Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Claudins ovat kalvoproteiineja että kriittisiä rooleja tiiviin liitoksen (TJ) muodostuminen ja toiminto. Jäsenet klaudiini geeniperheen on osoitettu olevan poikkeavasti säänneltävä, ja osallistua synnyssä erilaisten ihmisen syöpien. Tässä tutkimuksessa raportoimme että klaudiini-11 (

CLDN11

) vaimentuu mahasyövän

kautta

hypermetylaatiota sen promoottorialueen.

Menetelmät /Principal Havainnot

tasot

CLDN11

metylaation ja mRNA: n ilmentymisen mitattiin ensisijainen mahasyövän kudoksiin, noncancerous mahan limakalvoja, ja solulinjoja mahalaukun peräisin kvantitatiivisin metylaatiospesifinen PCR (qMSP) ja kvantitatiivinen käänteistranskriptaasi-PCR (qRT-PCR), vastaavasti. Analyysit pariksi syöpien ja viereisten normaali mahan kudoksissa paljasti hypermetylaatiota

CLDN11

promoottorialueen syöpien, ja tämä hypermetylaation korreloi merkitsevästi downregulation

CLDN11

ilmaisun

vs.

normaalit kudokset.

CLDN11

promoottorialue myös hypermetyloitunut kaikissa mahasyövässä testatuissa solulinjoissa suhteessa kuolemattomaksi normaaliin mahalaukun epiteelisolujen. Lisäksi

CLDN11

-mRNA korreloi käänteisesti sen metylointi tasolla. Hoito

CLDN11

-nonexpressing mahasyövän soluja 5-atsa-2′-deoksisytidiini palautettu

CLDN11

ilme. Lisäksi siRNA-välitteisen knockdovvn

CLDN11

ilmentymistä normaaleissa mahalaukun epiteelisolujen lisäsivät liikkuvuutta ja invasiivisuus.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tiedot viittaavat siihen, että hypermetylaatiota

CLDN11

, mikä vaimentua ilme, edistää mahasyövän lisäämällä solujen liikkuvuutta ja invasiivisuus. Lisäksi ymmärrys mekanismeista roolia klaudiini proteiinien mahasyövän todennäköisesti auttaa tunnistamaan uusia lähestymistapoja diagnosointiin ja hoitoon mahasyöpä.

Citation: Agarwal R, Mori Y, Cheng Y, Jin Z, Olaru AV, Hamilton JP, et ai. (2009) vaiennettu Claudin-11 liittyy lisääntynyt invasiivisuus mahasyövän Cells. PLoS ONE 4 (11): e8002. doi: 10,1371 /journal.pone.0008002

Editor: Fatah Kashanchi, George Washington University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 elokuu 2009; Hyväksytty: 23 lokakuu 2009; Julkaistu 24. marraskuuta 2009

Copyright: © 2009 Agarwal et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Yhdysvaltain National Institutes of Health myöntää CA085069, CA138677 ja CA146799 SJ Meltzer. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) jää toiseksi yleisimmäksi syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti. Se on yksi kaikkein vaarallisin syöpäsairauksia sekä johtava syy syöpäkuolemista kehitysmaissa, joissa yleinen 5-vuoden eloonjäämisluvut alle 20% [1], [2].

Opiskelu GC ja niiden preneoplastista esiaste vaurioita ovat tunnistaneet useita geneettisiä ja epigeneettiset muutokset, kuten mikrosatelliittien epävakaus, pistemutaatiot, ja heterotsygotian menetys (LOH) vaikuttavat tuumorisuppressorigeeneille (APT) [3] – [6]. Kuitenkin, molekyyli patogeneesi GC on vielä epätäydellisesti ymmärretty.

Epigeneettiset muutokset ovat erittäin tärkeitä syövän kehittymisessä ja etenemisessä [7]. Transkription inaktivointi tuumorisuppressorigeeneille kautta poikkeava promoottori hypermetylaation CpG-saarekkeiden, aiheuttaa pysyviä geenien, on merkittävä epigeneettiset mekanismi TSG inaktivaation.

Aiemmin tutkimuksia on julkaistu promoottori hypermetylaation in GC ja niiden syöpää edeltävät esiasteita [ ,,,0],8] – [10]. p16INK4A ja p15INK4B olivat ensimmäisiä geenit näyttää hypermetylaation in GC [11]. Ryhmämme ja muut myöhemmin löysi hypermetylaatiota hMLH1 DNA mismatch korjaus geenin GC näytteille usein mikrosatelliittien epävakaus (MSI-H) [12] – [14]. Osoitimme myös, että hypermetylaatiota E-kadheriinin (CDH1) geeni esiintyy usein GC [15].

pilotti microarray-pohjainen genominlaajuisten haku suoritti ryhmämme, suoritetaan löytää uusia epigeneettiseltä vaiennettu geenien mahasyövän, jonka tunnuksena klaudiini-11 (

CLDN11

), tiukka risteykseen (TJ) proteiini, mahdollisena kohteena epigeneettiset inaktivaatiomenetelmät syöpien (julkaisemattomia tuloksia).

