Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen DNA-polymeraasi iota (pol ι) Justus on virhealtista DNA: n replikaatiota ominaisuuksia ja tekee translesion DNA-synteesiä. Se voi olla erikoistunut ja tiukasti säänneltyä normaaleissa nisäkässoluissa. Häiriöstä pol ι voivat edistää hankinnan mutaattori- fenotyypin. On kuitenkin olemassa muutamia kuvaavia raportteja transkription sääntelyn mekanismi pol ι, ja siellä on kiistaa koskevat sen roolia syövän synnyssä. Tässä tutkimuksessa, suoritimme poistamisen ja piste-mutaatio koe, EMSA, siru, RNA-interferenssi ja western blot määritys osoittaa, että c-Jun aktivoida c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK) säätelee transkriptiota pol ι normaalissa ja syöpäsoluja. Kseroderma pigmentosumin ryhmä C-proteiinia (XPC) ja ataksia-telangiektasiassa mutatoitunut liittyvä proteiini (ATR) edistää varhaista JNK aktivoinnin vastauksena DNA vaurioita ja siten parantaa ilmentymistä pol ι, mikä osoittaa, että uusi rooli JNK signaalireitin on mukana DNA-vaurioita vastaus. Lisäksi kohonnut c-Jun aktiivisuuden yliekspressio pol ι korreloi positiivisesti kliinisen kasvaimen sisään 97 virtsarakon syöpä näytteitä ja saattaa edistää hypermutagenesis. Yli-ilmennetty pol ι-mukana mutageneesi on riippuvainen JNK /c-Jun väylän virtsarakon syöpäsolujen tunnistamiseen, jonka erityinen mutaatio spektrit. Tuloksemme tukevat johtopäätöstä, että dysregulaatio pol ι mukaan JNK /c-Jun on osallisena syövän synnyn ja tarjoavat uutta ymmärrystä rooli pol ι tai c-Jun mutageneesiä.

Citation: Yuan F, Xu Z, Yang M, Wei Q, Zhang Y, Yu J, et al. (2013) yli-ilmentyy DNA Polymerase Iota säätelemä JNK /c-Jun Auttaa Hypermutagenesis sisään virtsarakon syövän. PLoS ONE 8 (7): e69317. doi: 10,1371 /journal.pone.0069317

Editor: Spencer B. Gibson, University of Manitoba, Kanada

vastaanotettu: 07 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 12 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 26 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Yuan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Nature Science Foundation of China (30770460) ja armeijan Nature Science Foundation of China (06H026). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Solut hyödyntää DNA: n korjaukseen väyliä tehokkaasti korjata vahingollisia vaikutuksia DNA-vaurioita. Kuitenkin joissakin tapauksissa, ei kaikki vahingot voidaan korjata nopeasti ja availably, joka indusoi solusyklin pysähtymisen. Voittaa tämä salpaus jatkaa synteesiä kasvavan DNA-ketjun, solut käyttävät molekulaarisia mekanismeja, jotka mahdollistavat translesion DNA-synteesin (TLS) esiintyy [1], [2]. TLS suoritetaan erikoistuneet DNA-polymeraasien, mukaan lukien Y-perheen DNA-polymeraaseja (pol ι, pol κ, pol η ja Rev1), joka tavallisesti esiintyy paljon virheitä DNA-synteesin aikana. On osoitettu, että pol ι on alhaisin uskollisuutta TLS prosessi monilla eri DNA vaurioiden

in vitro

ja pol ι voi myös jäljitellä ehjä DNA alhainen Fidelity [3].

koska virhealtista DNA replikaatiota piirteitä pol ι, häiriöstä pol ι voivat edistää hankinnan mutaattori- fenotyypin, että yhdessä viallisen solusyklikontrollin tai muita genomin vakautta polkuja, voisi helpottaa nopeuttaa syövän etenemiseen. Olemme aiemmin ensimmäinen havaittu, että rintasyövän solut yli-ilmentävät pol ι proteiinia, joka johtaa UV-indusoidun hypermutagenesis [4]. pol ι on mukana myös UV-indusoidun mutageneesin Burkittin lymfooma ja XPV solulinjat [5], [6]. Lisäksi, pol ι oli alustava havaittiin yli-ilmentynyt eri primaaristen kasvainten kudokset, mukaan lukien eturauhasen, kohdun, mahan ja peräsuolen syöpiin, mutta ei ole olemassa arvokkaita kliinistä näyttöä [7]. Kuitenkin rooli pol ι karsinogeneesis- on edelleen epäselvä ja alle keskustelemme [8] ja muutamia raportteja ovat huolissaan sääntelyn mekanismi pol ι tai mahdollisen dysregulaatio mekanismi pol ι syövässä. Siksi on tärkeää tehdä pyrkimyksiämme selvittämään mekanismia sääntelyä ja määritellä karsinogeneesi rooli pol ι

in vivo

.

