Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kyllä liittyvä proteiini (YAP) on transkription koaktivaattori ja säätelee solujen lisääntymisen ja apoptoosin. Olemme tutkineet kliininen ja biologinen merkitys YAP endometriumin syöpä (EMCA).

Methods

YAP ilmentymisen 150 primaarikasvaimen kudoksia potilailta, joilla EMCA arvioitiin immunohistokemiallisesti ja sen yhdessä kliinis data arvioitiin. Biologinen toiminnot YAP määritettiin EMCA solulinjoissa kautta knockdown /yli-ilmentymisen YAP. Rooli YAP moduloinnissa säteilyherkkyydestä tutkittiin myös EMCA soluissa.

Tulokset

Lisääntynyt ydin- YAP ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä korkeampaan palkkaluokkaan, vaiheessa lymfoproliferatiivisten vaskulaaritilaa invaasio, leikkauksen jälkeinen toistuminen /etäpesäke ja kokonaiselossaolo estrogeenin välittämän EMCA, kutsutaan tyypin 1 syöpä (p = 0,019, = 0,028, = 0,0008, = 0,046 ja 0,015, tässä järjestyksessä). Vuonna Monimuuttuja-analyysissä, ydin- YAP ilmentyminen vahvistettiin itsenäisenä ennustetekijä varten eloonjäämiseen tyypin 1 EMCA. YAP Knockdown siRNA aiheutti merkittävän laskun solujen lisääntymisen (p 0,05), ankkurointi-riippuvaista kasvua (p = 0,015) ja muuttoliike /invaasio (p 0,05), ja merkittävä määrä kasvaa solujen G0 /G1 vaihe (p = 0,002). Kääntäen, YAP yliekspressio edistää solujen lisääntymistä. Klonogeeniset määrityksessä osoitti parannettu radioherkkyyttä noin 36% YAP esti soluissa.

Johtopäätökset

Koska YAP toimii transkription koaktivaattoria, sen ero sijoittuu tumaan syöpäsolujen ja myöhemmät vaikutukset soluproliferaatiota voisi olla merkittäviä vaikutuksia suhteessa rooliaan onkogeenin EMCA. Nuclear YAP ilmaisu voisi olla hyödyllinen ennustetyövälineenä indikaattorina tai terapeuttinen kohde ja ennustaa säteilyherkkyydestä potilaalla on EMCA.

Citation: Tsujiura M, Mazack V, Sudol M, Kaspar HG, Nash J, Carey DJ, et al . (2014) Kyllä liittyvä proteiini (YAP) Moduloi onkogeeninen ominaisuudet ja säteily Herkkyys endometriumsyöpään. PLoS ONE 9 (6): e100974. doi: 10,1371 /journal.pone.0100974

Editor: Hong Wanjin, Institute of Molecular and Cell Biology, Biopol’ia®, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 helmikuu 2014; Hyväksytty: 1 kesäkuu 2014; Julkaistu: 27 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Tsujiura et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitusta työ tässä julkaisussa oli Grant SRC-075 Clinic Research Fund, Geisinger Medical Center ja Rice Syöpäsäätiön. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohdun limakalvon syöpä (EMCA) on neljänneksi yleisin syöpä ja yleisin gynecologic syövän amerikkalaiset naiset, noin 8200 kuolemantapausta ja 49500 uutta tapausta Yhdysvalloissa vuonna 2013 [1]. Vaikka naisilla EMCA yleensä hyvä ennuste, jossa 81,5% 5 vuoden pysyvyys (2003-2009), ilmaantuvuus ja kuolleisuus EMCA ovat jatkaneet nousuaan keskimäärin 1,1% ja 0,4% vastaavasti vuosittain 10 viime vuoden aikana [2 ]. Viimeaikaiset lisäykset kohdun limakalvon syöpien on katsottu suurelta osin johtuvan liikalihavuusepidemiaa [3]. Vaikka parannuksia diagnoosimenetelmistä ja perioperatiivisena hallinta ovat johtaneet kasvua varhaisessa havaitsemisessa EMCA ja suotuisa ennuste, naiset diagnosoitu edennyt tai uusiutuva sairaus on paljon huonompi selviytymismahdollisuuksia ja rajoitettu liitännäishoitona hoitovaihtoehtoja. Geenien ilmentyminen tutkimuksissa on todettu joitakin geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti EMCA, kuten

PTEN

,

KRAS

,

CTNNB1

,

PIK3CA

ja

FGFR2

[4], [5], [6], [7]. Vuonna hoitopaikassa kuitenkin muutamia molekyylejä on analysoitu terapeuttisina ja /tai diagnostisia biomarkkereita. Siksi tunnistaminen biologinen markkereita ja niiden loppupään tavoitteet on olennainen yksilöllisen hoitojen ja lopputuloksen parantamiseksi ja elämänlaatua potilailla, joilla EMCA.