Claudin-11 kuuluu perheeseen klaudiini proteiineja, joka sisältää yli 23 jäsentä. Jäsenten klaudiini perheen ilmaistaan ​​erittäin kudosspesifisellä tavalla eri normaalien ja neoplastisten kudosten [16]. Claudins ovat transmembraaniproteiineja että keskeisessä asemassa ovat TJ muodostumista ja toimintaa. TJs ovat välisissä liitoksissa kriittisiä parasellulaarisen kuljetukseen liuenneita aineita, sekä ylläpitää solussa napaisuus. Kasvainsolut, esiintyy yleisesti rakenteellisia ja toiminnallisia häiriöitä niiden TJs [17].

Viime vuosina useat tutkimukset ovat osoittaneet, poikkeava ilmentyminen klaudiini proteiinien eri syöpätyypeissä [18], [16]. Useat näistä tutkimuksista löytyy häiriöstä klaudiini proteiinin ilmentymisen

kautta

promoottori hypermetylaation. Hypermetylaation aiheuttama vaiennettu klaudiini-7 ilmentyminen on aiemmin raportoitu rintojen [19] ja peräsuolen [20] karsinoomat. Claudin-6 on myös epigeneettiseltä vaiennetaan rintasyövässä [21], kun taas claudins -3 ja -4 ovat epigeneettiseltä säännellään munasarjasyöpäsoluja [22], [23].

Nykyinen tutkimus tunnistaa ja raportit, jotta tietomme ensimmäistä kertaa, että

CLDN11

promoottorialue hypermetyloitunut GC kudoksissa ja solulinjoissa. Lisäksi, kun taas

CLDN11

mRNA ilmentyy kaikissa ensisijainen noncancerous mahalaukun limakalvon kudoksissa, sekä kuolemattomaksi normaali mahan epiteelisolulinja, se oli vaiennettu kaikissa GC kudoksissa ja solulinjoissa tutkittiin. Mielenkiintoista, siRNA-välitteinen downregulation

CLDN11

in

CLDN11

ilmentävää mahalaukun soluissa liittyi myös syöpään liittyvien fenotyyppisten muutosten, erityisesti lisääntynyt solun liikkuvuus ja invasiivisuus.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja Clinical kudosnäytteiden

Immortalized ihmisen normaali mahan epiteelisolujen (HFE145) saatiin tri Duane T. Smoot (Howard University) ja GC solulinjat AGS, SIIA MKN28, KATOIII, ja SNU-1 saatiin ATCC: ltä. Kaikkia solulinjoja viljeltiin ja ylläpidettiin RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% antibiootti-antimykoottiliuoksella (Invitrogen).

Parilliset ensisijainen mahalaukun normaalien ja tuumorikudosten kerättiin Johns Hopkins Hospital ( JHH). Näytteet olivat snap-jäädytetty heti resektion.

Ethics lausunto

Johns Hopkins University (JHU) Institutional Review Board (IRB) hyväksyntä saatiin kaikissa tapauksissa mukana tutkimuksessa. Tapaukset saatiin JHU kirurginen patologia alle JHU IRB-hyväksytty vapautus 02-07-19-05e säännön nojalla 45 CFR 46,101 (b), joka poikkeaa saamisen edellytykset potilaan suostumus.

puhdistus ja Genomisen DNA ja Total RNA

Perimän DNA uutettiin snap-jäädytetty kudosnäytteistä tai solulinjoja käyttämällä DNeasy Veri Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA) valmistajan protokollaa. Kokonais-RNA uutettiin Trizol-reagenssia (Invitrogen). Uutettua DNA: ta ja RNA kvantitoitiin käyttäen NanoDrop ND-1000 Spektrofotometri (NanoDrop, Wilmington, DE).

Quantitative metylaatiospesifinen PCR (qMSP) ja Claudin-11

genomisia DNA: ita on saatu 36 potilaan näytettä, joka sisältää 18 GC ja 18 täsmäsi noncancerous mahan limakalvojen (NS) kudoksissa, samoin kuin eri mahalaukun solulinjoja, alistettiin qMSP. qMSP suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu, vähäisin muutoksin [24]. Lyhyesti, bisulfiittikäsittelyn genomi-DNA: iden suoritettiin käyttäen EpiTect bisulfiittikäsittelyä Kit (QIAGEN, Valencia, CA). MSP-amplikoni ja TaqMan-koettimella on havaita täysin metyloidut DNA oli suunniteltu sisältää useita CpG-sivustoja 5′-UTR-alue

CLDN11

geenin.

