Krooninen sairaus

tiivistelmä

PBX1 on TALE homeodomain transkriptiotekijä mukana organogeneesin ja kasvaimen kehittymisen. Vaikka on osoitettu, että munasarja-, rinta-, ja melanooma syöpäsolut ovat riippuvaisia ​​PBX1 solun kasvua ja selviytymistä, molekyylimekanismi miten PBX1 edistää kasvaimen kehittymisen edelleen epäselvä. Täällä soveltaa yhtenäistä lähestymistapaa päällekkäisten PBX1 chip siru tavoitteiden kanssa PBX1 säädelty transcriptome in munasarjasyöpäsoluja tunnistaa geenejä, joiden transkriptio oli suoraan säännelty PBX1. Olemme edelleen määrittää, jos PBX1 kohdegeenien tunnistettu munasarjasyövän soluja yhteistyössä yliekspressoituu kanssa PBX1 in syöpä kudoksiin. Analysoimalla TCGA geeniekspression microarray aineistoja munasarjojen vakavien karsinoomat, löysimme yhteistyössä säätelyä PBX1 ja huomattava määrä sen suoran kohdegeenien. Niistä PBX1 kohdegeeneissä, homeodomeenin proteiini MEOX1 joiden DNA: ta sitova motiivi oli rikastettu PBX1-immunoprecipicated DNA-sekvenssit valittiin toiminnallista analyysiä. Olemme osoittaneet, että MEOX1 proteiini vuorovaikutuksessa PBX1 proteiinia ja eston MEOX1 tuottaa samanlaisen kasvua estävä fenotyyppi kuin PBX1 tukahduttaminen. Lisäksi ektooppisesti ilmaisi MEOX1 toiminnallisesti pelastivat PBX1-peruutettu vaikutus, mikä viittaa MEOX1 välittää solukasvun signaalin PBX1. Nämä tulokset osoittavat, että MEOX1 on kriittinen kohdegeenin ja kofaktori PBX1 munasarjojen syöpien.

Citation: THIAVILLE MM, Stoeck A, Chen L, Wu R-C, Magnani L, Oidtman J, et al. (2012) tunnistaminen PBX1 kohdegeenien syöpäsoluissa Global kartoitus PBX1 toutumiskohtiin. PLoS ONE 7 (5): e36054. doi: 10,1371 /journal.pone.0036054

Editor: Jindan Yu, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. joulukuuta, 2011; Hyväksytty: 26 maaliskuu 2012; Julkaistu: 02 toukokuu 2012

Copyright: © 2012 THIAVILLE et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat American Cancer Society apurahan RSG-08-174-01-GMC ja NIH /NCI avustukset: R01CA148826, R01CA103937, R01CA129080, ja U24CA160036. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pre-B-solujen leukemiaa homeobox-1

(

PBX1

) kuuluu TALE (kolmen aminohapon silmukka laajennus) perhe epätyypillinen homeodomain proteiineja, joiden jäsentä on tunnusomaista kolmen tähteen lisäys ensimmäisen kierteen on homeodomeenin [1]. PBX1 proteiini vuorovaikutuksessa muiden homeodomain sisältävien tumaproteiinien kuten HOX ja MEIS muodostamaan heterodimeerisen transkription komplekseja. Biokemialliset tutkimukset ovat osoittaneet, että PBX1 ja HOX vuorovaikutuksessa välisten yhteyksien kautta PBX1 homeodomeenin ja säilyneestä hexapeptide sekvenssi HOX proteiini [2]. Röntgenkristallografiset tutkimukset ovat lisäksi osoittaneet, että PBX1-HOXB1 dimerisaatio välittyy sitova HOX heksapeptidin on tasku PBX1 välissä kolmen tähteen insertio ja kolmas kierteen ja PBX1 homeodomeenin [3]. Heterodimerisoitumisella PBX1 ja HOX säätelee yhteistoiminnallisesti affiniteetti ja spesifisyys niiden sitoutumaan kohde-DNA-sekvenssit [4], [5].

Koska sen keskeinen rooli transkription säätelyyn, se ei ole mikään yllätys, että PBX1 osallistuu erilaisia ​​biologisia prosesseja solun kohtalon määrittämiseen organogeneesin aikana kehittämiseen ihmisen syöpien [6], [7], [8]. Expression of PBX1 on ajallisesti ja paikallisesti säädeltyä ohjaamaan elin kehittämiseen perna, haima, munuainen, lisämunuainen, ja luuranko [9], [10], [11], [12], ja on sekaantunut kehittämiseen MUllerin kanava, joka myöhemmin kehittyy naisen sukuelimet [13].

