Krooninen sairaus

tiivistelmä

Autophagy modulaatio on nyt tunnustettu potentiaalinen terapeuttinen lähestymistapa syövän (mukaan lukien peräsuolen syöpä), mutta molekyylimekanismeja säätelevä autophagy vastauksena solustressiä vielä ole täysin ymmärretty. MikroRNA (miRNA) on havaittu tärkeitä rooleja valvoa monissa solun toimintoja, kuten kasvua, aineenvaihduntaa ja stressin vastaus. Fysiologiset merkitys miRNA-autophagy yhteenliittämistä on vasta selvittämättä. MiRNA sirutekniikalla helpottaa selvitys globaaleista miRNA ilmaisun tietyissä tilanteissa. Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmentymisen profiili miRNA aikana vasteen ihmisen paksusuolen syövän soluja (HT29s) ja 5-FU hoito ja ravinteiden nälkään käyttäen miRNA microarray-analyysiä. Muuttaminen miRNA ilmentymisen oli sama kuvio molemmissa olosuhteissa edelleen todisteena qRT-PCR: llä kolmessa ihmisen paksusuolen syövän solulinjat. Lisäksi bioinformatiikan ennustaminen kohdegeenien, polku analyysi ja geeni verkko analyysi tehtiin ymmärtää paremmin niiden roolia miRNA sääntelyssä autophagy. Me tunnistaa ja valita neljä vaimentua miRNA lukien HSA-miR-302a-3p ja 27 voimistunut miRNA alle nämä kaksi ehtoa olevan potentiaalia kohdistaa geenien säätelyyn autophagy ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Ne tarjoavat myös mahdollisuuden moduloida autophagy 5-FU-kemoterapiaan kolorektaalisyövässä.

Citation: Hou N, Han J, Li J, Liu Y, Qin Y, Ni L, et al. (2014) MicroRNA Profilointi Human koolonkarsinoomasoluissa aikana 5-fluorourasiili-aiheuttama Autophagy. PLoS ONE 9 (12): e114779. doi: 10,1371 /journal.pone.0114779

Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 heinäkuu 2014; Hyväksytty 13 marraskuuta 2014; Julkaistu: 19 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Hou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (avustus nro 31100969) ja tieteellinen tutkimussäätiö varten Palautettu Overseas Kiinan Tutkijat, State Opetusministeriö (2013-09) ja Dr. Hou. Se tukee myös avustusta National Natural Science Foundation of China (avustus nro 81172358) tohtori Li. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia kiinnostusta ole.

Johdanto

5-fluorourasiilin (5-FU) -pohjaisen adjuvanttihoitoa on laajalti käytetty yleiseen hoitoon peräsuolen syöpä (CRC). Kuitenkin, koska resistenssin 5-FU monilla potilailla, uusia terapeuttisia strategioita tutkitaan [1]. Autophagy on evoluutiossa säilyneitä eukaryoottisen prosessi, joka ylläpitää solunsisäisten homeostaasin poistamalla tarpeettomat proteiineja ja vaurioituneet tai vuotiaiden soluelimiin [2]. Viime vuosikymmeninä, varaamiseen näyttö on osoittanut, että autophagy on laajasti liittyy syöpään [3]. Ylläpitämällä solujen homeostaasin terveissä soluissa, autophagy estää kasvainten muutosta. Autophagy on tärkeä myös syövän etenemiseen, jolloin kasvainsolut hengissä metabolisen stressin tai anoikis, ylläpitää niiden mukauttaminen ohjelmoida aineenvaihduntaa, tukee kasvaimen kehitystä indusoimalla lepotilan ja ylläpitää selviytymisen ja itseuudistumisen syövän kantasoluja. Lisäksi, koska autophagy on olennaisia ​​rooleja määriteltäessä, miten kasvainsolut reagoivat terapiaan, autophagy modulaatio on havaittu olevan mahdollinen terapeuttinen lähestymistapa syövän [4], [5]. Autophagy näyttää edustavan pätevä mekanismi vastustuskyvyn radio- ja kemoterapia. Meidän aikaisemmat tutkimukset osoittivat, että inhibitio autophagy 3-metyyliadeniini (3-MA) ​​tai pieni interferenssi-RNA kohdistaminen Atg7 (Atg7 siRNA) lisäsivät tehokkuutta 5-FU apoptoosin tehostamiseksi ihmisen paksusuolen syöpä [6], [7]. Autophagy on erittäin konservoitunut ja tiukasti säänneltyä. Kuitenkin molekyylitason mekanismeja säätelevä autophagy vastauksena solustressiä ei ole vielä täysin ymmärretty.