EMCA on luokiteltu kahteen tyyppiin. Tyypin 1 syöpä vastaa noin 80% EMCA ja luonnehditaan estrogeeniriippuvaisen, estrogeenireseptori (ER) ja progesteroni reseptorin (PR) positiivinen endomet- morfologia ja yleensä suotuisa ennuste [8]. Sitä vastoin tyypin 2 syöpä on estrogeeni-riippumaton, ER /PR negatiivinen, huonosti eriytetty ja liittyy paljon huonompi ennuste [9]. Tavanomainen hoito molempien sisältää kirurginen poistaminen kohtu, kohdunkaula, kahden- munanjohtimet ja munasarjat. Potilaat, joiden kasvaimet osoittavat korkean riskin ominaisuudet voivat lisäksi läpikäydä imusolmukkeiden. Aikaisen vaiheen EMCA suuri riski ominaisuuksia, kuten syvä myometrisia invaasio, lymfoproliferatiivisten vaskulaaritilaa invaasiota (Lvsi) ja korkea laatu liittyy 15-25% uusiutumisen riskiä [10]. Adjuvantti sädehoito, yleisin hoitomuoto alkuvaiheen suuren riskin potilailla, on havaittu useissa tutkimuksissa vähentää lantion ja emättimen uusiutumisen 12-14% ilman hoitoa 3-4% terapiassa, mutta silti ilman vastaavaa lisäystä kokonaiseloonjäämisessä [11], [12]. Toisin sanoen, sädehoito paljastaa useita naisia ​​myrkyllisyydestä ilman selkeää hyötyä yleistä kuolleisuutta, erityisesti suurin osa potilaista, jotka on vapaa taudista puuttuessa lisähoitoa. Sädehoitoa käytetään myös aiemmin hoitamattomia potilaita paikallisia /alueellisia toistumisen. Huolimatta säteily, 50%: lla paikallisen uusiutumisen lopulta kuolevat sairauteen [13], mikä tarkoittaa, että näillä potilailla on säteilyä kestävien kasvaimia ja voi ovat hyötyneet vaihtoehtoisesta käsittely kuten kemoterapiaa. Tunnistaminen merkkiaineiden säteilyherkkyydestä /vastus antaisi räätälöity hoito tehokkain hoito ja vähentää tarpeetonta säteilyn aiheuttamaa toksisuutta.

Kyllä liittyvä proteiini (YAP) tunnistettiin ensimmäisen kerran, koska sen kyky yhdistää Yes n ja Src-proteiini-tyrosiini- kinaasien [14].

YAP

-geeni sijaitsee ihmisen kromosomissa 11q22, koodaa transkription koaktivaattori, ja se on yksi kaksi alavirran efektorien Hippo tuumoria tukahduttavan reitti [15]. Estämällä Hippo polku johtaa YAP aktivointi, ydinvoiman lokalisointi ja lisääntynyt aktiivisuus transkription kohdegeenien, kuten

CTGF

ja

AREG

[16], [17]. Kääntäen, aktivointi Hippo polku johtaa YAP fosforylaatioon, soluliman sitomisen ja inaktivoinnin. Luskuttaa seriini 127 alaniiniksi (S127A) mutantti on konstitutiivisesti aktiivinen muoto, joka jää tumassa ja on kopiointia ajatellen aktiivisen. YAP säätelee tasapainoa solujen lisääntymisen ja apoptoosin [18], [19], [20], ja monistetaan useissa ihmisen maligniteettien, mukaan lukien rinta-, ruokatorven, hepatosellulaarinen, ependymoma, pahanlaatuinen mesoteliooma ja varhaissolukasvaimesta [21], [22] , [23], [24], [25], [26]. Lisäksi YAP ilmaisu korreloi huonon ennusteen erilaisiin syöpiin, kuten kolorektaalisen, ruokatorven, mahalaukun, hepatosellulaarinen, keuhko- ja munasarjojen [22], [27], [28], [29], [30], [31], [32],

on myös ylikuulumisen YAP ja steroidihormonien kanssa. Dhananjayan et ai. osoitti, että YAP ja WW domain sitova proteiini-2 (WBP-2) ovat yhteistyössä aktivaattoreita ER ja PR [33], joka on keskeinen rooli normaalissa kuukautiskierron aikana ja etiologiassa tyypin 1 EMCA. Vaikka useat raportit osoittivat kasvaimia synnyttävän toiminnot YAP erilaisissa ihmisen syövissä, biologisen ja kliinistä merkitystä EMCA jää epäselväksi. Lisäksi YAP yliekspressio edistää radioresistance in medulloblastoma soluissa kautta YAP /IGF2 /Akt-reitin [34], mikä viittaa YAP voi toimia moduloimalla säteilyherkkyydestä /kestävyys. Nämä toteamukset kehotti meitä tutkia tarkemmin, ovatko YAP voisi olla rooli syövän synnyssä ja kehittämisessä EMCA ja modulaatio säteilyherkkyydestä.

