Krooninen sairaus

tiivistelmä

MicroRNA-34a (miR-34a), joka on voimakas välittäjänä kasvaimen p53, on raportoitu toimivan tuumorisuppressorina ja miR-34a havaittiin vaimentua eturauhassyövässä kudoksissa. Tutkimme toiminnalliset vaikutukset miR-34a c-Myc transkription komplekseja PC-3 syöpäsolujen. Transfektio miR-34a osaksi PC-3-solujen vahvasti esti

in vitro

solujen proliferaatiota ja invaasion ja edistää apoptoosin. Transfektio miR-34a osaksi PC-3-solut myös merkittävästi estivät

in vivo

ksenograftin kasvaimen kasvua nude-hiirissä. miR-34a vaimentua ilmentymisen c-Myc-onkogeenin kohdistamalla sen 3 ’UTR, kuten on esitetty lusiferaasireportterilla määrityksissä. miR-34a todettiin tukahduttaa RhoA, säätelijänä solumigraation ja invaasiota, tukahduttamalla c-Myc-Skp2-Miz1 transkription kompleksi, joka aktivoi RhoA. Yliekspressio c-Myc päinvastaiseksi miR-34a tukahduttaminen RhoA ilmaisun, mikä viittaa siihen, että miR-34a estää invaasio tukahduttamalla RhoA-c-Myc. miR-34a havaittiin myös tukahduttaa c-Myc-pTEFB transkriptio venymä monimutkainen, joka osoittaa yksi niistä mekanismeista, joilla miR-34a on syvällisiä vaikutuksia solujen toimintaa. Tämä on ensimmäinen raportti dokumentoida että miR-34a estää kokoamista ja käyttöä c-Myc-Skp2-Miz1 kompleksi, joka aktivoi RhoA ja c-Myc-pTEFB monimutkaisia, että elongates transkriptio erilaisten geenien, mikä viittaa uusi rooli asennuspalveli- 34a sääntelyssä transkription c-Myc monimutkainen.

Citation: Yamamura S, Saini S, Majid S, Hirata H, Ueno K, Deng G, et al. (2012) MicroRNA-34a moduloi c-Myc Transkription Complexes ohitettavat Maligniteetti Human eturauhassyöpä solut. PLoS ONE 7 (1): e29722. doi: 10,1371 /journal.pone.0029722

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 27 joulukuu 2010; Hyväksytty: 3. joulukuuta 2011; Julkaistu: 03 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Yamamura et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Grants R01CA138642, T32DK007790 (NIH), VA Research Enhancement palkinto-ohjelma (REAP) ja Merit Review avustuksia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat erittäin konservoituneita, yksijuosteinen, ei-koodaavat RNA: t on noin 22 nukleotidin, jotka säätelevät geeniekspressiota posttranskriptionaalisella hiljentäminen erityinen tavoite mRNA: iden, joita tukahduttaa käännös tai lohkaisemalla RNA-transkriptien [1]. miRNA säätelevät erilaisia ​​soluprosesseja, kuten solusyklin etenemisen, jakautumista, apoptoosia ja kehitystä. miRNA on osoitettu toimivan oncogenes tai tuumorisuppressorigeeneille [2].

p53-tuumorisuppressorin on poistettu tai mutatoitu yli 50% ihmisen kasvaimista, ja on keskeinen molekyyli, joka estää pahanlaatuisten kasvainten [3]. p53 on todettu kohdistaa miR-34 perheen [4], [5], [6] ja kohdunulkoinen ilmaus miR-34-geenit on rajuja vaikutuksia soluproliferaatioon ja selviytymistä. Kohdunulkoinen miR-34a aiheuttaa solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa [6], [7] ja apoptoosin [7], [8]. P53 on todettu kohdistaa miR-34a ja koska, solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin myös lopettaa olevia p53 aktivaation miR-34a-geeni voi olla välittäjä p53: n funktion.

proto-onkogeeni c-Myc säätelee solujen lisääntymistä ja transformaatio sekä transkriptionaalisesti ja ei-kopiointia ja usein vapautettiin ihmisen syövissä [9], [10]. c-Myc on perus helix-loop-helix ja leusiinivetoketju transkriptiotekijä, joka sitoutuu Enhancer Box elementtien (E-box) ja aktivoi geenien transkriptiota, jotka stimuloivat solusyklin etenemisen ja solujen kasvua. c-Myc estää geenien transkriptiota, jotka pysäyttävät solusyklin kautta Miz1, c-Myc liittyvä proteiini. c-Myc on myös toiminto rekrytoida histoni ase- tyylitransferaaseja (HAT). c-Myc ei transkriptionaalisesti vuorovaikutuksessa komponenttien replikaation koneen positiivisesti säädellä DNA-synteesiä, mikä johtaa genomista epävakauteen.

c-Myc: n raportoitiin aktivoida MiR-17-92, polykistronisen microRNA klusteri, joka koostuu miR -17, 18a, 19a, 20a, 19b ja 92a [11], [12]. miR-19 todettiin olevan pääasiallinen onkogeenisiä osa tätä klusterin, kohdistaminen tuumorisuppressorigeenin PTEN [13]. miR-34c on osoitettu säädellä negatiivisesti c-Myc vasteena DNA-vauriolle ja estää c-Myc-indusoidun DNA-synteesin [14]. Aikana onkogeeni aiheuttama vanhenemista, miR-34a havaittiin myös kohdistaa c-Myc [15].

