Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

terpinen-4-oli, joka on luonnossa esiintyvä monoterpeeni on tärkein bioaktiivinen komponentti tea-tree öljy ja on osoitettu olevan monia biologisia vaikutuksia.

Tavoite

tutkia antituumorivaikutukset terpinen-4-olin ja sen vaikutusmekanismi eturauhasessa ja GI syöpäsairauksia , yksin ja yhdessä kemoterapeuttisten ja biologisia tekijöitä.

Methods

terpinen-4-oli ylläpitäjä yksin tai yhdistettynä tavanomaisen kemoterapian (Oksaliplatiini, fluoriurasiili, gemsitabiini, Tarceva) ja biologisten tekijöiden ( setuksimabi). Se oli myös yhdistettynä humanisoidun anti-CD24-mAb: t (kehitti meitä). Tappaminen vaikutukset mitattiin kvalitatiivisesti valomikroskopialla ja kvantitatiivisesti käyttäen MTT: n ja FACS-analyysi sen jälkeen, kolorektaalisen, haiman, mahalaukun ja eturauhasen syöpäsoluja. Terpinen-4-oli vaikutusta kasvaimen kehitykseen arvioitiin ksenograftimallissa.

Tulokset

terpinen-4-oli indusoi merkittävän kasvun estäminen paksusuolen, haiman, eturauhasen ja mahasyövän solujen annosriippuvaisesti (10-90% vuonna 0,005-0,1%). Terpinen-4-olin ja eri syöpälääkkeitä (0,2 uM oksaliplatiinin ja 0,5 uM fluorourasiilin) ​​osoittivat synergistisen estävä vaikutus (83% ja 91%, vastaavasti), syövän solujen proliferaatiota. In

KRAS

mutatoitunut peräsuolen syövän soluja, jotka ovat resistenttejä anti-EGFR-hoidon yhdistäminen terpinen-4-oli setuksimabi (1 uM) johti vaikuttava teho 80-90% kasvun inhibitio. Sub-myrkyllisiä pitoisuuksia terpinen-4-oli voimistaa anti-CD24 mAb (150 ug /ml) aiheuttaman kasvun esto (90%). Vähentää huomattavasti kasvaimen nähtiin seuraavat terpinen-4-olia (0,2%) hoito yksinään ja Setuksimabihoitoa (10 mg /kg) (40% ja 63%, vastaavasti) kuin verrata kontrolliryhmään.

Johtopäätös

terpinen-4-oli parantaa merkittävästi vaikutusta useiden kemoterapeuttisten ja biologisia aineita. Mahdollisia molekyylimekanismiksi sen toimintaan liittyy induktion solukuolemaa tekee tätä yhdistettä mahdollisena syöpälääkettä yksinään ja yhdistelmänä hoidossa lukuisia syöpäsairauksia. Terpinen-4-oli palauttaa toiminnan Setuksimabin syöpiä mutatoitunut KRAS.

Citation: Shapiran S, Pleban S, Kazanov D, tirosh P, Arber N (2016) terpinen-4-oli A Novel ja lupaava Terapeuttisen ihmisille gastrointestinaalisten syöpien. PLoS ONE 11 (6): e0156540. doi: 10,1371 /journal.pone.0156540

Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 26 helmikuu 2016; Hyväksytty: 16 toukokuu 2016; Julkaistu: 08 kesäkuu 2016

Copyright: © 2016 Shapiran et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: EMERALD BIO-LABS LTD tuettiin muodossa palkkojen tekijöille SP PT, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: EMERALD BIO-LABS LTD tuettiin muodossa palkkojen tekijöille SP PT, mutta tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Lyhenteet: CRC, peräsuolen syöpä; DMSO, dimetyylisulfoksidi; EGFR, epidermaalisen kasvutekijän reseptori; FACS, Fluorescence solulajittelutekniikkaa; Luc lusiferaasi

Johdanto

öljyt ja niiden komponentit uutetaan kasviaineet on havaittu olevan anti-mikrobi, anti-virus, anti-sieni, antioksidantti, tulehdusta ja syöpälääkkeen toimintaa [1-3].