Kehittyvät tulokset ovat osoittaneet roolin PBX1 ihmisen syövässä. PBX1-HOX heterodimeeri kompleksi havaittiin edistää kasvaimia toimintaa rintasyöpä ja melanooma. Dominoiva negatiivinen PBX1 proteiinia tai HOX hexapeptide motiivi että häiritsi vuorovaikutus PBX1 ja HOX havaittiin merkittävästi vähentää leviämisen nämä syöpäsolut [14], [15], [16], [17]. Lisäksi PBX1 toimii edelläkävijänä tekijä rintasyövässä, remodeling kromatiinin suosimaan rekrytointiin estrogeenireseptori alfa (ERA) [18]. PBX1 on myös osoitettu olevan alavirtavaikuttajainhibiittorit Notch signalointireitin, joka usein aktivoidaan munasarjojen, kohdunkaulan, ja tietyntyyppisten rintakarsinoomissa [8], [19], [20]. Ottaen huomioon mahdollisen roolin PBX1 eri syöpätyyppejä, yksilöidään PBX1 transkriptio kohdegeenien syöpäsoluissa on kriittinen valaisemaan sen onkogeenista mekanismeja. Tässä tutkimuksessa suoritimme integroitu analyysi tunnistaa geenejä, joiden promoottorit hoitivat PBX1 proteiinia ja joiden ekspressiotasoja säädeltiin PBX1. Olemme keskittyneet yhteen PBX1 suoraan kohdegeenin,

MEOX1

, ja osoitti sen osallistuminen PBX1 välittämä kasvaimen solujen kasvua sekä sen suorassa vuorovaikutuksessa PBX1.

Tulokset

Global kartoitus PBX1 sitoutumiskohdista munasarjasyöpäsoluja

Koska PBX1 on tumatranskriptiotekijä joka sitoutuu promoottorit, pyrimme tunnistamaan PBX1 sitoutumiskohtiin ihmisen syövän genomin käyttäen chip siru analyysi. Munasarjasyöpäsolu solulinja, OVCAR3, valittiin, koska tämä solulinja on aikaisemmin raportoitu yliekspressoimaan PBX1, ja se oli riippuvainen PBX1 ilmentymisen solun eloonjäämisen [8]. PBX1 sidottuja DNA-fragmentit rikastettiin ChIP hybridisoitiin ihmisen promoottorin array sisältäviä 18028-geenin promoottorit, jotka edustavat yhteensä 24659 selostukset. IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina rinnakkain immunosaostus. Mikä tahansa positiivinen huiput päällekkäin niillä, IgG ohjaus jätettiin PBX1 huippu luettelosta. Käyttämällä väärä löytö suhde (FDR) ≤0.2 tunnistimme 2299 ainutlaatuinen promoottoreita, jotka osoittivat merkittäviä PBX1 sitova signaaleja (taulukko S1). Siru-chip tuloksia käytettiin sitten laskea PBX1 huippu sitova jakautuminen koko promoottorin alueet, ja olemme havainneet, että PBX1 sitoutumiskohdat tapahtunut koko promoottorialueet (Fig. 1). Olemme myös suorittaa chip siru määrittää jakelun RNA-polymeraasi II, H3K4me3, ja H3K27me3 vuonna promoottori alueilla (Fig. 1), ja testattiin niiden promoottori yhteistyössä esiintyminen kanssa PBX1 tavoitteita. Tulokset osoittivat, että PBX1 promoottori sitova yhteistyö tapahtui kaikkien kolmen testattu markkereita, jossa PBX1-RNA-polymeraasi II on merkittävin yhteistyössä esiintyminen parin (taulukko S2). Ei ollut merkittävää yhteistyötä esiintyminen välillä H3K4me3 ja H3K27me3, mikä osoittaa, että nämä kaksi histonimerkkien sidottu promoottorien erillisen joukon geenejä.

Histograms osoittaa jakauman huippu sitovan taajuus suhteen kantansa promoottorit (x-akseli). Sitovat taajuus, kuten on esitetty y-akselilla määritettiin useissa piikin sitovia tapahtumia promoottorin paikoissa. TSS: transkription aloituskohdasta.

Mahdolliset kofaktoreita yhteistyötä PBX1

Analysoimalla DNA-sekvenssit rikastuttavat PBX1 siru, cis-sääntelyyn kofaktoreita of PBX1 voitiin tunnistaa skannaamalla DNA: ta sitova motiiveja aiemmin tunnettu siitä, transkriptiotekijät. Web-pohjainen sovellus Cistrome käytettiin tähän analyysiin (https://cistrome.dfci.harvard.edu/ap/). Kanoninen PBX1 sitovan motiivin todettiin joukossa merkittävästi rikastettu jaksoryhmittymät (Fig. 2 taulukko S3). Kuvaaja, etäisyydet PBX1 sitova ja sen ennustettu motiivi paljasti normaalin (Bell-muotoinen) jakelun (Fig. S1). Lisäksi PBX1 aihe, GATA1, FOSL1, ja JUNB transkriptiotekijä motiiveja merkittävästi rikastettu, mikä viittaa niiden mahdollinen osallistuminen PBX1 transkription säätelyyn. Lisäksi motiivi MEIS1, joka on tunnettu kofaktori PBX1 ja ”TAATTA” aihe sekä MEOX1 ja HOX myös rikastettu PBX1 ChIPed sekvenssit.

