Krooninen sairaus

tiivistelmä

TRAIL on kuolema reseptoriligandiin joka indusoi solukuolemaa edullisesti kasvainsoluissa. Rekombinantti liukoinen TRAIL kuitenkin toimii huonosti kuin syövän terapeuttisia, koska oligomerointi tarvitaan voimakas biologinen aktiivisuus. Olemme aiemmin luotu diabodi muoto kasvaimeen kohdennettua TRAIL kutsutaan Db

αEGFR-scTRAIL, joka käsittää yksijuosteisen TRAIL molekyylejä (scTRAIL) ja vaihtelevat domeenit humanisoidun variantin EGFR estävän vasta-aineen Setuksimabia. Tässä me määrittelemme bioaktiivisuus Db

αEGFR-scTRAIL osalta sekä EGFR eston ja TRAIL reseptorin aktivoinnin 3D viljelmistä Caco-2 peräsuolen syövän solut, jotka ilmentävät villityyppistä K-Ras. Verrattuna perinteisiin 2D kulttuureissa, Caco-2-solut näkyvät voimakkaasti herkempiä kohti D b

αEGFR-scTRAIL näissä 3D kulttuureissa. Osoitamme, että vasta-osa Db

αEGFR-scTRAIL paitsi tehokkaasti kilpaili ligandin indusoiman EGFR-toiminto, mutta myös määrittää apoptoottisen vasteen nimenomaan ohjaamalla D b

αEGFR-scTRAIL EGFR-positiivisten solujen. Ja selvittää, kuinka poikkeavasti aktivoitu K-Ras, joka johtaa Setuksimabia vastus, vaikuttaa D b

αEGFR-scTRAIL herkkyys, me syntyy vakaa Caco-2tet solujen indusoitavasti ilmentävät kasvaimia synnyttävän K-Ras

G12V. Kun läsnä on doksisykliini, nämä solut osoittivat lisääntynyttä resistenssiä Db

αEGFR-scTRAIL, liittyy kohonnut ilmentyminen anti-apoptoottisten proteiinien cIAP2, Bcl-xL: n ja Flip

S. Co-hoito solujen kanssa Smac jäljittelevää SM83 palautti Db

αEGFR-scTRAIL aiheuttama apoptoottisen vasteen. Tärkeää on, tämä synergia D b

αEGFR-scTRAIL ja SM83 myös käännetty 3D viljelmät onkogeenisten K-Ras ilmentävien HCT-116 ja LoVo peräsuolen syövän soluja. Meidän löydökset tukevat käsitystä, että D b

αEGFR-scTRAIL terapia yhdistettynä apoptoosin herkistävä aineita voidaan lupaava hoitoon EGFR-positiivisten ja peräsuolen syöpiä, riippumatta niiden

KRAS

tila.

Citation: Möller Y, Siegemund M, Beyes S, Herr R, Lecis D, Delia D, et al. (2014) EGFR-Kohdennetut TRAIL ja Smac Mimeettien synergize voittaa apoptoosiresistenssiin in

KRAS

Mutant peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 9 (9): e107165. doi: 10,1371 /journal.pone.0107165

Editor: John Souglakos, University General Hospital Heraklionin ja laboratorio kasvain solubiologian, School of Medicine, University of Kreeta, Kreikka

vastaanotettu: kesäkuu 2, 2014; Hyväksytty: 04 elokuu 2014; Julkaistu: 08 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Möller et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ rahoitettiin Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; https://www.bmbf.de/) e: Bio avustus ”PREDICT” MAO, RK ja KP. RH ja TB tukee Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; https://www.dfg.de/) kautta Collaborative tutkimuskeskuksen 850 ja Excellence aloite BMBF kautta EXC 294 BIOSs. TB ja MAO tuetaan Heisenberg ohjelma DFG. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: DL ja DD ovat keksijöiden patentin WO /2013/124701 (PCT /IB2012 /000297: ”homo- ja heterodimeeriproteiinia SMAC mimeettiyhdisteiden apoptoosin indusoijia). KP ja RK ja MS ovat keksijöiden patentin CA2831820 A1 (PCT /EP2012 /001426: ”Rekombinantti TNF-ligandin perheenjäsen polypeptidien vasta-sitovan domeenin ja niiden käyttöjä”). KP on konsultti ja on saanut kaupallisia tutkimusrahoitusta Pk. RK on konsultti ja on saanut kaupallisia tutkimusrahoitusta BioNTech. Kirjoittajat vahvistavat, että tämä ei muuta niiden noudattamista kaikkien PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti ja erityisesti joilla on pitkälle edennyt CRC eloonjäämisluvut ovat alhaiset [1]. Lisäksi kemoterapia, kohdennettuja hoitomuotojen ovat tulleet klinikalla. Tällä hetkellä EGFR (epidermaalisen kasvutekijän reseptori) estävien vasta-aineiden Setuksimabia ja Panitumumabi on hyväksytty metastaattisen CRC yhdessä kemoterapian tai huolto hoito kemoterapia-tulenkestävät kasvaimia [2], [3].