Rho GTPaasit ovat pieniä G-proteiinit, jotka säätelevät solujen eri prosesseja, kuten solun tukirangan dynamiikkaa, muuttoliike, rakkula kaupan, soluproliferaatiota , apoptoosin, ja transkription [16], [17], [18]. Rho GTPaasit, niiden sääntelyviranomaisten ja niiden effektorit on ehdotettu valvoa kasvaimen muodostumisen ja etenemisen. RhoA on osoitettu ohjaamaan syövän etäpesäkkeiden ja etenemiseen [19], [20], [21]. Äskettäin, c-Myc kompleksi havaittiin aktivoida RhoA geeni [22].

positiivinen transkription elongaatiotekijä b (P-TEFb) säätelee promoottori-proksimaalisen tauon vapauttamaan venymään vaiheen transkription Pol II [23] ja integroi mRNA-synteesin kanssa histonimodifikaation, pre-mRNA: n prosessointi ja mRNA vienti [24]. P-TEFb koostuu sykliini (CycT1, CycT2a, CycT2b tai CycK) ja sykliini-riippuvaisen kinaasin 9 (CDK9) [23]. c-Myc vuorovaikutuksessa sykliini T1 (CycT1), sääntely komponentti P-TEFb, ja ohjaa venymä vaihe transkription Pol II [25], [26], [27].

c- Met polku on väärin säädellystä useimmissa ihmisen maligniteettien ja säätelee kasvainten muodostumista ja etenemistä [28], [29]. c-Met vuorovaikutuksessa hepatosyyttikasvutekijää /Hajontatekijän ja on osallistuvat kasvaimen invaasion ja maahanmuutto mukaan lukien PC-3-solujen [30], [31], [32], [33], [34], [35].

tässä raportoidaan että miR-34a säädeltiin vähentävästi eturauhassyövässä kudoksissa. miR-34a inhiboi soluproliferaatiota

in vitro

,

in vivo

kasvaimen kasvua ja edistää apoptoosin eturauhassyövän soluissa. Olemme myös löytäneet miR-34a tavoitteet c-Met ja estää PC-3 solujen invaasiota. Tutkimme vaikutukset miR-34a kahdesta c-Myc transkription komplekseja. Kohdistamalla c-Myc, miR-34a vähensi c-Myc-Miz-Skp2 kompleksi, joka indusoi RhoA transkription ja esti solujen invaasiota, jotka osoittavat, että miR-34a epäsuorasti säätelee RhoA. miR-34a tukahdutti myös c-Myc-P-TEFb kompleksi, jolla on keskeinen rooli valvoa venymä vaihe transkriptio RNA-polymeraasi II (Pol II), joka osoittaa yksi niistä mekanismeista, joilla miR-34a on dramaattisia vaikutuksia solun toiminto. Tuloksemme osoittavat, että eturauhassyöpä PC-3-solujen miR-34a estää kokoamista ja käyttöä c-Myc kompleksi, joka aktivoi tai elongates transkriptio, paljastaen uusi rooli miR-34a säätelyyn transkription c-Myc.

tulokset

miR-34a ilmentyminen säädeltiin vähentävästi eturauhassyövässä

tutki ekspressiotasot miR-34a laser kaapata mikropaloitelluista (LCM) eturauhassyöpäkudoksille (n = 10) ja sovitettu viereisten normaali alueiden reaaliaikainen PCR. Kaikki syöpäkudokset osoitti alempi miR-34a tasoa verrattuna Hyväksytty vieressä normaali alueilla, mikä osoittaa, että miR-34a on vaimentua syövän (Fig. 1A). Histologinen tiedot osoittavat, että nämä kudokset ovat adenokarsinooma kanssa Gleason tulokset 6 tai 7 Gleason kuvioita ja muut kliiniset tiedot on esitetty taulukossa S1.