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet mahdollisia hyödyllisyys YAP ennustetyövälineenä ja terapeuttinen ilmaisin EMCA ja biologisen toiminnan YAP in EMCA. Lisäksi arvioimme YAP vaikutus | säteilyherkkyydestä. Näin ollen tietomme todistamaan, että ydinvoiman YAP ilme on merkkiaine huono ennuste ja voi olla terapeuttista vaikutusta potilaiden hoitoon EMCA.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaiden ja kudosnäytteiden

tutkimus hyväksyi Institutional Review aluksella Geisinger Medical Center (Geisinger Medical Center IRB Protocol # 2011-0163) ja luopuminen suostumus saatiin IRB Centerin suorittamaan tutkimukseen. Kaikkiaan 150 ensisijainen EMCA kudokset saatiin potilailta, joille tehtiin kohdunpoisto at Geisinger Medical Center vuosien 2008 ja 2011, joista 120 tapausta tyypin 1 EMCA ja 30 tapausta tyypin 2 EMCA. Väestörakenteen ja varoituksia syntymässä olevista, kuten ikä, painoindeksi (BMI), laatu, vaiheessa Lvsi ja Eloonjääntitulokset saatiin kaikissa aineissa. Makroskooppiset ja mikroskooppiset luokitukset kasvainten perustuivat kansainvälisen liiton Gynekologi ja synnytyslääkärit (FIGO) pysähdyspaikan järjestelmä [35], [36].

immunohistokemia

Parafiini upotetut kudosnäytteet leikattiin joka paksuus 5 mikronia, ja altistettiin immunohistokemiallisella värjäyksellä YAP proteiinin avidiini-biotiini-peroksidaasi-menetelmällä. Antigeeni haku suoritettiin kuumentamalla näytteitä sitraattipuskurissa (pH 6,0) 5 minuutin ajan suuren tehon, sitten 10 minuuttia väliaineen teho käyttämällä mikroaaltouunia. Objektilasit jäähdytettiin ja huuhdeltiin tislatulla vedellä ja värjättiin käyttäen DAKO Autostaineriin seuraavasti: liukuu inkuboitiin 3% vetyperoksidia 5 minuuttia myöhemmin huuhtelu TBST-puskurissa. Näytteet inkuboitiin sitten YAP vasta-ainetta (1:200, NB110-58358) alkaen Novus Biologicals (Littleton, CO) 30 min myöhemmin TBST: llä pesun ja inkuboitiin Dako Envision + HRP-kani-liuosta (Dako, Carpinteria, CA) (laimennettuna mukaan valmistajan ohjeiden) 30 minuutin ajan. Jälkeen TBST pesun, dioja inkuboitiin sitten Dako DAB liuoksessa 10 minuuttia ja huuhdeltava uudelleen TBST-puskurilla. Objektilasit sitten vastavär- seuraavasti: 20 Toisen inkubaation Gills hematosykliiniväriä, jonka jälkeen vesijohtovettä pestä. Dioja poistettiin vesi ja ilmakuivattiin sitten, ja näytteet asetettiin vuonna kiinnitysväliaine. Immunovärjättiin objektilasit arvioitiin sekä ydin- ja sytoplasmista rauhas värjäyksen YAP jonka gynekologinen patologi, (HK), Tilanne intensiteetti käyttäen 5 pisteen (0-4) mittakaavassa.

EMCA solulinjoissa

kolme ihmisen tyypin 1 EMCA solulinjoja, HEC-1-A, HEC-1-B ja Ishikawa, käytettiin tässä tutkimuksessa. HEC-1-A (ATCC HTB112), ja HEC-1-B (ATCC HTB113) saatiin American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Ishikawa solut saatiin Dr. Jennifer Richer (University of Colorado) [37], [38], [39]. HEC-1-A viljeltiin McCoyn 5A-alustassa (ATCC, Manassas, VA), johon oli lisätty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), HEC-1-B Eaglen vähintään essential medium (EMEM) (ATCC, Manassas, VA), johon oli lisätty 10% (v /v) FBS: ää, ja Ishikawa Minimal essential medium (MEM) (Life Technologies, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 1% ei-välttämättömiä aminohappoja ( NEAA), 6 ng /ml insuliinia, ja 5% (v /v) FBS: ää. Antibiootit (10 yksikköä /ml penisilliiniä ja 10 ug /ml streptomysiiniä), lisättiin kaikkiin viljelyalustaan. Kaikkia solulinjoja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% hiilidioksidia.