EGFR, joka tunnetaan myös nimellä erbB1 tai HER1, liittyy patogeneesiin erilaisissa ihmisen epiteelin syövät. Tämä reseptori tyrosiinikinaasin käsittää ekstrasellulaarisen ligandia sitovan domeenin, yhden membraania sivuavia alueella, ja sytoplasminen tyrosiinikinaasidomeeni [4], [5]. Kun ligandien kuten EGF ja TGF-α, reseptoriin homo- ja heterodimerizes suosivasti perheenjäsen ErbB2 /HER2 johtaa reseptorin aktivoitumisen ja transphosphorylation tiettyjen tyrosiinien sisällä sytoplasman hännät. Nämä phosphotyrosines tarjoavat telakointikohtina solunsisäisiä molekyylejä, jotka laukaisevat MAPK ja PI3K reittejä, jotka välittävät biologiset vasteet kuten solujen lisääntymisen, migraation ja selviytyminen [5], [6]. Setuksimabi kilpailee EGFR ligandien reseptorin sitoutumiselle, mikä tukahduttaa reseptorin fosforylaation ja aktivaation alavirran signalointia [1].

Eri geneettisiä muutoksia löytyy CRC rajoittaa tehoa anti-EGFR hoitoja. Lähes 40% kaikista CRC tapauksista satama aktivoivia mutaatioita

KRAS

geeni. Reseptorityrosiinikinaasin signalointi suppenee tasolla pienten GTPaasi Ras, mestari säädin sekä, MAPK ja PI3K polkuja. Yleisin mutaatiot kodonissa 12 tai 13, jotka johtavat konstitutiiviseen Ras aktivointia, ja näin ollen vähennetään tai ei vastausta Setuksimabia hoitoon [7], [8].

TRAIL (tuumorinekroositekijä liittyviä apoptoosi- indusoiva ligandi) on kuolemaan ligandi, joka indusoi apoptoosia edullisesti kasvainsoluissa kautta syöttämällä reseptorien TRAILR1 ja TRAILR2, joka tunnetaan myös nimellä DR4 ja DR5, vastaavasti [9]. Sitovat TRAIL laukaisee reseptorin oligomerisaatioaste seuraa rekrytointi adaptoriproteiineja ja muodostumista kuoleman aiheuttavia signalointikompleksiin. Tämä johtaa lopulta aktivointi initiaattorin kaspaasien ja peräkkäisen aktivoinnin efektori kaspaasien, jolloin apoptoottisen solukuoleman [10]. Kliiniset kokeet käyttämällä yhdistelmä TRAIL vahvisti alhainen myrkyllisyys normaalia kudosta, mutta terapeuttiset vaikutukset olivat riittämättömiä [11], [12]. Voittaa nämä rajoitukset proteiinitekniikka lähestymistapoja, joilla pyritään parantamaan bioaktiivisuus säilyttäen kasvain valikoivuus. Oikeat trimerisaatiodomeeni ja sinkki koordinointi rekombinantin TRAIL näyttää olevan ratkaiseva biologiselle aktiivisuudelle [13]. Näin ollen suunnittelu yhden polypeptidiketjun, joka käsittää solunulkoisen domeenin kolme TRAIL monomeerien (scTRAIL) tehostettu bioaktiivisuutta rekombinanttimolekyylin [14]. Tällaisia ​​molekyylejä voidaan lisäksi fuusioida vastaisia ​​vasta-aineita kasvaimen merkkiaineita. Osoitimme aikaisemmin, että fuusio scTRAIL on yksiketjuinen vasta-aine fragmentti (scFv) toiminnallisesti matkia luonnon kalvoon sitoutuneen TRAIL ja oli tehokkaampi kuin scTRAIL yksinään [14]. Ottamalla käyttöön diabodyn kokoonpano perustuu humanisoidun vaihtelevien alueiden Setuksimabi (Db

αEGFR-scTRAIL) johti vielä korkeamman bioaktiivisuus Rekombinantti TRAIL sekä in vitro että in vivo, kuten nähdään voimakas väheneminen kasvaimen koon ja pitkittynyt selviytyminen nude-hiirten kuljettaa Colo205 ksenografteja [15].

sen lisäksi kasvaimen suunnattu vaikutus, EGFR-suunnatun vasta-aineen osan sisällä Db

αEGFR-scTRAIL molekyyli voi aktiivisesti vaikuttaa EGFR-toiminto, kun samanaikaisesti stimuloivan apoptoosin. Leikellä osuus EGFR saarto bioaktiivisuutta Db