Monoterpeenit ovat suuria kasviperäinen sekundäärimetaboliitteja yleisesti todettu luonnontuotteita, kuten hedelmiä, vihanneksia ja yrttejä ja tiedetään liittyvän kasville puolustusmekanismeja. Monoterpeenien koostuvat kahdesta isopreeniyksikköä, ja niitä löytyy suuria määriä eteerisiä öljyjä [4,5]. Lisäksi monet monoterpeenien on ehdotettu käyttämään voimakkaita syövän vastaista aktiivisuutta. Jotkut niistä tiettävästi näytetään lupaavia tuloksia ehkäisyssä ja hoidossa erilaisia ​​leukemia ja syöpien, kuten rinta-, iho-, haiman ja paksusuolen syöpiä jyrsijöillä [6]. Erityisesti useat näistä yhdisteistä, niiden joukossa perillyylialkoholin ja limoneeni, ollaan testaus meneillään ihmisen tutkimuksissa [7-9].

terpinen-4-oli, yksi ensisijainen aktiivisen ainesosat teepuuöljy , koostuu seoksesta yli 100 erilaista yhdistettä, ja on löydetty eri aromaattisia kasveja (appelsiinit, mandariinit, origanum, Uusi-Seelanti LEMONWOOD puu, japanilainen cedarand pippuri) [10]. Terpinen-4-olia on voimakas bakterisidinen aine [11], joilla on antifungaalinen ominaisuuksia [12]. Erityisen kiinnostavaa on sen

in vitro

tehoavan

Staphylococcus aureus

ja

C

.

albicans

[13,14]. On osoitettu, että yhdistämällä tämä luonnollinen aine, ja tavanomaisia ​​lääkkeet voivat auttaa hoitoon resistenttejä hiiva- ja bakteeri-infektioita.

Useat viimeaikaiset raportit viittaavat siihen, että terpinen-4-oli indusoi antituumorivaikutukset selektiivisesti aiheuttaa nekroottisen solukuoleman ja solusyklin pidätys melanoomasolulinjojen tai laukaisemalla kaspaasiriippuvaisen apoptoosin ihmisen melanooman soluissa, erityisesti huumeiden (adriamysiinin) resistenttien solujen [15,16]. Lisäksi terpinen-4-oli osoitettu saada annos-riippuvainen sytotoksinen vaste on ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut, luultavasti osallistumisen kautta mitokondriaalisen apoptoottisen reitin [17].

CD24 on pieni , voimakkaasti glykosyloitu limaa, kuten solun pinnan proteiineihin ankkuroitu kalvon kautta glukosylfosfatidyl inositoli (GPI) [18]. CD24: n tiedetään yliekspressoituvan ihmisen eri maligniteettien, sekä kiinteitä ja hematologiset [19], ja se on yleensä sidottu aggressiivisempi taudin kulkuun [18,20,21]. Olemme osoittaneet, että anti-CD24-pohjainen syövän immunoterapia on mahdollista kliinistä soveltamista kiinteitä kasvaimia [21-23]. Siksi yhdistelmä terpinen-4-oli yhdessä anti-CD24-terapiaa arvioitiin tässä työssä.

Tässä tutkimuksessa pyrittiin osoittamaan syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on terpinen-4-olin erityyppisten syöpien solut

in vitro

ja

in vivo

. On myös osoitettu, että terpinen-4-oli voidaan palauttaa teho setuksimabin kasvaimissa mutantti RAS.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Kaikki reagenssit hankittiin Sigma, Israel ellei toisin mainita. Soluviljelyalustoja ja lisäaineet saatiin Beit-Haemek, Israel. Anneksiini V ja propidiumjodidia ostettiin Biotium.

Seuraavat aineet testattiin:

terpineeni-4-olin

seos, 1 = γ-terpineeni, α-terpineeni, 1,8-kineolia, symeeni, terpineeni-4-olin

Seos 2 = γ-terpineeni, α-terpineeni, 1,8-sineoli, symeeni,

suhde kunkin yhdisteen kuvataan taulukossa 1.

seuraavat kemoterapiaa huumeiden ja vasta testattiin:

ELOXATIN

® (Oksaliplatiinilla) kanssa pitoisuuksina, jotka 0,2 -0,5 uM.

5-FU (fluorourasiilia) – 0,3-0,5 uM.