MikroRNA (miRNA), 18-25 nukleotidia, ovat endogeenisiä pieniä, ei-koodaavaa RNA: ita, jotka säätelevät ilmentymistä niiden kohdegeenien estämällä käännös tai pilkkomalla lähetti-RNA (mRNA), pääasiassa vuorovaikutuksessa 3’transloimattomat alueet (UTR) kohde-mRNA: iden [8]. MiRNA voi samanaikaisesti säädellä monia tavoitteita ja biologisen verkoissa. Kääntäen, useita eri miRNA voivat sitoutua ja yhteistoiminnallisesti ohjata yhden mRNA tavoite. MiRNA on havaittu tärkeitä rooleja valvoa monissa solun toimintoja, kuten kasvua, erilaistumista, aineenvaihduntaa ja stressin vastaus ja tarjotaan selkeä etu kliinisestä näkökulmasta [9] – [11]. Viime vuosina, jotkut miRNA on tutkittu välittäjinä autophagy asetuksen. MiRNA-30a voi herkistää hepatoomasolujen sisplatiinin kohdistamalla beclin-1-välitteisen autophagy [12]. MiRNA-101 on osoitettu olevan yhtä tehokas inhibiittori autophagy aiheuttama etoposidin tai rapamysiini rintasyöpäsoluissa [13]. Jegga et ai. Lisäksi ehdotetaan, että miRNA-130, miRNA-98, miRNA-124, miRNA-204 ja miRNA-142 on potentiaalisia sääntelyn toimintoja autophagic joka perustuu laskennallisen analyysin [14]. Fysiologinen merkitys miRNA-autophagy yhteenliittämistä on vasta selvittämättä.

Koska suuri määrä miRNA miRNA microarray-teknologiaa on laajasti sovellettu määrittää globaalin miRNA ilmentymistä tietyissä tilanteissa [15]. Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmentymisen profiili miRNA vasteessa ihmisen paksusuolen syövän soluja (HT29s) ja 5-FU hoitoon käytetään miRNA microarray-analyysiä. Priorisoida miRNA joka korreloi autophagy, autophagy indusoitui myös toinen väline (ravinteiden nälkään), ja miRNA ilmentyminen havaittiin myös tässä yhteydessä. Muuttunut miRNA ilmentyminen oli sama kuvio molemmissa olosuhteissa edelleen todisteena qRT-PCR: llä kolmessa ihmisen paksusuolen syövän solulinjat. Lisäksi bioinformatiikan ennustaminen kohdegeenien, polku analyysi ja geeni ontologian verkko analyysi suoritettiin myös paremmin ymmärtää niiden roolia miRNA sääntelyssä autophagy. Me tunnistaa ja valita neljä vaimentua miRNA ja 27 ilmen- tymisen lisääntymisen miRNA upon 5-FU hoidossa ja nälkään ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Nämä 31 miRNA on ennustettu kohdegeenien sääntelyn autophagy, kuten autophagy ydin geenejä ja autophagy sääntelyviranomaisten ja on mahdollista moduloida autophagy 5-FU-kemoterapiaan CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

5-FU ostettiin Sigma (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO). LC3 polyklonaalinen vasta-aine hankittiin MBL (MBL, Nagoya, Japani). Anti-p62 ja anti-β-aktiini-vasta-aineita saatiin Sigmalta, ja mTOR-vasta-aine oli peräisin Cell Signaling Technology (Cell Signaling tekniikka, Danvers, MA).

