilasta, 64 potilasta (44,8%) osoitti positiivisia B7-H1 ilmentymistä sytoplasmassa ja kalvon (kuvio 1A). Oli 79 potilaan näytteitä ilman havaittavaa B7-H1 ilmaisu (kuvio 1 C). Lisäksi, vain 5 (11,4%) ja 44 viereisiin kudoksiin positiivisesti B7-H1 ilmentyminen (kuvio 1 B p = 0,006). Kuten on esitetty taulukossa 2, solujen erilaistumista ja TNM-luokitus oli liittyy myös ennusteen paksusuolen syöpä. Vuonna Monimuuttuja-analyysissä, huomasimme, että positiivinen B7-H1 ilmentyminen liittyi pieneni selviytymisen. Oikaistu HR oli 2,771 (95% CI: 1,048-2,994; p = 0,003), mikä osoittaa, että B7-H1 ilmentyminen voi olla ennustetekijä riippumaton näistä säädettiin ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia (taulukko 2).

Univariate

Monimuuttujatestaus

HR

95% CI

P-arvo

HR

95% CI

P-arvo

B7-H1 expression2.611(1.008-3.576)0.006

*2.771(1.048-2.994)0.003

*Age0.815(0.497-1.335)0.4160.888(0.520-1.516)0.663Sex1.225(0.757-1.983)0.4081.010(0.596-1.714)0.433Tumor location1.199 (0,463-3,104) 0.7090.904 (0,281-2,906) 0.865TNM stage2.345(1.153-2.778)0.010

*1.416(1.179-1.971)0.043

*Differentiation1.956(1.224-2.928)0.030

*3.192(1.126-3.679)0.004

*Table 2. Coxin regressioanalyysin ennustavat tekijät eloonjäämiseen kolorektaalisyövässä potilailla (n = 143).

95% CI osoittaa 95%: n luottamusväli * P ≤ 0,05 CSV Lataa CSV

3.3: Tehokas knockdovvn B7-H1 siRNA in HCT116-soluissa

on raportoitu, että kasvaimeen liittyvän B7-H1 voisi edistää T-solujen apoptoosia [10], mutta ei ole olemassa tutkimuksia osoittaa roolia B7-H1 ekspressiota kasvainsoluissa. Kuten yleisesti käytetty ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinja HCT116-solujen on osoitettu olevan invasiivinen ja erittäin liikkuvia in vitro [24-26]. Täten tutkimaan toimintaa B7-H1 kolorektaalisyövässä solubiologian, käytimme siRNA kohdistamista B7-H1 estää B7-H1 ilme. Sitten tutkittiin kasvainsolun ominaisuudet myös solujen jakautumista, apoptoosia, muuttoliike ja hyökkäystä. Efektiivinen Knockdown B7-H1 varmistettiin qRT-PCR, western blot ja virtaussytometria analyysi. Verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu salattu siRNA, solut transfektoitiin siRNA: illa B7-H1, osoittivat merkittävästi vähentää B7-H1 ilmentymistä (jokainen koe suoritettiin kolme kertaa, ja tyypillinen tulos on läsnä kuvio 2A, 2B ja 2C).

(A) RT-qPCR analyysi osoittaa B7-H1 mRNA-tasolla. Vanhempien tai HCT116-solut transfektoitu salattu siRNA tai siRNA kohdistaminen B7-H1 48 tuntia kerättiin ja RT-qPCR tehtiin; (B) Western blot analyysi tunnistaa B7-H1-proteiinin tason. Vanhempien tai HCT116-soluja, jotka on transfektoitu salattu siRNA tai siRNA kohdistaminen B7-H1 48 tuntia otettiin talteen ja solulysaatit valmistettiin ja käytettiin Western blot; (C) virtaussytometrianalyysin ja keskimääräinen kanavan fluoresenssi osoittaa B7-H1 ilme solukalvon. Vanhempien tai HCT116-solut transfektoitu salattu siRNA tai siRNA kohdistaminen B7-H1 48 tuntia kerättiin ja solun pinnan värjäys suoritettiin ennen virtaussytometria-analyysiä. Tulokset esitettiin keskiarvoina ± SD, * P 0,05 verrattuna si-ryntäily ryhmä.

