Krooninen sairaus

tiivistelmä

Biomarkers ja uusia terapeuttisia tavoitteita tarvitaan pikaisesti kolorektaalisyövässä (CRC). Pseudo tyrosiinikinaasireseptori 7 (PTK7) on mukana Planar solun polariteetti ja se vapautetaan säännöstelystä oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien CRC. Silti vähän tiedetään sen proteiinin ilmentymistä ihmisen CRC, tai mahdollisesta korrelaatio sen ilmaisun kliiniseen vasteita. Käyttämällä kliinisesti selityksin Tissue Microarray (TMA) valmistettu 192 peräkkäisen CRC-potilaalla alkuperäisen leikkauksen, tutkimme PTK7 ilmentymisen immunohistokemia kasvainkudoksen ja vastaaviin normaaleihin limakalvojen, ja korreloi sen ilmaisutapoja kliinis-patologisia piirteitä ja potilaiden hoitotuloksiin. PTK7 ehtyminen erityisillä shRNA vuonna HCT116 ja HCT15 CRC solulinjojen havaittiin vaikuttavan solujen lisääntymistä, lääkeresistenssin ja solujen vaeltamiseen. Kasvaimen kasvu ja metastaattisen fenotyypin tutkittiin

in vivo

käyttäen ksenografti hiirimallissa CRC solujen moduloitu ilmaus PTK7 tasoilla. PTK7 oli merkitsevästi säädellään ylöspäin CRC kudoksessa verrattuna terveisiin limakalvoja, ja merkittävä yli-ilmentyminen todettiin 34%: lla potilaista. PTK7 yliekspressio oli merkitsevästi yhteydessä alentuneen etäpesäke elinaika ei-metastasoituneen potilaille. Vuonna HCT116 ja HCT15 soluja, shRNA PTK7 vähensi muuttoliikettä mutta ei vaikuttanut solujen lisääntymisen ja lääkeresistenssin. Vuonna ksenografti hiiri HCT15 soluja, downregulation PTK7 vähentänyt kasvaimen kasvua, kun taas sen yli-ilmentymisen PTK7-negatiivisten syöpäsolujen lisännyt metastaattisen tapahtumiin. PTK7 ilmaisu edustaa siten mahdollisten prognostisten biomarkkeri, ja uusi terapeuttinen kohde CRC.

Citation: Lhoumeau A-C, Martinez S, Boher J-M, Monges G, Castellano R, Goubard A, et al. (2015) yli-ilmentyminen on Promigratory ja Prometastatic PTK7 Reseptori liittyy positiivisena kliinistä tulosta peräsuolen syövän. PLoS ONE 10 (5): e0123768. doi: 10,1371 /journal.pone.0123768

Academic Editor: Anthony W. I. Katso, Queen Mary Hospital, HONGKONG

vastaanotettu: 2. lokakuuta, 2014; Hyväksytty: 21 helmikuu 2015; Julkaistu: 11. toukokuuta 2015

Copyright: © 2015 Lhoumeau et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat La Ligue Nationale Contre le Cancer (Label Ligue JPB) https://www.ligue-cancer.net/, Fondation pour la Recherche médicale (ACL) https://www.frm.org/, Region PACA (SM) https://www.regionpaca.fr/, SIRIC (INCA-DGOS-Inserm 6038) https://www.oncopaca.org /fr /. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

447 000 tapausta ja 215 000 kuolemaa vuosittain Euroopassa, peräsuolen syöpä (CRC) on edelleen merkittävä kansanterveydellinen ongelma [1,2]. Integrointi 5-FU- ja oksaliplatiinipohjaisen adjuvanttihoitoa on poistettu kirurgisella in imusolmukkeisiin-potilailla on parantunut eloonjääminen [3,4], mutta merkittävä osa näistä potilaista edelleen lopulta relapsi ja kuolevat etäpesäkkeitä. Samaan aikaan, solmu-negatiiviset potilaat eivät yleensä hoidettu adjuvanttia systeemistä hoitoa, kun taas jotkut niistä voisivat hyötyä tästä strategiasta [5]. Siten tunnistaminen voimassa ja vankka biomarkkerit, jotka voivat erottaa ryhmä potilailla merkittävä riski toistumisen tarvitaan kipeästi. Lisäksi vaikka jotkin molekyylitason kohdennettuja terapeuttisten ovat osaltaan lisätä selviytymisen metastaattisessa CRC [6-9], mikään niistä osoitettiin parantaa selviytymistä liitännäishoitona [10,11]. Siksi on edelleen innokkaasti tarpeen yksilöidä molekyyli toimijat olla merkittävä rooli paksusuolen syövän biologian ja voivat toimia kohteina uusia biologisia hoitoja.