Soluviljely ja käsittely

HT29, HCT116 ja DLD1 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syöpä-solut hankittiin American Type Culture Collection, ystävällisesti professori Kuwano ja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2/95,% ilmaa keskipitkän vaihtuu joka toinen päivä. Solut keski-log-vaiheen käytettiin tässä tutkimuksessa. 5-FU hoitoon, HT29s käsiteltiin 5 uM 5-FU: ssa 24 tuntia. Ravinteiden nälkään, HT29s inkuboitiin Krebs-Ringer-puskuriin [16] (120 mM NaCl, 5 mM KCI, 24 mM NaHCO

3, 5,6 mM glukoosia, 2 mM CaCl

2, pH 7,6) 37 ° C 7 h.

mittaaminen solujen elinkelpoisuuden ja apoptoosin

solujen elävyys määritettiin käyttäen Cell Counting Kit 8 (CCK-8). Solut ympättiin 96-kuoppaisille tasapohjaisille mikrotiitterilevyille tiheyteen 1 x 10

3 solua kuoppaa kohti. Hoidon jälkeen, 10 ui CCK-8-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 h. Absorbanssi liuosta luetaan spektrofotometrisesti 450 nm: ssä, jossa on viittaus 650 nm käyttäen mikrotiitterilevyn lukijaa (BIO-TEK ELX800). Solujen elinkelpoisuus laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti: solujen elinkykyä (%) = A450 (näyte) /A450 (kontrolli) x 100.

solun apoptoosi määritettiin käyttäen Apoptosis Detection Kit. Lyhyesti, solut kerättiin ja värjättiin anneksiini V -FITC (anneksiini V) ja propidiumjodidilla (PI). Apoptoosi määritettiin anneksiini V

+ /PI

– (varhainen apoptoosi) ja anneksiini V

+ /PI

+ (myöhäinen apoptoosin) määritettynä FACScan (Becton Dickinson).

Analyysi autophagy

analyysi autophagy suoritettiin pääasiassa immunofluoresenssilla ja immunoblottauksella mikrotubulusten liittyvä proteiini 1B-kevyt ketju 3 (LC3) kuten aiemmin on kuvattu [7], [16]. Voit selvittää immunofluoresenssi LC3, solujen kammion dia kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja läpäiseviksi 0,05% Triton X-100. Blokkauksen jälkeen soluja inkuboitiin anti-LC3-vasta-aine (1:500 laimennos) 4 ° C: ssa yön yli ja inkuboitiin Alexa Fluor 488-konjugoidulla anti-kani-vasta-aineen pesun jälkeen. Objektilasit kiinnitettiin ja tutkittiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (ECLIPSE TE2000-U, Nikon). Värjäämällä 0,1 ug /ml 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) suoritettiin tunnistamiseksi ydin. Immunoblottausta ja LC3, 20 ug solulysaattia erotettiin 5-20% Tris-Tricine Ready Gel SDS-PAGE: lla (Bio-Rad) ja polyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvo blottauksella. Blotatun kalvo blokattiin ja inkuboitiin anti-LC3 (1:1000 laimennus). Immunoreaktiivisia vyöhykkeet visualisoitiin kehittynyt kemiluminesenssin avulla piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kani-vasta-aine (1:5000 laimennus). P62 ja mTOR immunoblottaus (1:1000 laimennokset molemmat) tehtiin myös arvioimaan autophagy tilassa.

RNA: n eristys ja miRNA mikrosirujen

Solun kokonais-RNA kerättiin käyttäen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA ) ja miRNeasy mini -kittiä (Qiagen, GmbH, Hilden, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Exiqon LNA MicroRNA Human Array lukien kaikki ihmisen kypsän miRNA (Database 18,0) käytettiin profiloida miRNA ilmaisun ja suorittaa Kangcheng Bio-Tech Inc. (Shanghai, Kiina). Teimme toimittamisen meidän microarray tietojen Gene Expression Omnibus, ja hakunumero on GSE61943. Lyhyesti, RNA-näytteet (1 ug) leimattiin käyttäen miRCURY Hy3 leimauspakkausta ja hybridisoitiin sen miRCURY LNA Array (v.18.0). Pesun jälkeen objektilasit skannattiin käyttämällä Axon GenePix 4000B microarray skanneri, ja raaka intensiteetti kuvan luettiin ja analysoitiin käyttämällä GenePix pro 6.0 -ohjelmisto (Axon). Neljä monistaa täplät kukin koetin samalla dian otettiin keskiarvo. Ilmaisi miRNA data normalisoitiin käyttämällä Mediaani normalisointi. Normalisoinnin jälkeen, ilmentyvät eri miRNA tunnistettiin kertaluokkamuutos suodatuksen ( = 2).