αEGFR-scTRAIL käytimme EGFR-positiivisten Caco-2 CRC solulinjaa, joka satamat mutaatiot APC, p53, ja Smad4 mutta on villityyppinen varten MAPK ja PI3K reittejä [16]. Matkia tarkemmin in vivo tilanteessa, Caco-2-soluja kasvatettiin 3D kollageeni /matrigeeliä kulttuureissa, joissa ne muodostavat täysin eriytetty polarisoitunut kystat [17]. Kasvuolosuhteet tiedetään vaikuttavan tasapainon säilymiseen ja apoptoosin signaaleja, mikä korostaa tarvetta opiskeluun lääkehoitoa ja resistenssimekanismeja paitsi perinteisissä 2D kulttuureissa [18]. Todellakin, tuloksemme osoittavat, että viljely Caco-2 solujen 3D matriisissa tekee solujen TRAIL-herkkien. Me osoittavat lisäksi, että EGFR signalointi edistää Caco-2-solujen lisääntymisen ja voidaan estää farmakologinen EGFR esto. Tärkeys EGFR-spesifisen vasta-aineen osan tehokkaaseen kohdentamiseen Db

αEGFR-scTRAIL alleviivaa se, että alhainen EGFR tasoja luonnehtivat solu alaryhmästä joka selviytyy D b

αEGFR-scTRAIL hoitoa. Vaikka herkkä EGFR saarto sinänsä, EGFR-positiivisten Ras mutantti CRC solut kohdennettuja ja herkistyneet Db

αEGFR-scTRAIL aiheuttaman apoptoosin samanaikainen hoito kanssa Smac jäljittelevää SM83. Voimakas sytotoksinen aktiivisuus Db

αEGFR-scTRAIL paljasti tässä tutkimuksessa näin antaa tukea sen kehittämiseksi edelleen anti-syövän terapeuttista hoitoa varten CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja reagenssit

vasta-aineita käytettiin monoklonaalisia kanin anti-pEGFR (Y1068) (1:1000), monoklonaalinen kanin anti-kaspaasi-3 (1:1000), kanin polyklonaalista anti-TRAILR2 (1:500), polyklonaalista kanin anti-Perk (T202 /Y204) (1:1000), monoklonaalinen kanin anti-Pakt (T308) (1:1000), polyklonaalinen kaniinin anti-cIAP1 (1:1000), monoklonaalinen kanin anti-cIAP2 (1:1000 ), monoklonaalinen hiiren anti-ERK (1:1000), monoklonaalinen hiiren anti-AKT (pan) (1:1000), monoklonaalinen hiiren anti E-kadheriinin (1:250), monoklonaalinen hiiren anti-Smac (1:1000), polyklonaaliset kanin anti-Bcl-2 (1:1000), monoklonaalinen kanin anti-Bcl-xL: n (1:400) ja monoklonaalisia kanin anti-surviviiniperäisten (1:1000) (kaikki Cell Signaling, Danvers, MA, USA), monoklonaalinen hiiren anti-XIAP (1:400), monoklonaalinen hiiren anti-Ras (1:200) (BD, CA, SanJose, USA), monoklonaalinen hiiren anti-kääntää /L (1:400) ja polyklonaalista kanin anti-TRAILR1 (1 :1000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), monoklonaalinen hiiren anti-EGFR (1:500) (Thermo Scientific, Fremont, MA, USA), monoklonaalinen hiiren anti-alfa-tubuliinin (1:5000) (Sigma -Aldrich, St Louis, MO, USA), ja hiiren monoklonaalinen anti-GFP (1:1000) (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa). HRP-leimatut sekundääriset anti-hiiri ja anti-kani-IgG-vasta-aineita (1:10000) olivat GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Alexa Fluor 488- ja 546-leimatut sekundääriset anti-hiiri ja anti-kani-IgG-vasta-aineita (1:500) ja Alexa Fluor 633-leimattua phalloidin (1:100) oli Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). DAPI oli Sigma-Aldrich, Z-VAD-FMK oli Bachem AG (Bubendorf, Sveitsi), ja Setuksimabia Merckiltä (Darmstadt, Saksa). Db

αEGFR-scTRAIL tuotettiin HEK293-soluissa ja puhdistettiin soluviljelmän supernatanteista [15]. Synteesi ja puhdistus SM83 on kuvattu aiemmin [19], [20].

Soluviljely

Caco-2, HCT-116, ja LoVo solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 (Invitrogen ), ja Caco-2tet solut DMEM (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% FCS: ää (PAA Laboratories, Cölbe, Saksa). Solulinjoja inkuboitiin kostutetussa atmosfäärissä, 5% CO

2 37 ° C: ssa. Kasvua riippuva määrityksissä-soluja viljeltiin alustassa, joka sisälsi 2% FCS: ää plus 10 ng /ml EGF: ää (Sigma-Aldrich) ja TGF-α (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA). Kasvun 3D, solut ympättiin sängyssä kasvutekijän vähentää matrigeeliä (BD) ja PureCol-S kollageenia (Advanced Biomatrix, San Diego, CA, USA) (01:01), ja peitettiin kasvualustaa, joka sisälsi 2% matrigeeliä. Lumen laajennus aiheutettiin lisäämällä 100 ng /ml choleratoxin (CTX; Sigma Aldrich) päivänä 3 ymppäämisestä.