(A) Suhteellinen miR-34a ilmentymisen laser kaapata mikropaloitelluista (LCM) eturauhasen syöpä kudokset (C) ja sovitettu viereisen normaali alueet (N). (B) miR-34a yliekspressio estää pehmeä agar pesäkkeiden muodostumista stabiilisti transfektoitujen miR-34a PC-3 solulinja. 14 päivän kuluttua inkuboinnin pesäkkeet yli 50 solut laskettiin. Arvot on normalisoitu kuin kontrolli. (C) Kuvat ovat pesäkkeiden. (D) miR-34a inhiboi

in vivo

kasvaimen kasvua. Aika aikana kasvaimen kasvua nude-hiirissä ihon alle annetun stabiilisti transfektoitujen miR-34a PC-3 solulinjaa tai ohjaus solulinjaa. *, P 0,05 verrattuna kontrolli. (E) edustaja kuviin kasvaimista nude-hiirissä 5 viikon kuluttua ihonalaisen stabiilisti transfektoitujen miR-34a PC-3 solulinjaa tai ohjaus solulinjaa. (F) miR-34a indusoi apoptoosia PC-3-solut. PC-3-solut transfektoitiin ennalta miR negatiivinen kontrolli (NC) tai pre-miR-34a 3 päivää. PC-3-solut värjättiin anneksiiniV-FITC /7-AAD ja apoptoosi analysoitiin virtaussytometrialla. Tiedot näyttää prosentteina varhaisen apoptoottisten ja apoptoottisten solujen ulos koko solupopulaation PC-3-solut. *, P 0,05 verrattuna ohjaus.

määritettiin myös miR-34a ekspressiotasot pahanlaatuinen (PC-3, LNCaP ja DU145 solut) ja ei-pahanlaatuiset eturauhasen RWPE-1-soluissa. Reaaliaikainen RT-PCR osoitti, että ilmentymistaso miR-34a oli selvästi pienempi PC-3-soluja verrattuna ei-pahanlaatuisten epiteelisolujen eturauhasen solujen RWPE-1-soluissa (tietoja ei esitetty). Tämä tulos oli yhdenmukainen aiemmin raportoitujen tietojen avulla PrEC normaalia ihmisen eturauhasen epiteelisolujen [36]. Vertasimme myös ekspressiotasot miR-34a pahanlaatuisia eturauhasen soluissa ja laser talteenotto mikropaloitelluista (LCM) eturauhasen normaalien kudosten (n = 10). Reaaliaikainen RT-PCR osoitti, että ilmentymistaso miR-34a oli pienempi pahanlaatuisten eturauhasen soluissa verrattuna keskimääräiseen ilmentymisen tason miR-34a on normaaleissa kudoksissa (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset olivat myös yhdenmukaisia ​​aiemmin raportoitujen tietojen normaalilla ihmisen kudoksia [37].

miR-34a inhiboi solujen lisääntymistä PC-3-solujen

vaikutuksen tutkimiseksi miR-34a kasvun eturauhassyöpäsolujen, me transfektoitiin ohimenevästi useissa solulinjoissa, joissa on valmiiksi miR negatiivinen kontrolli (NC) tai pre-miR-34a. Ohimenevä transfektio pre-miR-34a kasvoi miR-34a tasoa eturauhassyövän soluissa (kuvio. S1A). MTS-määritys osoitti, että miR-34a esti PC-3-solujen lisääntymisen noin 40% päivänä 4, mutta ei ollut merkittävää vaikutusta LNCaP ja DU145 soluja (Kuva. S2A). Tuoreessa raportissa osoittaa, että PC-3-solut ovat ominaisuuksia eturauhasen pienisoluisen karsinooman eikä adenokarsinooma [38], mutta käytimme PC-3-solujen lisätutkimuksia, koska leviämisen tukahduttaminen vaikutus miR-34a oli merkittävä, mikä oli yhdenmukainen aiemmin raportoitu data [36]. Ohimenevä transfektio ennalta miR-34a aiheuttivat myös merkittäviä morfologisia muutoksia PC-3-solut (Fig. S2B).

palveluksessa lentiviraalinen järjestelmä ilmaista miR-34a. HIV lentiviruksen järjestelmä, ilmentävät miR-34a tai vektorisäätö, käytettiin infektoimaan PC-3-soluja, ja infektoidut solut valittu puromysiini. Vakaa transfektio ennalta miR-34a kasvoi miR-34a tasoa PC-3-solut (Fig. S1B). Suoritimme pehmeä agar pesäkemuodostusta käyttämällä tartunnan PC-3-solut ilmentävät miR-34a tai valvontaa. miR-34a vähensi colony numeroita, noin 20%, että valvonta, joka osoittaa, että miR-34a inhiboi merkittävästi pesäkkeenmuodostuskyvyn PC-3-solut (kuviot. 1B ja C).

vaikutusten tutkimiseksi kohdunulkoinen ilmaus miR-34a

in vivo

kasvaimen kasvua, me ihon alle injektoidaan vakaa miR-34a tai ohjaus solulinjasta nude-hiiriin. Tuumoritilavuudet mitattiin joka 7. päivä 5 viikon ajan injektion jälkeen. Ksenograftikasvaimissa PC-3-solut yli-ilmentävät miR-34a olivat pienempiä kuin ksenograftikasvaimissa ohjauspaneelista soluja. Viikolla 5, kasvainten koot ohjaus ksenograftien oli noin 5 kertaa suurempi kuin miR-34a-ksenografteja, mikä osoittaa, että ektooppinen ekspressio miR-34a suppressoi merkittävästi kasvaimen kasvua in vivo (kuviot. 1D ja E).