Gemzar (gemsitabiini) – 0,1-1 uM

Tarceva (0,05-0,1 uM) .

Erbitux (Setuksimabilla) pitoisuutena alueella 1 uM.

humanisoidut anti-CD24 mAb (humanisoitu IgG1-vasta-aine, joka sitoutuu solun pinnan CD24-proteiini) pitoisuudet ovat 75-150 ug /ml.

Solulinjat

Human CRC (HT29, HCT116, Colo320), mahasyöpä (AGS), haima (COLO357, Panc-1, MIA-PACA) solujen linjat kasvatettiin korkean glukoosin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 5% lämpöinaktivoitua (HI) naudan sikiön seerumia (FBS), 1% glutamiinia ja streptomysiiniä /penisilliiniä. Androgeeni-riippumaton eturauhasen (DU145, CL-1), ja peräsuolen DLD1 syövän soluja kasvatettiin RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 5% HI-FBS: ää.

MTT solunelinkykyisyysmääritys

Solut ympättiin 96-kuoppalevyille (1×10

4 solua /kuoppa) täydellisessä väliaineessa. Seuraavana päivänä, eri pitoisuuksia edellä kuvatun aineita lisättiin soluihin kolmena rinnakkaisena. 72 tuntia myöhemmin väliaine korvattiin tuoreella väliaineella (100 ui per kuoppa), joka sisälsi 1 mg /ml 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) ja inkuboitiin 2 -4 h. MTT-formatsaanikiteet liuotettiin lisäämällä 100 ui uuttopuskuria. Absorbanssi 570 nm ja viite aallonpituudella 690 nm mitattiin automatisoidulla mikrolevyn lukijaa. Suhteellinen määrä elinkelpoisia soluja, verrattiin käsittelemättömiin soluihin.

transfektio ja lusiferaasin määritys

Transfektiot suoritettiin käyttäen jetPEI

™ (Polyplus-transfektio Inc, NY, USA) mukaisesti valmistajan ohjeita. 5 x 10

5HCT116-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille Luc määrityksissä. Seuraavana päivänä, kun solut olivat noin 50% konfluentteja, kotransfektion 3 ug PY4-SV40-LUC vektori plus 0,3 ng PRL-CMV (Promega) suoritettiin. 24 transfektion jälkeen elatusaine vaihdettiin ja solut altistettiin setuksimabia eri pitoisuus terpinen-4-olin tai ne jätetään hoitamatta. Luc analyysi suoritettiin 48 tunnin kuluttua käsittelyn jälkeen. Lyhyesti, solut pestiin kerran PBS: llä ja sitten hajotettiin 250 ~ il lyysipuskuria 5 min huoneen lämpötilassa. Lysaatteja sentrifugoitiin 14000 rpm: ssä 5 min, ja 20 ui kutakin lysaattia käytettiin mittaamaan Luc reportterigeenin ilmentymistä. Luc aktiivisuus normalisoitiin Renilla Luc aktiivisuutta rinnakkain kotransfektoimalla PRL-CMVDual Luc-järjestelmä, Promega).

Detection solukuoleman

Solut ympättiin 12-kuoppalevyille ( 1×10

5 solua /kuoppa) täydellisessä väliaineessa ja käsiteltiin terpinen-4-oli useilla pitoisuuksilla 72 tuntia. Anneksiini V: havaittiin mukaisesti valmistajan protokollaa. Solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin sitten liuoksessa, kalvon läpäisemätöntä ydin- väriainetta propidiumjodidia. Sitten solut välittömästi analysoitiin virtaussytometrillä [FACSCalibur (Becton Dickinson, CA)], ja tulokset analysoitiin CellQuest ohjelman (Becton Dickinson).

ksenograftimallia mittaamiseen

in vivo

kasvaimen vastainen aktiivisuus terpinen-4-olin yksin ja yhdessä biologisten tekijöiden

Male kateenkorvattomiin nude-hiiriin, ikä 6-8 viikkoa, (Harlan Laboratories) pidettiin steriileissä häkeissä ja käsitellä aseptisia varotoimia. Niitä ruokittiin ad libitum. Testaamiseksi terapeuttista potentiaalia terpinen-4-oli, eksponentiaalisesti kasvavia syövän solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen loppukonsentraatioon 5×10