3,4: Effect of B7-H1 Knockdown soluproliferaatioon

Kun olet vahvistanut knockdown hyötysuhde että siRNA: iden kohdistaminen B7-H1, me määritti alennetun B7-H1 tason soluproliferaatioon käyttämällä MTT-määritystä. HCT116-solut, jotka transfektoitiin siRNA kohdistaminen B7-H1 osoitti merkittävästi vähemmän proliferaation kuin vanhempien tai salattu siRNA-transfektoiduissa soluissa (kuvio 3A). Tämä tulos osoitti B7-H1 oli suora vaikutus soluproliferaation HCT116-soluissa ja että korkea B7-H1 proteiinin taso korreloi lisääntyneeseen soluproliferaatioon.

(A) MTT analyysi havaitsemiseksi solujen lisääntymistä. Vanhempien tai HCT116-solut transfektoitiin salattu siRNA tai siRNA kohdistaminen B7-H1 48 h ympättiin 96-kuoppalevyille ja solujen lisääntyminen havaittiin MTT. Tulokset esitettiin keskiarvoina ± SD, * P 0,05 verrattuna si-scramble ryhmä. (B) virtaussytometrinen analyysi havaitsemiseksi solun apoptoosin. Vanhempien tai HCT116-solut transfektoitu salattu siRNA tai siRNA kohdistaminen B7-H1 48 tuntia kerättiin ja värjättiin anneksiini-V-FITC ja PI ennen virtaussytometrianalyysin. Tulokset esitettiin keskiarvoina ± SD, * P 0,05 verrattuna si-ryntäily ryhmä.

3.5: Effect of B7-H1 Knockdown solujen apoptoosiin

Olemme osoittaneet, että B7-H1 ekspressiotaso korreloi solujen lisääntymistä. Sen vuoksi testasimme, onko esti solujen lisääntyminen voi johtua lisääntynyt solujen apoptoosin B7-H1 knockdown-soluja. HCT116-solut transfektoitu scramble siRNA tai siRNA kohdistaminen B7-H1 48 tuntia analysoitiin apoptoosin. Tulokset osoittavat, että verrattuna vanhempien tai salattu siRNA-transfektoiduissa soluissa, jotka on transfektoitu siRNA kohdistaminen B7-H1 oli lisääntynyt apoptoosi-indeksi, joka lasketaan lisää solut 1 ja solut 2 (12,3 ± 5,9% ja 17,2% ± 6,2 vs. 1,1 ± 0,4%, P 0,05; 12,3 ± 5,9% ja 17,2% vs. 0,9 ± 0,5%, P 0,05; jokainen koe suoritettiin kolme kertaa, ja tyypillinen tulos on läsnä kuvio 3B). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että ilmaus B7-H1 HCT116-soluissa on tärkeää sekä solujen lisääntymisen ja apoptoosin.

3,6: Effect of B7-H1 Knockdown solun muuttoliikettä ja invaasiota

B7 -H1 on aikaisemmin osoitettu säätelevän solujen vaeltamiseen ja invaasiota haimakarsinooma- soluissa [27]. Meidän havainnot että B7-H1 ilme oli tärkeä rooli HCT116-solujen lisääntymisen ja apoptoosin johti meidät arvioimaan toimintaa B7-H1 solumigraatio ja hyökkäyksen koolonkarsinoomasoluissa. Voit testata muuttoliike, käytimme standardi Matrigel päällystettyjä tai päällystämättömiä siirtokuoppaan kammioon määrityksiä. Olemme havainneet, että verrattuna salattu siRNA-transfektoiduissa soluissa, HCT116-solut transfektoitu siRNA kohdistamista B7-H1 olivat vähentyneet muuttoliikettä ja invaasiota kyky (kuva 4A-4D) sekä alennettua invasiivisia indeksi (invaasio solujen määrä /muuttoliike solujen määrä, kuva S2 ). Lopuksi tuloksemme osoittavat, että B7-H1 ilmentyminen HCT116-soluissa korreloi solujen lisääntymistä, apoptoosin, muuttoliikettä ja invaasiota.