Valitut esimerkkejä transkriptiotekijän sitovat motiivit, jotka ovat tilastollisesti rikastettu PBX1 immunosaostettiin DNA-sekvenssit.

PBX1 suoraan säädellyt transcriptome

Transkriptiotekijöihin voi toimia suoraan sekä pitkän kantaman tai epäsuoria mekanismeja; siten tunnistaa geenejä, joiden transkriptio oli suoraan säännelty PBX1, me päällekkäin PBX1 säädelty transcriptome kanssa PBX1 chip chip kohdegeenien. PBX1 transcriptome tunnistettiin vertaamalla ilmaisun microarray dataa PBX1 siRNA-käsiteltyjen ja hallita siRNA-käsiteltyjen OVCAR3 soluissa. Knockdown tehokkuus PBX1 siRNA validoitiin Western blotilla (kuvio. S2). Havaitsimme 2094 ainutlaatuinen geenejä, joiden ilmentyminen tasot olivat merkitsevästi säätelee PBX1 (FDR 0,01). Kanoninen signalointireittien rikastettu PBX1 transcriptome kuuluu Wnt signalointia, insuliinin reseptorin signalointi, ja caveolar endosytoosin signalointia (taulukko S4).

Päällekkäiset PBX1 chip chip kohdegeenien ja PBX1 transcriptome tunnistettu 195 geenejä, jotka olivat potentiaali PBX1 suora kohdegeeneissä (Fig. 3A ja Taulukko S5). Olemme edelleen analysoineet jakelua PBX1 ChIP kohdegeenien suhteessa muutoksiin siinä transcriptome in OVCAR3 käsitellyissä soluissa PBX1 siRNA. Pystyimme osoittamaan merkittävää rikastumista PBX1 ChIP tavoitteiden vain keskuudessa geenejä alassäädetty jälkeen PBX1 siRNA hoidon (Fig. 3B). Sen sijaan PBX1 ChIP tavoitteita ei rikastunut jopa geenien tai geenejä, joiden ekspressio oli muuttumaton (FDR 0,01). Määrittämään mahdollisia transkription myötäsääntelyn varten PBX1 kohdegeenien, 195 tunnistetut geenit peitettiin sirun aineistot, jotka sisältävät muunnettuja histonimerkkien (katso edellä). Tulokset osoittivat, että suurin osa (~ 70%) ja PBX1 kohdegeenin promoottorit sisältyvät myös H3K4me3 mutta vain ~ 2% of PBX1 kohdegeenin promoottorit sisältyvät H3K27me3 (Fig. S3 ja sarake Q taulukossa S5). Tilastolliset testit osoittivat, että 195 oletetuilla PBX1 kohdegeenien merkittävästi yhteistyössä tapahtui H3K4me3 ja RNA-polymeraasi II, mutta ei H3K7me3 (taulukko S2). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että PBX1 vaadittiin aktiivisen ilmentymistä kohdegeenien ja promoottorit sen kohdegeenien usein vienyt H3K4me3, Histonimerkki liittyy aktiivisesti puhtaaksi geenejä.

V: Venn kaavio PBX1 chip chip kohdegeenien ja PBX1 transcriptome paljastaa joukon päällekkäisiä geenejä, jotka ovat suoraan kohdegeenien PBX1. Täydellinen luettelo päällekkäisten geenien on esitetty taulukossa S5. Kokeet suoritettiin OVCAR3 soluissa. B: Gene set rikastaminen analyysi suoritettiin sen määrittämiseksi PBX1 ChIP tavoitteet rikastuneet PBX1 transcriptome. Geenit alas-säädellä PBX1 siRNA merkittävästi rikastettu PBX1 ChlP asetettua tavoitetta.

Seven edustaja ehdokasta, joka perustuu niiden tunnettujen toimintojen syöpäbiologian, valittiin 195 ehdokkaan PBX1 tavoitteet validointi käyttäen qPCR. Tulokset vahvistivat spesifinen sitoutuminen PBX1 että promoottorit analysoitu (Fig. 4A), ja vahvisti transkriptio alassäätöä vastauksena PBX1 knockdown kullekin näistä analysoitiin geenien (Fig. 4B).