Huomattava signalointireitille aktivoituvat vasteena solustressiä on mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) reitti. Kolme suurta MAPK väyliä on kuvattu: ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK), c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK) ja p38 MAPK polkuja. Tavoitteet JNK-reitin kuuluvat aktivaattoriproteiini 1 (AP-1) ryhmä, transkriptiotekijöiden, kuten Jun, Fos- ja ATF perheenjäsenten [9]. Kuitenkin, c-Jun erityisesti fosforyloitu JNK on keskeinen rooli erilaisissa toiminnot AP-1 kompleksin [10]. JNK voidaan aktivoida solujen stressiä signaalit johtuvat tulehdusta edistävien sytokiinien ja DNA-vaurioita aineita, kun taas AP-1 voi vaikuttaa solun DNA-vaurioita vastaus säätelemällä useiden geenien ekspression kannalta DNA-vaurio torjuntamekanismeissa [11], [12], [13]. Entinen todisteet ovat myös osoittaneet, että c-Jun edistää muutosta ja kasvainten kehittymiseen ja on luokiteltu esikasvaintekijän [14]. JNK aktivaation on osoitettu, koska vaatimus kehittää erilaisia ​​syöpiä [15], [16], [17]. Kuitenkaan mikään tutkimus ei ole vielä raportoitu, että selventää rooli JNK /c-Jun väylän TLS ja DNA-vaurioita aiheuttama hypermutagenesis. Lisäksi useimmat kuvaavat raportit signalointi JNK-reitin aktivaatio seuraavat DNA-vaurioita ovat keskittyneet membraanireseptoriin liittyviä JNK aktivointia. Tapa, jolla DNA-vaurioita vastaus liittyviä mekanismeja edistää JNK aktivaatio nucleus on vielä epäselvä.

tutkimukset antavat näyttöä siitä, että JNK /c-Jun-reitin keskeinen transkription säätelevän roolin pol ι. Tiedot myös annettava uusi oivallus, että JNK /c-Jun-reitin osallistuu TLS ja hypermutagenesis. Olemme todenneet, että JNK /c-Jun-reitin voi aktivoida DNA-vaurioita avain proteiineja, XPC ja ATR. Lisäksi, yliekspressio pol ι havaittiin liittyvän laajuuden c-Jun: n fosforylaatiota virtsarakon syövän kudosten ja liittyä syövän etenemiseen ja hypermutagenesis tunnistetaan erityinen mutaatio spektrit. On ehdotettu, että säädeltyyn pol ι mukaan JNK /c-Jun voi toimia mutaattori-. Siksi DNA-polymeraasi iota voi olla mahdollinen indikaattori ja tavoitteeksi syöpähoidon in pahanlaatuinen kasvain.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksyttiin eettisen lauta Varsinais sairaalan kolmannessa Military Medical University (KY201016), ja kaikki osallistujat kirjallinen lupa.

Soluviljely ja käsittely

T24, RT4 rakkosyöpä- solut ja HEK293-solut ostettiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Soluja ylläpidettiin RPMI 1640, McCoyn 5A-tai DMEM, johon oli lisätty 10% FBS: ää, ja seosta antibiootteja, vastaavasti. Inhibiittorit JNK (SP600125), p38 (SB203580) ja ERK1 /2 (PD98059) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) käytettiin käsittelemällä soluja 2 tunnin ajan. Solujen altistaminen ja plasmidien UV-valossa (254 nm), saatiin aikaan CL-1000 UV silloitinta.

Kliiniset näytteet ja immunohistokemia

urothelial carcinoma kudosnäytteitä saatiin 97 potilasta, jotka virtsaputkeen virtsarakkokasvain resektion ja radikaali cystectomy Lounais sairaalassa. Kaikki näytteet kerättiin vuosien 2008 ja 2010. Nämä kudokset jaettiin patologinen laatuja urothelial karsinooma I, II tai III mukaisesti WHO: n luokituksen (1973). Formaliinilla, parafiiniin upotettujen kudosleikkeiden poistettiin parafiini, kostutetaan arvostellaan alkoholeja sarjassa, ja käsiteltiin käyttäen streptavidiini immunoperoksidaasimenetelmällä. Anti-pol ι vasta-ainetta (LS-B296; käyttöikä Biosciences, Seattle, WA, USA) ja anti-PC-Jun-vasta-ainetta (sc-822; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) käytettiin laimennoksina 1:200 ja 1:100, vastaavasti. Proteiinin ilmentyminen kvantitoitiin ja tekee arvioimalla vasta-signaalin voimakkuuden ja arvioimalla prosenttiosuus, jotka värjäytyivät positiivisesti urothelial karsinoomasolut [18]. Viisi sattumanvaraisesti näkökentät valittiin, ja 100 solua per kenttä analysoitiin. Pisteytys suoritettiin sokea ilman kliinistä tietoa. Pisteytys oli luetteloitu 1 pisteet (prosentteina positiivisesti värjäytyneiden solujen 25%), 2 pisteet (25-50%), 3 pisteet (50-75%) ja 4 pistemäärä ( 75%), tässä järjestyksessä. Samaan aikaan tahra signaali luokiteltiin heikoksi (1 pisteet), kohtalainen (2 tulos) ja vahva (3 pisteet), tässä järjestyksessä. Prosenttiosuus pisteet kertomalla signaali pistemäärä oli lopputuloksen. Lopullinen pistemäärä määriteltiin alhainen (alle 6 tulos) ja voimakas taso ( 8 pisteet).