(A) Boyden kammion määrityksessä havaitsemaan solujen vaeltamiseen. Vanhempien tai HCT116-soluja, jotka on transfektoitu salattu siRNA tai siRNA kohdistaminen B7-H1 48 h ympättiin Boyden kammioihin ilman Matrigel-päällystetty kalvo, ja sen jälkeen vielä 48 h, siirtyneet solut värjättiin ja laskettiin mikroskoopilla (suurennos x 10). Kuvat ovat näytettiin. (B) määrä siirtynyt solujen esitetyn A. Käyttäjän näkyi keskiarvoja ± SD viidestä aloilla. * P 0,05 verrattuna si-scramble ryhmä. (C) Boyden kammion määrityksessä havaitsemaan soluinvaasiota. Vanhempien tai HCT116-solut transfektoitu salattu siRNA tai siRNA kohdistaminen B7-H1 48 h ympättiin muokattu Boyden jaostoa Matrigel-pinnoitettu kalvo, ja toiset 24 tuntia, invasiivisia soluja, jotka siirrettiin läpi matrigeelin kalvon värjättiin ja laskettiin mikroskoopilla (suurennos x 10). Kuvat ovat näytettiin. (D) määrä invasiivisen solujen esitetyn C. Data näkyi keskiarvoja ± SD viidestä aloilla. * P 0,05 verrattuna si-ryntäily ryhmä.

Keskustelu

B7-H1 ilmenee vahvasti erilaisia ​​kasvaimia. Kuitenkin korrelaatio B7-H1 ilmaisun ja peräsuolen syövän etenemisessä ei ole hyvin tutkittu [20,28]. Tässä tutkimuksessa olemme vahvistaneet, että ilmentyminen B7-H1 voitu havaita sekä peräsuolen syövän ja viereisiin kudoksiin, mutta eri taajuudella. Olemme myös näyttöä siitä, että positiivinen B7-H1-ilmentyminen korreloi kliinisiä ja patologinen ominaisuudet kolorektaalikarsinoomasta. Lisäksi osoitimme, että B7-H1 ilmentymisen taso oli myös ennakoivaa taudin etenemisen ja syöpää erityisiä kuolema. Tuloksemme osoittivat potilaiden positiveB7-H1 ilme ovat yleensä huomattavasti suurempi riski syövän etenemisen, syöpään erityinen kuoleman ja lyhyempiä kokonaiselossaolo. Tämä lisääntynyt riski oli riippumaton sukupuoli, ikä, kasvaimen koko, kasvain sijainti, erilaistumista tila ja TNM-luokitus. Nämä tulokset toimittanut ensimmäiset todisteet tukevat B7-H1 ennustajana huonon ennusteen kolorektaalikarsinoomasta.

Mielenkiintoisin ja odottamaton havainto oli meidän tulokset osoittivat, että B7-H1 itse korreloi solujen lisääntymistä, apoptoosin, muuttoliike ja invaasio. Vaikka jotkut tutkimusryhmät ovat vahvistaneet, että kasvainsolut ilmentävät B7-H1 oli korkea proliferatiivinen indeksi [14,27], useimmat ryhmät taipumus uskoa B7-H1 estää kasvaimen tuhoutumisen vain muodostamalla ”molekyyli kilpi [18,29]”, mutta ei muodostaen ”tehokkaampi keihäs” [18,30]. Meidän havainto tarjoaa tehokkaita todisteita siitä, että B7-H1 voi olla kasvaimia synnyttävän toiminnon aikana paksusuolen syövän synnyn, joka karistanut uudessa valossa toiminta B7-H1 peräsuolen syövän kehittymisessä.