Koska ektooppinen ilmentyminen miR-34a tukahdutetaan PC-3 solujen lisääntymistä, me seuraavaksi tutkittiin vaikutuksia miR-34a apoptoosin PC-3-solujen virtaussytometriaa käyttämällä. Huomasimme, että ektooppinen ilmentyminen miR-34a kasvoi PC-3-solujen apoptoosin sen about4 aikoina että valvonta (Fig.1F ja Fig. S3), jotka osoittavat, että miR-34a on apoptoottista aktiivisuutta PC-3-solut.

miR-34a estää solujen invaasiota ja muuttoliike

Teimme siirtokuoppaan invaasiomääritys käyttämällä matrigeelin tutkia vaikutuksen miR-34a on invasiivisen kyky PC-3-solut. Me transfektoitu tilapäisesti PC-3-solujen ennalta miR negatiivinen kontrolli (NC) tai ennalta miR-34a ja alistettiin transfektoitujen solujen TranswellTM invaasiomääritys. Tulokset selvästi ilmi, että miR-34 vähensi hyökkäyksen PC-3-solujen 20% tästä valvonnan (kuviot. 2A ja B). Haavan paranemista määritys osoitti myös, että miR-34a vähensi huomattavasti migraatio PC-3-solut (kuviot. 2C ja D).

(A) miR-34a estää hyökkäys PC-3-solut. PC-3-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti ennalta miR negatiivinen kontrolli (NC) tai pre-miR-34a: ssa 48 tuntia. Solut kerättiin ja alistettiin Transwell invaasiomääritys. Arvot on normalisoitu kuin NC. *, P 0,05 verrattuna kontrolli. (B) edustaja kuvia hyökkäsi soluja. (C) miR-34a inhiboi haavan paranemista PC-3-soluja. PC-3-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti ennalta miR negatiivinen kontrolli (NC) tai pre-miR-34a: ssa 48 tuntia. Solut kerättiin ja alistettiin haavan paranemista määrityksessä. Leveys jäljellä avoimen haavan laskettu suhteessa erottaminen ajankohtana 0 h. *, P 0,05 verrattuna kontrolli. (D) Kuvat ovat haavan paranemista määrityksessä.

miR-34a tavoitteet c-Myc ja c-Met

Onkogeenit, c-Met ja c-Myc, ovat ennustaneet sitova sivustoja miR-34a niiden 3′-UTR (Fig. S4). c-Met on 2 ennustettu sitoutumiskohdat miR-34a sen 3′-UTR (Fig. S3). Me kloonattu otaksuttu miR-34a tavoitteita 3’UTRs osaksi lusiferaarikonstrukti. Lusiferaasireporttiterilla määrityksiä kanssa miR-34a-ilmentävät PC-3-solut osoittivat, että miR-34a tukahdutettu lusiferaasiaktiivisuus. Mutaatio oletetun miR-34a kohdesivustot näissä UTR vähensi vaste miR-34a. Nämä tulokset osoittavat, että miR-34a sitoutuu 3′-UTR c-Myc ja c-Met (Fig. 3A).

(A) PC-3-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti ennalta miR negatiivinen kontrolli (NC) tai pre-miR-34a tai esi-miR-con: ssa 8 tuntia, minkä jälkeen ohimenevän transfektion ohjaus toimittaja plasmidit tai 3’UTR plasmidit 48 tuntia. 3’UTR toimittaja aktiivisuus mitattiin lusiferaasianalyysissä ja normalisoidaan aktiivisuus Renillan lusiferaasin. *, P 0,05 verrattuna kontrolli. (B) PC-3-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti ennalta miR negatiivinen kontrolli (NC) tai pre-miR-34a tai esi-miR-con: ssa 72 tuntia. Ekspressiotaso analysoitiin Western blot.

tutkinut, mitä vaikutuksia miR-34a transfektion proteiinin tasot näiden geenien. Transfektio miR-34a vähensi proteiinin tasot c-Met: sta ja c-Myc, proteiinin PC-3-solut (Fig. 3B). Nämä tulokset vahvistavat, että miR-34a suoraan suunnattu c-Met ja c-Myc sitoutumalla niiden 3’UTRs PC-3-solut. miR-34a myös alhaisempia transkriptiotekijän E2F1 joka säätelee solusyklin, DNA: n replikaatiota ja soluproliferaatiota (Fig. 3B).

miR-34a estää RhoA ja estää kokoonpano c-Myc transkription kompleksin

c-Myc-Skp2-Miz1 transkription kompleksi on havaittu aktivoivan RhoA-geenin ja on kriittinen solujen invaasiota ja syövän etäpesäkkeiden [22]. Koska huomasimme, että c-Myc on tavoite miR-34a, mikä vähen- tämisessä ilmaus c-Myc, tutkimme onko downregulation c-Myc by miR-34a johtaa vähentämiseen RhoA ilmaisun tukahduttamalla kokoonpanoon c- myc-Skp2-Miz1 monimutkainen. Reaaliaikainen PCR osoitti miR-34a laski RhoA mRNA-tasolla (Fig. 4A) ja Western blot osoitti, että miR-34a vähensi RhoA proteiinin ilmentymisen (Fig. 4B).