Western blot -määritys

yhtä suuri osuus kustakin solujen lysaatin analysoitiin SDS-PAGE [19]. Vasta-aineet sisälsivät anti-pol ι (ab1324; Abcam, Inc., Cambridge, UK), anti-XPC (ab6264, Abcam), anti-ATR (sc-1887, Santa Cruz), anti-c-Jun (SC- 44X, Santa Cruz), anti-pc-Jun (sc-822; Santa Cruz), anti-p-MKK4 (BS4168; Bioworld, St. Louis Park, MN, USA), anti-p-MKK7 (4171; Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA), anti-p-JNK (sc-6254; Santa Cruz), anti-JNK (9252; Cell Signaling Technology), anti-MKP-1 (sc-1102; Santa Cruz), ja anti -GAPDH (KC-5G4, Kangchen, Shanghai, Kiina). Proteiinin ekspressio arvioitiin käyttäen SuperSignal West Pico kit (NCI4106; Pierce, Rockford, IL, USA). Koe toistettiin vähintään kolme kertaa. Taso -proteiiniekspressio kvantifioitiin käyttämällä Scion kuva densitometria ohjelmisto (Scion Corporation, Frederick, MD).

rakentaminen pGL3-

POLI

poisto ja mutageneesin

-2751 /+ 63, -1832 /+ 63, -1299 /+ 63, -685 /+ 63, -275 /+ 63, -208 /+ 63, -160 /+ 63 ja -126 /+ 63 DNA fragmentteja ihmisen

POLI

geenin (suhteessa transkription aloituskohdasta) monistettiin HEK293 genomisesta DNA: sta PCR: llä. Mutageeniset alukkeet suunniteltu c-Jun sitomiskohta kuluessa -275 /+ 63, jossa on 2 emäsparin epäsuhta (tummennettu ja alleviivattu); eteenpäin: 5′-TGAGCCGGTATTGCCACACTGTTGCCCAC-3 ’ja reverse: 5′-CTGCAACCTCTGCCTCCCGGATTCAAGC-3’. Monistetut PCR-tuotteet insertoitiin sitten

KpnI

ja

Hindlll

kohtiin pGL3-perusvektoriin (Promega, Madison, WI, USA). Kaikki konstruktit varmistettiin DNA-sekvensoinnilla (Invitrogen, Shanghai, Kiina).

Transient transfektion ja Lusiferaasimäärityksiä

Solut (1 x 10

5) on joko transfektoitu eri alakloonatun lusiferaasireportteri- plasmidit ja pSV-β-galaktosidaasi tai yhdessä transfektoitiin pcDNA3.1-c-Jun käyttäen Lipofectamine-transfektioreagenssia (Invitrogen). PGL3-perus- ja tyhjä pcDNA3.1 vektoreita käytettiin verrokkeina. 48 tuntia transfektion jälkeen, solut otettiin talteen ja analysoitiin käyttäen Luciferase Assay System (E1500, Promega). PSV-β-gal (E2000, Promega) analysoitiin kontrollina. Määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja jokainen koe toistettiin ainakin kolme kertaa.

Elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määritykset

Kokeet suoritettiin, kuten on kuvattu aikaisemmin, mutta joitakin muutoksia [20]. Oligonukleotidit, jotka on leimattu biotiinilla 3 ’End DNA Labeling Kit (89818, Pierce). Biotiini-leimatun 29 bp: oligoja (5’-TGAGCCGGTATTGCGTCACTGTTGCCCAC-biotiini-3 ’; AP-1-like sitoutumiskohta esitetty alleviivattu) ja mutantti kaksijuosteinen 29 bp oligoja (5′-TGAGCCGGTATTGCCACACTGTTGCCCAC-3’; mutaation lihavoitu ja alleviivattu) käytettiin testaamaan spesifisen sitoutumisen. Non-leimattuja oligoja käytettiin kilpailuun. LightShift Kemiluminesenssiin EMSA Kit (20148; Pierce) käytettiin suorittamaan reaktioita. Leimatut oligot (20 fmol) inkuboitiin tumaekstrakteilla (4 ug) peräisin HEK293-soluissa. Elektroforeesin ei-denaturoivissa 6% polyakryyliamidigeelillä, geeli kuivattiin ja sille suoritettiin kemiluminesenssin. Supershift analyysit suoritettiin käyttäen anti-c-Jun-ainetta (sc-44X, Santa Cruz) ja hiiren IgG (sc-2025; Santa Cruz).

