Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kapesitabiini (CAP) on 5-FU aihiolääke hyväksytty hoitoon useiden syöpien ja sitä käytetään yhdessä gemsitabiinin (GEM) hoidettaessa potilaita, joilla haiman (PDAC ). Kuitenkin rajallinen prekliinisiä tietoja vaikutuksista YMP PDAC ovat käytettävissä tukemaan käytön GEMCAP yhdistelmän klinikalla. Siksi tutkimme farmakokinetiikkaa ja tehoa CAP ainoana lääkkeenä ensin ja sitten yhdessä GEM arvioimaan hyödyllisyyttä GEMCAP terapian klinikalla. Mallina käyttäen spontaaneja PDAC esiintyvien Kras

G12D; p53

R172H; Pdx1-Cre (KPC) hiiret ja ihonalainen allograftit on KPC PDAC johdettu solulinja (K8484), osoitimme, että CAP aikaan kasvaimen pitoisuuksia (-25 pM) 5-FU molemmissa malleissa, ainoana lääkkeenä, ja aiheuttama selviytyminen samanlainen GEM vuonna KPC hiirissä, mikä viittaa samanlaisen tehokkuuden.

In vitro

tutkimuksissa käytetyt K8484 soluissa sekä ihmisen haiman solulinjoissa todettiin additiivinen vaikutus GEMCAP yhdistelmän kuitenkin lisääntynyt myrkyllisyys

in vivo

eikä hyöty siedettävällä GEMCAP yhdistelmä tunnistettiin siirteen mallissa verrattuna GEM yksin. Työmme tarjoaa prekliinisiä todisteita 5-FU toimitus kasvaimia ja antituumoriteholla suun kautta CAP annon, joka oli samanlainen vaikutus GEM. Kuitenkin GEMCAP yhdistelmä ei paranna terapeuttista indeksiä verrattuna GEM yksin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että CAP voidaan pitää vaihtoehtona GEM tulevaisuudessa rationaalisesti suunniteltu, yhdistelmähoito strategioita kehittyneen haimasyövän.

Citation: Courtin A, Richards FM, Bapiro TE, Bramhall JL, Neesse A, Cook N, et al. (2013) Anti-Kasvaimen teho kapesitabiinilla geenimuunnossolulinjoissa hiirimallissa Haimasyöpä. PLoS ONE 8 (6): e67330. doi: 10,1371 /journal.pone.0067330

Editor: Hana Algul, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 06 helmikuu 2013; Hyväksytty: 16 toukokuu 2013; Julkaistu: 28 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Courtin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Cancer Research UK (www.cancerresearchuk.org) kautta ohjelman Grant C96 /A8333 DJ ja kautta CRUK Cambridge Institute ryhmänjohtaja rahoitusta DJ ja DT. Tätä työtä tukivat myös Cambridgen yliopisto, Li Ka Shing säätiö ja jonka hyväntekeväisyyteen lahjoitus Cambridgen yliopiston välillä Hutchison-Whampoa Oy Teos tukivat myös rahoituksella NIHR Cambridge Biomedical Research Centre (www.nihr .ac.uk). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: DJ on saanut tukea Kliiniset kokeet Rochen ja on myös toiminut toimituskunta että Xeloda (Capecitabine) kotisivuilta. Tämä Tutkimuksen rahoittivat osittain Hutchison-Whampoa Ltd muodossa hyväntekeväisyyteen lahjoitus CRUK Cambridge Institute mikä osaltaan palkkaa DT. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Kaikki muut kirjoittajat toteamaan ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat teollisuusmaissa. Kaiken kaikkiaan 5 vuoden pysyvyys on alle 5% [1]. Korkea kuolleisuus PDAC johtuu puute varhaisen havaitsemisen menetelmiä ja köyhien tehoa olemassa oleviin hoitomuotoihin. Gemsitabiini (GEM) on tavallinen hoito, mutta keskimääräinen eloonjäämisaika jää vain 5-7 kuukautta potilailla, joiden sairaus [2]. Siksi entistä tehokkaampien hoitomenetelmien kehittäminen edellyttää.