6 solua per 0,1 ml PBS: ää per injektio. Solut injektoitiin ihonalaisesti kylkeen hiiret. Kun kasvaimet olivat palpoitavissa (~ 0,3 cm

3), hiiret jaettiin satunnaisesti ryhmiin ja hoito aloitettiin (vatsaonteloon ja /tai kasvaimeen injektiota). Eläimiä käsiteltiin kahdesti viikossa 3 viikkoa. Ne punnittiin ja kasvaimen tilavuus mitattiin paksuus ja piirrettiin joka 3 päivä alkaen alkamisesta hoidon. Kasvaimen tilavuus laskettiin 4 /3π ∙ ∙ b

2. Lopussa kokeen, hiiret nukutettiin ja tapettiin katkaisemalla kaula ja kasvaimet irrotettiin.

Tilastot

Tiedot

in vitro

tutkimuksissa on esitetty keskiarvo ± SD, jossa tietoja määritetty kolmena rinnakkaisena. Tilastollinen merkitsevyys hoitojen välillä määritettiin Studentin t-testiä, ja

P

arvojen 0,05 pidettiin merkittävinä.

vivo tutkimukset, joilla oli kasvain, hiiret satunnaistettiin 5 hoitoryhmään ja tuumorin tilavuudet seurattava säännöllisesti ja laskettiin 4 /3π ∙ ∙ b

2. Merkittäviä eroja ryhmien välillä ja eri ajankohtina määritettiin Studentin t-testiä.

Tutkimus hyväksynnän

Tutkimus hyväksyi institutionaalisten komitea eläinten hyvinvoinnin Tel-Aviv Sourasky Medical Center.

tulokset

tunnistaminen terpinen-4-olia tehokas ainesosa

Kaksi seoksia erilaisilla monoterpens koostumus testattiin (taulukko 1). Seosta 1 oli merkitsevästi tehokkaampi ja myrkyllisiä kuin sekoitus 2 (

P 0

.

005

). Tärkein ero näiden kahden välillä oli terpinen-4-olia. Tulokset (kuvio 1A) osoitti merkittäviä eroja solujen selviytymistä välillä seoksia, jotta voimme tunnistaa terpinen-4-olin ja sen osuus sytotoksista vaikutusta.

. Tunnistaminen ja eristäminen terpinen-4-oli. Kaksi seokset (niiden koostumus on taulukossa 1) on monoterpens testattiin peräsuolen (HCT116, DLD1, Colo320), mahalaukun (AGS), haiman (PANC-1, COLO357, MIA-PACA) ja eturauhasen (CL-1, DU145 ) syöpäsolulinjoissa. 1×10

4-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille täydelliseen alustaan. 0,05%: n seoksia lisättiin soluihin seuraavana päivänä. Solujen eloonjäänti arvioitiin entsymaattisella MTT assay72 h käsittelyn jälkeen. Kukin pylväs keskiarvoa ± SD joukon määritettyjä kolmena rinnakkaisena. *

P

.

05

, **

P

.

005

. B. terpinen-4-oli aktiivisuus ei riipu läsnäolo DMSO. 1×10

4CRC, maha-, haima- ja eturauhassyöpä solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille täydelliseen medium.0.05% of terpinen-4-olin kanssa tai ilman 0,01% DMSO: ta lisättiin solujen seuraavana päivänä. Solujen eloonjäänti arvioitiin entsymaattisella MTT assay72 h käsittelyn jälkeen. Kukin pylväs keskiarvoa ± SD joukon määritettyjä kolmena rinnakkaisena. *

P

.

05

, **

P

.

005

.