Western blot-analyysi

Solut hajotettiin Tris-puskurissa (10 mmol /l, pH 7,4), joka sisälsi 5 mmol /l EDTA: a, 300 mmol /l NaCI: a, 10% glyserolia, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS: ää ja proteaasi-inhibiittoriseosta (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) ja alistettiin SDS-PAGE . Anti-YAP-vasta-aine (NB110-58358) ostettiin Novus Biologicals (Littleton, CO); anti-fosfo-YAP (ser127) (# 4911) Cell Signaling Technology (Danvers, MA); anti-NF2 (sc-331) Santa Cruz; anti-LATS2 (ab70565) ja anti-GAPDH (ab9485) peräisin Abcam (Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta). Asianmukaista piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (anti-kani /hiiri, GE Healthcare, Little Chalfont, UK) käytettiin. Proteiinivyöhykkeet näkyviksi tehostetun kemiluminesenssin alustan (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) ja havaittiin käyttäen LAS-3000 (Fujifilm, Tokio, Japani).

Immunofluoresenssi- ja kuvantamisen

Viljellyt solut pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 4% (w /v) paraformaldehydillä. Läpäiseväksi tekemisen jälkeen 0,2% Triton X-100 PBS: ssä, solut estettiin 5% (w /v) vuohen seerumilla PBS: ssä ja niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen (YAP, 1:500) huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan, minkä jälkeen Alexa Fluor 488 vuohen anti kani (1:500) sekundaarisena vasta-ainetta 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen, kun se on asennettu, 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) ja nucleus värjäystä, solut tutkittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Olympus IX81, Olympus, Tokio, Japani).

Short häiritsevä RNA (siRNA ) käsittely

siRNA kohdistaminen

YAP

geeni (sc-38637; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) käytettiin menettämisestä toiminnon kokeita. Ohjaus siRNA (sc-37007; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) käytettiin negatiivisena kontrollina. Jokainen siRNA (37,5 nM) transfektoitiin EMCA soluihin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pudotus kohdegeenin varmistettiin western blottauksella.

Soluproliferaatiomääritys

elinkykyisten solujen eri aikapisteissä transfektion jälkeen siRNA: iden arvioitiin kolorimetrisellä vesiliukoista tetratsoliumsuolaa määritys (Cell laskenta kit-8; Dojindo, Kumamoto, Japani), kuten on kuvattu muualla [40].

Soft agar määritys

in vitro testaus kiinnittymisestä riippumattoman siirtokunnan kehittäminen, 5000 transfektoitu siRNA: illa 48 tunnin ajan maljattiin 1 ml 0,4% suli agaria EMEM 10% (v /v) FBS: ää 6-kuoppaisille levyille päällystettiin 1,5 ml: lla 0,9% sulanut agar samassa väliaineessa. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% hiilidioksidia. Pinnoitus suoritettiin sextuplicate ja pieni määrä EMEM täydellistä alustaa lisättiin varovasti muutaman päivän välein päälle kunkin kuopan varmistaa ravitsemuksellista tarvikkeet ja kuivumisen estämiseksi. Kun oli inkuboitu noin neljän viikon, solut kiinnitettiin ja värjättiin liuoksella, joka sisälsi 2% etanolia ja 0,03% kristalliviolettia, ja pesäkkeiden lukumäärä arvioitiin kahden sokkoutettu riippumaton tutkijat.

Invasion ja Migration määritykset

TranswellTM maahanmuutto- ja invaasion määritykset suoritettiin käyttäen 24-kuoppaista BioCoat soluviljelmässä insertit (BD, Franklin Lakes, NJ). Yläpinnalle 6,4-mm suodattimet 8 um huokosia huokoset esipäällystettiin (invaasiomääritys) tai ilman sitä (migraatiokokeessa) soluväliaineen pinnoite (Matrigel). 50000 siRNA transfektoidut solut seerumivapaassa väliaineessa ympättiin ylempään kammioon kunkin insertin, jossa on täydellinen väliaine lisätään alaosaan. Seuraavat 24 h inkuboinnin siirtynyt tai invasiiviset solut alemmalla pinnalla suodattimet fiksattiin ja värjättiin Differential Quik Stain Kit (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), ja numerot värjäytyneiden solujen, jotka olivat vaeltaneet /tunkeutuneet pohjaan suodattimen laskettiin suoraan kahden riippumattoman sokkoutettua tutkijat.

Solusyklianalyysiä

virtaussytometrianalyysissä, solut trypsinoitiin 72 tai 96 tuntia transfektion jälkeen siRNA: iden, minkä jälkeen inkuboimalla värjäys puskuria (0,1% Triton X-100, 0,2 mg /ml RNaasi A: n ja 40 ug /ml propidiumjodidia PBS: ssä). Solut analysoitiin DNA-sisällön käyttäen Beckman Coulter, Cytomics FC 500 (Brea, CA).