Reaaliaikainen qRT-PCR-analyysi miRNA ilmaisun

kvantitatiivinen RT-PCR (qRT- PCR) suoritettiin validoimiseksi miRNA array data. Kypsä miRNA oli käänteistranskriptio cDNA: ksi, jonka varsi-silmukka käänteistranskriptiolla käyttäen PrimeScript RT reagenssipakkausta (Takara Bio, Shiga, Japani) ja erityisiä varsi-silmukka-alukkeita, kuten on esitetty taulukossa 1. qRT-PCR kunkin miRNA suoritettiin käyttäen FastStart Essential DNA Green Master (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Saksa) koskevasta lightcycle96 koneella (Roche) mukaan valmistajan ohjeiden. Käytetyt alukkeet on lueteltu taulukossa 1. Kukin näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena. Mirna ekspressiotasoja normalisoitiin ja kvantifioidaan U6-RNA. Suhteellinen kvantitointi laskettiin käyttäen 2

(- ΔΔCt) menetelmällä.

Target ennustaminen ja toiminta-analyysi

kohdegeenien miRNA ennustettiin käyttämällä leikkauspiste kaksi suurta verkossa miRNA tavoite ennustaminen algoritmeja, TargetScan (https://www.targetscan.org) [17] ja PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de) [18], tai TargetScan ja miRDB (http: //mirdb .org) [19], jos ei ollut tietoja joillekin miRNA vuonna PicTar.

DIANA-miRPath v2.0 (https://www.microrna.gr/miRPathv2) levitettiin analysoimaan päätoiminnot miRNA [20]. Yleensä miRNA ja polku liittyviä tietoja saatiin miRBase ja Kioton Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg) v58.1, vastaavasti. Yksisuuntaista Fisherin testiä käytettiin tunnistamaan rikastettua Kegg reitit tavoitteineen erityisiä miRNA, ja väärä löytö määrä (FDR) laskettiin korjaamaan p-arvo. Rikastamiseen antaa mitan merkityksen funktion; kuten rikastamisen kasvaa, vastaava toiminto on merkittävämpi.

Gene ontologia (GO) verkostoanalyysi käytettiin myös analysoimaan päätehtävä ennustetun kohdegeenien ja paljastaa miRNA-geenin sääntelyverkon perusteella biologiset prosessit ja molekyylien toimintoja. CyTargetLinker plugin Cytoscape (https://projects.bigcat.unimaas.nl/cytargetlinker) käytettiin rakentaa integroiva verkosto miRNA-tavoite vuorovaikutuksia kuuden miRNA tunnistettu tutkimuksessamme [21], [22]. Vahvistetut tavoitteet kullekin miRNA saatiin mirTarBase, ja ennustettu tavoitteet saatiin Targetscan.

Tilastollinen

Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvoina ± keskihajonta (SD). Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS versio 17.0 ohjelmisto. p 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

5-FU laski elinkelpoisuuden HT29 ihmisen paksusuolen syöpäsoluja,

vaikutus pääasiassa CRC kemoterapiaa, 5-FU, ja HT29 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa varmistettiin CCK-8-määrityksessä. 5-FU (0~500 uM) tuotti annoksesta ja ajasta riippuvaa inhibitio solujen elinkelpoisuuden joka saavutti 64,20% ja 42,20%, kun 5 uM 5-FU: n hoito 24 h ja 48 h, vastaavasti (Fig. 1). 5-FU voi olla monia vaikutuksia HT29. Virtaussytometria anneksiini V: n ja PI-värjäyksellä havaitsemiseen käytettiin apoptoosin meidän kokeessa. On hyvin vähän apoptoosia HT29 5 uM 5-FU: n hoito 24 h (S1 kuvio.).

HT29-soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien kanssa (5 uM ja 25 uM) 5-FU: 12, 24, ja 48 h. Solujen elinkelpoisuus mitattiin CCK-8-määrityksessä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD.