Kapesitabiini (Xeloda®; Hoffmann La Roche) on suun kautta fluoropyrimidiiniä karbamaatti, metaboloituu maksassa ja kasvain carboxylesterases ja sytidiinideaminaasin 5′-deoksi-5-fluorisytidiinin (5′-DFCR) ja 5′-deoksi-5-fluoriuridiinin (5′-DFUR), vastaavasti. Viimeisen vaiheen aktivoinnin kapesitabiinin (CAP), muuntaminen 5′-DFUR: n sytotoksisille 5-fluorourasiilin (5-FU), välittyy Tymidiinifosforylaasi [3] – [5], joka on ilmaistu erittäin neoplastisessa kuin normaali kudos, jolloin CAP enemmän kasvainspesifin kuin 5-FU [5], [6]. Antituumoriteholla CAP on osoitettu lukuisissa tutkimuksissa käytettiin ihmisen syövän ksenograftimalleja rinta-, paksusuoli-, maha-, kohdunkaulan, virtsarakon munasarja- ja eturauhassyöpään (ks tarkistettavaksi [7]), mutta vain yksi tutkimus on raportoitu haima malli [8] ja tämä oli epätyypillinen KRAS villityypin haimasyöpä solu ksenografti-. Klinikalla, CAP on hyväksynyt FDA ensilinjan ainoana lääkkeenä potilailla, joilla oli metastasoitunut kolorektaalisyöpä ja metastasoitunut rintasyöpä yksittäisenä aineena tai yhdistelmänä doketakselin epäonnistumisen jälkeen anthracyline kemoterapiaan. Potilailla, joilla on täysin resektoidun haimasyöpä, on osoitettu, että yhdistetty laskimobolus 5-fluorourasiilin ja foliinihapon (FUFA) on aktiivinen adjuvanttihoito ja käyttöä FUFA vastaa GEM kun eloonjäämiseen on päätepiste [9 ], [10]. Kehittyneissä PDAC, erityisesti Yhdistyneessä kuningaskunnassa, CAP on korvannut FUFA ja sitä käytetään yhdessä GEM (GEMCAP), joka perustuu tulosten meta-analyysi suoritetaan Heinemann ja al. osoittaa vaatimaton, mutta merkittävää selviytymisen hyötyvät yhdistelmä GEM fluoripyrimidiinisyöpälääkkeen kanssa ja erityisesti CAP [2]. Tuore kliininen tutkimus vahvisti hyödyksi GEMCAP valikoimattomissa joilla on pitkälle edennyt PDAC [11].

Koska rajoitetun prekliinisiä tietoja käyttäen maatalouspolitiikan PDAC,

in vivo

tutkimuksissa tehtiin arvioida CAP on geneettisesti hiirimallissa taudin. Kras

G12D; p53

R172H; Pdx1-Cre (KPC) hiiret ehdollisesti ilmentävät endogeenista KRAS ja p53-alleelit haimasoluissa [12] ja kehittää haiman kasvaimia, jotka kerrata patofysiologisia näkökohtia ja molekyylitason ominaisuudet ihmisen PDAC [13]. Käytimme myös allograft on haimasyöpä solulinja (K8484) eristettiin KPC PDAC. Farmakokineettiset ja tehoa tutkittaessa käytetään yksinkertaista ainetta CAP ja yhdistelmä GEM ja CAP. Tutkimukset kirjallisuudesta ehdotti yhdistyksen välillä sytidiinideaminaasin (CDA) entsyymin aktiivisuus ja toksisuusriskiä saavilla potilailla GEM tai CAP-pohjainen terapia [14], [15]. CDA on mukana aktivointi CAP kautta Deaminoimalla DFCR osaksi DFUR: n, mutta on toisaalta vastuussa Deaminoimalla GEM inaktiivisiksi metaboliitiksi dFdU [4], [5], [16], [17]. Koska myrkyllisyyttä havaitsimme kanssa GEMCAP yhdistelmä me määrällisesti CDA entsyymiaktiivisuus kasvainkudoksessa.

Materiaalit ja menetelmät

hiirilajilla

KPC hiiret kehittävät kehittyneen PDAC 2 3 kuukautta ja on lyhennetty mediaanielossaolosta noin 5 kuukautta [12], [18]. Heidän poikuekumppaniverrokista, Kras; p53

R172H; Pdx1-Cre (PC) hiiriä käytettiin myös tässä tutkimuksessa elinsiirron ihonalaisesti K8484 solulinjassa. Näin ollen kaikki kokeet suoritettiin käyttämällä hiiriä samalla sekoitetaan 129 /SvJal /C57BL /6 geneettinen tausta. Kaikki kokeet suoritettiin mukaisesti Britanniassa Animals (Scientific Procedures) Act 1986 hyväksyntää paikallinen Animal eettinen komitea, ja seuraava 2010 suuntaviivoja Yhdistyneen kuningaskunnan koordinointikomitea Cancer Research [19].

Solulinjat

K8484 solulinja perustettiin peräisin KPC PDAC kasvain Olive et al. [18], [20]. -Soluja kasvatettiin DMEM-alustassa (Life Technologies), jota oli täydennetty 5% naudan sikiön seerumia (FBS). Ihmisen haimasyövän solulinjoissa Panc-1 ja MiaPaca-2 saatiin ECACC (Salisbury, UK) ja niitä kasvatettiin DMEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää. Identiteetti kaikista ihmisen solulinjoja varmistettiin STR genotyypityksen ja testattu negatiivisiksi Mycoplasma.