Ekspressiorakenteet ja pesäkemuodostusta

ilmentävien plasmidien villityypin YAP (pEGFP-C3-WT- YAP) saatiin kloonaamalla koko koodaussekvenssin YAP kanssa 504 aminohapon [41] vektoriin pEGFP-C3 (lahja Gregory Matera ja Channing Der, University of North Carolina, Chapel Hill, NC). S127A mutantti muoto YAP (pEGFP-C3-S127A-YAP) aikaansaatiin PCR: n välittämä kohdennettu mutageneesi ja pEGFP-C3-WT-YAP. pEGFP-C3-WT-YAP, pEGFP-C3-S127A-YAP tai tyhjän vektorin (pEGFP-C3-EV) kontrollina otettiin EMCA soluihin käyttäen Lipofectamine LTX ja Plus-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) mukaisesti valmistajan ohjeita. Ilmentymistä YAP proteiinin transfektoiduissa soluissa varmistettiin western blottauksella. Kun oli inkuboitu noin neljän viikon asianmukaiset pitoisuudet G418, solut kiinnitettiin ja värjättiin liuoksella, joka sisälsi 10% formaldehydiä, ja 1% kristalliviolettia. Värjättyä alue laskettiin densitometrialla avulla ImageJ ohjelmistoa.

klonogeeninen määritys ja säteilytysolosuhteita

Survival seuraava säteilyaltistus oli määritellä kyvyksi solujen säilyttää klonogeeniset kapasiteettia. Lyhyesti, yhä useammat transfektoitujen solujen valvontaa siRNA tai YAP-spesifisiä siRNA: ssa 48 tuntia maljattiin 6-kuoppaisille levyille. Soluja säteilytettiin 0-6 Gy käyttäen lineaarista kiihdytin ja palautettiin inkubaattoriin useita viikkoja, kunnes solut kontrollikuopissa oli muodostunut riittävän suuria pesäkkeitä. Muodostuneiden pesäkkeiden kiinnitettiin ja värjättiin liuoksella, joka sisälsi 10% formaldehydiä, ja 1% kristalliviolettia, ja ne, joilla on vähintään 50 solut laskettiin kahden riippumattoman sokkoutettua tutkijat. Pesäkkeiden lukumäärä kolmesta toistokokeesta saadut laskettiin keskiarvo kullekin tilalle. Nämä keskiarvot korjattiin mukaan pinnoitus tehokkuuden verrokkeihin nähden laskea solusäilyvyyden kutakin annostasoa. Lineaarinen asteen yhtälö sovitettiin tietokokonaisuuksien tuottaa eloonjäämiskäyrien, ja annos lisälaite kerroin laskettiin 10% eloonjääntifraktio (DEF 0.1).

Tilastollinen

väliset korrelaatiot ydin- /sytoplasmista värjäytymistä tasot ja kliinis tekijöitä arvioitiin Studentin t-testiä, Chi square testiä tai Fisherin testi vastaavasti. Mann-Whitney

U

-testin ja Opiskelijan t- testiä käytettiin vertaamaan ero biologista käyttäytymistä välillä transfektoitujen solujen ja ohjaus soluja. Analysoitaessa selviytymisen, Kaplan-Meierin eloonjäämisen konstruoitiin ryhmille perustuvat yhden muuttujan ennustajia ja eroja ryhmien välillä testattiin log-rank-testi. Niille muuttujat tilastollisesti merkitsevä yhden muuttujan analyysin Coxin suhteellisten riskien mallia kanssa uskottavuusosamäärä käytettiin lisäarviointia monimuuttujaisesta selviytymisen analyysin. P-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen JMP 10 (SAS Institute Inc., Cary, NC).