CLDN11

erityisiä alukkeita ja koetinsekvenssit käytettiin: forward-aluke 5 ’CGCGATTGGTCGGCGCGTTTC 3’; reverse-aluke 5 ’GACGAAAACAACAACGCTACT 3’; TaqMan-koetin 5’TCGGAGTCGCGGGGTTTAAAGAG 3 ’. CpGenome Universal Metyloitu DNA (Chemicon International, Temecula, CA) toimi positiivisena kontrollina, ja sarjalaimennoksia sitä käytettiin piirtää standardikäyrän. qMSP kanssa TaqMan koetin tehtävä sellaisen iQ5 lämpösyklilaite (BioRad, Hercules, CA) käyttäen iQ Supermixiä (

em.

). Viisikymmentä sykliä PCR-monistuksen lähtien 50 ng ui bisulfiittikäsiteltyä genomisen DNA tehtiin kolmena kappaleena, mukaan valmistajan protokollaa. Duplex PCR β-aktiini (ACTB) aluketta ja koetin sekvenssit, joissa ei ole CpG: t tehtiin normalisoinnin. Aluke ja koetinsekvenssit käytettiin olivat aiemmin julkaistuista [24]. Normalisoitu metylaatio arvo (NMV) on määritelty seuraavasti: NMV = (

CLDN11-S

/

CLDN11-FM

) /(

ACTB-S

/

ACTB Fm

) * 100, jossa

CLDN11-S

ja

CLDN11-FM

edustavat

CLDN11

metylaatiotasoilla näytteessä ja täysin metyloidut DNA: t, vastaavasti, kun taas

ACTB-S

ja

ACTB-FM

vastaavat

β-aktiini

näytteessä ja täysin metyloidut DNA: t, vastaavasti. Koko genomin monistettu DNA (WGA) käytettiin metyloimattoman negatiivisena kontrollina.

Quantitative Käänteinen transkriptio-PCR-analyysi

CLDN11

RT-PCR-amplikoni on suunniteltu päällekkäisiä introni-eksoni rajan, jotta suljetaan genomista DNA (

g

DNA) vahvistusta. Primer sekvenssit kuten aiemmin julkaistuista [18]. Yksi askel qRT-PCR suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [24], käyttämällä Quantitect SYBRA RT-PCR-kittiä (QIAGEN, Valencia, CA), mukaisesti valmistajan protokollaa.

CLDN11

ilmaus normalisoitiin

β

aktiinin ilme. Kokonais-RNA HFE145 soluja käytettiin standardikäyrää. (

CLDN11-S Twitter /

CLDN11-C

) /(

ACTB-S Twitter /

ACTB-C

), jossa

CLDN11- S

ja

CLDN11-C

edustavat

CLDN11

mRNA ekspressiotasot testinäytteen ja ohjaus mRNA: t, vastaavasti, kun taas

ACTB-S

ja

ACTB -C

vastaavat

β-aktiinin

ekspressiotasot testinäytteessä ja valvonta-mRNA: iden, vastaavasti.

5-atsa-2′-Deoksisytidiini (5-atsa-dC) hoito

AGS on GC solulinja ilmentää hypermetylaatiota

CLDN11

promoottori yhdessä poissa

CLDN11

mRNA ilmaisun. 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC) solujen käsittely suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, GC solulinja AGS (ATCC luettelonumero CRL-1739) siirrostettiin tiheydellä 2 x 10

5 solua /ml T-75 pulloon. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin solut käsiteltiin 1 uM 5-atsa-dC: ssa 72 tuntia. Media, joka sisältää 5-atsa-dC korvattiin juuri valmistettu media 24 tunnin välein. Sitten solut otettiin talteen ja kokonais-RNA uuttamalla. Yhteensä RNA: iden AGS soluista ennen ja jälkeen 5-atsa-dC hoito tehtiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR-analyysillä.

Sirna Knockdown Kokeet

CLDN11

erityisiä siRNA oligot ostettiin Ambion, Inc. (Austin, TX). HFE145 solulinja, joka on

CLDN11

positiivinen, valittiin vaikutuksen tutkimiseen klaudiini-11 Knockdown maahanmuutosta ja hyökkäys ominaisuuksia mahan soluja. Kokeet suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu (Agarwal

et ai.