. Seitsemän geenit valitaan PBX1 ChIP kohdegeenin lista, ja käyttöaste kunkin promoottorin PBX1 validoitiin Chip-qPCR analyysi. ChIP suoritettiin käyttäen joko IgG- tai anti-PBX1-vasta-aine, ja immunosaostettiin DNA saatettiin qPCR-analyysillä käyttämällä alukkeita, jotka reunustavat huippu PBX1 sitoutuneen alueen. B. transkription säätelyyn näistä kohde- geenien PBX1 tai MEOX1 arvioitiin käyttämällä siRNA ja RT-qPCR analyysi. Expression kaikista seitsemästä kohdegeenien ovat merkittävästi alas-säädellä PBX1 siRNA verrattuna ohjata siRNA (Opiskelijan

t

-testi,

p

0,01). Paitsi ZHX2, MEOX1 siRNA merkittävästi vaimentua ilmentymistä testattujen geenien (Opiskelijan

t

-testi,

p

0,01). C. ChIP-qPCR validointi GATA1 ja MEOX1 sitova lähellä PBX1 sidottu sekvenssit. ChIP suoritettiin käyttäen IgG, anti-GATA1, tai anti-MEOX1 vasta-aineen ja immunosaostettiin DNA saatettiin qPCR käyttäen samoja alukkeita kuin A. Lukuun ottamatta sitoutumisen MEOX1 on

ZHX2

promoottorin sitominen GATA1 tai MEOX1 geenien promoottorit on huomattavasti korkeampi kuin sitoutuminen IgG samaan promoottorit (Opiskelijan

t

-testi,

p

0,01).

Määritä jos potentiaali PBX1 kofaktoreita tunnistaa motiivin analyysi edellä kuvattuja yhteistyössä esiintyä PBX1 sitovia promoottorialueille, suoritimme chip qPCR varten GATA1 ja MEOX1 käyttämällä PCR-alukkeita, jotka reunustavat huippu sitova sekvenssit PBX1. Western blot-analyysi osoitti, että sekä transkriptiotekijöitä ilmennettiin OVCAR3 soluissa (kuvio. S4A). ChIP-qPCR osoitti, että GATA1 sidottu kaikki testatut promoottorit ja MEOX1 oli läsnä 6 7 testattujen promoottorien (Opiskelijan

t

– testissä,

p

0,01; Fig. 4C).

Korrelaatio PBX1 ja kohdegeenin ilmentymisen munasarjasyövän kudoksissa

ekstrapoloimiseksi biologinen merkitys PBX1 kohdegeenien tunnistettu OVCAR3 solulinjassa suhteessa ihmisen syövän kudoksiin, suoritimme

in silico

analyysi käyttäen julkisesti saatavilla ilmaisun microarray aineisto [21] onko PBX1 ilmentyminen korreloi sen kohdegeenien 9 eri tyyppisiä syöpä kudoksiin. Kaikkiaan 86 ehdokasta PBX1 kohdegeenien tunnistettiin microarray aineisto [21], ja nämä geenit hakuja eri Oncomine. Tulokset osoittivat, että munasarjasyövän on korkea PBX1 ilmentymisen verrattuna muihin 8 syöpien (Fig. 5). Lisäksi 28 86 kysyi geenit olivat merkitsevästi ajan säännellä munasarjasyöpiä verrattuna muihin karsinoomat (

p

0,05).

Oncomine meta-analyysi suoritettiin aikaisemmin julkaistu geenien ilmentyminen microarray aineisto, joka sisältää yhdeksän eri kasvaintyypeille. Geenejä paremmuusjärjestykseen yli-ilmentyminen munasarjasyövän ja top 18 geenit piirrettiin.

Äskettäin saatavilla TCGA munasarjasyövän serous syöpä aineisto sallittu voimme tehdä tilastollinen analyysi määrittää yhteistyössä säätelyä PBX1 ja sen kohdegeenien munasarjakarsinoomissa. Niistä 195 potentiaali PBX1 kohdegeenien edelleen analyysi tehtiin yhteensä 137, joiden geenien ilmentyminen tiedot olivat läsnä kaikissa kolmessa eri microarray alustoille saatavilla cBio Cancer Genomics portaali (https://www.cbioportal.org/public-portal /). Näistä 137 PBX1 kohdegeenien, 53 geenit osoittivat taipumusta yhteistyössä ylösajon kanssa PBX1 (riskisuhde 1,5), joista 18 (13,1%) oli merkitsevä (

p

0,05). Tämä on korkeampi kuin odottaisi sattumalta (

p

= 0,013, Chi-square test), koska sovellettu samoja analyysin koko joukko 11201 geenien käytettävissä analyysi paljasti, että vain 873 (7,8%) geenit osoittivat molemmat kertoimet suhde on suurempi kuin 1,5 ja

p

0,05. Kertoimet suhde ja merkitys (

p

-arvo) yhteistyön voimistumista PBX1 ja sen kohdegeenien on esitetty taulukossa S5 sarakkeissa H ja I, vastaavasti.