uusiutui kolorektaalisyöpää on suhteellisen korkea. Yksi mahdollinen syy toistuminen on, että jäljelle jäävä kasvain voi kiertää isäntä immunesurveillance. Aiemmat tutkimukset ovat vahvistaneet, että suuri T-solujen infiltraatio paksusuolen ja peräsuolen syövän kudosta korreloi parannetun 5 vuoden elinaika. Korkea T-solujen tunkeutuminen voi toimia tarkemman ennusteen ennustetta kuin perinteiset histopatologisia pysähdyspaikan [31]. Kuitenkin on myös osoitettu, että paksusuolen ja peräsuolen syövän potilailla on laajennettu Treg väestöstä. Lisääntymisen Treg solut voivat estää CD4

+ T solujen toimintaa vastauksena kasvaimeen liittyviä antigeenejä [32]. On myös raportoitu, että tiheys Tregs vuonna TDLNs korreloi taudin vaiheessa [33]. Kolorektaalisyöpä potilaalla on korkea ilmentymisen Th1 tai sytotoksisten cluster geenit on pitkittynyt tautivapaan elinajan. Toisaalta korkea ilmentyminen Th17 klusterin geenien johtaa huonoon ennusteeseen [34,35]. Suhde kasvaimeen liittyvien B7-H1 ja toiminta tunkeutuminen on T-solujen kasvaimen mikroympäristössä on vakiintunut. On myös yleisesti hyväksytty, että kasvaimeen liittyvän B7-H1 voi auttaa kasvainsoluja välttää immuunijärjestelmän valvontaa toiminnan estäminen efektori-T-solujen ja tehostaa toimintaa Tregs kolorektaalisyövässä [36]. Ja tuloksemme tukevat tätä käsitystä korkean ilmentymisen B7-H1, joka voi lamaannuttaa isäntä immunesurveillance liittyy huonoon ennusteeseen kolorektaalisyövässä.

Kuitenkin toiminta B7-H1in tukahduttaminen kasvainimmuniteetin ole vieläkään täysin ymmärretä. Miten esimerkiksi B7-H1 säätelee T-solujen toimintaa ja oletetun ei-PD-1-reseptori on tunnistettava. Tunnistaminen B7-1 uutena B7-H1-reseptorin tehty kysymys monimutkaisempi, ja monimutkaisuus näiden molekyylivuorovaikutusten viittaa siihen, että B7-H1 tai PD-1-salpauksen yksinään ei välttämättä riitä estämään estävä reittejä. Ja tulokset tekevät tätä kysymystä vielä monimutkaistuvat. Tuloksemme osoittivat, että solut alennettu B7-H1 ilme oli alentunut solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion. Lisäksi, vähentää B7-H1expression lisännyt apoptoosia (kuviot 3 4). Vaikka tarkempi mekanismi on löydetty selittää tuloksia, nämä tulokset tarjoavat todisteita siitä, että B7-H1 voi olla paitsi ligandin PD-1 tai otaksuttu ei-PD-1-reseptorin, mutta myös toimia kasvaimia synnyttävää molekyyliä. Yhdessä tuloksemme ja edellinen kirjallisuuden, voimme saada siihen tulokseen, että B7-H1 voi nopeuttaa etenemistä kolorektaalisyövän vaikka toiminnan estäminen T-solujen ja parantaa aste maligniteetin paksusuolen syöpäsolu, jolloin se liittyy huono ennuste peräsuolen syöpäpotilailla.

Huomasimme myös äskettäin kirjallisuudessa saada ristiriitaisia ​​johtopäätös meidän tutkimus.