, 2005). Soluja viljeltiin 6-kuoppalevyillä transfektoitiin siRNA-dupleksit käyttämällä LipofectAMINE 2000 (Invitrogen) seuraten valmistajan ohjeita. Mock-transfektioissa ja epäspesifinen siRNA-dupleksit käytettiin negatiivisina kontrolleina. Soluja käsiteltiin 48 72 tuntia jotta mahdollisimman Knockdown, jonka jälkeen ne joko korjattu Western blot analyysiä tai migraatioon ja invaasion määrityksissä.

Western Blot analyysi Claudin-11 Mahalaukun Cell Lines

Konfluentteja soluviljelmiä pestiin HBSS (Invitrogen) ja kokosolulysaateista tehtiin käyttäen lyysipuskuria: 62,5 mmol /L Tris-HCI (pH 6,8), 10% glyserolia, ja 2% SDS: ää. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen bikinkoniini- happoa (BCA) -määrityksellä (Pierce, Rockford, IL). Kaksikymmentä mikrogrammaa kokonais-proteiinit erotettiin 10%: sta 20% SDS-PAGE: Tris-glysiini-geeleissä (Invitrogen) ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Millipore Corp., Bedford, MA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa, pestiin TBST-puskurissa, ja tutkittiin anti-klaudiini-11-vasta-ainetta (Zymed, San Francisco, CA). Sitten blotit pestiin ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (anti-kani-IgG: 1:10,000; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Havaitsemiseen, kemiluminesenssin suoritettiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia (Amersham Pharmacia Biotech).

Cell Invasion ja Migration Pitoisuus

invasiivisuus siRNA-transfektoiduissa soluissa määritettiin käyttämällä Matrigel-päällystettyjä invaasio kammion insertit (24-well-muodossa 8-um huokosia, BD Biosciences) käyttäen muunneltua Boyden kammion määritys [25]. Soluja viljeltiin noin 80%: n konfluenssiin ja seerumia yön yli. Päivänä määritystä solut käsiteltiin trypsiinillä ja elinkelpoisten solujen määrä ottaa. Noin 50000 solut maljattiin päällekkäin jokaisen suodattimen seerumia. Yhtä suuri määrä samaa alustaa, joka sisälsi 20% FCS: ää, pantiin alempaan kammioon (

ts.

, Hyvin alla suodatin) toimimaan kemoattraktantti. Koelevyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa korkeintaan 48 tuntia. Solut, jotka eivät muuttaneet tai hyökätä huokosten läpi Transwell insertit poistetaan käsin pumpulipuikolla. Solujen läsnä alareunassa kalvon kiinnitettiin kylmällä metanolilla 10 minuutin ajan, ja sitten värjättiin 0,01% kristalliviolettia 20% etanolia. 10 minuutin inkubaatioajan jälkeen, suodattimet pestiin huolellisesti vedellä ja suspendoitiin 200 ul: aan 5% etikkahappoa ja 5% metanolia. Kolorimetrinen lukemat otettiin OD

595. Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa, ja kolmena rinnakkaisena kussakin kokeessa. Arvioida solujen vaeltamiseen, määritykset suoritettiin olennaisesti kuten edellä, paitsi että solut maljattiin päälle päällystämättömän (matrigeelin-vapaa) inserttejä.

Tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Studentin t -testi (SPSS, versio 16), jossa

p

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

tulokset ja keskustelu

testattiin ensin hypoteesia, että

CLDN11

promoottori hypermetyloitunut ja että tämä hypermetylaation korreloi käänteisesti

CLDN11

mRNA: n ekspression ensisijainen GC kudoksissa. Pariksi ensisijainen mahalaukun normaalin ja kasvaimen kudokset kerättiin Johns Hopkins Hospital (JHH). Näytteet saatiin heti resektion ja pikajäädytettiin käyttöön asti. Ainoastaan ​​tapauksissa saatu tietoisen suostumuksen hyväksymä Institutional Review Board (IRB) sisällytettiin tässä projektissa. Genomisia DNA: ita saatiin 36 kliinisistä näytteistä, jotka käsittävät 18 GC ja 18 Hyväksytty noncancerous mahalaukun limakalvon (NS) kudoksiin.

CLDN11

promoottorin metylaation tasot näissä analysoitiin käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen metylaatiospesifinen PCR (qMSP). Kuvio 1A näyttää normalisoitu metylaatio arvo (NMV),

ts.

Suhde metyloitua arvosta

CLDN11

promoottorialue kunkin näytteen täysin metyloitu kontrolli-DNA.