Kromatiini immuunisaostustesti

siru suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [21]. Lyhyesti, sen jälkeen, kun ristisilloitukseen 1% formaldehydiä, HEK293-solut hajotettiin ja sonikoitiin. Ennen immunosaostus hiiren IgG tai c-Jun (sc-44X, Santa Cruz) vasta-aineita, pieni alikvootti kromatiini tallennetaan ja käytetään tulona ohjaus. Erityisten kohdennettujen DNA-fragmentti mitattiin spesifisiä alukkeita (eteenpäin: 5′-GCCGGTATTGCGTCACTGTT-3 ’; taaksepäin: 5′-CAGAGTGACACGCATGCCAAGGAATCG-3’) monistamiseksi -236 /-61-alueen

POLI

geenin.

Bioinformatics analyysi

noin 3000 bp: n 5′-alueella

Poli

sekvenssi saatiin käyttämällä BLAST-algoritmi National Center for Biotechnology Information (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/ja https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgc). Otaksuttu transkriptiotekijän sitoutumiskohtia tunnistettiin Transfac ammatti 8.1 ohjelmisto (https://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html). Promoottori ennustus analyysi suoritettiin käyttäen online-tietokanta (https://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html).

RNA-interferenssi kokeissa

c-Jun-siRNA (sc-29223; Santa Cruz), joka on poolin 4 kohde-erityinen 19-25 nt siRNA: t, ATR siRNA (sc-29763; Santa Cruz), joka on poolin 3 kohde-erityinen 19-25 nt siRNA: t tai ohjata siRNA-A (SC- 37007; Santa Cruz) laimennettuna transfektioväliainetta (sc-36868; Santa Cruz) transfektoitiin soluihin transfektioreagenssia (sc-29528; Santa Cruz). XPC-spesifinen shRNA (5′-GGATGAAGCCCTCAGCGAT-3 ’) [22] ja ei-spesifistä kontrolli shRNA syntetisoitiin ja insertoitiin lentiviruksesta vektoriin (Genechem, Shanghai, Kiina), sitten infektoituja soluja, vastaavasti. Kokeet itsenäisesti muotoon vähintään kolme kertaa.

Detection of UVC-välitteisen mutaatiot

SupF

reportterigeenin

Plasmidi pSupFG1 on kuvattu aiemmin [23], [ ,,,0],24]. Lyhyesti, UV-vaurioitunut plasmidi (10 ug) transfektoitiin soluihin esikäsitelty tai ilman SP600125. Plasmidi-DNA eristettiin 48 tunnin kuluttua ja muuttunut

E. coli

SY204 (lacZ meripihka) -kanta elektroporaatiolla 1800 V /20 mF. Mutaatio taajuus

SupF

reportterigeenin määritettiin määrä mutantti pesäkkeiden (valkoinen) agarmaljoilla jakamalla koko pesäkkeitä. Mutaatio spektri

SupF

geenin valkoiset pesäkkeet osoitettiin DNA-sekvensoinnilla. Koe toistettiin ainakin neljä kertaa.

Reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol ja käänteistranskriptoidaan cDNA-(Invitrogen). Monistuskäyriä muodostettiin seuraamalla fluoresenssia SYBR Green (Invitrogen). Käytetyt alukkeet monistusta sisältyvät seuraavat: MKP-1 eteenpäin, 5′-GTACATCAAGTCCATCTGAC-3 ’ja reverse, 5′-GGTTCTTCTAGGAGTAGACA-3′; GAPDH eteenpäin, 5’-AAGGTCGGAGTCAACGGATT-3 ’ja reverse, 5′-CTCCTGGAAGATGGTGATGG-3’. Määritys suoritettiin kolminkertaisena, ja jokainen koe toistettiin ainakin kolme kertaa.

Tilastollinen

Tiedot kerättiin vähintään kolmena kappaleena ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe (SE). Erot ryhmien densitometria molekyylien ilmentyminen analysoitiin Studentin t-testiä. Tilastollisen merkittävyyden välinen pol ι ilmaisun ja patologinen luokan virtsarakkokasvain kudosten arvioitiin käyttäen chi-neliö testi. Korrelaatio Pol ι ja p-c-Jun-ilmentyminen analysoitiin kahden muuttujan testi. SPSS13.0 ohjelmistoa käytettiin suorittamaan tilastollisen analyysin (p 0,05 katsottiin merkitseväksi). Immunoblottaustietojen, EMSA ja siru analyysitiedot edustivat vähintään kolmen tai viisi riippumatonta tutkimukset toistettavissa olevia tuloksia.