Sytotoksisuusmääritys

Drug sytotoksisuus

in vitro

arvioitiin keinoin sulforodamiini B kolorimetriset (SRB) määritys. Solut maljattiin 96-kuoppalevylle ja annostellaan eri pitoisuuksia 5-FU (0,03 uM 30 uM) riveihin ja gemsitabiinin (3 x 10

-4 uM 0,3 uM) sarakkeisiin, jolloin verkkoon 8 x 8 pitoisuus yhdistelmiä. 72 tunnin kuluttua inkuboinnin 37 ° C: ssa, solut kiinnitettiin sitten (3% trikloorietikkahappo, 90 minuuttia, 4 ° C), pestään vedellä ja värjätään 0,057% SRB (Sigma) liuosta etikkahapossa (w /v) 30 minuuttia. Levyt pestiin (1% etikkahappoa, 4 kertaa), ja proteiiniin sitoutunut väriaine liuotettiin 10 mM Tris-emästä (pH 10,5). Fluoresenssi mitattiin Tecan Infinite M200 levy-lukija (viritys 488 nm, emissio 585 nm). Että% kasvunestomenetelmää (GI) verrattuna liuotinkontrolliviljelmissä käsiteltyjä soluja laskettiin kullekin lääkkeen pitoisuuden yhdistelmä.

yhdistämisen vaikutusta arvioitiin käyttämällä Bliss Independance malli [21], [22] mukaisesti protokolla olemme kuvanneet aiemmin [23]. Lyhyesti, joka on additiivisuuteen malli rakennettiin perustuen monoterapiana tietoja 5-FU ja GEM. GI-arvoja tämän mallin sitten vähennetään kokeelliset arvot alueiden tunnistamiseksi synergiaa ja antagonismin. Negatiiviset luvut osoittavat vähemmän kuin lisäaineen vaikutukset (keltaisesta punaiseksi) ja positiiviset luvut osoittavat additiivista suuremman vaikutuksen (vihreästä siniseksi).

Drug valmistelu

Capecitabine jauhetta (Sequoia Research) suspensoitiin 40 mM sitraattipuskuria ja 5% arabikumi 100 mg /ml ja tapahtui suun kautta. Gemsitabiinihydrokloridia (Tocris Bioscience) liuotettiin suolaliuokseen 20 mg /ml ja annettiin injektiona vatsaonteloon.

Farmakokinetiikka ja tehokkuustutkimuksissa in K8484 Allograft Model

Kahdenväliset K8484 allotransplantaatteja saatiin ihonalaisella 10

6 solua kylki. Farmakokinetiikan tutkimuksissa hiirillä, joilla siirteen kasvaimen hoidettiin kerta-annoksen CAP 755 mg /kg, ja kerättiin 10 min, 20 min, 40 min, 1 h, 2 h ja 4 h kuluttua, kolme eläintä per ajankohta. Veri kerättiin Litium hepariinin, ja plasma eristettiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Maksa ja tuumorit poistettiin ja pikajäädytettiin nestemäisessä typessä.

CAP tehotutkimuksissa, hiiriä hoidettiin CAP 755 mg /kg tai ajoneuvon 5 peräkkäisenä päivänä viikossa 3 viikon ajan. Vuonna GEMCAP yhdistelmä tehoa tutkimuksessa hiirille gemsitabiini annosta 75 mg /kg, 3 päivän välein yksinään tai yhdessä suun kautta CAP annokset 539 mg /kg 5 päivää viikossa. Kasvaimet mitattiin mukaan jarrusatulat. Kasvaimen tilavuus laskettiin pituus x leveys

2 × π /6.

Tehoa ja Survival Study in KPC Mouse Model

ilmoittautuminen KPC hiiret Tutkimus perustui kasvaimen koon, mitattuna ultraäänitutkimuksella akselin suunta. Hiiret keskiarvolla PDAC kasvain halkaisijat 6-9 mm otettiin. Lyhyellä aikavälillä tehotutkimuksen, hiiriä hoidettiin CAP 755 mg /kg tai ajoneuvon 7 peräkkäisenä päivänä. Hoidon aikana hiiret kuvattiin kahdesti korkearesoluutioisia kaikukuvaukseen käyttäen Vevo 770 System (Visual Sonics, Inc.) [24] ja kasvainten tilavuudet määrällisesti [18]. Päivänä 7 hiiret tapettiin 2 tunnin kuluttua CAP annoksen. Plasma, kasvain ja maksan kerättiin kuten edellä. Selviytymisen tutkimuksessa hiirille kirjoilla, ja kuvaamisen 3 päivän välein samalla käsittelemällä CAP 755 mg /kg 5 peräkkäisenä päivänä viikossa tai GEM 100 mg /kg 3 päivän välein, kunnes päätepiste kriteerit saavutettiin. Näihin sisältyi kehittäminen vatsan askites, vakavia kuihtuminen, merkittävä painon lasku (lähestyy 20%) alkuperäisestä painosta tai erittäin huono tai toimettomuuden.

immunohistokemia

Formaliinifiksoidusta, parafiiniin kudosleikkeiden olivat värjätään käyttämällä fosfo-histoni H3-ainetta (Upstate, # 06-570) ja todeta käyttäen DAB peroksidaasisubstraattia (Vector Labs). Värjäys mittausta ja mittaamaan Ariol järjestelmää (Leica). Vähintään 3 kenttää per kasvain oli määrällisesti. PH3 positiiviset solut määriteltiin ne, joiden positiivisesti värjäystä kondensoidaan chromatin.