Tulokset

YAP proteiinin ilmentymisen ensisijainen EMCA kudoksissa

Voit selvittää YAP ilmaistaan ihmisen EMCA, YAP proteiinin ilmentymisen ensisijainen EMCA kudoksissa arvioitiin immunohistokemiallisesti. Edustaja mikroskooppivalokuvat osoittavat ydin- ja sytoplasman YAP ilmentyminen on esitetty kuviossa S1. Koska solunsisäinen lokalisaatio YAP pidetään yleisesti tärkeänä sen onkogeenisten toiminta [42], sekä ydin- ja sytoplasmista värjäytymistä tasot analysoitiin ja pisteytettiin intensiteetti käyttäen 5 pisteen asteikolla (0-4). Demografiset tiedot ja YAP värjäys tasolla vertaamalla tyypin 1 ja 2 EMCA on koottu taulukkoon 1. tyypin 2 EMCA oli korkeammat vaiheessa tiheämmin Lvsi ja postoperatiivisen etäpesäke /toistuminen, ja korkeammat ydinvoiman YAP ilmaisu verrattuna tyypin 1 EMCA. Seuraavaksi me arvioineet korrelaatio kliinis tekijöiden ja YAP värjäys tyypin 1 ja tyypin 2 EMCA, yksilöllisesti. Kuten taulukosta 2, korkeammat ydinvoiman YAP ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä korkeampaan palkkaluokkaan, patologinen vaiheessa Lvsi ja postoperatiivinen toistuminen /etäpesäke tyypin 1 EMCA (p = 0,019, = 0,028, = 0,0008, = 0,046, tässä järjestyksessä). Mitään merkittävää assosiaatio ydin- YAP ilmaisun ja näiden muuttujien havaittiin tyypin 2 EMCA (taulukko S1). Sytoplasminen ilmentyminen YAP ei liittynyt kliinis tekijät joko tyypin 1 tai tyypin 2 syöpiä (tuloksia ei ole esitetty). Kaplan-Meier eloonjäämisennusteet osoitti, että lisääntynyt ydinvoiman immunoreaktiivisuus YAP oli merkitsevästi yhteydessä huonompi eloonjäämiseen tyypin 1 syöpään. (P = 0,015, log-rank testi, kuvio 1). Univariate analyysi osoitti pitkälle ja läsnäolo Lvsi myös korreloi huono kokonaiselinaikaa (p = 0,0005 ja 0,003, log-rank testi, vastaavasti, kuvio S2). Ei ollut mitään korrelaatiota eloonjäämiseen ja YAP sytoplasmista värjäytymistä tyypin 1 EMCA tai YAP ydin- /sytoplasman tahra tyypin 2 EMCA (kuva S3). Monimuuttuja Coxin suhteellisen vaarat regressioanalyysi että pidetään vaiheessa, Lvsi ja ydinvoiman YAP tasolla vain ydin- YAP taso (pisteet 2/3/4 vs. pisteet 0/1) oli itsenäisesti liittyy yleiseen eloonjäämiseen (p 0,021). Tuloksemme osoittivat, että ydinvoiman YAP liittyy huono ennustetekijöiden ominaisuuksia ja pieneni selviytymisen tyypin 1 EMCA.

Lisääntynyt ydin- immunoreaktiivisuus YAP oli merkitsevästi yhteydessä huonompi kokonaiselinaikaa (P = 0,015, log-rank-testi).

YAP proteiinin ilmentymistä EMCA solulinjoissa

päästääkseen paremmin sisälle biologiseen roolit YAP vuonna EMCA, päätimme käyttää kolmea tyyppiä 1 EMCA solu linjat; HEC-1-A, HEC-1-B ja Ishikawa. Ensin arvioitiin proteiinin tasot YAP ja fosfo-YAP (inaktiivinen YAP) (kuvio 2A). HEC-1-B osoitettiin huippunimistä koko YAP ja hyvin alhainen toimeton fosfo-YAP western blottauksella. Sen sijaan, HEC-1-A ilmaisi alhaisin koko YAP ja korkeimman toimeton fosfo-YAP. Immunofluoresenssikoe vahvisti korkea ydin- ja sytoplasman YAP in HEC-1-B-solujen ja alhainen ydin- ja sytoplasman YAP in HEC-1-A-soluissa, sopusoinnussa tulosten Western blotting (kuvio 2B). Siksi HEC-1-B-soluja käytetään menettämisestä toiminnon kokeilu, ja kääntäen HEC-1-A-soluja käytettiin voitto-of-function kokeilu.

(A) Expression of YAP ja fosfo-YAP (Ser127) kolmessa EMCA solulinjojen western blottauksella. (B) Immunofluoresoivat sytokemiallisten värjäys endogeenisten YAP käyttäen anti-YAP vasta-aine (YAP: vihreä, DAPI: sininen).

YAP Knockdown vuonna EMCA soluissa

laajentaa immunohistokemiallinen tulokset osoittavat korrelaatio ydin- YAP ja huono ennustetekijöiden ominaisuuksia EMCA potilailla, määritimme vaikutuksia YAP knockdown soluproliferaatioon käyttäen YAP-erityisiä siRNA (siYAP) ja ohjaus siRNA (siCont) in HEC-1-B EMCA soluissa. Endogeeninen ilmentyminen Luskuttaa proteiinin estää tehokkaasti 72 ja 96 tuntia sen jälkeen, kun ohimenevän transfektion siRNA (kuvio 3A). Soluproliferaatiota oli merkittävästi vähentynyt YAP inhiboi solujen kontrolliin verrattuna solujen 26,2% (72 tuntia) ja 42,9% (96 tuntia), vastaavasti (kuvio 3A). Tämä samanlaista kasvua estävä vaikutus soluproliferaatioon vahvistettiin käyttäen vaihtoehtoista YAP siRNA-sekvenssin (tuloksia ei ole esitetty).