MEOX1 suoraan vuorovaikutuksessa PBX1 ja pelastaa PBX1-peruutetaan vaikutus

Otimme

MEOX1

yksi kohdistu suoraa PBX1, edelleen toiminnallisia tutkimuksia. Kuten PBX1, MEOX1 on homeodomeenin proteiini ja voi mahdollisesti vuorovaikutuksessa PBX1 muodostaen heterodimeerisen transkription komplekseja. Niinpä kysyimme MEOX1 ja PBX1 fyysisesti vuorovaikutuksessa soluissa. Aktiivisesti immunosaostus koe suoritettiin HEK293-soluissa, jotka on transfektoitu PBX1-V5 ja MEOX1-FLAG cDNA ekspressiovektorit. Tulokset osoittivat, että PBX1 pull-down käyttäen V5-vasta-ainetta merkittävästi rikastettu MEOX1 proteiini havaittiin Western blot, jossa on FLAG-vasta-aineella (Fig. 6A). Vastavuoroinen samanaikainen immunosaostus vahvisti, että MEOX1 yhteistyössä immunosaostettiin PBX1 (Fig. 6A).

. HEK293-solut transfektoitiin PBX1-V5 ja /tai MEOX1-FLAG ekspressiovektorit. Immunosaostus ja Western blot suoritettiin käyttämällä epitooppi-tag-vasta-aineita. B. Vasen paneeli: OVCAR3 solut transfektoitiin MEOX1 ekspressiovektorilla tai valvontaa vektori. Western blot suoritettiin testaamiseksi MEOX1 lauseke (ylhäällä). Samat solut transfektoitiin PBX1 siRNA tai ohjaus siRNA ja Western blot suoritettiin testata alas-säätely PBX1 proteiinia (keskellä). Havaitseminen GAPDH proteiinia käytettiin latauskontrollina (alhaalla). Oikea paneeli: Suhteellinen solujen määrä mitattiin OVCAR3 transfektoiduissa soluissa MEOX1 cDNA, PBX1 siRNA, ohjaus plasmidi (pLPC), ja ohjaus siRNA (siLuc). Opiskelijan

t

-testi käytettiin määrittämään merkityksen välillä MEOX1 yliekspressoitujen ryhmän ja kontrolliryhmän.

Testasimme myös paneelia PBX1 geenien onko MEOX1 oli mukana säädellä transkription. Käyttäen MEOX1 siRNA, olemme havainneet, että ilmentyminen kuusi seitsemästä PBX1 geenien oli myös riippuvainen MEOX1. Lisäksi olemme havainneet, että

PBX1

transkriptio riippui MEOX1, kun MEOX1 siRNA pienensi

PBX1

mRNA-tasolla. Vastavuoroisesti

MEOX1

mRNA tasoa alas-säädellä PBX1 knockdown. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että PBX1 oli välttämätön solujen kasvua munasarjasyöpäsoluja lukien OVCAR3; täällä, suoritimme siRNA Knockdown onko MEOX1 knockdown tuotettu fenotyyppi samanlainen PBX1 knockdown. Tulokset osoittivat, että MEOX1 pudotus vähensi merkittävästi solujen kasvua OVCAR3 solujen fenotyyppi muistuttaa PBX1-vedettyjen vaikutus (Fig. S5).

testata, jos MEOX1 välitteistä solujen kasvun funktiona PBX1, esitimme MEOX1 konstitutiivisesti (n CMV-promoottori) ja tukahdutetaan PBX1 ilmaisua käyttäen siRNA. Huomasimme, että konstitutiivinen MEOX1 ilmaisu osittain suojattu soluja PBX1 peruuttamisesta aiheuttama kasvun hidastuminen, kuten huomattavasti enemmän solumäärät havaittiin MEOX1-transfektoiduissa soluissa verrattuna ohjata plasmidin-transfektoiduissa soluissa (kuvio. 6B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että MEOX1 on olennainen välittäjänä PBX1 liittyvän kasvun signaalia, vaikka ilmentyminen MEOX1 itsessään ei riitä stimuloimaan solujen lisääntymistä (kuvio. S6).

Keskustelu

homeobox geeniperheen, joka on kriittinen transkription säätelyyn, koodaa tumaproteiinit sisältävän erittäin konservoituneita DNA-sitovan homeodomains [22]. Homeobox proteiinit ovat osallisena kriittisiä toimintoja kehittämisen aikana ja kasvaimen kehittymisen. Tässä raportissa olemme keskittyneet yhden homeobox geenien, PBX1, jonka todettiin olevan keskeinen rooli munasarjasyöpä, jonka tarkoituksena on tunnistaa ja luonnehtia sen transkription verkon syöpäsoluissa. Integrointi analyysi geenien promoottorien sitoo PBX1 ja PBX1 transcriptome antoi meille mahdollisuuden tunnistaa geenien suoraan säätelee PBX1.