Ei vaikutusta DMSO: n aktiivisuuteen terpinen-4-oli

Yksi esteistä joka kohdataan käytettäessä sytotoksisia yhdisteitä terapeuttisina aineet on niiden alhainen liukoisuus farmaseuttisesti ratkaisut ja niiden alhainen kyky tunkeutua soluihin. Tältä osin me tutki terpinen-4-oli on aktiivinen puuttuessa dimetyylisulfoksidia (DMSO). DMSO: ta, joita käytetään liuottamaan terpinen-4-olin ja sen vaikutus arvioitiin. Kävi ilmi, että sytotoksista aktiivisuutta terpinen-4-oli ei haitannut lisäämällä DMSO: ta (kuvio 1 B). Useat pitoisuudet terpinen-4-olia (0,005% -0,1%) kanssa ja ilman DMSO testattiin (tuloksia ei ole esitetty), ja ero vaikutus DMSO havaittiin pääasiassa suuret annokset terpinen-4-olia. DMSO näytti häiritä tai estää biologinen vaikutus terpinen-4-oli, ehkä estämällä imeytymistä tämän biologisesti aktiivista molekyyliä.

terpinen-4-olia solunsalpaajaksi

terpinen -4-oli esti kasvua kolorektaalisyövän (kuvio 2A), haiman (kuvio 2B), mahalaukun (kuvio 2C) ja eturauhasen (kuvio 2D) syövät annoksesta riippuvalla tavalla [10% (0,005%) – 90 (in 0,1%) kasvun inhibitio)], mitattuna laadullisesti mikroskooppinen huomautuksia (tietoja ei esitetty) ja kvantitatiivisesti entsymaattisella MTT-määrityksellä (kuvio 2).

1×10

4 HCT116, DLD1, HT29 ja Colo320 CRC (A), MIA-PACA, Colo357 ja Panc-1 haiman (B), AGS mahalaukun (C), ja DU145 ja CL-1 syöpäsolujen (D) ympättiin 96-kuoppaisille levyille täydelliseen alustaan. Useat pitoisuudet terpinen-4-olia [0,005%, 0,01%, 0,05 ja 0,1% (v /v)] lisättiin soluihin seuraavana päivänä. Solujen eloonjäänti arvioitiin entsymaattisella MTT-analyysi 72 h käsittelyn jälkeen. Kukin pylväs keskiarvoa ± SD joukon määritettyjä kolmena rinnakkaisena. *

P

.

05

, **

P

.

005

terpinen-4-oli indusoi apoptoosia eikä nekroosia

Pieniä pitoisuuksia terpinen-4-olia (+0,005-,01%) esti HCT116 solu leviämisen vaatimattomalla tavalla (20-30%) mitattuna MTT elinkelpoisuuden määrityksessä. Suuret pitoisuudet (0,05-0,1%), indusoi massiivinen solukuolema (75-90%). Kuten voidaan nähdä kuviosta 3, apoptoosi on solukuoleman mekanismia vastuussa sytotoksisen vaikutuksen aiheuttama terpinen-4-olia. Varhainen apoptoottista kuolemaa indusoitiin pieniä annoksia terpinen-4-oli, kun taas prosenttiosuudet myöhään apoptoosin kasvoi korkeammilla konsentraatioilla. Ei nekroottisia soluja ei havaittu.

1×10

5 HCT116-solut ympättiin 12-kuoppaisille levyille täydelliseen elatusaineeseen ja altistettiin eri pitoisuuksia terpinen-4-oli 72 tuntia. Solukuolema mitattiin FACS värjäyksen jälkeen anneksiini V ja PI väriaineita. Kukin pylväs keskiarvoa ± SD joukon määritettyjä kolmena rinnakkaisena. *

P

.

05

, **

P

.

005

Enhancement of terpinen-4-oli tehoa

terpinen-4-oli yhdistetty eri tavanomaisen kemoterapian, riippuen siitä, minkä tyyppistä syöpä hoidettavan. CRC hoito, terpinen-4-oli, oksaliplatiinin (kuvio 4A) ja 5-FU (kuvio 4B). Vaikuttava synergistinen kasvun esto vaikutus saavutettiin (83% ja 91%, sillä oksaliplatiini ja 5-FU, vastaavasti) yhdistetyssä hoito verrattuna kunkin aineen yksinään [12% (oksaliplatiini), 25% (terpinen-4-oli) ja 20% (5-FU)]. Nämä tulokset ovat saavuttaneet tilastollista merkittävyyttä,

P 0

.

005

. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin haimasyövän soluja (kuvio 4C-4F). Terpinen-4-oli näyttävästi lisäsi tehoa gemsitabiinin ja että Tarcevan (60-85% solukuolema).