Generation of Caco-2tet Ras

G12V solujen

pTet /

KRAS

G12V-IRES-GFP-BSR-ekspressiovektoriin, joka sallii doksisykliini-indusoituvan ilmentymisen K-Ras

G12V, syntyi talteen K-Ras

G12V avoimen luku- kehys pBabe-K-Ras

G12V (Addgene) by

BamHI

I-digestiolla, jota seurasi insertoimalla

Bgl

II-linearisoituun pMIG vektori [21]. Saatu K-Ras

G12V-IRES-GFP-kasetti monistettiin PCR: llä käyttämällä oligonukleotideja, jotka sisältävät reunustavat

Ei

I sivustoja, joita käytettiin subkloonaamista PSC-A-amp /kan (Stratagene, La Jolla , CA, USA). Sen jälkeen, K-Ras

G12V-IRES-GFP-kasetti kloonattiin kautta

Ei

I-digestiolla osaksi pTet-bsr vektori [22], jolloin saatiin pTet /K-Ras

G12V-IRES- GFP-BSR. Saavuttaa doksisykliini-indusoituvan ilmentymisen onkogeenisten K-Ras, Caco-2tet soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti doksisykliini-indusoituvan järjestelmän osat rtTA ja RTT [21], transfektoitiin

Ahd

I-linearisoitu pTet /K- Ras

G12V-IRES-GFP-bsr vektori elektroporaatiolla. Seuraavat valinta blasticidine S (5 ug /ml) ja puromysiiniä (5 ug /ml), jotka kestävät solujen altaat seulottiin tehokkaan induktion K-Ras

G12V ilmaisua. Siirtogeenin ilmentyminen indusoitiin lisäämällä 2 ug /ml doksisykliiniä (Merck).

FACS-analyysi

Analyysi siirtogeenin ilmentymisen Caco-2tet soluissa suoritettiin sen jälkeen, kun 72 DOX hoidon. Solut pestiin, suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 2% FCS: ää ja 0,01% natriumatsidia, ja analysoitiin käyttäen EPICS FC500 (Beckman Coulter, Krefeld, Saksa). Hankinnan jälkeen data-analyysi suoritettiin käyttäen FlowJo ohjelmistoa (Puu Star, Ashland, OR, USA).

Western blotting

Solut lyysattiin RIPA-puskuriin (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% Triton-X 100, 0,5 natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 1 mM natriumortovanadaatti, 10 mM natriumfluoridia ja 20 mM β-glyserofosfaatti plus Complete-proteaasi-inhibiittorit (Roche)). 3D lysaatit, soluja viljeltiin puhtaita Matrigelillä ilman kollageenia. Sferoidit eristettiin 4 päivän kuluttua käyttäen Cell Recovery Solution (BD) ja lyysattiin RIPA puskuriin. Lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla, yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris Gel, Invitrogen) ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille (iBlot Gel Transfer pinot; Invitrogen). Membraanit blokattiin 0,5% blokkausreagenssia (Roche) PBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Tween-20, ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla, minkä jälkeen HRP-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita. Visualisointi tehtiin ECL tunnistusjärjestelmä (Pierce, Rockford, IL, USA).

MTT, sytotoksisuus, ja kaspaasi 3/7 aktiivisuusmääritysten

2D kulttuureissa, 2,5 x 10

3 solua /kuoppa 100 ul: ssa väliaineessa maljattiin päällystämättömän 96-kuoppaisille levyille. 3D kulttuureissa, 5 x 10

3 solua /kuoppa ympättiin matrigeeliä /kollageenipäällysteisiin 96-kuoppaisille levyille 100 ul väliaineessa, joka sisälsi 2% matrigeeliä. Elinkyky määritettiin lisäämällä 10 ui 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2yl-) 2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT, Roth, Karlsruhe, Saksa) liuosta (5 mg /ml), jota seurasi inkubointi 3 tuntia. Solut hajotettiin lisäämällä 100 ui 50% dimetyyliformamidia, joka sisälsi 10% SDS: ää ja absorbanssi mitattiin 570 nm: ssä käyttäen multimode lukijan Infinite 200 PRO (Tecan, Männedorf, Sveitsi). Sytotoksisuus mitattiin käyttämällä CytoTox-Glo Sytotoksisuusmääritys Promega (Madison, WI, USA). Aktiivisuus kuolleiden solujen proteaasin viljelmän määritettiin lisäämällä 50 ui luminogeenisen substraattia. Sen jälkeen kun 15 minuutin inkuboinnin RT: ssä, luminesenssi mitattiin käyttäen multimode lukijan Infinite 200 PRO (Tecan), jota seurasi solun hajoaminen ja mittaus koko luminesenssin normalisoinnin.

kaspaasi 3/7 aktiivisuus määritettiin käyttäen Caspase- Glo3 /7 Pitoisuus Promega (Madison, WI, USA) lisäämällä 70 ui luminogeenisen substraattia, joka sisältää DEVD-sekvenssin. 30 minuutin inkuboinnin RT, luminesenssi mitattiin käyttäen multimode lukijan Infinite 200 PRO (Tecan).