(A) esti proteiinin ilmentymistä YAP Yap-spesifisten siRNA (siYAP) varmistettiin western blotting sekä 72 ja 96 tuntia transfektion jälkeen (vasemmalla). Useita elävien solujen välillä 24-96 tuntia transfektion jälkeen siYAP tai ohjaus siRNA (siCont) arvioitiin HEC-1-B-solut käyttämällä vesiliukoista tetratsoliumsuolaa määritys (Cell laskenta kit-8) (oikealla). 26,2% ja 42,9% soluproliferaation inhibointi vahvisti knockdovvn YAP ilmaisun 72 ja 96 tuntia, vastaavasti. (* P 0,05 (Mann-Whitney U-testi)). Tulokset esitetään keskiarvo ± keskihajonnat (palkit) neljänä kokeissa. Samanlaisia ​​suuntauksia saatiin muissa kahdessa riippumattomassa kokeessa. (B) määrä pesäkkeiden pehmeässä agarissa verrattiin välillä YAP esti solujen ja kontrollisolujen arvioida kiinnittymisestä riippumatonta solukasvua HEC-1-B-solujen. Edustavia kuva muodostivat pesäkkeitä pehmeässä agarissa (vasemmalla). Kvantitatiivinen analyysi useissa muodostivat pesäkkeitä (oikealla), joka osoittaa merkittävä lasku siYAP transfektoiduissa soluissa. (* P 0,05 (Mann-Whitney U-testi)). Pylväät ja palkit ovat keinot ja keskihajonta sextuplicate kokeita. Samanlaisia ​​suuntauksia saatiin toisessa erillisellä kokeella. (C) TranswellTM maahanmuutto- ja invaasiomääritys. Edustavia kuva siirtynyt /tunkeutuneet HEC-1-B-solujen (vasemmalla). Kvantitatiivinen analyysi kuinka monen /tunkeutuneet soluja (oikealla), joka osoitti merkittävää vähenemistä siYAP transfektoiduissa soluissa. (* P 0,05 (Mann-Whitney U-testi)). Pylväät ja palkit ovat keskiarvo ja keskihajonta neljänä kokeita. Samanlaisia ​​suuntauksia saatiin toisessa erillisellä kokeella. (D) virtaussytometrinen analyysi. Edustavia tuloksia väestöstä kussakin vaiheessa solusyklin in HEC-1-B EMCA solut 72 ja 96 tunnin kuluttua transfektiosta siCont /siYAP (vasemmalla). Kvantitatiivinen analyysi väestön kussakin vaiheessa (oikealla). siYAP transfektoidut solut osoittivat merkittävää kerääntymistä solujen G0 /G1 vaiheeseen ja pienensi merkitsevästi S ja G2 /M vaiheiden 72 ja 96 tuntia (* P 0,05, ** P 0,001, Opiskelijan t- testi). Pylväät ja palkit ovat keskiarvo ja keskihajonta kolmena kappaleena kokeita. Samanlaisia ​​suuntauksia saatiin toisessa erillisellä kokeella.

määräytyy myös roolia YAP in kiinnittymisestä riippumaton solujen kasvua, muuttoliikkeen ja invaasio kyky, yleisesti pidetään ominaisuudet pahanlaatuisten transformoitujen solujen. Pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritykset, knockdovvn YAP in HEC-1-B-solujen vähentynyt kyky pesäkemuodostuksen kontrollisoluihin verrattuna (p = 0,015, kuvio 3B). In solumigraation /invaasion määrityksissä, merkittävä lasku solujen määrä, jotka kulkeutuivat /tunkeutuu läpi päällystämätön /Matrigel-pinnoitettu kalvojen havaittiin siYAP transfektoiduissa soluissa verrattuna siCont transfektoituja soluja (p 0,05, kuvio 3C). Nämä kokeet osoittavat, että YAP ilmentyminen liittyy solujen lisääntymistä, ankkurointi riippumattoman kasvun ja muuttoliike /invaasion potentiaalia tällä EMCA solulinjassa.

Solusyklianalyysiä vuonna EMCA soluissa

Voit selvittää kasvun estäminen aiheuttama YAP pudotus aiheutti muutoksia solusyklissä, virtaussytometria-analyysi suoritettiin HEC-1-B-EMCA transfektoitujen solujen YAP-spesifisiä ja ohjaus siRNA. Yhdenmukainen tulokset Soluproliferaatiomäärityksiä siYAP käsiteltiin HEC-1-B-solujen osoitti merkittävää kerääntymistä solujen G0 /G1 vaiheen ja merkittävää laskua S ja G2 /M-vaiheisiin 72 ja 96 tuntia, verrattuna siCont käsiteltyjen solujen (Kuva 3D). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että YAP Knockdown tuottaa G0-G1 solukierron pysähtymisen tässä EMCA solulinjassa.