PC-3-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti pre -miR negatiivinen kontrolli (NC) tai pre-miR-34a: ssa 72 tuntia. (A) RhoA mRNA taso analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä. (B) RhoA proteiinin ilmentyminen analysoitiin Western blot. (C) c-Myc vetää alas endogeenisen Miz1, Skp2 ja Max PC-3-solut. PC-3-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti ennalta miR negatiivinen kontrolli (NC) tai pre-miR-34a: ssa 72 tuntia, ja koko solulysaatit immunosaostettiin c-Myc-vasta-ainetta tai IgG: tä (kontrolli) ja sen jälkeen Western blot-analyysi. (D) miR-34a vähentää rekrytointi c-Myc on RhoA promoottori. PC-3-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti ennalta miR negatiivinen kontrolli (NC) tai pre-miR-34a: ssa 72 tuntia ja ChIP määritykset suoritettiin. *, P 0,05 verrattuna ohjaus.

Suoritimme immunosaostuksella (IP) tutkia kokoonpano c-Myc-Skp2-Miz1 transkription monimutkainen miR-34a transfektoiduissa soluissa. IP (Fig. 4C) paljasti, että anti-c-Myc immunosaostumissa sisälsi Miz1, Skp2 ja Max (kaista 5), ​​mutta ei anti-IgG: tä (kontrolli) immunosaostumissa (kaista 3), mikä osoittaa, että c-Myc-Skp2-Miz1 kompleksi muodostettu PC-3-solut. IP osoitti myös, että miR-34a vähensi tasot näiden komponenttien c-Myc immunosaostumissa [kaistat 4 (kontrolli) ja 6], mikä osoittaa, että miR-34a tukahdutti kokoonpano c-Myc-Skp2-Miz1 transkription monimutkainen PC- 3-soluissa. miR-34a ei merkittävästi vähentänyt Skp2 Immunosaostumien verrattuna muihin komponentteihin.

suoritetaan kromatiinin immunosaostuksella (ChIP) määritykset tutkia miR-34a vähentää sitoutumista c-Myc, että RhoA-promoottorin alue, joka sisältää E -laatikoiden 5 ja 6, joka on ensisijainen sitoutumiskohta c-Myc [22]. Siru määritys osoitti, että endogeeninen c-Myc sitoutuu E-box-5 ja 6 ohjaus kokeet osoittivat, että RNA-polymeraasi II: n sitoutumisen glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) -promoottori ei muuttunut (Fig. 4D). Nämä tulokset viittaavat siihen, miR-34a vähensi rekrytointi c-Myc-Skp2-Miz1 kompleksin RhoA promoottori ja vähentää RhoA ilme.

yli-ilmentyminen c-Myc kääntää estämällä hyökkäyksen

sen määrittämiseksi, onko inhibitio hyökkäystä miR-34a voi olla myös käänteinen kautta palauttaminen c-Myc, transfektoimme PC-3-solujen kanssa, c-Myc-ekspressioplasmidin kanssa pre-miR-34a. c-Myc yliekspressio osittain pelastettiin RhoA lauseke (Fig. 5A, vertaa kaista 4 3) ja miR-34 aiheuttama vaimennus invaasion (Fig. 5B), mikä viittaa siihen, että miR-34a estää invaasio, ainakin osittain, kautta RhoA vähennys kohdistaminen c-Myc.

(A) PC-3-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti pCMV6-ENTRY ainoa tai pCMV6-ENTRY-c-Myc: ssa 8 tuntia ja sen jälkeen lyhytaikaisella transfektiolla ennalta miR negatiivinen kontrolli (NC) tai pre-miR-34a: ssa 72 tuntia. Proteiini taso analysoitiin Western blot. (B) c-Myc ilmaisun osittain pelastaa esto invaasion aiheuttama miR-34a. PC3-solut transfektoitiin ohimenevästi pCMV6-ENTRY vain (kontrolli) tai pCMV6-ENTRY-c-Myc: ssa 8 tuntia, jota seuraa transfektio ennalta miR negatiivinen kontrolli (NC) tai pre-miR-34a: ssa 48 tuntia. Solut kerättiin ja alistettiin Transwell invaasiomääritys. *, P 0,05 verrattuna kontrolli. (C) edustavat kuvat hyökkäsi soluja.