5-FU indusoimaa aktivoitumista autophagy vuonna HT29

aktivointi autophagy 5-FU: n HT29-soluihin havaittiin LC3 immunofluoresenssilla . Kontrollisoluissa, jakelu LC3 osoitti diffuusin kuvio (sytoplasmassa, LC3- I). 5-FU hoito muuttanut LC3 jakelua moniin karkea pisteitä ja pistemäinen värjäytymistä (kuvio. 2A), ja ajan lisääntynyt, pisteitä tuli voimakkaampi. LC3-positiivisten punctuates (LC3-II) edustaa autophagosomes. LC3 immunoblottauksella käytettiin myös tarkkailla autophagy (Fig. 2C). LC3-II (16 kDa), indusoitiin 5 uM 5-FU: n hoitoa varten 24 tuntia. Ominaisuutena mekanismi asiakkuutta autophagy induktio, ravinteiden nälkään suoritettiin myös (Fig. 2B). Nälänhätä teki LC3 värjäys voimakkaampi ja 7 h, oli jonkin verran pistemäinen värjäytymistä. Lisäksi intensiteetti LC3 lisättiin nälkään 7 tuntia. Koska indikaattori autophagy flux, p62 väheni sekä 5-FU hoidossa ja nälkään (Fig. 2C). Kun 5 uM 5-FU: n hoitoa 24 tuntia, solun elinkelpoisuus HT29 estyi, autophagy aktivoitiin, ja oli lähes apoptoosia. Sitten suoritimme globaali ilmentymisen profilointi miRNA microarray määrityksissä sekä HT29 ravinnotta 7 h ja HT29-solut, joita käsiteltiin 5 uM 5-FU: ssa 24 tuntia.

HT29-soluja käsiteltiin 5 uM 5-FU: tai ei. Aktivaatio autophagy havaittiin LC3 immunofluoresenssilla (A). HT29-soluja ilman ravintoa Krebs-Ringer puskurin tai ei. Aktivaatio autophagy havaittiin LC3 immunofluoresenssilla (B). DAPI-värjäys suoritettiin tunnistamiseksi ydin. LC3, P62 ja mTOR immunoblottaus suoritettiin käyttäen solulysaateista HT29 käsiteltiin 5 uM 5-FU: 24 h tai ei, ja nälässä 7 h tai (C). Tiedot ovat edustaja kolmen erillisen kokeen. Bar, 20 um.

tunnistaminen muuttunut miRNA ilmentymisen 5-FU ja nälkään HT29

Kun microarray skannauksen ja normalisointi, 124 ulos 1900 kypsän ihmisen miRNA tunnistettiin voimistuvan nälkään 7 h HT29, ja 56 miRNA olivat vaimentua. 5 uM 5-FU: n hoito 24 h, oli 302 voimistunut miRNA ja 86 vaimentua miRNA in HT29. Priorisoida miRNA korreloi muutoksiin autophagy, miRNA olevan samalla muuttunut kuvio alle 5-FU hoidossa ja nälkään (toista yleistä keino autophagy induktio) katsottiin todennäköisemmin osallisena säätelyssä autophagy. MiRNA olevan samalla muuttunut kuvio näissä kahdessa olosuhteet olivat 94 ilmen- tymisen lisääntymisen miRNA ja 22 vaimentua miRNA (S1 taulukko). Ennustaminen miRNA-säänneltyjen geenikohteet on välttämätön askel ymmärtää toimintoja tietyn miRNA. Risteyksessä kaksi eri ohjelmaa (algoritmeja) raportoitiin herkkyyden lisäämiseen ennustamiseen. TargetScan tunnistaa tavoitteita konservoituneita komplementaarisuutta siemenen (nukleotidit 2-7) ja miRNA [23]. Käytimme risteyksessä TargetScan ja PicTar ennustaa kohdegeenien muuttaa miRNA. Jos ei ole tietoja PicTar, miRDB käytettiin sijasta PicTar. Kaiken kaikkiaan olemme tunnistaa ja valita neljä vaimentua miRNA, HSA-miR-302a-3p, HSA-miR-548ah-5p, HSA-miR-133b ja HSA-miR-323a-3p, ja 27 ilmen- tymisen lisääntymisen miRNA, HSA-miR-203a , HSA-miR-99b-5p, HSA-miR-195-5p, HSA-let-7c-5p, HSA-miR-320d, HSA-miR-301a-3p, vmiR-30e-5p, HSA-miR-374c -5p, HSA-miR-181a-5p, HSA-let-7g-5p, HSA-miR-513b-5p, HSA-miR-30b-5p, HSA-miR-19b-3p, HSA-miR-19a-3p HSA-miR-15a-5p, HSA-miR-106b-5p, HSA-miR-330-3p, HSA-miR-582-5p, HSA-miR-16-5p, HSA-miR-30a-5p, HSA -miR-23a-3p, HSA-miR-26b-5p, HSA-miR-98-5p, HSA-miR-186-5p, HSA-miR-30d-5p, HSA-miR-93-5p ja HSA-miR -320c, olevan ennakoi maalin geenien säätelyyn autophagy, jotka sisältävät autophagy ydin geenit ja autophagy sääntelyviranomaisten (taulukko 2).