CLDN11

NM

Vs

olivat merkittävästi korkeammat GC yksilöitä kuin niiden vastaavat NS kudoksiin (

P

0,001). Sen arvioimiseksi,

CLDN11

promoottori hypermetylaation in GC liittyi vaiennettu

CLDN11

ilme,

CLDN11

mRNA mitattiin käyttämällä kvantitatiivista reaaliaikaista (qRT-PCR) in RNA: t uutetaan 36 yksilöihin, joita käytetään metylointianalyysi. Kuten osoitettu kuviossa 1B, normalisoitu ilmaisu arvot (Nevs) on

CLDN11

GC näytteet olivat huomattavasti pienemmät kuin pariksi NS näytteissä (

P

0,001). Nämä tiedot vahvistetaan, että

CLDN11

promoottori hypermetylaation korreloi heikentynyt tai vaimennettu

CLDN11

mRNA ilmaisun ensisijainen GC.

Tämä kuvio havainnollistaa promoottori metylaation ja mRNA: n ilmentymisen tasot

CLDN11

pariksi mahasyövässä (GC) ja noncancerous mahalaukun limakalvon (NS) kudoksiin. A) Quantitative metylaatiospesifistä PCR (qMSP) varten

CLDN11

perusterveydenhuollossa kudoksissa. Genomi-DNA: ta 18 GC ja 18 täsmäsi NS kudoksia tehtiin qMSP analyysin avulla MSP-amplikoni ja TaqMan-koettimella on suunniteltu myös useita CpG sivustoja 5′-UTR-alue

CLDN11

geenin. CpGenome Universal Metyloitu DNA (Chemicon International, Temecula, CA) käytettiin täysin metyloitu positiivisena kontrollina. Duplex PCR β-aktiini (ACTB) aluketta ja koetin sekvenssit, joissa ei ole CpG: t tehtiin normalisoinnin. Normalisoitu metylaatio arvo (NMV) on määritelty seuraavasti: NMV = (

CLDN11-S

/

CLDN11-FM

) /(

ACTB-S

/

ACTB Fm

) * 100, jossa

CLDN11-S

ja

CLDN11-FM

edustavat

CLDN11

metylaatiotasoilla näytteessä ja täysin metyloidut DNA: t, vastaavasti, kun taas

ACTB-S

ja

ACTB-FM

vastaavat

β-aktiini

näytteessä ja täysin metyloidut DNA: t, vastaavasti. Tämä yksiulotteinen scatterplot osoittaa merkittävästi korkea

CLDN11

promoottori metylaatiotasoilla GC näytteitä verrattuna NS näytteet (

P

0,001

). Koko genomin monistettu DNA (WGA), jota käytetään metyloitumattoman negatiivisena kontrollina ei osoittanut mitään vahvistusta.

P

laskettiin käyttämällä pariksi Studentin t-testiä. B)

CLDN11

mRNA: n ekspression mahalaukun kudoksissa. Kokonais-RNA uutetaan 18 pariksi NS ja GC näytteet altistettiin

CLDN11

erityisiä RT-PCR.

CLDN11

mRNA ilmaisun normalisoitiin

β

aktiini-mRNA ilmaisun kussakin näytteessä.

P

laskettiin käyttämällä pariksi Studentin t-testiä. Tämä juoni osoittaa, että

CLDN11

mRNA-ekspressiotasot olivat merkittävästi alemmat ei-havaittavissa GC yksilöt, kun taas suurin osa vastaavista NS näytteet oli havaittavissa

CLDN11

mRNA tasolla (

P

0,001

). C) 2D-sirontakuvaajaan promoottorin metylaation ja mRNA: n ilmentymisen arvot GC kudoksissa.

CLDN11

mRNA: n ilmentymisen hiljentäminen liittyy promoottori hypermetylaation GC potilailla. Tämä kaksiulotteinen scatterplot osoittaa NEV arvot (Y-akseli) ja NMV arvot (X-akseli) 18 pariksi NS ja GC yksilöitä.

Seuraavaksi arvioitiin

CLDN11

promoottori metylaatio ja ilmaisun mahalaukun solulinjoissa. Ikuisti ihmisen normaalia mahalaukun epiteelisolujen (HFE145) ja GC solulinjat AGS, SIIA, MKN28, KATOIII, ja SNU-1 tutkittiin. Kaikki GC testatuissa solulinjoissa (AGS, SIIA, MKN28, KATOIII, ja SNU-1) osoitti promoottorin hypermetylaatio, kun taas mitään metylaatio havaittu kuolemattomaksi normaaleissa HFE145 solut (kuvio 2A).

CLDN11

mRNA-tasot arvioitiin käyttäen qRT-PCR: ää RNA: t puhdistettiin solulinjoista, kun taas klaudiini-11-proteiinin ilmentyminen analysoitiin Western-blottauksella. Kuten kuvassa 2B on esitetty, kaikki 5 syövän riviä ei esiintynyt havaittavaa ekspressiota

CLDN11

mRNA: n tai proteiinin, kun taas HFE145 solut ilmenee korkea

CLDN11

ekspressiotasoja. Tämä havainto vahvistetaan, että

CLDN11

on koordinoidusti hypermetyloitunut ja vaimentua GC solulinjoissa suhteessa normaaliin mahalaukun epiteelisolujen (NGECs).