miR-34a tukahduttaa kokoonpano c-Myc-P-TEFb monimutkainen

positiivinen transkription elongaatiotekijä b (P-TEFb) näytelmiä keskeinen rooli valvoa venymä vaihe transkriptio RNA-polymeraasi II (Pol II) [23]. Se on sykliiniriippuvaisen kinaasin, joka koostuu CDK9 andcyclin. c-Myc on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa P-TEFb kautta CycT1 ja säätelevät transkription venymä [25], [26], [27]. Koska miR-34a tavoitteet c-Myc, teimme immunosaostuksella (IP) tutkia kokoonpano c-Myc-pTEFB transkription venymä monimutkainen mir-34a-transfektoituja PC-3-soluja. IP (Fig. 6A) paljasti, että anti-c-Myc-vasta vedetty alas CycT1, CDK9 ja Max (kaista 5), ​​mutta IgG (kontrolli) ei vedä alas näitä proteiineja (kaista 3), mikä osoittaa, että c-Myc vuorovaikutuksessa P- TEFb. IP osoitti myös, että miR-34a vähensi p-TEFb c-Myc immunopresipitaateista PC-3-solut [kaistat 4 (kontrolli) ja 6], mikä osoittaa, että miR-34a tukahdutti kokoonpano c-Myc-P- TEFb monimutkainen PC-3-soluja.

(A) miR-34a estää muodostumisen endogeenisen c-Myc-P-TEFb monimutkainen. PC-3-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti ennalta miR negatiivinen kontrolli (NC) tai pre-miR-34a: ssa 72 tuntia, ja koko solulysaatit immunosaostettiin c-Myc-vasta-ainetta tai IgG: tä (kontrolli) ja sen jälkeen Western blot-analyysi. (B) miR-34a estää CAD ja NUC mRNA: n ilmentymisen ja DRB revereses tukahduttamista. PC-3-soluja käsiteltiin 20 uM DRB 12 h ja transfektoitiin ohimenevästi ennalta miR negatiivinen kontrolli (NC) tai pre-miR-34a: ssa 48 tuntia. CAD ja NUC mRNA tasolla analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä.

c-Myc: n raportoitiin aktivoimaan transkription CAD, karbamoyyli-fosfaatti syntaasi /aspartaatti transcarbamoylase /dihydroorotase, ja NUC stimuloimalla promoottori purkupallon venymä kautta rekrytointi P-TEFb [25], [39], [40]. Tutkimme onko miR-34a vaikutti ilmentymistason CAD ja NUC käyttämällä DRB (5,6-di-kloori-1-BD-ribofuranosyyli-bensimidazole), joka nimenomaan estää ilmentymisen c-Myc-reagoiva CAD ja NUC estämällä P-TEFb [ ,,,0],40]. Huomasimme, että miR-34a laski CAD ja NUC mRNA ilmaisun PC-3-solut, kun taas DRB palautti ilmaisun (Fig. 6B). Nämä tulokset osoittavat, että miR-34a tukahduttaa näiden geenien tukahduttamalla c-Myc-pTEFb monimutkainen.

yli-ilmentyminen c-Met: kääntää inhibition hyökkäyksen

On ehdotettu, että miR-34a inhiboi soluinvaasion in c-Met-riippuvaisella tavalla [41], [42]. Siksi tutkimme vaikutuksia miR-34a c-Met ja invaasio koska miR-34a tavoitteet c-Met (Fig. 1). PC-3-solut transfektoitiin c-Met-ekspressioplasmidin kanssa pre-miR-34a. c-Met: ilmentymistasot tutkittiin Western blot, joka osoitti, että c-Met: ekspressio lisääntyi c-Met transfektoiduissa soluissa (kuvio. 7A). c-Met edistetään invaasio hallinnassa kokeissa. c-Met päinvastaiseksi miR-34 aiheuttama tukahduttaminen hyökkäyksen, mikä osoittaa, että miR-34a estää invaasio, ainakin osittain, kohdistamalla c-Met (kuviot. 7B ja C).

(A) PC-3 -solut transfektoitiin ohimenevästi pCMV6-ENTRY ainoa tai pCMV6-ENTRY-c-Met: 8 tuntia, minkä jälkeen lyhytaikaisella transfektiolla ennalta miR negatiivinen kontrolli (NC) tai pre-miR-34a: ssa 72 tuntia. Proteiini taso analysoitiin Western blot. (B) c-Met ilmaisun osittain pelastaa esto invaasion aiheuttama miR-34a. PC3-solut transfektoitiin ohimenevästi pCMV6-ENTRY vain (kontrolli) tai pCMV6-ENTRY-c-Met: ssa 8 tuntia, jota seuraa transfektio ennalta miR negatiivinen kontrolli (NC) tai pre-miR-34a: ssa 48 tuntia. Solut kerättiin ja alistettiin Transwell invaasiomääritys. *, P 0,05 verrattuna kontrolli. (C) edustavat kuvat hyökkäsi soluja.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitettiin ensimmäistä kertaa toiminnalliset vaikutukset miR-34a c-Myc transkription komplekseja PC- 3 eturauhasen syöpäsoluja. Huomasimme, että miR-34a ilmentyminen säädeltiin vähentävästi eturauhassyöpäkudoksen ja että miR-34a uudelleen ilmentyminen estää voimakkaasti solujen lisääntymistä,