GEMCAP Yhdistelmä siedettävyyskokeet

PC hiirillä K8484 solujen allotransplantaatteja hoidettiin GEM 100 mg /kg tai 75 mg /kg joka 3 päivää yksin tai yhdessä CAP 755 mg /kg tai 539 mg /kg tai 378 mg /kg, 5 peräkkäisenä päivänä viikossa ja tapettiin jos kliinisiä löydöksiä lähestyi sallitut raja-arvot (jotka sisältyvät ripuli, verenvuoto ja laihtuminen lähestyy 20%). Kaksi eläintä annosta kohti käytettiin. Kasvaimen vaste arvioitiin päivittäin mittaus kasvainten liukumitalla.

määritys Kapesitabiini ja sen metaboliitin pitoisuutta plasmassa, Maksa ja Kasvaimet

CAP, DFCR, DFUR ja 5FU määritettiin sekä plasman ja kudoksia käyttäen muunneltua versiota menettelystä aiemmin julkaistu [25]. Lyhyesti, kudosnäytteet homogenisoitiin käyttäen Precellys 24 homogenisaattoria pieniä kuulalaakereita (Kit Precellys MK28-R) 2 x 50 sekunnin ajan 6 000 rpm: llä jääkylmää 50:50 asetonitriili: vesi (v /v), joka sisälsi 25 ug /ml tetrahydrouridine (Promega), jotta lopulliseksi pitoisuudeksi 50 mg kudosta millilitraa kohden. Viisikymmentä ui homogenaattia siirrettiin puhtaaseen putkeen prespiked 200 ui jääkylmää asetonitriiliä, joka sisälsi 50 ng /ml vakaa leimattua (SIL) sisäisten standardien kaikkien 4 analyyttien (Toronto Research Chemicals). Kun oli sentrifugoitu 20000 g 5 minuuttia supernatantti haihdutettiin kuiviin, suspendoitiin uudelleen 100 ui: aan vettä, ja injisoitiin LC-MS /MS: llä. Plasma näytteitä, 50 ui plasmaa saostetaan 150 ul: n asetonitriiliä, joka sisälsi 50 ng /ml vakaa merkitty sisäisiä standardeja ja käsitellään samalla tavalla.

Detection saavutettiin LC-MS /MS: llä käyttäen Thermo TSQ Vantage massaspektrometri joiden Hesi-II anturi toiminut positiivisia ja negatiivisia tilassa spray jännitteellä 3 kV ja höyrystin on 325 ° C. Detection ionien suoritettiin useita reaktion seurannan tila, joka on spesifinen kullekin yhdisteelle. Pitoisuudet kapesitabiinin ja aineenvaihduntatuotteiden näytteet määritettiin vertaamalla vastaan ​​kalibrointi linjat rakentaa käyttämällä aitoja viitestandardien.

CDA Entsyymiaktiivisuusmittaukset

valmistamiseksi Raakaentsyymin matriisi, kasvain kudos homogenoitiin 500 ui 0,1 M Tris-HCl pH 8 puskuria varten 2 x 50 sekuntia 6000 rpm käyttäen Precelly homogenisaattoria. Kasvaimen lysaatit sentrifugoitiin sitten 10 minuutin ajan 14500 rpm: ssä 4 ° C: ssa, supernatantit dekantoitiin, ja proteiinipitoisuus mitattiin käyttämällä DC-BIORAD proteiinimäärityksellä.

CDA entsyymiaktiivisuuden määritys, GEM kantaliuokset valmistettiin vesi. Kutakin reaktiota varten 20 ui kasvaimen entsyymin uutetta sekoitettiin 170 ui 0,1 M Tris-HCl, 50 mM β-merkaptoetanolia, ja 10 ui sopivaa gemsitabiinin kantaliuosta, jotta lopullinen GEM substraatin pitoisuus on 50 uM 5000 uM. Näytteitä inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuuttia, reaktio pysäytettiin lisäämällä 600 ui asetonitriiliä ja 50 ui sisäistä standardia dFdU-

13C,

15N

2: ta lisättiin kuhunkin näytteeseen. Saman protokollan valmistamiseksi dFdU standardikäyrän välillä 2,5 ng /ml 5000 ng /ml, samoin kuin korkea (3500 ng /ml), keski (200 ng /ml) ja matalan (37,5 ng /ml) laadunvalvonta dFdU standardeja.

Kaikki näytteet sekoitettiin ja sentrifugoitiin 5000 rpm: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. 200 ui supernatanttia siirrettiin 96-kuoppaiselle levylle ja haihdutettiin kuiviin. Sitten näytteet liuotetaan 200 ui vettä, vorteksoitiin 5 minuuttia ja dFdU kvantifioitiin LC-MS /MS ja normalisoitiin proteiinin kokonaismäärästä pitoisuudet.

in vitro

kilpailun määritys oli suoritetaan entsyymin ote käsittelemättömän allograft kasvaimen käyttäen edellä kuvattua protokollaa. Entsyymi Uute sekoitettiin kiinteä pitoisuus 1800 uM GEM, jotka vastaavat Km CDA tämän entsyymin uutetta, ja jotka vaihtelevat annokset DFCR (0-1200 uM) kilpailijana. DFdU muuntaa GEM kvantifioitiin LC-MS /MS.

Tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen GraphPad Prism versio 5.0. Merkitys erot CAP antituumoriteholla, CDA Vmax ja Km CAP vehikkeliä vastaan ​​määritettiin käyttäen paritonta t-testiä. Suvaiten ja GEMCAP yhdistelmä tutkimuksissa ero kasvain kasvaimet analysoitiin käyttämällä yksisuuntainen ANOVA seurasi Newman-Keuls monivertai- testin jälkeen.

Tulokset

farmakokinetiikkaan tai CAP ja sen aineenvaihduntatuotteiden hiirikudoksissa

tutkimiseksi farmakokinetiikkaa CAP ja sen aineenvaihduntatuotteet analysoimme massaspektrometrialla homogenaatteja plasman, kasvain ja maksan hiirten, joilla K8484 siirteen kasvain kerättiin eri ajankohtina kerta-annoksen CAP annetaan suun kautta 755 mg /kg (2,1 mmol /kg /päivä). Tämä annos on ihmisen vastaava annos, määritetään menetelmän Reagan-Shaw et ai [26]. CAP, DFCR ja DFUR löytyivät 3 kudoksissa kunakin ajankohtana (kuva 1). Plasma C

max DFCR oli 393 ± 27 uM (20 min) ja DFUR 125 ± 90 uM (40 min) (kuva 1A). Kasvainkudoksessa, DFCR ja DFUR C

max oli 256 ± 7 uM ja 101 ± 7 uM 45 min kuluttua CAP annon ja laski 64,4 ± 45,3 uM ja 46,4 ± 28,1 gM kuluttua 4 h (kuvio 1 B). Maksan, C

max kaikkien aineenvaihduntatuotteiden saavutettiin 10 minuuttia annostelun jälkeen ja sitten pienenivät asteittain (kuvio 1 C). Pitoisuudet maksassa DFCR olivat korkeammat kuin kasvain samasta hiirillä ja maksassa DFUR pitoisuudet olivat pienemmät, vastaa aiemmin raportoitu jakaumat CES ja CDA kudoksissa [5]. Intra-kasvaimia pitoisuuksia 5-FU nostetaan asteittain 12,7 ± 3,7 pM ja 10 minuutin kuluttua 49,5 uM 1 tunnin jälkeen ja putosi 10,7 ± 3,4 uM 4 h kuluttua (kuvio 1 B). Kuten

in vitro

kokeita K8484-solut osoittivat IC

50 5-FU: 2,56 ± 0,55 uM (tuloksia ei ole esitetty), nämä

in vivo

tulokset viittaavat siihen, että suun kautta CAP annostelu antaa terapeuttisesti tehokas annos siirteen kasvaimia. 5-FU pitoisuudet olivat yli 30 kertaa pienempi plasman (1,9 ± 0,5 uM 40 min ja 0,3 ± 0,2 uM kuluttua 4 h) kuin kasvain ja olivat alle määritysrajan maksassa 2 h (kuvio 1 C). Farmakodynaaminen tutkimus suoritettiin myös määrittämään miten yksittäinen 755 mg /kg CAP annos leviämisen K8484 siirteen kasvaimia. Kasvaimet kerättiin 40 min, 2 h ja 4 h annostelun jälkeen ja immunohistokemia varten fosfo-histoni H3 (PH3) kvantifioitiin. PH3 värjäys väheni huomattavasti 4 tunnin kuluttua annostelusta (P 0,01; kuvio 1 D) verrattuna kontrolliin, paljastaen lasku mitoosi solujen määrä seuraavan CAP hoitoa.

metaboliitin pitoisuutta plasmassa (A), K8484 siirteen kasvain homogenaatteihin (B) ja maksahomogenaatte- (C) kerta-annoksen jälkeen CAP 755 mg /kg. Keskiarvo ± SD (n = 3, lukuun ottamatta 45 min ja 1 h, jossa n = 2). (D) immunohistokemiaallisesti fosfo-histoni H3 (PH3) määrällisesti KPC siirteen kasvaimia eri ajankohtina kerta 755 mg /kg CAP annos. Keskiarvo ± SEM vähintään kolme kasvaimet (** p 0,01). (E) metaboliitin pitoisuutta KPC hiirikudoksissa 2 tuntia viimeisen 7 peräkkäistä annosta CAP 755 mg /kg, keskiarvo ja SEM 6 hiirillä. (F) 5-FU pitoisuudet 2 h annoksen jälkeen (yhtenäinen viiva) tai viisi peräkkäistä annosta (katkoviiva) ja CAP (755 mg /kg) annettuna hiirille, joilla K8484 allograft kasvaimia.

on osoitettu aikaisemmin, että

in situ

KPC PDAC kasvaimia ovat vähemmän herkkiä GEM kuin KPC allotransplantaatteja huolimatta identtinen