luotettavuutta meidän genominlaajuisten chip siru määritystä osoituksena havainto että kanoninen PBX1 aihe on joka on hyvin rikastettu PBX1 ChIPed sekvenssit. Olemme osoittaneet, että 195 PBX1 ChIP tavoitteita merkittävästi päällekkäinen promoottori täyttöaste RNA-polymeraasi II ja H3K4me3, Histonimerkki liittyy aktiivinen transkriptio, mutta ei H3K27me3, Histonimerkki liittyy transkriptio tukahduttaminen. Lisäksi olemme havainneet, että ChIP tavoitteita merkittävästi rikastettu vain keskuudessa geenit, joiden transkriptio tukee PBX1 (vaimentua by PBX1 siRNA), mutta ei joukossa geenit, joiden transkriptio estyy tai ei vaikuta PBX1. Nämä tiedot yhdessä tukevat näkemystä, että PBX1 ensisijaisesti toimii transkriptioaktivaattorina sijaan repressorin munasarjasyöpäsoluja.

Nykyinen tutkimus paljasti myös mahdollisia cis-sääntelyyn kofaktoreita of PBX1, jotka sisältävät GATA1, FOSL1, MEIS1 , JUNB ja ”TAATTA” motiivi MEOX1 [23] ja HOX [24]. Kuviot Näiden transkription kofaktoreita merkittävästi rikastuneet PBX1 sidottuja sekvenssit, mikä viittaa siihen, että nämä proteiinit voivat työskennellä yhteistuumin PBX1 helpottamiseksi transkription säätelyyn. Mielenkiintoista, useat näistä mahdollisista PBX1 kofaktoreita, mukaan lukien BCL6 ja MEOX1, havaittiin myös suoranaisesti säädellä PBX1, mikä viittaa automaattinen sääntely transkription ohjaus näistä geeneistä. Nykyinen tutkimus keskittyi MEOX1 arvioimaan yhteistyötään sitova ja yhteissääntelymekanismien toimintaa PBX1. Lisäksi kokeet on selvitettävä, onko muita kofaktoreita toimivat yhteistyössä sääntelyyn tekijöitä PBX1 syöpäsoluissa.

Toinen jännittävä havainto tässä tutkimuksessa on tunnistaa uuden roolin MEOX1 syövän synnyssä. Vaikka MEOX1 on vakiintunut yhdeksi tärkeimmistä transkription sääntelyviranomaisten alkionkehityksen aikana, tuloksemme osoittavat, että MEOX1 on mukana myös syövän kehittämiseen osallistuvat PBX1 transkription verkkoon. Se, että MEOX1 on co-yliaktiivista kanssa PBX1 osajoukossa munasarjakarsinoomat (Fig. 5), viittaa siihen, että PBX1-MEOX1 molekyyli akseli on mukana transkription säätelyyn näiden karsinoomien. Pohjautuvien, teimme ”pelastus” määrityksessä ektooppisesti ilmaisemalla MEOX1 syöpäsoluissa kanssa PBX1 knockdown. Tuloksemme osoittavat, että MEOX1 ilmaisun päinvastainen kasvua estävää vaikutusta PBX1 Knockdown viittaa siihen, että MEOX1 välittää kasvua tukeva funktio PBX1 vuonna munasarjasyöpäsoluja. Sekä PBX1 ja MEOX1 kuuluvat homeodomeenin perhe, jonka jäsenet yleensä vuorovaikutuksessa muiden homeodomain proteiinien tuottamiseksi heterodimeeriproteiinia kompleksit, jotka ovat toiminnallisia välittäjiä transkription säätelyyn. Todellakin, meidän samanaikainen immunosaostus koe osoitti vuorovaikutusta PBX1 ja MEOX1 proteiineja, mikä viittaa siihen, että MEOX1 voi olla kriittinen homeodomain kofaktori PBX1. Näin ollen, PBX1 näyttää toimivan ei vain ylävirran säädin, vaan myös sitova kofaktori MEOX1. Tämä havainto muistuttaa aiemman tutkimuksen osoittaa, että PBX1 ja HOXB1 yhteistyötä säätelyssä HOXB1 ilmaisun aktiivisuus hiiren kudoksissa [25]. Se voidaan kuvitella, että tämä myönteinen automaattinen sääntely loop toimii varmistaa jatkuva transkriptionaalista aktiivisuutta muiden PBX1 säännelty geenejä.