in vivo

ksenografti- kasvua ja solujen invaasiota. Olemme osoittaneet, että miR-34a inhiboi c-Myc sitomalla sen 3’UTR PC-3-solut ja tukahdutti kokoonpano c-Myc transkription komplekseja. Mutaatiot c-Myc löytyy erilaisia ​​syöpiä ja sääntelemättömään ilmentymiseen aiheuttaa hallitsematon ilmentymistä monien geenien joitakin, jotka säätelevät solujen proliferaatiota ja aiheuttaa kasvainten kehittymiseen [43], [44]. Vaikka c-Myc ei pysty yksinään muuttaa soluja ja vaatii yhteistoiminnassa onkogeenin, kuten ras-onkogeenin [45], c-Myc on tärkeä tekijä kasvaimen kehittymisen. Siten inhibitio c-Myc uskotaan olevan merkittävä tehtävä miR-34a. Osoitimme myös, että miR-34a esti PC-3 solujen invaasiota kohdistamalla c-Met.

Rho GTPaasit, perheen pieniä G-proteiineja, säätelemään solunsisäinen aktiini dynamiikka kuten solun polariteetti, muuttoliike, rakkula ihmiskauppa jne Näitä molekyylit säätelevät myös soluproliferaatiota, apoptoosin, geeni-ilmentymisen [17]. RhoA, jäsen Rho perheen GTPaaseja, on sekaantunut muutosta ja etäpesäkkeitä. RhoA on osoitettu olevan tärkeä tekijä liittyy erilaisia ​​ihmisen syövissä, [46].

c-Myc-Skp2-Miz1 transkription kompleksi on aikaisemmin osoitettu aktivoivan RhoA ja on olennaista solujen invaasiota ja syöpä etäpesäke [22]. Huomasimme, että c-Myc on tavoite miR-34a PC-3-solut, ja tutkimme vaikutus miR-34a RhoA aktivoimalla c-Myc-Skp2-Miz1 transkription monimutkainen. miR-34a vähensi RhoA ilmentyminen ja yli-ilmentyminen c-Myc päinvastaiseksi vähentäminen RhoA ja estävät solujen invaasiota. ChIP määritys paljasti miR-34a estää rekrytointi c-Myc on RhoA promoottori. Olemme osoittaneet, että miR-34a tukahdutetaan RhoA transkription vähentämällä c-Myc-Skp2-Miz1 transkription monimutkainen. Nämä tiedot dokumentoida että miR-34a estää RhoA aktivointi transkription kautta kohdistaminen c-Myc. Tuloksemme osoittavat, että miR-34a estää kokoamista ja käyttöä c-Myc kompleksi, joka aktivoi transkriptiota RhoA.

positiivinen transkription elongaatiotekijä b (P-TEFb) säätelee promoottori-proksimaalisen tauon vapauttamaan pidentymisen vaihe transkription Pol II [23]. c-Myc vuorovaikutuksessa CycT1, sääntely komponentti P-TEFb, ja ohjaa venymä vaiheen transkription Pol II [25], [26], [27]. P-TEFb on maailmanlaajuisesti tarvitaan sukupolven mRNA: iden ja geenin ilmentymisen [27], [47], ja se on rekrytoitiin geenejä erilaisten transkriptiotekijöiden [23], [48]. Tuloksemme osoittavat, että miR-34a estää kokoamista ja käyttöä c-Myc monimutkainen, että elongates transkriptio. Tiedetään, että P-TEFb osallistuu poikkeavien transkription venymän seka-sukuperää leukemia (MLL) [49], [50]. Eri kasvainsolulinjoja-ilmentävät P-TEFb ja CycT1 yliekspressio edistää muutosta ja kasvaimen kasvua [51]. Tutkimuksemme osoittaa tässä, että miR-34a kumoaa c-Myc-P-TEFb kompleksin kohdistamalla c-Myc. Kertyvät näyttö on osoittanut, että on tärkeää P-TEFb in maligniteetti, mikä yhdistää miR-34a P-TEFb on merkittävä havainto syövän biologian. Tutkimuksemme osittain selostaa maailmanlaajuinen ja syvällisiä vaikutuksia miR-34a matkapuhelinverkon prosesseihin osoitti täällä ja aiemmissa raporteissa [4], [5], [7], [8].