Tunel-värjäys

DNA katkeamisen analysoitiin in situ solukuoleman havaitseminen pakki (TMR ) Roche. Solut kiinnitettiin 4% PFA: ssa 1 h RT: ssä ja tehtiin läpäiseviksi 0,1% Triton-X-100 0,1% natriumsitraattia 2 minuuttia huoneenlämpötilassa. Leimaus suoritettiin valmistajan protokollan 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Tumat vastavärjättiin DAPI. Objektilasit kiinnitettiin Fluoromount G (Southern Biotechnology, Birmingham, AL, USA) ja analysoitiin konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi (LSM 700, Zeiss, Oberkochen, Saksa). Kuvat prosessoitiin ZEN ohjelmisto (Zeiss). Tunel-positiiviset solut laskettiin käyttäen ImageJ (W. Rasband, National Institute of Health, USA; Version 1.48).

Immunofluoresenssimikroskopia

kasvaneet solut 3D Matrigelillä /kollageeni päällystetyt 8-kuoppaiset lasikammiota dioja (BD) fiksoitiin 4% PFA: ssa 15 minuutin ajan, permeabilisoitiin PBS: llä, joka sisälsi 0,1% Triton X-100: ssa 10 min ja pysäytettiin 5% vuohen seerumia (Invitrogen) PBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Tween-20. Sitten soluja inkuboitiin primaaristen vasta-aineiden estopuskurissa (2 h RT: ssa), pestiin PBS: llä, joka sisälsi 0,1% Tween-20, ja inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen estopuskurissa (2 h RT: ssa). F-Actin ja tumat vastavärjättiin Alexa Fluor 633-leimatun phalloidin ja DAPI. Objektilasit kiinnitettiin Fluoromount G ja analysoitiin konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi (LSM 700, Zeiss, Oberkochen, Saksa) käyttäen 488, 561 ja 633 nm: n virityksellä öljyllä objektiivit Plan-Apochromat 63x /1,40 DIC M27. Kuvat prosessoitiin ZEN ohjelmisto (Zeiss).

Tilastollinen

Data ilmaistaan ​​keskiarvona (± SEM), ja ”n” tarkoittaa määrää riippumattoman kokeen. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin t-testi, ja yksisuuntainen ANOVA seurasi Tukeyn testin jälkeen (GraphPad Prism versio 4.03; GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). p-arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä (* p 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001; ns, p 0,05).

Tulokset

3D matrigeeliä viljelmät, Caco-2-solut erilaistuvat polarisoitu kystat koostuu yhden solun, joka ympäröi keskiontelon [17], [21], mikä organotypic organisaation paksusuolen. Koska nämä solut ovat EGFR-positiivisia ja express villityypin Ras, ne edustavat ihanteellinen mallijärjestel- män yhdistetty vaikutus EGFR eston ja apoptoosin indusoiva aine kuten TRAIL. Ensin tehokkuuden testaamiseksi Db

αEGFR-scTRAIL, Caco-2-soluja viljeltiin kolmen päivän ajan 3D elatusaineessa, joka sisälsi 10% FCS: ää, ennen kuin lisättiin Db

αEGFR-scTRAIL seurasi MTT mittaukset kolme päivää myöhemmin. Näiden viljelmien, suhteellisen pieniä annoksia Db

αEGFR-scTRAIL aiheutti merkittävää vähentämistä solujen elinkelpoisuus, joka liittyy häiriöitä kystat ja muodostumista apoptoottisten kappaleiden (Fig. 1a, b), scTRAIL yksin tai yhdessä setuksimabi eivät ole pystyneet osoittamaan sytotoksisen vasteen Caco-2 3D viljelmät (Fig. S1), joka tukee aiempien tietojen diabodin välittämää dimeerirakenne Db

αEGFR-scTRAIL antaa erinomaisen bioaktiivisuus yli scTRAIL [15]. Mielenkiintoista on, että tavanomainen 2D soluviljelmissä muoville, Caco-2-solut olivat erittäin resistenttejä Db

αEGFR-scTRAIL hoitoa (Fig. 1a, b), linjassa aiemman raportin kanssa käyttäen yhdistelmä ihmisen TRAIL [23]. Esikäsittely Caco-2-3D ​​viljelmiä Z-VAD, pan-kaspaasi-inhibiittori, vähensi merkitsevästi sytotoksinen vaikutus Db

αEGFR-scTRAIL (Fig. 1 c), ja apoptoosin induktio Db

αEGFR- scTRAIL vahvistettiin analysoimalla DNA-fragmentoinnin Tunel-värjäys (Fig. 1 d, e). Lisäksi verrattuna 2D kulttuureissa annoksesta riippuvaa aktivaatio caspases 3/7 vastauksena Db

αEGFR-scTRAIL lisääntyi merkitsevästi 3D kulttuureissa (Fig. 1f). Tämä ero herkkyyttä D b