Tämä kuvio havainnollistaa klaudiini-11 promoottori metylaatio, mRNA ekspressiotasot ja proteiinin ilmentyminen mahalaukun soluissa linjat. A) Quantitative metylaatiospesifistä PCR (qMSP) varten

CLDN11

. Genomisia DNA: ita eristettiin ikuisti ihmisen normaali mahan epiteelisolujen (HFE145) ja GC solulinjat AGS, SIIA, MKN28, KATOIII, ja SNU-1 saatu ATCC analysoitiin qMSP. Tämä kuvio havainnollistaa, että promoottorialueen

CLDN11

geeni hypermetyloitunut kaikki GC-solulinjoissa suhteessa HFE145 soluihin. B)

CLDN11

mRNA ilmaisun mahalaukun solulinjoissa. Yhteensä RNA: t eri mahalaukun solulinjoja altistettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR-analyysillä. Kuten voidaan nähdä tästä kuviosta, HFE145 solut ilmensivät hyvin korkeita

CLDN11

mRNA, kun taas kaikki viisi syövän testatuissa solulinjoissa oli hyvin alhainen tai havaitsemattomia

CLDN11

mRNA: n ilmentymisen. C) Western blot-analyysi klaudiini-11 ilmentyminen mahalaukun solulinjoissa. Kokosoluliuotteista saatu useista mahalaukun solulinjoja koetettiin anti-klaudiini-11-vasta-ainetta. Tämä kuvio osoittaa, että vaikka kuolemattomaksi normaali mahan epiteelisolulinja, HFE145, ekspressöivät runsaasti klaudiini-11-proteiinin, sitä ei voitu havaita eri GC solulinjoissa. Anti-β-aktiini vasta-ainetta käytettiin latauskontrollina.

edelleen vahvistaa vaiennettu

CLDN11

ilmentymistä hypermetylaation, käsittelimme GC solulinja AGS kanssa demetyloiva agentti, 5-atsa-2-deoksisytidiini (5-atsa-dC, 1 uM), ja vaihtelevin aikavälein. Yhteensä RNA: t uutetaan ennen

vs.

Käsittelyn jälkeen tehtiin qRT-PCR

CLDN11

. Kuten voidaan nähdä kuviosta 3, kullakin ajanhetkellä,

CLDN11

mRNA tuli uudelleen ilmaisi käsiteltäessä 5-atsa-dC, jossa vahvistetaan, että

CLDN11

on vaiennetaan promoottori hypermetylaation vuonna AGS GC soluja.

AGS on GC solulinja ilmentää hypermetylaatiota

CLDN11

promoottori yhdessä poissa

CLDN11

mRNA ilmaisun. Näitä soluja käsiteltiin 5-atsa-dC, maailmanlaajuinen demetyloivan ainetta. Kokonais-RNA AGS solut ennen ja jälkeen 5-atsa-dC käsittely tehtiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR-analyysi

CLDN11

mRNA: n ilmentymisen.

Y-akseli

edustaa keskimääräistä kertainen muutos ekspressiotasot

CLDN11

mRNA jälkeen 5-atsa-dC hoidon eri aikapisteissä, verrattuna käsittelemättömiin soluihin. AGS-soluja, kun käsiteltiin 5-atsa-dC, osoittivat ajasta riippuva nousu

CLDN11

mRNA: n ilmentymisen jopa 72 tuntia hoidon jälkeen. Tämä palauttaminen

CLDN11

ilmaisu jälkeen 5-atsa-dC hoito tukee hypoteesia, että klaudiini-11 on vaiennetaan promoottori hypermetylaation GC soluissa.

jäsenet klaudiini proteiinin perhe on sekaantuneet sääntelyssä soluadheesiota, invaasiota ja migraatio syöpäsolujen [25] – [27]. Siksi tutkimme seuraavaksi

CLDN11

vaikutteita solun liikkuvuus tai invasiivisuus. HFE145 soluja, jotka ilmentävät runsas

CLDN11

, valittiin vaikutuksia tutkittiin

CLDN11

Knockdown on invasiivisia ja muuttavien ominaisuuksien mahalaukun epiteelisolujen. Ohimenevä siRNA transfektiot tehtiin käyttämällä

CLDN11-

erityisiä siRNA dupleksit. Transfektio

CLDN11

erityisiä siRNA-dupleksit tehokkaasti tukahdutettu klaudiini-11-proteiinin tasot 90%, kun taas ilmaisu pysyivät ennallaan jäljitellyistä tai ohjata siRNA käsiteltyjä soluja (kuvio 4A). Solun liikkuvuus ja invaasio määritykset suoritettiin siRNA-transfektoiduissa soluissa käyttäen muunneltua Boyden-kammion koejärjestelmässä [25]. Mielenkiintoista on, kuten on esitetty kuvioissa 4B ja 4C, inhibitio

CLDN11

ilmentymisen HFE145 soluissa lisäsi merkittävästi muuttavien ja invasiivisia mahdollisuuksia näiden solujen, vastaavasti.