YAP yli-ilmentymisen EMCA soluissa

Koska meillä johtuu menettämisestä toiminnon määritykset, me arveltu, että yliekspressio YAP in EMCA solujen alhaisen endogeenisen YAP tasolle lisäisi solujen lisääntymistä. Olemme tutkineet kyky muodostaa pesäkkeitä jälkeen ohimenevän transfektion YAP ilmentävien konstruktien HEC-1-A-soluja, jotka osoittivat suhteellisen alhainen YAP ja korkea fosfo-YAP (kuvio 2). Yliekspressio GFP-merkityn villityypin YAP ja GFP-leimatun konstitutiivisesti aktiivinen S127A mutantin YAP in HEC-1-A-soluissa varmistettiin western blottauksella (kuvio 4A). Solut yli-ilmentävät WT-YAP tai S127A-YAP tuotetaan merkittävästi enemmän pesäkkeitä verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu ohjaus tyhjällä vektorilla (EV). Vaikka S127A-YAP transfektoidut solut tuottivat eniten pesäkkeitä, merkitsevä ero ei havaittu verrattuna WT-YAP transfektoiduissa soluissa (kuvio 4B). Nämä tulokset tukevat edelleen rooli YAP solujen leviämisen EMCA.

(A) Endogeeninen ilmentymä YAP (noin 65 kDa) ja eksogeenisen ilmaus YAP koodattu GFP-proteiinia (noin 92 kDa yhteensä) in HEC -1-A-soluja, jotka on transfektoitu villin tyypin YAP (WT-YAP) ja S127A mutantti YAP (S127A-YAP). (B) edustaja kuva pesäkemuodostusta (vasemmalla). Solut transfektoitiin lyhytaikaisesti tyhjällä vektorilla (EV) /WT-YAP /S127A-YAP ja valitaan asianmukaiset konsentraatiot G418 neljä viikkoa. Lääke-resistenttien pesäkkeiden muodostettu YAP-transfektoidut solut olivat merkittävästi lukuisia kontrolliin verrattuna (Mann-Whitney U-testi). Pylväät ja palkit ovat keskiarvo ja keskihajonta neljänä kokeita. Samanlaisia ​​suuntauksia saatiin toisessa erillisellä kokeella.

rooli YAP moduloinnissa säteilyherkkyydestä

Kun otetaan huomioon sädehoitoa EMCA hoidossa ja äskettäin julkaistuja tietoja syytetään YAP moduloimaan säteily herkkyys medulloblastooma soluja, seuraavan kerran määritti YAP säteilystä herkkyys EMCA soluissa käyttäen klonogeenisten -eloonjäämiskoe. Knockdovvn YAP ilmentymisen siRNA vähennetään klonogeeniset eloonjäämisen HEC-1-B-solut, jolloin kasvu säteilyherkkyydestä kanssa DEF 0,1 1,36 (kuva 5). Erityisesti 90% solukuolemaa säteilyaltistuksen siYAP transfektoiduissa soluissa tarvitaan 3,48 Gy, kun taas samantasoinen solukuoleman siCont transfektoiduissa soluissa tarvitaan 4,72 Gy. Siksi tuloksemme osoittavat lisääntynyt herkkyys säteilylle menettäminen YAP ilmentymisen HEC-1-B EMCA soluissa.

knockdovvn YAP ilmentymisen siRNA vähennetään klonogeeniset eloonjäämisen HEC-1-B-solut, mikä johtaa kasvaa säteilyherkkyydestä annoksella lisälaite kerroin 10% eloonjääminen (DEF 0,1) 1,36. Tulokset esitetään keskiarvo ± keskihajonnat (palkit) kolmena kappaleena kokeissa. Samanlaisia ​​suuntauksia saatiin muiden kolmen erillisen kokeen.

Keskustelu

data tunnistaa kasvaimia synnyttävän toiminnot YAP in EMCA. Hippo polku, erityisesti suora alkupään säädin, LATS1 /2, negatiivisesti moduloi YAP aktiivisuus fosforylaatio sen S127-sivuston. Fosforyloitua-YAP erotellaan sytoplasmassa ja suunnattu ubikitiinistä välittämän proteolyysin [43], [44]. Siksi solunosasijaintia YAP on pidetty ratkaiseva merkitys sen biologisia toimintoja erilaisissa syövissä [42]. Nuclear YAP ekspressiota huono prognostinen markkeri on osoitettu muiden syöpien, kuten ruokatorven, mahalaukun ja munasarjojen [22], [28], [31], [32].