1×10

4 CR DLD1 soluja (A, B), ja haiman MIA-PACA ( C, D) ja Panc-1 (E, F) solut siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille täydelliseen alustaan. Seuraavana päivänä, oksaliplatiini, jonka pitoisuus on 0,2 uM ja terpinen-4-olia, jonka konsentraatio on 0,01% (A), 5-FU, jonka pitoisuus on 0,3 gm ja terpinen-4-olia, jonka konsentraatio on 0,01% ( B), gemsitabiini, jonka pitoisuus on 0,1 uM ja terpinen-4-olia, jonka pitoisuus on 0,01%, (C), gemsitabiini, jonka pitoisuus on 0,1 uM, erlotinibi hydrokloridit (Tarceva

®), jonka konsentraatio on 0,1 uM, ja terpinen-4-olia, jonka konsentraatio on 0,01% (D), gemsitabiini, jonka pitoisuus on 1 uM ja terpinen-4-olia, jonka konsentraatio on 0,01% (E), gemsitabiini pitoisuutena 1 uM, anderlotinib hydrokloridit (Tarceva

®), jonka pitoisuus on 0,1 uM, ja terpinen-4-olia, jonka konsentraatio on 0,01% (F) lisättiin 72 tuntia. Solujen eloonjäänti arvioitiin entsymaattisen MTT-määrityksellä. Kukin pylväs keskiarvoa ± SD joukon määritettyjä kolmena rinnakkaisena. *

P

.

05

, **

P

.

05

Tehostettu sytotoksisuutta terpinen-4-oli biologisten tekijöiden

yhdistäminen terpinen-4-oli joko humanisoitu anti-CD24 erääntyi vasta-aineella (Arber n lab, Tel Aviv, Israel) tai kimeerinen anti EGFR-vasta-aine (Setuksimabia, Merck Serono) johti merkittävä synergistinen kasvun inhibitiota vaikutuksen (85-90%,

P 0

.

005

) ihmisen CRC (kuvio 5A ja 5B) ja eturauhassyövän soluissa (kuvio 5C ja 5D).

1×10

4 CR DLD1 ja HCT116-solut (A, B, E), ja eturauhasen CL-1 (C, D) solut siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille täydelliseen alustaan. Seuraavana päivänä, terpinen-4-olia, jonka pitoisuus on 0,01%, ja humanisoitu anti-CD24-vasta-aineiden (150 ug /ml) (A, C), ja terpinen-4-olia, jonka pitoisuus on 0,01% ja setuksimabi, jonka konsentraatio 1 uM (B, D, E) lisättiin 72 tuntia. Solujen eloonjäänti arvioitiin entsymaattisen MTT-määrityksellä. Kukin pylväs keskiarvoa ± SD joukon määritettyjä kolmena rinnakkaisena. (F) 0.4X10

6 HCT116-solut ympättiin 6-kuoppalevyille kolmena kappaleena. Seuraavana päivänä kotransfektion PY4-SV40-LUC vektorin ja PRL-CMV suoritettiin. 24 transfektion jälkeen elatusaine vaihdettiin ja solut altistettiin setuksimabia eri pitoisuus terpinen-4-olin tai ne jätetään hoitamatta. Luc analyysi suoritettiin 48 tunnin kuluttua käsittelyn jälkeen. Kukin pylväs keskiarvoa ± SD joukon määritettyjä kolmena rinnakkaisena. *

P

.

05

, **

P

.

05

terpinen-4-oli palauttaa herkkyys

K-ras

mutantti syöpäsolujen ceteximub

DLD1 CRC solut mutaatio

KRAS

onkogeeni. Näin ollen, ne ovat resistenttejä anti-epidermaalinen kasvutekijä (EGFR) hoito. Yhdistämällä terpinen-4-olia (0,01%) Setuksimabihoitoa (1 uM) johti varsin vaikuttava tehosta 85-90% kasvun esto. Nämä tulokset vahvistettiin toisessa

KRAS

mutatoitunut CRC solulinja (HCT116) (kuvio 5E), 80%: n kasvun esto (

P 0

.

005

) yhdistetyn hoidon.