Validation microarray dataa qRT-PCR HT29, HCT11 ja DLD1 solut

validoimiseksi microarray data, suoritimme qRT-PCR kaksi vaimentua (HSA-miR-302a-3p ja on-miR-548ah-5p) ja neljä ilmen- tymisen lisääntymisen miRNA (HSA-asennuspalveli- 30a-5p, HSA-miR-23a-3p, HSA-miR-195-5p ja HSA-anna-7c-5p) 5-FU käsitelty tai nälkään HT29. Koska paksusuolen syöpä on heterogeeninen, muuttuneen ilmentymisen näiden miRNA määritettiin myös kahden muun ihmisen paksusuolen syövän solulinjat, HCT116 ja DLD1. Olemme havainneet, että sopusoinnussa tulosten miRNA mikrosiruanalyysi ekspression näiden miRNA muuttui merkittävästi, joka perustuu niiden qRT-PCR lukemat (Fig. 3).

kolme erilaista ihmisen paksusuolen syövän solulinjat, HT29 (A ), DLD1 (B) ja HCT116 (C), käsiteltiin, kuten on kuvattu kuviossa. 2. qRT-PCR suoritettiin validoimiseksi muuttaminen ilmentymisen HSA-miR-302a-3p, HSA-miR-548ah-5p, HSA-miR-30a-5p, HSA-miR-23-3p, HSA-miR -195a-5p ja HSA-anna-7c-5p alle 5-FU hoito (5-FU) ja nälkään. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. * P 0,05. Kokeet toistettiin kolme kertaa toistettavia tuloksia.

Pathway analyysi ja GO verkko analyysi paljasti miRNA-autophagy yhteenliittämisen

saadaan käsitys toimintoja näiden miRNA, DIANA-miRPath oli käytetään analysoida Kegg reitit vaikuttavat näiden 31 miRNA (Fig. 4). Tämän seurauksena korkean merkittävää rikastumista väyliä neljän vaimentua miRNA sisältyvät MAPK-signalointireitin, jonka on raportoitu positiivisesti osallistua asetuksen autophagy [24] (Fig. 4A). Kiinnostavampi, joukossa suuri merkittävän rikastamisen reittejä 27 ilmen- tymisen lisääntymisen miRNA, The mTOR-signalointireitin merkittävästi tunnistettiin näiden miRNA (Fig. 4B, 4C ja 4D). Johdonmukaisesti, proteiini taso mTOR oli laskenut alle nämä kaksi ehtoa (Fig. 2C). Lisäksi miRNA-mRNA geeni verkko analyysi integroitu nämä miRNA ja alkuperätakuiden jota hahmotellaan vuorovaikutukset miRNA ja GO liittyvien geenien avulla Cytoscape ohjelmistoa (Fig. 5).

DIANA-miRPath v2.0 levitettiin analysoida päätoiminnot valitun 31 miRNA (A, neljä vaimentua miRNA, B, miRNA upregulated yli nelinkertaiseksi alle 5-FU hoidossa ja nälkään, C, miRNA upregulated välillä kaksi- ja nelinkertaiseksi kahdella ehdolla, D, miRNA voimistuvan yli nelinkertaiseksi ja välillä kahden ja neljän kertaiseksi). Pystyakseli on Kegg polku luokka, ja vaaka-akselilla on negatiivinen logaritmi

p

arvo (-Log

p

), joka edustaa merkitystä polkuja.

integroiva verkot luotiin käyttäen Cytoscape ohjelmistoa. Kukin verkko sisältää kahdenlaisia ​​solmuja, yksittäisten miRNA (punaiset ympyrät) ja niiden ennustettu mRNA tavoitteet (vaaleanpunainen kuusikulmio), joka on saatu kahdesta eri julkisia tietokantoja (miRTarBase ja Targetscan). Kuvaaja osoittaa, että mRNA tavoitteet näkyvät kaksi tietokantaa, jotka tunnistetaan väri yhdistävät nuolet, miRTarBase (punainen) ja Targetscan (musta).