HFE145 solulinja, joka on claudin- 11 positiivista valittiin roolin tutkimiseksi klaudiini-11 knockdown maahanmuutosta ja hyökkäys ominaisuuksia mahan soluja. Solut transfektoitiin

CLDN11

erityisiä siRNA oligojen. Mock transfektiot ja epäspesifinen siRNA-dupleksit käytettiin negatiivisessa kontrollissa. A) Western blot-analyysi siRNA välittämän klaudiini-11 knock-down in HFE145 soluissa. HFE145 solut transfektoitiin

CLDN11

– erityisiä ja ei-spesifistä kontrolli siRNA-dupleksit, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Jälkeen 48-72 tunnin ajan, yhteensä solulysaatit valmistettiin ja analysoitiin klaudiini-11 ilmentyminen. Transfektio klaudiini-spesifisten siRNA oligoja johti 90%: n vähennys proteiinin ekspressiota, kun taas tasojen klaudiini proteiinin ohjaus soluja ei muutu merkittävästi. B) Boyden kammion solun invaasiomääritys. Invasiivisuus siRNA-transfektoiduissa soluissa määritettiin käyttämällä matrigeeliä päällystettyä hyökkäystä kammioon, käyttäen muunneltua Boyden kammion määritystä. Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa, ja kolmena rinnakkaisena kussakin kokeessa. Tiedot edusti tässä on keskimääräinen kertainen muutos hyökkäystä siRNA-transfektoiduissa soluissa verrattuna mock transfektioista. Kuten on osoitettu tässä kuvassa, siRNA knockdovvn klaudiini-11 johtaa lisäys solujen invaasion HFE145 soluja. C) Kahden kammion solujen migraatiokokeessa. Vaikutukset klaudiini-11 knockdown maahanmuutosta on HFE145 soluja verrattiin mittaamalla solujen lukumäärä kautta päällystämätön suodattimien (sijasta Matrigel päällystettyjä suodattimia). Palkit tässä kuviossa edustaa keskiarvoa kertainen muutos migraatio siRNA-transfektoiduissa soluissa verrattuna valetransfektoidun ohjaus soluissa. Kuten voidaan nähdä tästä kuviosta, vähentämistä klaudiini-11-proteiinin tasot liittyy lisääntynyt motiliteettia soluista.

Nykyinen tutkimus vahvistaa näin ollen hypoteesia, että

CLDN11

, tiukka risteykseen proteiinia, on vaiennettu GC kautta promoottori hypermetylaation, ja nämä tiedot tukevat osallistumista

CLDN11

valvonnassa GC soluinvaasiota ja muuttoliike.

promoottori hypermetylaation tiedetään liittyvän jossa transkription hiljentäminen tiettyjen geenien. DNA: n metylaatio voi häiritä sitoutumista transkriptiotekijöiden joiden sitoutumiskohtien sisältävät CpG dinukleotideissä. Käyttämällä TFSEARCH ohjelma, me skannattu

CLDN11

sekvenssin havaittiin olevan hypermetyloitunut mahasyövän kudoksissa ja solulinjoissa,

eli

., The qMSP amplikonin (-104-4 emästä suhteessa kun transkription aloituspaikan

CLDN11

). Tämä skannaus tunnistaa otaksuttu sitoutumiskohtia SP1 ja GATA-1 ja GATA-2. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että hypermetylaatiota promoottori DNA myötävaikuttaa vaiennettu

CLDN3

ja

CLDN4

munasarjojen solulinjoissa, osittain

kautta

metylaatio aiheuttama häiriö sitoutumisen SP1 sen samaa alkuperää sitoutumiskohdan (22, 23). Lisäksi jäsenet GATA perheen on osoitettu olevan positiivinen säätelijöitä

CLDN11

transkriptio [28]. Lisätutkimukset ovat nyt perusteltua arvioida hypermetylaatiota näitä sivustoja häiritsee sitoutumista transkriptiotekijöiden, ja kuinka tällaiset häiriöt voivat vaikuttaa

CLDN11

geenin transkription.