Vähentynyt aktiivisuus

K-ras

signalointireitistä kanssa terpinen-4-oli

Tätä varten käytimme (Ets /AP1)

4 RAS-reagoivan elementin (PY4) konstruktio, jota oli aikaisemmin rakennettu [24-26]. Aktiivisuus

KRAS

polku arvioitiin mutatoitunut CRC soluissa (HCT116) (kuvio 5F). Transfektion PY4-SV40-Luc aktiivisuus läsnäollessa terpinen-4-olia (0,005 ja 0,01%) oli 1,3 ja 1,5 kertaa pienempi verrattuna toimintaan sen puuttuessa (

P 0

.

05

) _. Mitään vaikutusta ei havaittu, kun altistus setuksimabi (1 uM).

inhibitio ihonalainen DLD1 kasvaimen kasvua hiirissä terpinen-4-oli

Seuraavaksi testasimme mahdollisia kasvaimen vastainen aktiivisuus terpinen-4-ol

in vivo

. Kasvaimensisäistä injektiota (5 injektiot) yhdistettä (0,1% ja 1%) annettiin kahdesti viikossa nude-hiiriin (n = 6), joissa on ksenografteja CRC DLD1 soluja. Hoito aloitettiin, kun kasvaimet olivat 0,3-0,5 cm

3. Merkitsevän eston kasvaimen kehittymisen havaittiin; 40% ja 70% vähennys kasvaimen tilavuuden ja noin 25% ja 50% vähennys kasvaimen paino (kuvio 6A). Nämä tulokset vahvistettiin toisessa kokeessa (kuvio 6B). Ei ole merkittäviä haitallisia vaikutuksia ei havaittu (tuloksia ei ole esitetty).

Eksponentiaalisesti kasvavat DLD1 syövän solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen loppukonsentraatioon 5×10

6 solua per 0,1 ml PBS: ää per injektio. Kun kasvaimet olivat palpoitavissa, hiiret jaettiin satunnaisesti ryhmiin ja hoito aloitettiin [kasvaimeen injektioita terpinen-4-olia (A, B) tai kasvaimeen injektioita terpinen-4-olin ja vatsaontelonsisäisiä setuksimabi (C)] . Hiiriä käsiteltiin kahdesti viikossa. Ne punnittiin ja kasvaimen tilavuus mitattiin mittaharpilla joka 3 päivä alkaen alkamisesta hoidon terpinen-4-olia. Kasvaimen tilavuus ajan funktiona hoidon piirrettiin. Lopussa kokeen, hiiret nukutettiin ja tapettiin katkaisemalla kaula ja kasvaimet leikattiin irti ja mitattiin tilavuus ja paino. Kukin pylväs edustaa keskiarvo ± SD. *

P

.

05

, **

P

.

005

yhdistetyn kasvun inhibition ihonalainen hiirissä

Kun kasvaimen läpimitta saavutti koon 0,5 mm kasvaimeen injektioita terpinen-4-oli (0,1%) yhdessä systeemisen (IP) annon setuksimabin (10 mg /kg) johti vähentynyt merkittävästi kasvaimen tilavuus (62% ± 2,5%,

P 0

.

05

) ja paino (62,5% ± 3%,

P 0

.

05

) (kuvio 6C) B

suunnittelu tehokkaamman muotoilua terpinen-4- ol

Kaksi eri formulaatioiden terpinen-4-oli arvioitiin

in vivo

, nano ja suspensioformulaatiot. Jälkimmäinen ilmeni olevan tehokkaampia ja turvallisempia (tietoja ei ole esitetty). Systeeminen anto suspension (1 ja 4 mg) hiirille, joilla ksenografteja CRC (HCT116-soluja) johti vaikuttava pieneneminen kasvaimen tilavuus (32% ± 1,1%,

P 0

.

05

ja 72% ± 0,7%,

P 0

.

005

, vastaavasti) ja paino (26% ± 1,19 ja 70% ± 0,71%,

P 0

.

005

, vastaavasti) annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 7).