tulokset ilmoitetaan tässä ensimmäinen askel kohti ymmärrystä monimutkaisen sääntelyn verkosto PBX1 syövissä. Koska roolia PBX1 ihmisen kiinteiden kasvainten on syntymässä, kohdegeenien suoraan ohjaa PBX1 raportoitu tässä toimii jalanjälkiä varten selvittämisessä miten PBX1 vaikuttaa kasvainten kehittymiseen. Tässä tutkimuksessa esitetään useita tärkeitä kysymyksiä vielä käsiteltävä. Esimerkiksi olisi mielenkiintoista testata, onko PBX1 geenien tunnistettu munasarjasyöpäpotilailla jaetaan koneen toimivien aikana urut kehitystä. Koska yli-ilmentyminen PBX1 ja MEOX1 on suhteellisen spesifinen munasarjasyöpä verrattuna muita kiinteitä kasvaimia (Fig. 5), biologista merkitystä PBX1 ja MEOX1 koekspressio ja niiden välinen yhteistyö on transkription säätelyyn ovat todennäköisesti konteksti- ja kudos-riippuvaisen . Tästä näkökulmasta olisi tärkeää määrittää, jos MEOX1 moduloi selektiivisyys ja kohdesekvenssin sitoutumisaffiniteetti PBX1 transkriptio monimutkainen munasarjasyöpä, ja lopulta, olisi mielenkiintoista selvittää, kuinka PBX1 /MEOX1 kompleksin muodostumista edistää syövän synnyn.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat

solulinjat tässä tutkimuksessa käytetyt sisältyi munasarjasyövän solulinja, OVCAR3, ja alkion munuaisen epiteelisolujen linja, HEK293. Molemmat solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia). Solulinjoja pidettiin RPMI1640 täydennetty 5% naudan sikiön seerumia ja antibiootteja. Ei ollut näyttöä mykoplasmakontaminaation perustuu PCR-määritystä.

Kromatiini Immunosaostaminen (chip) Analysis

Kunkin immunosaostus, noin 12 x 10

6 OVCAR3 soluja käytettiin. Solut levytettiin 150 mm maljoihin ja viljellään, kunnes 80% konfluentteja. Solut kiinnitettiin lisäämällä formaldehydiä (1% loppukonsentraatio) kulttuuriin ja inkubaatio 10 min. Reaktio pysäytettiin 125 mM glysiiniä ja 5 min. Solut pestiin DPBS: llä, tumat turvonnut ytimet turvotusta puskurissa (5 mM PIPES, pH 8,0, 85 mM KCI, 0,5% NP 40), ja lyysattiin ytimet lyysipuskuria (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI , pH 8,0). Hajotettiin tumat ultraäänellä Fisherin malli 100 sonicator 5 sykliä 40 sekunnin vakiopulssivälejä kanssa 2 min jäillä inkuboinnin välissä pulsseja. Sonikoitiin lysaatit laimennettiin ChIP laimennuspuskuriin (0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, 167 mM NaCl) ja inkuboitiin proteiini G Sepharose (Invitrogen) 1 tunnin ajan. Helmet poistettiin, ja helmi poistetaan lysaatit inkuboitiin vasta-aineiden PBX1, GATA1 tai MEOX1 (Santa Cruz sc-899, SC-265-kertainen, ja Epitomics T2204, vastaavasti) yön yli kierto 4 ° C: ssa. 01:01 lietettä BSA-estetty proteiini G Sepharose lisättiin vasta-ainetta inkuboidaan lysaatit ja pyörittää 4 ° C: ssa 2-3 tunnin ajan. Vasta-aine-proteiini-kompleksit sidottu helmiä pestiin kerran Low Salt puskuria (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl), kun LiCl puskurilla (0,25 M LiCI: a, 1% NP 40, 1% natriumdeoksikolaatti, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0), ja kaksi kertaa TE, pH 8,0. Kompleksit eluoitiin helmistä inkuboimalla 1% SDS, 0,1 M NaHCO

3 (kuumennettiin 65 ° C) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa ravistellen. Näytteet käsiteltiin 200 mM NaCl: a ja 1 ug RNase A: ta 65 ° C: ssa yön yli. 1 tunnin kuluttua proteinaasi K -käsittely 37 ° C: ssa, DNA puhdistettiin käyttämällä Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit ja eluoitiin 100 ui: aan TE: tä.

qPCR-analyysi, 2,5 ui näytettä käytettiin reaktiota kohden. PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green väriainetta ja iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA). Kynnys syklien (Ct) saatiin käyttämällä iCycler Optinen järjestelmä liitännän ohjelmisto. PCR-alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer 3-ohjelma (nukleoti- Alukkeiden sekvenssit on esitetty taulukossa S6). Data normalisoitiin käyttämällä standardikäyrää, joka valmistettiin sonikoitiin tulo (yhteensä) DNA: sta.