Kras

ja

p53

genotyyppiä, ja tämä ero herkkyydessä johtui rajoitetun lääkeaineen KPC kasvaimiin [18]. Siksi olemme analysoineet määrä CAP ja metaboliittien kudoksissa KPC kasvain hiirille jälkeen seitsemän päivän CAP hoidon (755 mg /kg). Plasmassa ja maksassa CAP, DFCR, DFUR ja 5-FU pitoisuudet olivat samankaltaiset KPC hiiret ja siirteen isännät 2 tuntia viimeisen annoksen jälkeen (kuvio 1 E). Vuonna KPC PDAC kasvaimia, 5-FU pitoisuudet olivat 26,9 ± 14,3 uM (kuvio 1 E) verrattuna 23,0 ± 8,1 uM KPC allograftin kasvaimia, 2 h kuluttua yhden CAP-annos (kuvio 1 B). Koska ero tutkimussuunnitelman (7 annokset KPC hiirillä versus yhtenä annoksena K8484 siirteessä), vertasimme myös datan kanssa riippumattoman PK tutkimus suoritetaan sen jälkeen 5 vuorokausiannokset CAP antaa hiirillä K8484 vieraskudossiirteitä. Tässä tutkimuksessa 5-FU pitoisuudet kasvain 2 h kuluttua viides peräkkäinen annos CAP oli 22,7 ± 7,7 uM (kuvio 1 F), joka vastaa 5-FU-pitoisuuksien jälkeen yhtenä annoksena allograftin kasvain (kuvio 1 B) tai sen jälkeen 7 peräkkäisen annokset KPC kasvaimissa (kuvio 1 E). Nämä tiedot viittaavat siihen, että useita annoksia CAP ei johtanut 5-FU kertyminen kasvaimeen. Nämä tulokset osoittavat, että suun kautta CAP toimitti saman määrän 5-FU, että

in situ

PDAC kasvaimia ja siirteen kasvaimia.

CAP antituumoriteholla haiman Kasvaimet

ensin tutkittiin vaikutusta CAP kasvuun K8484 siirteen kasvaimia. Hiiriä vehikkeliä tai CAP 755 mg /kg 5 päivää viikossa. 3 viikon kuluttua, ajoneuvo-hoidetut hiiret osoittivat keskimäärin kasvaimen 1840 ± 201 mm

3 verrattuna 629 ± 86 mm

3 CAP-käsitellyissä hiirissä (kuvio 2A), joilla on merkittävä kasvaimen kaksinkertaistumisaika 3,5 ± 0,5 päivää ajoneuvon 7,5 ± 3,0 päivää in CAP-käsitellyissä hiirissä (p = 0,0002; kuvio 2B).

(A) Kapesitabiini tehokkuus hiirillä K8484 siirteen kasvaimia. Eläimet saivat 755 mg /kg vuorokaudessa 5 peräkkäisenä päivänä viikossa 3 viikon ajan. Kasvainten tilavuudet edustettuina keskiarvo ± SEM 12 ajoneuvo- ja 13 CAP-käsiteltyihin hiiriin (** p 0,01). (B) Kasvaimen kaksinkertaistaa aikaa kunkin kasvaimen (*** p 0,001).

sitten vielä lyhyen aikavälin tehotutkimuksessa

in situ

KPC PDAC malli . KPC hiiriä hoidettiin CAP 755 mg /kg 7 peräkkäisen päivän ajan ja kasvainten tilavuudet tarkkailtiin kahdesti viikossa 3D ultraääni. Kasvaimen kasvu hidastui CAP-käsiteltyjen KPC hiirissä verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin hiiriin (kuvio 3A). Volyymi Cap- käsiteltyjen kasvainten oli 121 ± 10,2% verrattuna 199 ± 21,8% vuonna valvonta (p 0,01; kuvio 3B). Kasvainten kudos kerättiin 2 tunnin kuluttua viimeisen annoksen CAP. PH3 värjäys paljasti vähemmän solujen mitoosia CAP-käsiteltyjen kasvainten kontrolliin verrattuna (p 0,05; kuvio 3C), mikä viittaa kasvun pysähtymisen.

(A) Lyhytaikainen kapesitabiinin tehoa tutkimuksessa KPC hiirten

vuonna situ

PDAC, annosteltiin 755 mg /kg 7 peräkkäisen päivän ajan. Kasvainten tilavuudet ajoneuvojen ja CAP mitattiin ultraäänellä ja normalisoidaan kasvaimen tilavuus päivänä ilmoittautuminen tutkimuksessa (keskiarvo ± SEM, n = 6 ryhmää kohti). (B) Kasvaimen tilavuus päätepisteessä prosenttiosuutena määrästä alussa, vuonna KPC käsitellyillä hiirillä ajoneuvon tai CAP (keskiarvo ± SEM, n = 6 kussakin ryhmässä; ** p 0,01). (C) immunohistokemiaallisesti fosfo-histoni H3 oli määrällisesti PDAC kasvaimissa 2 h kuluttua 7

th ja viimeinen annos CAP 755 mg /kg. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (n = 6 ryhmää kohti; * p = 0,027).