Eksponentiaalisesti kasvavat HCT116 syövän solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen loppukonsentraatioon 5×10

6 solua per 0,1 ml PBS: ää per injektio. Kun kasvaimet olivat palpoitavissa, hiiret jaettiin sattumanvaraisesti 3groups ja hoito, joka koostuu vatsaonteloon injektioina terpinen-4-olia (1 ja 4 mg /kg), aloitettiin. Hiiriä käsiteltiin kahdesti viikossa. Ne punnittiin ja kasvaimen tilavuus mitattiin mittaharpilla joka 3 päivä alkaen alkamisesta hoidon terpinen-4-olia. Kasvaimen tilavuus ajan funktiona hoidon piirrettiin. Lopussa kokeen, hiiret nukutettiin ja tapettiin katkaisemalla kaula ja kasvaimet leikattiin irti ja mitattiin tilavuus ja paino. Kukin pylväs edustaa keskiarvo ± SD. *

P

.

05

, **

P

.

005

Keskustelu

syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on terpinen-4-oli ovat vaikuttavia erilaisten syöpäsolujen sekä

in vitro

ja

in vivo

.

terpinen-4-oli on tärkeä osa eteerinen öljy peräisin useista aromaattisia kasveja. Sitä käytetään tulehdusta ja antioksidanttia [27-29]. Osuus terpinen-4-olia syövän vastaisen aineen ja sen taustalla signalointireitteihin erilaisia ​​solukuoleman on tuntematon. Tässä on osoitettu, että vaikutusmekanismi terpinen-4-olia on apoptoosin induktiota, ei nekroosia. On myös osoitettu, että terpinen-4-olin ja erilaisia ​​syöpää vastustavien aineiden osoittaa synergististä kasvua estävä vaikutus vähentämällä selviytymistä eri syöpäsolulinjoissa. Tällaisia ​​yhdistelmiä ehkä odotetaan olevan tehokkaampia ja vähemmän myrkyllisiä, koska alempi lääkeainepitoisuudet voidaan käyttää hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä.

Huomattavaa on, että palauttaminen herkkyys anti-EGFR hoitoa (esim setuksimabi), CRC tapauksissa kuljettavat

KRAS

mutaatio, kun sitä annetaan yhdessä terpinen-4-oli etuna on kliinistä merkitystä. On osoitettu mittaamalla aktiivisuus ras reagoivan promoottorin ennen ja jälkeen altistuksen terpinen-4-olia. On osoitettu, että promoottorin aktiivisuus väheni merkittävästi altistettaessa Terpenin-4-olia. Tämä mielenkiintoinen ja tärkeä havainto on vahvistettu edelleen laboratoriotutkimuksissa ennen johtavat tahansa kliinisestä käytöstä terpinuin-4-oli.

injektio terpinen-4-oli kasvaimeen estettiin merkittävästi kasvaimen kasvua ilman merkittäviä haittavaikutuksia vaikutuksia. Etsiessään helpommalta antoreittejä, kaksi farmaseuttiset formulaatiot valmistettiin ja testattiin annettavaksi systeemisesti, nano- muotoilu ja jousitus. Nano muotoiluja lisääntynyt pinta-ala ja sen vuoksi parantanut vesiliukoisuus, hyötyosuutta, tehokkuutta ja vaikuttavuutta. Suspension muodossa koostui pieniä pisaroita /molekyylien terapeuttisesti aktiivinen ainesosa (öljy) suspensioväliaineessa. Koska nanodrops liittyi vakava myrkyllisyys (painon menetys, kuolleisuus), suspension lähestymistapa, joka oli vailla mitään haittavaikutuksia valittiin lisäselvitysten. Systeemisesti terpinen-4-olista suspensio liittyy merkittävä kasvaimen koon pienentyminen kokeellisessa nude-hiirissä.

Yhteenvetona yhdistelmän käyttö on kasviperäinen syövänvastainen aineiden ja kemoterapeuttisten tai biologisten aineita hoidettaessa erilaisia ​​syöpätyyppejä on lupaava, jossa synerginen teho jotka mahdollistavat alhaisempi pitoisuus kemoterapiaa ja biologisten aineiden, jotka eivät voi vain lisätä tehoa vaan voi minimoida myrkyllisyys samoin. Tärkeintä terpinen-4-oli merkittävä etu on kyky palauttaa herkkyys EGFR antagonisteja kasvaimissa

Ras

mutaatioita.

Kiitokset

Kirjoittajat ovat kiitollisia Esther Eshkol, institutionaalisten lääketieteen copyeditor, huolellinen muokkaus meidän paperia.