αEGFR-scTRAIL 3D vs. 2D viljelmiä ei voida osoittaa muutokset EGFR tai TRAILR1 /2 lauseke (Fig. 1 g, h). Valitettavasti, koska syötti reseptorit DcR1, DcR2 ei voitu havaita immunoblottaus vasta-aineiden käytettävissä, ilmaisu muutokset näiden reseptorien ei voitu sulkea pois. Analyysi keskeisten signalointireittien kävi ilmi, että 3D kulttuureissa, aktiivisuus PI3K koulutusjakso on tukahdutettu verrattiin kasvatettujen solujen 2D mitattuna fosfo-Akt tasoilla taas ERK /MAPK-reitin oli voimistunut katsottuna lisääntynyt ERK1 /2 fosforylaatio ( Fig. 1 g, h). Kuitenkin inhibitio PI3K jonka LY294002 2D viljelmissä ei ollut riittävä herkistää soluja Db

αEGFR-scTRAIL (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa monimutkaisempi tilanne 3D kulttuureissa. Yhdessä nämä tulokset korostavat vaikutus viljelmän olosuhteet soluvasteen kohti apoptoosia indusoivat aineet.

Soluja kasvatettiin 3D- tai 2D-elatusaineessa, joka sisälsi 10% FCS: ää. (A) Kolme vuorokautta kylvön, viljelmiä käsiteltiin Db

αEGFR-scTRAIL. Elinkelpoisuus mitattiin 72 tuntia myöhemmin MTT-määrityksellä ja normalisoitiin käsittelemättömään kontrolliin (n = 3). (B) vaiheen kontrasti kuvat 3D ja 2D viljelmät on kuvattu (a) käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla Db

αEGFR-scTRAIL 72 h (asteikko bar: 50 um). (C) Kolme vuorokautta kylvön, 3D viljelmiä esikäsiteltiin 20 uM Z-VAD kuten ennen lisäämällä 1 nM Db

αEGFR-scTRAIL. Elinkelpoisuus mitattiin 72 tuntia myöhemmin MTT-määrityksellä ja normalisoitiin käsittelemätön kontrolli (ut) (n = 3). (D) 24 h käsittelyn jälkeen solut kiinnitettiin ja värjättiin DNA-juosteen katkoksia. Tunel-positiiviset solut laskettiin (n = 2). (E) edustaja kuvia Tunel värjäykset kuvattu (d), Tunel-positiivisten solujen (punainen), DAPI (ytimet, sininen). Näkyy ovat confocal kohdat (asteikko bar: 100 pm). (F) Kolme vuorokautta kylvön, viljelmiä käsiteltiin 0,1 nM tai 1 nM Db

αEGFR-scTRAIL 24 tuntia. Kaspaasi 3/7 aktiivisuus mitattiin ja normalisoitiin kunkin käsittelemätön kontrolli (ut) (n = 3). (G) Neljä vuorokautta kylvön, lysaatit tuotettu ja analysoitiin immunoblottauksella. Näkyy on yksi edustaja blotti kolmen erillisen kokeen. Tubuliinia havaittiin latauskontrollina. Erityisiä nauhat on merkitty nuolenpäin. (H) kvantifiointi Western blotteja päässä (g). Proteiini tasot normalisoitiin vastaavaan tubuliinin valvonta; tasot 2D Viljelmät asetettiin 1 (n = 3).

tutkimme seuraavaksi, miten läsnä EGFR-ligandien vaikuttaa kasvua ja erilaistumista Caco-2-solujen 3D kulttuureissa. Solut siirrostettiin matrigeeliä viljelmissä, jotka sisälsivät matalan seerumia (2%), kun läsnä on EGF: n tai TGF-α, varmistetaan, että proliferaatio oli pääasiassa kautta EGFR signaloinnin. MTT toimintamittaukset kuuden päivän kuluttua viljelyn osoitti, että EGF: n ja TGF-α tehostettu leviämisen Caco-2-soluja verrattuna ohjaus kasvatettujen solujen matalan seerumin vasta (Fig. 2a). Mikroskooppinen analyysi osoitti, että EGF: n läsnäollessa ja TGF-α Caco-2 kystat olivat suurempia ja sisälsi enemmän soluja (Fig. 2b). Erityisesti, lisäämällä EGFR-ligandien ei häiritse erilaistumista, kuten on päätelty tyypillinen apikaalisella jakelu F-aktiini ja muodostumista soluvapaan ontelon (Fig. 2b). Ja selvittää, kuinka EGFR saarto vaikuttaa pohjapinta ja EGFR ligandin indusoiman proliferaation perustettu Caco-2 kystat, käsittelimme solut kolme päivää sen jälkeen kylvöön Setuksimabihoitoa (0,5 uM) ja analysoi kulttuurien kolme päivää myöhemmin. Kontrolliin verrattuna, näissä kulttuureissa MTT aktiivisuus hidastui merkitsevästi 35-50%, mutta solut olivat edelleen elinkelpoisia, ei osoittanut mitään merkkejä apoptoosin ja vain mitättömän lisääntynyt sytotoksisuus (Fig. 2C-E, S1D). Tämä osoittaa, että EGFR-aktivointi edistää pohjapinta proliferaatiota, mutta ei vaadita hengissä. Setuksimabi myös esti voimakkaasti proliferaatiota kun läsnä on EGF: n ja TGF-α katsottuna pelkistämällä MTT aktiivisuus ja pienentynyt koko kystat (Fig. 2c, d). Yhdessä nämä kokeet osoittavat, että leviäminen Caco-2 solujen 3D kulttuureissa voidaan ohjata EGFR signalointi ja on herkkä farmakologinen EGFR esto, ja voivat siten mahdollisesti tukahduttaa D b

αEGFR-scTRAIL.