Vaikutus CAP hallinnon KPC Hiiret Survival verrattuna GEM

farmakokineettiset tiedot osoittivat tehokasta 5-FU toimitus ja lyhyen aikavälin CAP tehotutkimuksen tiedot johtivat meidät verrata maatalouspolitiikan GEM vuonna pitempiaikainen tutkimus käyttäen selviytyminen kuin päätepisteenä. KPC hiiriä hoidettiin joko CAP 755 mg /kg 5 päivää viikossa tai 100 mg /kg GEM 3 päivän välein. Tulokset havaittiin, että selviytyminen oli samanlainen 2 ryhmää; mediaanielinajassa 8 ja 10,5 päivää CAP ja GEM vastaavasti P = 0,61 (kuvio 4A). Pisin eloonjääminen oli 67 päivää YMP ryhmässä verrattuna 26 päivää GEM ryhmään. Lisäksi ei ollut eroa kasvaimen kasvun välillä Cap- ja GEM- testiryhmään (kuva 4B), mikä viittaa samanlainen tehoa GEM ja maatalouspolitiikan PDA.

(A): Kaplan-Meier -käyrät kapesitabiinin (haudottu ) ja gemsitabiinin (kiinteä) selviytymisen. P = 0,61 Log-Rank testi, riskisuhde = 0,78, 95%: n luottamusväli 0,29-2,06 (n = 10 ryhmää kohti). (B): Yksittäiset kasvukäyrät Cap- (musta) ja GEM-käsitellyt tuumorit (punainen). Volyymit normalisoitiin tilavuus päivä ilmoittautuminen selviytymisen tutkimuksessa.

vaikutus GEMCAP Yhdistelmä

Seuraavaksi yhdistelmä GEMCAP tutkittiin. Jotta valita sopiva annoksen, ensin tutki siedettävyyttä että yhdistelmä hiirillä K8484 vieraskudossiirteitä. Hiiriä käsiteltiin GEM 100 mg /kg 3 päivän välein yksin tai yhdessä CAP annetaan 5 päivää viikossa 755 mg /kg, 539 mg /kg tai 378 mg /kg. Kaikki kolme yhdistelmää käyttäen täyden annoksen GEM aiheuttama merkitty ruoansulatuskanavan toksisuutta osoitettu hiiren kehon painon ja histologia hiiren ohutsuolessa: lyhentää Villi kanssa häiritsi arkkitehtuuri ja crypt tappio (Supplemental kuva S1 D, F). Kumpikaan CAP 755 mg /kg tai GEM 100 mg /kg yksinään havaittu mitään ruoansulatuskanavan toksisuutta (kuva S1, A – C) Siksi toisti kokeen samalla CAP annosten mukaisesti vähennetty GEM annoksella (75 mg /kg). Yhdistelmä ryhmä hoidettiin 755 mg /kg CAP osoitti aikaisin myrkyllisyys, vahvisti ohutsuolen histologia (kuva S1, G). Yhdistelmä 539 mg /kg CAP (71% täydestä annoksesta) ei esiintynyt merkkejä toksisuudesta yli kaksi hoitojaksoa (11 päivää). Näiden tulosten perusteella, siksi käytetään turvallisempaa annoksia 539 mg /kg CAP ja 75 mg /kg GEM tutkia tehoa GEMCAP yhdistelmän hiiriä K8484 vieraskudossiirteitä. 3 viikon kuluttua, GEM vähensi merkitsevästi kasvaimen kasvua (p 0,001) verrattuna vehikkeliin, samoin kuin CAP yksinään (p 0,05) (kuvio 5). Välillä havaittu ero GEM ja CAP yksin ollut merkittävä (P 0,05). GEMCAP yhdistelmä inhiboi merkittävästi kasvaimen kasvua kasvaimen kaksinkertaistaa aikaan 8,6 ± 10,8 päivää (verrattuna 2,7 ± 0,9 päivää hallinnassa), mutta tämä ei ollut parempi GEM yksin (kasvain kaksinkertaistaminen aikaan 7,2 ± 2,8 päivää) ja ei merkittävästi poikkea CAP yksin. Aikana 3

rd hoitoviikosta, joissa hiirille on annettu GEMCAP yhdistelmä alkoi näkyä myrkyllisyys (laihtuminen), verrattuna ainoana lääkkeenä käsitellyistä hiiristä mutta suoliston histologian päätepisteessä ilmestyi normaali (kuva S1, H ja I). ​​

GEMCAP yhdistelmän teho hiirillä KPC siirteen kasvaimia. Eläimet saivat ajoneuvon tai GEM joka 3 päivä 75 mg /kg tai CAP 539 mg /kg, 5 päivää viikossa tai yhdistelmä näistä kaksi annosta. Kasvainten tilavuudet edustettuina keskiarvo ± SEM (n = 5 ryhmää kohti; * p 0,05, *** p 0,001 verrattuna ajoneuvoon ns: ei merkitsevä).