Tulokset

c-Jun on kriittinen transkriptionaalinen tekijä

POLI

geeni

Koska kokeellinen vihjeitä osoitti, että muuttunut ilmentyminen pol ι voivat assosioitua hypermutagenesis ja karsinogeneesin me ensin selkeyttää sen transkription säätelyyn mekanismi. Kartoittaa minimaalisen promoottorin aktiivisuutta ja säätelysekvenssit, analysoimme ihmisen

POLI

geenin bioinformatiikan ja tunnistaa perus promoottori

POLI

geeni oletetun AP-1

cis

-elementtiin. Sarja deleetioita 5’flanking alueella

Poli

geeni subkloonattiin pGL3-perusvektoriin (lusiferaasireport- vektori). Alukkeet luetellaan taulukossa 1. Edellä Näiden rakenteiden arvioitiin perustuen lusiferaasiaktiivisuus lapäisen transfektion jälkeen HEK293-soluihin, joka on yleisesti käytetty solujen linja välineenä soluja. Tuloksemme osoittivat, että minimaalinen

Poli

promoottori sijaitsee -275 /+ 63 alue (Fig. 1A). Edelleen analyysit osoittivat, että alueen (-275 /-208) sisältää oletetun AP-1-kaltainen sitova

cis

-elementti (TGCGTCA) on -228 sivusto, joka on samanlainen erittäin evoluutiossa konservoitunut AP- 1 sitova sekvenssi TGAGTCA (Fig. 1 B).

(A) Lusiferaasiaktiivisuutta deleetioiden 5 ’reunustavan alueen

POLI

geeni normalisoitui β-

gal

aktiivisuutta. Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. (B) Kaaviokuva esityksiä distaalisen

Poli

promoottorialueen. (C) Transcriptional toimintaan poistamista tai mutantin

POLI

promoottori. * Tilastollisesti merkitsevä ero verrattuna pGL3-275 /+ 63 ja pGL3-275 /+ 63MU konstrukti (p 0,01; Studentin t-testi). (D) EMSA Pitoisuus. (E) pelimerkin määrityksessä. Hiiren IgG negatiivisena kontrollina. Syöte DNA tai ei DNA Lisätyn kukin käytettiin positiivisena ja nollakoe, vastaavasti.

Lisäksi selventää sääntelyn transkription roolia tämän sitoutumisen

cis

-elementti , teimme mutageneesi analyysi -275 /+ 63 alueella

POLI

geenin. Vektori, joka nimettiin pGL3-275 /+ 63MU (mutatoidun AP-1-sitoutumisominaisuuden motiivi) rakennettiin kahdella pistemutaatioita (TGCcaCA). Kiinnostavaa, lusiferaasiaktiivisuus vakavasti vaimentunut pGL3-275 /+ 63MU (Fig. 1 C, vasen sarake). c-Jun on keskeinen rooli erilaisia ​​toimintoja AP-1 kompleksin siksi meidän ohimenevästi kotransfektoitiin HEK293 solujen rakentaa ja pcDNA3.1-c-Jun, onko c-Jun voisi aktivoida

POLI

promoottori. Tulos kotransfektiolla paljasti, että lusiferaasin eniten merkittävästi aktivoitu pGL3-275 /+ 63, vaikka pGL3-275 /+ 63MU ja pGL3-208 /+ 63: n havaittiin myös noussut (Fig. 1 C, oikea palsta) . On mahdollista, että sekvenssi voi sisältää ylimääräisiä säätelyelementtejä epäsuorasti ohjaa yliekspressoitu c-Jun, joita ei tunnistettiin tutkimuksemme. Siitä huolimatta meidän data silti viittaavat siihen, että c-Jun voi tehokkaasti aktivoida transkriptio

POLI

geeni

kautta of the AP-1

cis

-elementti on -228 sivustolla.