Caco -2-soluja kasvatettiin 3D viljelmissä, jotka sisälsivät 2% FCS: n läsnä ollessa kasvutekijöiden (10 ng /ml) tai 2% FCS: ää vain (con). (A) Viljelmät analysoitiin MTT-määrityksellä päivänä 6 ja normalisoitiin ohjaus (n = 5). (B) Kolme vuorokautta kylvön 100 ng /ml CTX lisättiin aiheuttaa ontelon laajeneminen. Sferoidit kiinnitettiin päivänä 6 ja värjättiin phalloidin (F-aktiini) ja DAPI (ytimet). On esitetty konfokaali osien edustavan kysta (asteikko bar: 10 um). (C) Kolme päivää ymppäyksen jälkeen, 3D viljelmät jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin 0,5 uM Setuksimabia (Cet) 72 tuntia. Elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä ja normalisoitiin käsittelemätön kontrolli (ut). (N = 4) (d) Caco-2-3D ​​viljelmät jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin 0,5 uM Setuksimabia 72 h ja analysoitiin vaiheen mikroskopialla (asteikko bar: 50 um). (E) Kolme päivää ymppäyksen jälkeen, 3D viljelmät jätettiin käsittelemättä (ut) tai käsitelty 0,5 uM Setuksimabia (Cet) 72 tuntia. Sytotoksisuus määritettiin käyttäen CytoTox-Glo sytotoksisuusmääritys (n = 3).

EGFR aktivointi ei vain stimuloi soluproliferaatiota, mutta se voi myös suojata TRAIL-indusoidun apoptoosin [24]. Näin ollen, seuraavan kerran tutkia tehokkuuden Db

αEGFR-scTRAIL läsnä ollessa EGFR-ligandien. Immunoblottauksella lysaatit EGF- ja TGF-α-stimuloiduissa soluissa paljasti samantasoisen tukahduttaminen ligandin indusoiman EGFR fosforylaatiota joko Setuksimabia tai Db

αEGFR-scTRAIL esikäsittelyn (Fig. 3a, b), joka osoittaa tehokkaan kilpailun diabodin osan kanssa EGFR ligandien. Tämä voisi myös vahvistaa 3D viljeltyihin Caco-2-soluja stimuloitiin EGF (Fig. S2). Näin ollen, EGF: n ja TGF-α ei ollut suojaava vaikutus elinkelpoisuuden 3D (Fig. 3c) kuten ei myöskään näiden ligandien voi puuttua kaspaasi aktivaation (Fig. 3d), jotka osoittavat, että Db

αEGFR-scTRAIL aktiivisuus ei ole rajoittunut läsnäolo EGFR-ligandien. Ymmärtää tarkemmin resistenssimekanismeja kohti D b

αEGFR-scTRAIL, me uudelleen eristetty kystat käsittelemättömästä ja Db

αEGFR-scTRAIL saaneista 3D matrigeeliä kulttuureissa immunoblottaus solulysaateista (kuvio. 3f, g). Mielenkiintoista, lysaatit johdettu elossa kystat (Fig. 3e, nuolet) paljasti, että nämä D b

αEGFR-scTRAIL erottelua solut sisälsivät erityisen alhainen EGFR tasolle. Huomattavaa on, että TRAIL-reseptorin tasot näissä soluissa olivat samanlaisia ​​kuin käsittelemättömissä soluissa, mikä viittaa siihen, että jakelu EGFR solupopulaatiossa vaikuttaa voimakkaasti Db

αEGFR-scTRAIL herkkyys (Fig. 3f, g). Näin ollen vaikka diabodin osan ei aktiivisesti edistää apoptoosin ja pääasiallisesti on kasvua estävä toiminto Caco-2 3D kulttuureissa EGFR-suunnatun kohdistaminen on tärkeää lisätä paikallista TRAIL pitoisuuden ja laukaista tehokas apoptoottisen vasteen.

(a) Caco-2-soluja kasvatettiin 2D jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin 4 nM Db

αEGFR-scTRAIL tai 4 nM Setuksimabia 15 min ennen stimulaatiota EGF: n tai TGF-α (10 ng /ml) 10 min. Fosforyloidun ja koko proteiinit havaittiin immunoblottauksella. Näkyy on yksi edustaja blotti kolmen erillisen kokeen. Tubuliinia havaittiin latauskontrollina. (B) kvantifiointi Western blotit (a). Fosfo-EGFR tasot normalisoituivat vastaavaksi kokonaisproteiinin tasossa; tasot käsittelemätön kontrolli asetettiin 1 (n = 3). (C, d). Kolme päivää ymppäämisestä, Caco-2-3D ​​viljelmiä kasvatettiin puuttuessa tai läsnä kasvutekijöiden käsiteltiin 1 nM Db