tuumorisoluja tyypillisesti rakenteellisia ja toiminnallisia puutteita niiden TJs [17]. Nämä puutteet liittyvät menetys napaisuuden ja erilaistumista. Toinen tärkeä yhteys TJs ja syöpä on menetys TJ eheyden, minkä seurauksena vuoto tai kuljetusta pro-tuumorigeenisen aineita (kuten kasvutekijöitä tai ravintoaineiden) kehittääkseen tuumorisolun primordia, edistää kasvaimen kasvua [29]. Lisäksi menetys polariteetin, erilaistumista ja liima ominaisuuksia, jotka liittyvät heikentynyt TJ toiminto syöpä voi olla kriittinen hankkimisesta metastaattisessa fenotyyppi [30]. Tutkimukset ovat viitanneet siihen, että poikkeamat TJ liittyvien proteiinien voi edustaa epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), mikä muuttaa invasiivisuus ja motiliteettia syöpäsoluja.

Modulaatiot ilmentymisen TJ liittyvien proteiinien, erityisesti klaudiini proteiineja, on on osoitettu useissa syövissä. Viimeaikaiset tutkimukset meidän ja muut ovat osoittaneet muutoksia klaudiini proteiinia sääntelyn eri epiteelisyövissä [18]. Jäsenet klaudiini geeniperheen ilmaistaan ​​erittäin kudosspesifisiä sekä erittäin kehitysvaiheessa-erityisiä, tavalla. Lisäksi, riippuen syövän tyypistä, ekspression klaudiini proteiinit voivat olla joko ilmen- tymisen lisääntymisen tai vaimentua syöpäsoluissa. Esimerkiksi useat klaudiini proteiinit yläreguloituja paksusuoli, munasarja-, haima- ja eturauhasen syöpiä, kun taas jotkut ovat vaimentua rintasyövän ja pään ja kaulan alueen syövät [16], [18]

Tutkimukset ovat aiemmin raportoitu muutoksia ilmaisun profiilit jäsenten klaudiini perheen liittyvän GC. Serial analyysi geenien ilmentymistä (SAGE) tunnisti

CLDN18

geenin vaimentua in GC joilla suoliston fenotyyppi [31].

CLDN23

geeni myös vaimentua suolen-tyyppinen GC [32]. Kääntäen, Cunningham

et al.

Raportoitu

CLDN4

lauseke kasvanut suolen metaplasiaa ja mahalaukun epiteelin dysplasiaa, tämän geenin tunnistamiseksi merkkinä GC esiasteleesioita [33]. Nykyisessä tutkimuksessa löydettiin

CLDN11

lauseke vaimentua tai vaiennettu GC

kautta

hypermetylaatiota sen promoottorialueen. Lisäksi olemme havainneet, että toisin kuin

CLDN18

ja

CLDN23

,

CLDN11

ilmentymistä vaimentua GC potilasnäytteiden sekä solulinjoissa, riippumatta hajanainen

vs .

suoliston alatyyppi.

Claudin-11, joka tunnetaan myös nimellä oligodendrocyte-spesifistä proteiinia, oli ensimmäinen identifioitu nimenomaisesti ilmaistaan ​​tiiviin liitoksen osa oligodendrosyyttien aivoissa ja Sertoli-solujen ja rotilla ja hiirillä [ ,,,0],34], [35]. Menetys klaudiini-11 ilmentyminen, joka johtaa häiriöitä TJ este, liittyy neurologisia ja lisääntymis- alijäämät [36]. Tuoreessa tutkimuksessa raportoitu yli-ilmentymisen ja mislocalization on

CLDN11

verestä-kiveksen esteen Sertolin soluissa liittyvän kivesten intraepiteliaalisten neoplasiaa miehillä [37]. Tiedot nykyisen tutkimuksessa todetaan, että

CLDN11

ilmentyy normaaleissa mahan kudoksissa ja kuolemattomaksi NGECs. Kuitenkin sen täydellinen tehtävät normaalissa vatsassa sekä mahasyövän jäävät epäselviksi.

Yrittäessään tutkia mahdollista osallistumista

CLDN11

GC, tutkimme fenotyyppisiä muutoksia, jotka liittyvät hiljentäminen

CLDN11

ilmaisun

CLDN11-

ilmentävät mahan epiteelisolujen (HFE145). Erittäin kiinnostavaa, siRNA-välitteisen knockdovvn

CLDN11

lisännyt solun liikkuvuus ja invaasiota.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet syöpää erityisiä fenotyyppisiä muutoksia liittyä modulaatiot vuonna klaudiini ilmaisun eri syöpätyypeissä . Yli-ilmentymisen klaudiini-3 ja klaudiini-4 proteiinien munasarjasyövän solulinjoissa johtaa lisääntyneeseen invaasiota näiden solujen [25].