Sikäli kuten tiedämme, vaikutukset MikroRNA kokoonpanoon proteiinia komplekseja ei ole koskaan raportoitu. Me raportoimme tässä vaikutuksia miR-34a kokoonpanoon c-Myc toiminnallisia komplekseja, c-Myc-Skp2-Miz1 ja c-Myc-P-TEFb komplekseja. c-Myc aktivoi eri geenien osana proteiinin monimutkainen, säätelee transkription venymä ja pääasiassa toimintoja erilaisten komplekseja muiden proteiinien kanssa. Vaikutukset miR-34a seuraavilla c-Myc toiminnallisia komplekseja tarjota suoraa näyttöä siitä, miten miR-34a toiminnot tukahduttaa c-Myc. C-Myc komplekseja, jotka indusoitiin miR-34a oli heterogeeninen, koska suhteet komponentit olivat erilaiset kuin kontrolliryhmässä immunokompleksien (kuviot. 4C ja 6A). Nämä tulokset osoittavat, että kompleksit muuttunut miR-34a, mikä viittaa uuden mutkikkaaksi. Muuttaminen c-Myc komplekseja miR-34a ehdottaa myös, että tukahduttaminen kokoonpano c-Myc komplekseja voi liittyä tuntemattomia mekanismeja Lisäksi yksinkertainen vähennys määrän c-Myc-proteiinin miR-34a vuodesta asennuspalveli- 34a on dramaattisia vaikutuksia solun prosesseihin.

Yhteenvetona olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että miR-34a estää kokoamista ja käyttöä c-Myc-Skp2-Miz1 kompleksi, joka aktivoi RhoA ja c-Myc- pTEFB monimutkaisia, että suippenee transkription eri geenejä. Siksi tutkimuksemme osoittaa uusi rooli miR-34a säätelyyn transkription c-Myc.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Formaliinifiksoidusta, parafiinia -Embedded (FFPE) eturauhassyöpänäytteissä saatiin San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical Center. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja tutkimuksen hyväksyi UCSF komitean Human Research (Hyväksyntänumero: H9058-35751-01). Kaikki eläinten hoito oli suuntaviivojen mukaisesti San Francisco Veterans Affairs Medical Center ja tutkimuksen hyväksyi San Francisco VA IACUC (Protocol numero: 08-003-01).

Soluviljely ja transfektio

Ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa, PC-3, LNCaP ja DU145 ja ei-pahanlaatuisen epiteelin eturauhasen solulinja, RWPE-1, hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Eturauhassyövän solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). RWPE-1-solulinjaa viljeltiin keratinosyyttien kasvualustassa, johon oli lisätty 5 ng /ml ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää ja 0,05 mg /ml naudan aivolisäkeuutetta (Invitrogen, Carlsbad, CA) B

Solut 6-kuoppalevyillä transfektoitu 30 nM ennalta miR negatiivinen kontrolli (NC) tai ennalta miR-34a (Applied Biosystems, Foster City, CA) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen), mukaan valmistajan ohjeiden.

kudosnäytteitä

Formaliinifiksoidusta, parafinoidut (FFPE) eturauhassyöpänäytteissä saatiin San Francisco Veterans Affairs Medical Center. Kaikki objektilasit uudelleen muussa hallituksen sertifioitu patologi tunnistamiseksi eturauhassyövän pesäkkeitä sekä viereisen normaalin rauhasepiteeliin.

Generation vakaa miR-34a solulinjoissa

Hiv-pohjainen lentivirus pakkaus joka sisältää ekspressoivan plasmidin miR-34a tai vektorisäätö hankittiin GeneCopoeia (Rockville, MD). Lentivirus- partikkeleita tuotettiin transfektoimalla lentiviruksen ekspressioplasmidin 293T-soluihin. PC-3-solut infektoitiin HIV-pohjainen lentivirus ilmentävien miR-34a tai vektorisäätö (1,5 x 10

6 tarttuvaa yksikköä virusta (IFU) (20 ui), ja tartunnan PC-3 solut valittiin puromysiinin (0,5 ug /ml).

Soft agar pesäkemuodostusta

Soft agar pesäkkeiden muodostumisen määritys suoritettiin ymppäämällä solut kerros 0,35% agaria /RPMI /FBS yli kerros 0,5% agar /RPMI /FBS. RPMI /FBS lisättiin 5 päivän välein jatkuvasti toimittaa kasvun lisiä soluille. Viljelmiä ylläpidettiin kostutetussa 37 ° C inkubaattoriin. päivänä 14 istuttamisesta, pesäkkeitä muodostavaa tehokkuutta kvantifioitiin valomikroskoopilla .

in vivo kasvaimen kasvua

suspensioita vakaa miR-34a ilmentävien solujen tai kontrolli solut (1 x 10

7 solua 100 ul RPMI) injektoidaan subkutaani- naaraspuolisiin nude-hiiret (kanta BALB /c nu /nu; Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA, 4-5 viikkoa vanhoja). Kasvaimen tilavuus laskettiin sen perusteella, leveys (x) ja pituus (y): x

2y /2, jossa x y.

RNA ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

RNA eristettiin käyttäen RNeasy mini (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden . Käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen Reverse Transcription System Kit (Promega, Madison, WI).