αEGFR-scTRAIL. (C) Elinkelpoisuus määritettiin MTT-analyysi 72 tunnin jälkeen ja normalisoitiin kunkin käsittelemätön kontrolli (ut). (N = 3) (d) kaspaasi 3/7 aktiivisuus mitattiin 24 tunnin kuluttua. Normalisoitiin vastaavaan käsittelemättömään kontrolliin (n = 3). (E) Kolme vuorokautta kylvön, Caco-2 3D viljelmät jätettiin joko hoitamatta tai hoidettiin 5 nM Db

αEGFR-scTRAIL 72 tuntia. Elossa kystat faasikontrastimikro- kuvat on merkitty nuolilla (asteikko bar: 50 pm). (F) lysaatit johdettu 3D kulttuureista esitetyn (e) analysoitiin immunoblottauksella. Näkyy on yksi edustaja blotti kolmen erillisen kokeen. Tubuliinia havaittiin latauskontrollina. Erityisiä nauhat on merkitty nuolenpäin. (G) kvantifiointi Western blotteja päässä (f). Proteiini tasot normalisoitiin vastaavaan tubuliinin valvonta; tasot käsittelemättömien viljelmien sarja, kuten 1 (n = 3).

Noin 40% kaikista CRC kasvainten satama aktiivinen mutaatio

KRAS

geenin, joka johtaa konstitutiiviseen ERK /MAPK aktivointi ja menetys vastata Setuksimabi [7], kun taas TRAIL herkkyyttä voidaan lisätä [25]. Tutkia vaikutuksen onkogeenisten Ras DB

αEGFR-scTRAIL aiheuttama sytotoksisuuden, me syntyy vakaa Caco-2-solut indusoitavasti ilmentävät K-Ras

G12V. Näissä soluissa, doksisykliini indusoi bi-sistronista ilmentymisen onkogeenin ja GFP, kun taas vektori valvonta-solut ekspressoivat GFP vain. Kolmen vuorokauden kuluttua doksisykliini Lisäksi yli 85% Caco-2tet solut olivat GFP-positiivisten FACS-analyysillä (Kuva. 4a). Immunoblottauksen Caco-2tet K-Ras

G12V solulysaateista vahvisti Ras yliekspressio yhdessä, että GFP: n, samanaikainen vahva ERK-fosforylaation, kun taas vektorisäätö solut ilmensivät vain GFP (Fig. 4b). Kun nämä solut ympättiin 3D kulttuureissa puuttuessa doksisykliini, sekä Caco-2tet vektori ja K-Ras

G12V solut muodostivat hyvin eriytetty ja polarisoitunut sferoidit basolateraalisessa vyöliitos (E-kadheriinin värjäys) ja apikaalisella F-aktiini kerääntyminen soluvapaasta lumenia. Lisäksi Doksisykliinin ei ollut vaikutusta morfologian valvonta soluja, kun taas K-Ras

G12V ilmentävät solut muodostivat usean luminal pallosia, joka ei ollut selvä polarisaatio (Fig. 4c). Nämä eriyttäminen aiheuttamia vikoja K-Ras

G12V ovat mukaisesti tuoreessa raportissa Magudia et al. (2012) [16].

(a) Caco-2tet vektori ohjaus ja K-Ras

G12V-soluja käsiteltiin 2 ug /ml doksisykliiniä 72 h (+ Dox). Solut kerättiin ja GFP-fluoresenssi analysoitiin virtaussytometrialla. Ei-indusoidun soluja käytettiin kontrollina (-dox). (B) Caco-2tet vektori ohjaus ja K-Ras

G12V soluja kasvatettiin 2D ja doksisykliinillä varten ilmoitettu kertaa ennen lyysiä. GFP, Ras, Perk (T202 /Y204) ja ERK-tasot määritettiin Western-blottauksella. Tubuliinia havaittiin latauskontrollina. Kaikki paneelit osoittaneet ovat peräisin samasta blot. (C) Caco-2tet vektorisäädön ja K-Ras

G12V solut ympättiin 3D kulttuureissa puuttuessa tai läsnä doksisykliini. Kolme vuorokautta kylvön ontelon laajeneminen aiheutettiin lisäämällä 100 ng /ml CTX. Viljelmät kiinnitettiin kolme päivää myöhemmin ja värjättiin E-kadheriinin-spesifistä vasta-ainetta (vihreä), phalloidin (punainen) ja DAPI (ytimet, sininen). On esitetty konfokaali osia edustavia kystat (asteikko bar: 10 pm).

määrittämiseksi vaikutuksia K-Ras

G12V ilme D b

αEGFR-scTRAIL aiheuttama sytotoksisuuden, 3D kulttuureissa hoidettiin doksisykliini kolme päivää. Kontrolliin verrattuna soluihin, elinkelpoisuuden mittaukset paljastivat vähentynyt herkkyys onkogeenisten Ras ilmentävien solujen Db

αEGFR-scTRAIL (Fig. 5a).