Jos haluat varmistaa, että c-Jun suoraan sitoutuu motiivi

POLI

promoottori, suoritimme EMSA ydinenergialla otteita HEK293 soluista. Vaihtoehtoisen vyöhyke erityisesti tuotettu ja supersiirtymäanalyysi anti-c-Jun-vasta osoitti, että bändi todella sisälsi c-Jun-proteiinia (kuvio. 1 D). Hankkiakseen todisteita c-Jun suoraan sitovia alueella

in vivo

, siru suoritettiin myös anti-c-Jun-vasta saostua chromatin HEK293 soluista (Fig. 1 E). Yhdessä edellä havaintojen c-Jun näyttää suoraan sitoutua

POLI

promoottori ja konstitutiivisesti aktivoida ilmentymistä pol ι HEK293-soluissa.

yli-ilmentyminen pol ι on riippuvainen aktivoidaan JNK /c-Jun

on hyvin dokumentoitu, että translesion DNA-polymeraaseja, kuten pol ι, voi olla tärkeä rooli DNA-vaurioita vastaus. Jopa mennessä tietyntyyppisiä DNA-vaurioita, jotka on voitava ohittaa pol ι ovat edelleen epäselviä ja kiistanalaisia. Tutkimme DNA-vaurion indusoima pol ι, joka ei havaittu indusoivan joidenkin DNA-vaurioita, mukaan lukien sisplatiini, bleomysiini ja etoposidi (julkaisemattomia tuloksia). Kuitenkin monet todisteet tukevat käsitystä, että yksi vallitseva ominaisuudet pol ι on taipumus virheellisesti sisällyttämään nukleotidin vastakkaiseen joidenkin DNA vaurioita, jotka sisältävät syklobutaani tymiinidimeeri ja 6-4 pyrimidiini pyrimidoni kuva addukti vääristymä seuraavat UV vaurioita [8 ], [25]. Vielä tärkeämpää on, osoitimme, että pol ι voidaan merkittävästi indusoituu UV vahinkoja aiemmissa tutkimuksessa [4].

Jotta voitaisiin määrittää roolin JNK /c-Jun on pol ι välittämän TLS, päätimme UV (UVC 254 nm), sillä tutkimuksessa tilassa DNA-vaurioita. Sen määrittämiseksi, UV-induced pol ι ilmentymistä ohjataan JNK /c-Jun toimintaa, voimme todentaa, että ilmaus pol ι oli nopeasti aiheuttama altistuminen HEK293 solujen UVC valo 30 J /m

2 (a keskimmäinen sopiva annos [26]) ja pysyi koholla 2-8 tunnin ajan, mikä oli samanaikainen aktivointi c-Jun ja JNK seuraava UV-säteilyllä (Fig. 2A). Promoottori aktiivisuus pGL3-275 /+ 63-konstrukti on myös lisääntynyt noin 3-kertaiseksi 2 tunnin kuluttua UV vahinkoa samalla annoksella (Fig. 2B).

(A) kinetiikka pol ι, s -JNK ja pc-Jun ilmaisu UV vahinkoja HEK293-soluissa. (B) vaikutus UV vahinkoa aktiivisuutta

Poli

promoottorialueen. * Tilastollisesti merkitsevä ero verrattuna pGL3-275 /+ 63 ja pGL3-275 /+ 63MU konstrukti (p 0,01; Studentin t-testi). ** Tilastollisesti merkitsevä ero verrattuna käsiteltyjen solujen kanssa tai ilman UV (p 0,01). (C) ilmentymistä pol ι, c-Jun ja p-c-Jun RT4 ja T24 virtsarakon syöpäsoluja. Ilmentyminen pol ι havaittiin (D) HEK293, T24 ja RT4 soluissa, joita käsiteltiin eri pitoisuuksilla SP600125 viljeltiin vielä eri pituisia aikoja; (E) HEK293 käsitelty PD98059 tai SB203580; (F) HEK293 käsitelty tai ilman SP600125 ja UV; (G) HEK293-solut transfektoitiin siRNA-c-Jun: ssa 48 tuntia. Ei-spesifinen siRNA käytettiin valvontaa. Densitometristä arvot esitetyllä tavalla kunkin paneelin.

Kun otetaan huomioon toteamukset, pyrimme vahvistamaan, JNK /c-Jun on keskeinen sääntely tekijä pol ι ilmaisun yleistä mekanismia. Vertasimme eri ilmaisua pol ι, c-Jun ja p-c-Jun RT4 (hyvin erilaistunut solulinja huonolaatuisesta kasvain) ja T24 (solulinja edustaa korkealaatuista invasiivisia kasvain) virtsarakon syöpä soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 2C: n ilmentyminen pol ι in T24-soluissa oli huomattava korkeampi kuin RT4, kun taas ekspressio c-Jun ja aktiivisuus p-c-Jun kehitettiin samoin. Aika- tai annoksesta riippuvainen estoja pol ι havaittiin HEK293, T24 ja RT4 virtsarakon syövän solujen esikäsiteltiin 2 tunnin ajan JNK-spesifinen estäjä (SP600125) (Fig. 2D), vaikka ilmentymistä pol ι HEK293-soluissa näytti kasvavan 48 tuntia. Se voi olla esto SP600125 että JNK aktiivisuus kestää vain 48 tuntia, joka aiheuttaa ilmentymisen pol ι talteen 48 tunnin kuluttua SP600125 hoidon. Kontrollina, pohjapinta pol ι ilmentymistä ei havaittu muutosta HEK293-soluissa esikäsiteltiin PD98059 ja SB203580 (spesifinen inhibiittori ERK: n ja p38, vastaavasti) (kuvio. 2E). Tulokset osoittavat, että JNK: n aktivaatiota /c-Jun-reitti ei ole vastuussa vain pol ι ilmentyminen normaaleissa soluissa, mutta myös edistää mahdollisten dysregulaatio pol ι virtsarakon syövän soluissa. Olemme lisäksi osoittaneet, että JNK /c-Jun myös suoraan säätelevät pohjapinta ja UV-induced ilmaisuja pol ι. Kun HEK293-solut esikäsiteltiin SP600125 (20 uM), ilmentyminen pol ι väheni 4 tunnin kuluttua UV-altistus 30 J /m