Keskustelu

5 -FU kemoterapian on valtavirtaan adjuvanttihoitona CRC. Autophagy modulaatio on pidetty mahdollisena strategian toteuttamiseksi kemoterapian kasvaimen hoidossa [4]. MiRNA tärkeitä rooleja valvoa solun toimintoja ja on raportoitu olevan mukana säätelyssä autophagy viime vuosina [25]. Meidän kokeessa, induktio autophagy vahvistettiin HT29 sekä 5-FU hoito ja ravinteiden nälkään. Käyttämällä miRNA mikrosiruanalyysi, qRT-PCR, ja bioinformatiikan, me tunnistaa ja valita neljä vaimentua miRNA lukien HSA-miR-302a-3p ja 27 voimistunut miRNA lukien HSA-miR-30a-5p, HSA-miR-23a-3p, hsa- miR-195a-5p, HSA-miR-99b-5p ja HSA-anna-7c-5p alle nämä kaksi ehtoa olevan potentiaalia kohdistaa geenien säätelyyn autophagy (taulukko 2). Lisäksi toiminnalliset analyysit näiden miRNA täytyy suorittaa.

koottua näyttöä siitä, että autophagy on merkittäviä rooleja kasvainten synnyssä ja kasvaimen hoito [3]. Se voi joko estää tai edistää kasvaimien synnyn vaiheesta riippuen kasvain. Kuten kasvaimen hoito, autophagy näyttää välittävän vaikutusta syöpälääkkeiden estyminen autophagy estää niiden terapeuttista tehokkuutta. Autophagy voidaan myös aktivoida pro-selviytymisen vaste edistää terapeuttisen vastustuskyky sytotoksisen hoidon. Ja esto autophagy parantaa huume- tai säteilyn aiheuttama solukuolema, kuten olemme raportoineet [6], [7]. Molekyylit mukana sääntelyn autophagic prosessin ovat nousseet lupaavia kohteita innovatiivisia syöpähoitoihin [4].

Autophagy (lähinnä macroautophagy) on tiukasti säädeltyä, säilyneitä catabolic prosessi. Induktion jälkeen, osat sytoplasma erottautuvat osaksi ominaisuus kaksinkertainen kalvovesikkeleiden tunnetaan autophagosomes (rakkula nukleaatiossa, rakkula venymä ja haku). Myöhemmin autophagosomes fuusioituvat myöhään endosomeihin tai lysosomeihin muodostaen autolysosome (fuusio). Altistuminen sisemmän osastosta lysosomaalisen hydrolaasien aiheuttaa hajoamista sytoplasmisen lastin, ja tuloksena hajoamistuotteet sitten vapautuu sytosoliin kierrätystä varten. Tiukka valvonta autophagy on välttämätön solun homeostaasiin ja vastaus solustressiä. Suuri perhe ydin autophagy valvojat, autophagy (ATG) liittyvien geenien, palvelee koordinoidusti säännellä vaiheittaista etenemistä autophagy välillä autophagy induktion rakkuloita nukleaatiossa, rakkula venymä, haku ja fuusio [26]. Lisäksi monipuolinen ja monimutkainen verkosto alkupään signalointireittien edistää autophagy asetuksen lukien fosfatidyyli 3 kinaasi (PI3K), RAS-proto-onkogeenin ja AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) polkuja, joista monet yhtyvät kohde nisäkkäässä rapamysiini kompleksi 1 (mTORC1), joka on keskeinen negatiivinen säätelijä autophagy signaloinnin [27].