Nämä tiedot, osoittaa puutteellista yhdistelmän synergiaa, ovat yhdenmukaisia ​​alkaen

in vitro

-sytotoksisuusmäärityksiä me suoritettiin K8484 soluissa ja ihmisen haiman solulinjoissa (MiaPaca-2 ja Panc-1) annosteltiin erilaisia ​​5- FU ja GEM-yhdistelmä, jossa lisäaine mutta ei synergistisiä vaikutuksia havaittiin (kuva S2). Yhdessä tuloksemme osoittivat lisäaine solumyrkkyvaikutuksessa

in vitro

mutta myös lisäaineena myrkyllisyyttä

in vivo

. Siksi GEMCAP ei johda parantunut terapeuttinen indeksi hiirillä verrattuna GEM yksin.

Sitten tutkittiin kasvaimen CDA aktiivisuutta. Käyttäen GEM substraattina, määritimme tulosprosentti GEM osaksi dFdU ja kineettisyysvakioiden CDA, Vmax ja Km, vuonna ajoneuvo- ja CAP-käsiteltyjen siirteen kasvaimet (kuva 6). Tulokset oli vähentynyt Vmax ja Km in CAP-käsiteltyjen kasvainten (15,1 ± 2,6 nmol /h /mg proteiinia ja 1320 ± 147 uM) verrattuna hoitamattomiin kasvaimia (56,3 ± 7,2 nmol /h /mg proteiinia ja 1880 ± 82 uM; kuvio 6C ja 6D) viittaa siihen, että gemsitabiinia metaboloivan kapasiteettia CDA vähennettiin siirrettyjen PDAC kasvaimissa aikana CAP hoidon. Koska kasvaimet kerättiin välillä 2 h ja 4 h kuluttua viimeisen annoksen CAP, mietimme jos vähentynyt aktiivisuus johtui välistä kilpailua lisätty GEM alustan ja DFCR jo kasvaimia. Siksi suorittanut

in vitro

kilpailun määritys käyttäen entsyymiä ote käsittelemätön allograft kasvain, kiinteän GEM pitoisuus 1800 uM, joka vastaa Km CDA entsyymin uutteen ja DFCR pitoisuuksina 0-1200 uM . Tulokset, esitetty kuviossa 6E, osoitti vähäisiä muutoksia tulosprosentti GEM osaksi dFdU jopa läsnäollessa korkein pitoisuus DFCR. LC-MS /MS-analyysit CAP-käsiteltyjen kasvainten paljasti, että korkeimmat DFCR pitoisuudet olivat 511 uM, rajoissa testattiin tässä kilpailussa määrityksessä, joka tukee että havaittu väheneminen CDA aktiivisuuden CAP-käsitelty kasvaimia ei liittynyt alustaan kilpailu. Tämä viittaa siihen, että CAP-hoito voi downregulate CDA aktiivisuutta.

CDA-entsyymin aktiivisuus määritettiin käsittelemättömän (A) ja CAP-käsitelty (B) KPC siirteen kasvaimia käyttäen GEM substraattina. Muuntokurssi GEM osaksi dFdU mitattiin homogenaateissa yksittäisten kasvainten lopussa YMP tehotutkimuksessa esitetty kuvassa 2, ja kineettisyysvakioiden Vmax (C) ja Km (D) määritettiin (n = 10 ryhmää kohti; * * p 0,01, *** p 0,001). (E)

In vitro

kilpailun määritys suoritettiin entsyymi ote hoitamatta allograft kasvain. Kiinteä GEM pitoisuus 1800 uM, joka vastaa Km CDA entsyymin uutteen ja DFCR pitoisuuksina 0-1200 uM käytettiin.

Koska

in vivo

myrkyllisyys ja puute tehostetun vaikutuksen GEMCAP verrattuna GEM yksin allograftien emme testata GEMCAP sisään KPC PDAC hiirillä, joiden terveys on vähemmän kestävä.

keskustelu

opinnot esitetään tässä tarjota , ensimmäistä kertaa, prekliiniset tiedot farmakokinetiikasta ja tehoa kapesitabiinilla geenimuunnossolulinjoissa hiirimallissa PDAC. Käytimme Kras

G12D; Trp53

R172H; Pdx1-Cre hiirimallissa [12], koska se esitetään yhteenveto kliinisen oireyhtymän ja histopatologia ihmisen sairauden. Meidän farmakokineettiset tiedot osoittivat, että suun kautta antamisen jälkeen, CAP metaboloituu plasmassa, maksassa ja kasvain. Pitoisuudet CAP aineenvaihduntatuotteiden kussakin näissä osastoissa ovat yhdenmukaisia ​​löydetty ihmisen paksusuolen syövän ksenografti- [27]. Ne ovat myös sopusoinnussa aiemmin raportoitu jakautuminen osallistuvien entsyymien YMP aineenvaihduntaa ihmisen ja hiiren [5], [27]. 5-FU havaittiin korkeammilla tasoilla kasvain kuin plasmassa 30 minuuttia annon jälkeen ja oli havaita maksassa vahvistaa kasvaimen selektiivisen 5-FU jälkeen CAP annon myös kuvanneet Ishikawa et al. [6]. Alhainen 5-FU plasmassa ja maksassa voi selittää alhainen myrkyllisyys CAP annoksella 755 mg /kg: yksikään hiiristä osoittivat myrkytysoireiden vuoksi CAP hoito yksinään.