2 (Fig. 2F). Ja c-Jun pudotus vähensi huomattavasti pohjapinta ja UV-indusoidun ilmentymisen pol ι (Fig. 2G). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen pol ι on suurelta osin riippuvainen aktivoitua JNK /c-Jun-reitin kautta.

ATR ja XPC edistää p-JNK säätelemään pol ι ilmentymistä vasteena UV vaurioita

havainto edellä sai meidät tutkimaan alkupään MAPK signalointi. Rooli DNA-vaurion vasteen signalointi on noussut, mikä voi lisäksi tunnettuja epäsuoria kalvo tai soluliman signalointi, aktivoi MAPK-reitin kautta ydin- signaloinnin [27]. Siksi olemme kehittäneet hypoteesin, että JNK /c-Jun koulutusjakson vastaavat UV-induced pol ι ilmaisua voidaan myös säännellä DNA-vaurioita vastaus. Arvioimme vaikutus DNA-vaurioita vastaus proteiineja XPC ja ATR laajuudesta JNK fosforylaation ja pol ι ilmaisun UV vaurioita. SiRNA-ATR tai shRNA-XPC, vaiennettu HEK293 ja T24-solujen molemmat ilmaistaan ​​alhaisempi pol ι seuraavien aiheuttamasta UV-vauriosta, ja p-JNK vastaavasti pienenevät. Päinvastoin, ilman UV vaurioita, ilmaus pol ι tai p-JNK ei muuttunut merkittävästi ATR ja XPC inhibition, vaikka p-JNK havaittiin hieman kasvaa shRNA lentiviruksen järjestelmä (Fig. 3A, 3B, 3C ja 3D). Tämä tulos voidaan selittää mahdolliset erityiset solustressiä reaktio lentivirus järjestelmän. Näin ollen, ATR ja XPC ovat mukana UV-indusoidun JNK-signaloinnin, jotka säätelevät ilmentymistä pol ι normaaleissa soluissa ja virtsarakon syövän soluissa.

Proteiinin ilmentyminen tutkittiin eri soluissa eri hoitoa. (A) HEK293-solut transfektoitu siRNA-ATR. (B) HEK293-solut infektoitiin shRNA-XPC. (C) T24 transfektoitujen solujen siRNA-ATR. (D) T24-soluissa tartunnan shRNA-XPC. (E) Reaaliaikainen PCR-analyysi ilmentymisen MKP-1 käsittelemättömän tai käsitellyn HEK293 solujen siRNA-c-Jun, siRNA-ATR tai shRNA-XPC; GAPDH mRNA-tasot määritettiin sisäisenä kontrollina. * Tilastollisesti merkitsevä ero verrattuna HEK293-hoitoa tai (p 0,01; Studentin t-testi). (F) MKP-1-proteiinin ilmentymistä HEK293-soluissa käsitelty siRNA-ATR tai shRNA-XPC. Ei-spesifinen siRNA tai ei-spesifisiä shRNA-lentivirus käytettiin valvontaa. Densitometristä arvot esitetyllä tavalla kunkin paneelin.

MAPK sääntelyverkon, JNK fosforyloituu ja aktivoi dual-spesifisyys MAPKKs, kuten MKK4 /SEK1 ja MKK7. Jatkuva JNK toiminta on katsottu johtuvan heikentyneen defosforylaatio JNK MAP kinaasi fosfataasi-1 (MKP-1) [28]. Voidaan arvioida, kuinka ATR ja XPC aktivoi JNK-reitin, me tutkimme, MAPKK signalointi säätelee ATR ja XPC vastauksena UV vaurioita. Ensin määritetään, missä määrin UV-indusoitu fosforylaatio MKK4 ja MKK7. Suhteessa villityypin soluissa, mitään selvää muutosta ei havaittu noin ilmentymistä p-MKK4 tai p-MKK7 in ATR- ja XPC-vaiennetaan HEK293 ja T24-soluissa; tämä voi vähentää mahdollista osallisuutta ATR ja XPC suoraan aktivoimalla MAPKK signalointi (Fig. 3A, 3B, 3C ja 3D), kun taas ilmaus MKP-1 oli merkittävästi lisääntynyt ATR- ja XPC-vaiennettu HEK293-soluissa UV vaurioita (Fig. 3E ja 3F). Yhdessä muiden tuloksia, meidän havainnot merkitsevät sitä, että DNA-vaurioita vastaus proteiinia ATR ja XPC vaikutus JNK-reitin ja säätelevät transkription pol ι vähentämällä inhibitiosignaalia MKP-1 sijaan aktivoimalla MKK4 ja MKK7.