ChIP-chip Array Analyysi

ChIP-chip array analyysi, ChIP suoritettiin kuten edellä on kuvattu, paitsi että DNA puhdistusvaihetta. DNA puhdistettiin käyttämällä Qiagen MinElute PCR-puhdistuskittiä ja eluoitiin 10 ui H 2O: lla. Koko Immunopresipitoidun DNA-näyte monistettiin käyttäen WGA2 kittiä (Sigma) ja puhdistettiin käyttämällä Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit, jossa on eluutiotilavuus oli 40 ui H 2O: lla. Panos DNA, 200 ng puhdistettua DNA: ta käytettiin WGA2 PCR. Alikvootti kustakin monistettu näyte laimennettiin 5 ng /ul ja käytetään qPCR. Jos 4 ug DNA: ta ei ole tuotettu WGA2 PCR, 10 ng WGA2 Reaktion monistettiin uudelleen käyttäen WGA3 kittiä (Sigma), ja testattu ohjaus alukkeita uudelleen. Alikvootit kutakin näytettä (4 ug) lähetettiin NimbleGen merkintöjä ja array hybridisaatio. NimbleGen 385K RefSeq promoottori 1-Plex array käytettiin näytteen hybridisaation.

array analyysissä NimbleGen ohjelma Signal Kartta saamiseksi käytettiin signaalinhuippuja kullekin näytteelle ja kartoittaa näiden huippujen niiden vastaavien genomialuetta. Käyttämällä Bioconductor paketti GenomicRanges (saatavilla bioconductor.org), me seulotaan huippu alueita kohde chip siru FDR≤0.2 varten päällekkäisiä huippuja epäspesifisestä IgG chip siru ja hävittää ne piikit ainakin yhdellä emäsparin päällekkäisyyttä. Loput huiput kohde chip chip katsottiin positiiviseksi proteiineihin.

motiivi haku analyysit tehtiin käyttäen seqpos motiivi löytö työkalu (Cistrome, https://cistrome.org/ap/root) ja Transfac motiivi tietokannan seuraavan parametrin: leveys huipusta skannattava = 600 emäsparia;

p

0,05 asetettiin cutoff varten merkitys.

Gene Expression Array Analysis

RNA eristettiin OVCAR3 soluista, jotka olivat aikaisemmin saaneet joko PBX1 siRNA tai valvontaa siRNA kohdistaminen lusiferaasigeeniin. RNA merkintöjä, hybridisoimalla Illumina ihmisen HT-12 Expression Array, ja normalisointi analyysi suoritettiin Lowe Family Genomics Core laitos, Johns Hopkins Bayview Medical Center. Taitteen muutos ekspressiotason kunkin geenin laskettiin suhteena PBX1 siRNA hoidon hallita. Koska oli vain yksi array kullakin ajanhetkellä, käytimme logaritmi kertainen muutos testin tilastollinen, ja johdetaan merkitys analyysi laskea

p

-arvo, joka määriteltiin todennäköisyys saada testi tilastollinen ainakin yhtä äärimmäinen kuin yksi todella noudatetaan alla nollahypoteesin. Sillä null jakelu oletimme testin tilastollinen seuraa normaalijakaumaa, kun keskiarvo ja keskihajonta estimoidaan kontrollinäytteistä. Olemme myös toteuttaneet Benjamini ja Hochberg n menettely [26] useita hypoteesin testaukseen, ja arvioitu väärä löytö määrä (FDR) merkittävästi ilmaistuna geenejä. Huomattavasti säädelty ja alas geenien lopulta määritettiin ennalta FDR sulku 0,01.

Tilastollinen testi geenin päällekkäistä keskuudessa array aineistot

arvioimiseksi merkitystä päällekkäisyyden tietokokonaisuuksien (ts välillä chIP lastuja ja välillä 195 kohde- geenien ja siru-chip), määritimme todennäköisyys saada sama määrä tai enemmän päällekkäisiä geenejä satunnaisesti näytteille koko joukko geenejä. Määrä geenien koko joukko oli 18511 siru-siru ja 30.500 ilmentämiseen array.

p

-arvo laskettiin määrittämällä hännän tyvi todennäköisyydet vastaavan hypergeometrisen Jakeluiden phyper () funktio R version 2.14.1.

Tilastollinen testi koekspression välillä PBX1 ja sen kohdegeenien

Z-tulokset mRNA ilmaisun tietoja TCGA munasarjasyöpä tutkimuksessa haettiin Cancer Genomics data Server (CGDS) isännöi Memorial-Sloan-Kettering Cancer Center (http: //www. cbioportal.org/) käyttäen CGDS-R 1.1.19 paketti (https://cran.r-project.org/web/packages/cgdsr/index.html). Z-score laskettiin diploidi kasvaimet (diploidi kunkin geenin) ohjearvon väestöä, ja vain geenit edustaa kaikkia kolmea ilmaisua alustoilla käytetyt TCGA tutkimuksessa otettiin mukaan [27]. Kaikkiaan 11202 geenejä 316 kasvain näytteiden Z-lukujen haettiin analysoitavaksi.

Yli-ilmentyminen Kunkin geeni määritelty Z-score 1,65 (edustaa top 5% mRNA ilmaus). Taipumus yhteistyössä yli-ilmentymisen PBX1 ja sen kohdegeenien samasta näytteestä arvioitiin 316 kasvain vedostulostus, ja kertoimet suhdeluvut (syrjäisimpien alueiden) laskettiin.