meidän kokeessa 27 miRNA, jotka mahdollisesti kohdistuvat säätelevien geenien autophagy havaittiin voimistuvan, kun 5-FU hoitoa tai nälkään. Pathway analyysi ehdotti, että mTOR signalointireitille merkittävästi tunnistaa nämä miRNA. Se oli aiemmin osoitettu rintasyövän solut, jotka ravintoaineprofiilin nälkään johtaa lisääntymiseen autophagy estämällä mTOR [28]. Tuloksemme myös tukenut voimakkaasti tätä aikana 5-FU aiheuttama autophagy paksusuolen syöpäsoluissa. Näistä miRNA ennakoi maalin geenit HSA-miR-99b-5p mukana mTOR. Ja kasvu tämän miRNA kun kaksi autophagy induktion (5-FU hoidon ja nälkään) oli merkittävä, 5,624 ja 6,243 kertaa suurempi kuin kontrolli. HSA-miR-99b-5p optio lisätutkimuksia säätelyssä autophagy 5-FU hoito ihmisen paksusuolen syöpä. Lisäksi mTOR verkkoon, beclin1 verkko on myös raportoitu säädellä autophagy rintasyövän [29]. BCL2 perhe lohkot nälkään aiheuttama autophagy olemalla vuorovaikutuksessa BH3-domeenin Beclin1 ja ovat negatiivisia säätelijöitä autophagy. Meidän kokeessa, HSA-let-7c-5p, HSA-miR-195-5p, HSA-miR-23a-3p, HSA-miR-15a-5p, HSA-miR-98-5p, ja HSA-miR-181a -5p ennustetaan kohdistaa geenien Bcl2 perheen ja myös oikeuttaa lisätutkimuksia. Vaikka nämä 27 miRNA osoittivat ilmen- tymisen lisääntymisen ilmentymistä näissä kahdessa menetelmiä autophagy induktioiden, ne ennustetaan kohdistaa autophagy ydin geenejä; HSA-miR-30a-5p kohdentamista BECN1 ja ATG5 on osoitettu edellisessä raporteissa [30]. Toiminto Näiden miRNA on vielä tutkittava. Lisäksi oli vain neljä vaimentua miRNA ennakoidun tavoitteita mukana autophagy asetuksessa, vähemmän kuin määrä ilmen- tymisen lisääntymisen miRNA. Se osoitti myös, että on tärkeää mTOR signalointireitin sääntelyssä autophagy. Lisäksi ennustettu kohdegeenien mukana autophagy ydin geenejä; HSA-miR-302a-3p tavoitteet ULK1 ja HSA-miR-548ah-5p tavoitteet ATG16L1, viittaa siihen, että nämä neljä miRNA osallistuvat autophagy prosessin 5-FU hoitoa ja on mahdollista käyttää manipuloida autophagy 5-FU perustuva kemoterapian CRC.

roolit autophagy syövän riippuvat syövän tyypistä, yhteydessä ja sijainti [4]. Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet 5-FU aiheuttama autophagy ihmisen paksusuolen syövän perustuvat ja muiden aikaisempien raporttien. Siellä oli 4 alassäädetty miRNA lukien HSA-miR-302a-3p ja HSA-miR-548ah-5p; ja 27 sääteli miRNA lukien HSA-let-7c-5p ja HSA-miR-30a-5p upon 5-FU hoidossa ja nälkään ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Nämä 31 miRNA on ennustettu kohdegeenien sääntelyn autophagy, kuten autophagy ydin geenejä ja autophagy sääntelyviranomaisten ja ovat lupaavia tavoitteita autophagy modulaatiota 5-FU-kemoterapiaan CRC. Nämä tiedot voivat myös valaista miRNA-autophagy vuorovaikutukset muiden syöpätyyppeihin sekä tarjota mekanismi mahdollisesti säännellä autophagy kliinisessä käytössä.

tukeminen Information

S1 Kuva.

5-FU indusoi vähän apoptoosia HT29. HT29-soluja inkuboitiin yhdessä 5-FU: ssa 24 tuntia. Virtaussytometria käyttämällä anneksiini V ja PI suoritettiin apoptoosin havaitsemiseen meidän kokeessa. Oli vähän apoptoosia HT29 jälkeen 5-FU: n hoitoa varten 24 h.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0114779.s001

(TIF)

S1 Taulukko.

Differential miRNA ilmentymistä nälkään (Starv) vs. kontrolli (Ctrl) ja 5-FU vs. kontrolli (DMSO) in HT29.

doi: 10,1371 /journal.pone.0114779.s002

(DOC)

Kiitokset

Kiitämme professori Kuwano H ja Prof. Torii S (tutkijakoulu lääketieteen, Gunma University, Maebashi, Japani) heidän ystävällisistä apua. Kiitämme myös Aiying Wang ja Lin Yu niiden teknistä tukea.