Kohonnut ilmaus pol ι liittyy aktiivisuus c-Jun ja maligniteetti ihmisen virtsarakon syövän

urothelial solut altistuvat jatkuvasti monenlaisia ​​DNA-vaurioita reagenssit, jotka ovat läsnä virtsassa teollisuuden aromaattisia amiineja, tupakansavun ja otto kemiallisten huumeet [29]. Toimintahäiriö DNA-vaurioita vastaus on mukana niin ratkaiseva tekijä taustalla syntyminen geneettinen epävakaus urothelial karsinogeneesissä. Lisäksi pol ι joka on taipumus väärin sisällyttää nukleotidin vastakkaiseen DNA vaurioiden on epänormaalia ilmentymistä monissa syövissä, vaikka mekanismit ovat edelleen epäselviä. Niinpä me pyrkineet onko pol ι näyttelee mahdollisten mutageenisten rooli virtsarakon syöpä, joka on korkea heterogeenisyys ja toistuminen [29]. Tutkimme pol ι ilmentymistä 97 virtsarakkokasvain kudosten immunohistokemiallisella analyysillä. pol ι proteiini pääasiassa lokalisoitu ytimet, ja pieni määrä havaittiin sytoplasmassa. Tämä tulos osoitti, että pol ι ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi korkealaatuisesta rakkokasvaimista kuin huonolaatuisen kasvaimia (Fig. 4A). Tilastollinen analyysi osoitti, että vahvan yhteyden välillä oli pol ι ilmaisun ja patologisten luokan virtsarakkokasvain kudosten (taulukko 2; p 0,01). pol ι ekspressiota havaittiin myös olevan koholla virtsarakon syövän kudoksissa verrattuna karsinooma puolin kudosten Western-blottauksella (kuvio. 4B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ilmaus pol ι voi käyttää indikaattorina maligniteetin ja etenemistä urothelial karsinoomien.

(A) pol ι proteiinia poikkeuksellisesti ilmaistaan ​​eri kasvaimen mukaan WHO: n luokituksen. A1 on I-luokan kasvain; A2 on II-luokan kasvain; A3 on III-luokan kasvain (x 400 suurennos). (B) ekspressio pol ι 5 paria virtsarakon karsinooman puolin ja syöpäkudoksissa. ”N” edusti karsinooma puolin kudos, ”C” edusti syöpäkudoksessa. Densitometristä arvot esitetyllä tavalla kunkin paneelin. (C) edustaja tapauksia konkordanssin pol ι ja p-c-Jun ilmentymistä virtsarakon syöpä. C1 ja C2 ovat vastaavasti osoitti korkean ilmentymisen pol ι ja p-c-Jun on paria yksinkertainen. C3 ja C4 olivat heikkoa ilmentymistä toisessa parit (x 100 ja x 400-kertainen suurennus).

onko yliekspressio pol ι johtuu häiriöstä JNK /c-Jun aktivointi

in vivo

, olemme analysoineet konkordanssin koholla pol ι ja epänormaali c-Jun aktiivisuuden virtsarakon syöpä kudoksiin. Me satunnaisesti valittu 41 parafinoidut virtsarakkokasvain kudoksia kaikkiaan 97 potilaan näytteitä. Taso p-c-Jun oli pääosin sopimukseen pol ι lauseke (Fig. 4C). Ilmaisu p-c-Jun positiivisesti kohonnut pol ι ilmentymistä virtsarakon syöpien (taulukko 3; r = 0,662, p 0,01). Tulos vahvistaa päätelmää, että c-Jun säätelee positiivisesti pol ι ilmaisun ja viittaa siihen, että epänormaali pc-Jun edistää säädeltyyn pol ι ilmaisu mukana etenemistä virtsarakon syöpään.

yli-ilmentyminen pol ι aktivoitua by JNK /c-Jun edistää UV-induced hypermutagenesis in T24-soluissa

arvioimiseksi merkitystä yli-ilmentyminen pol ι ja pc-Jun

in vivo

selvitimme mahdollisia hypermutagenic rooli virtsarakon syöpä soluja.