solupintareseptorin PTK7, joka tunnetaan myös paksusuolen syöpä kinaasi-4 (CCK-4), on kehittyvä konservoitunut jäsen reseptorityrosiinikinaasin superperheen, joka oli ensimmäinen tunnistettu ihmisen normaalissa melanosyyttien [12] ja ihmisen paksusuolen syöpä [13]. Joka koostuu seitsemästä solunulkoisten immunoglobuliinidomeeneja, transmembraaninen alue ja solunsisäinen tyrosiinikinaasidomeeni, se on viallinen kinaasiaktiivisuutta ja ei ole tunnettua ligandia. Vaikka sen tarkkaa biologinen rooli on epäselvä, viimeaikaiset todisteet on liitetty PTK7 tasomaiseen solun polariteetti (PCP) reitin [14]. Vaikka apico-pohjapinta napaisuus järjestää epiteelisolujen kiinnitys pitkin xy-akselilla, PCP ohjaa kannan solujen tasossa epiteelin rakenne, joka takaa, että ne suuntautuvat samaan suuntaan, ja siten on tärkeä rooli erilaisissa kehitysprosesseissa, mukaan lukien epiteelisolujen erilaistumisen ja liikkeiden [15]. Huomattavaa on, että vapauttaminen PCP voi aiheuttaa erilaisia ​​patologisia sairauksia, kuten syöpää. Tunnettu sääntelyviranomaisten PCP kuuluvat Wnt ligandit ja Frizzled (Fz) reseptorit, jotka aktivoivat Dishevelled sovittimeen solukalvon ja aloittaa ns Wnt-reitin, joko sen kanoninen (β-kateniinin riippuva) tai ei-kanoninen (β-kateniinin riippumaton) organisaatio [16]. PTK7 ehdotettiin säännellä PCP koska sen mutaatio Xenopus tai hiiren johtanut ilmeinen PCP liittyviä kehityshäiriöitä, kuten hermostoputken sulkemisen vikoja [17,18]. Lisäksi PTK7 osoitettiin suoraan vuorovaikutuksessa Dishevelled, mikä sen rekrytointia kalvon ja myöhemmin fosforylaatio /aktivoinnin FZ7 [19]. Me ja muut ovat osoittaneet, että PTK7 voi myös aktivoida kanoninen Wnt-reitin kinaasidomeeni riippuvalla tavalla [18,20].

Äskettäin, PTK7 havaittiin olevan yli-ilmentynyt useissa ihmisen syövissä, mukaan lukien epiteelin tuumoreissa, kuten maha-, rinta-, ruokatorvi, sappitiehyiden ja keuhkosyövässä [21-26], mutta myös sarkooma [27] ja hematologisissa maligniteettien, mukaan lukien akuutti ja krooninen myeloidileukemiat [28-30]. Yllättäen, kun taas PTK7 kuvattiin ensimmäisen kerran ihmisen paksusuolen syöpäsolulinjoissa [13], ei ole tietoa tällä hetkellä koskevat sen proteiinin ilmentymistä CRC kudoksissa kliinisesti selityksin potilaista. Niinpä olemme arvioineet PTK7 proteiiniekspressiossa TMA koostuu CRC ensisijaisen kudosten ja terveisiin limakalvojen, ja arvioidaan mahdollisia korrelaatioita sen ilmaisutapoja kliinisiä ja patologisia parametrit, sekä potilaiden hoitotuloksiin. PTK7 ilmentyminen siis osoitettu liittyvän metastaattisen tulokseen ja vähentää eloonjäämisen kuin metastaattisen CRC potilaille. Sitten tutkittiin vaikutusta moduloi sen ilmentymistä kokeellisissa malleissa ja totesi, että PTK7 indusoi pro-muuttavien ja pro-metastasoitunut fenotyyppi, sopusoinnussa kliinisiä tietoja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethic lausuma

tutkimus hyväksynyt Institut Paoli-Calmettes (IPC) Institutional Review Board (IRB, Comité d’Suunta stratégique, COS). IRB ei pitänyt pakollisiksi tietoon perustuvan suostumuksen saamiseen potilailta, mutta tiedot analysoitiin, kun kaikki potilastiedot ovat täysin anonymisoitu. Eläintutkimukseen, kaikki kokeet suoritettiin yhteisymmärryksessä Ranskan suuntaviivojen eläinten käsittelyyn ja hyväksynyt eettinen komitea eläinkokeissa Marseille (C2EA-14). Eläimiä pidettiin vuonna Erityiset taudinaiheuttajista vapaat olosuhteet, yksittäin ilmanvaihto häkeissä (Tecniplast, Ranska, Sealsafe Plus Mouse-hiiri IVC Green Line) 4-5 seuralaisia.

Kaikki hiiret saivat vapaan pääsyn autoklavoitiin ja suodatetaan vesi ja säteilytettyä ruokaa 10-14 tunnin valo /pimeä sykli, huonelämpötila 21 ± 2 ° C ja kosteus 55 ± 15%. Kaikki häkeissä sisälsivät lastuja, vuodevaatteet ja poppeli lastuvillatuotteet pesä (Anibed, Ranska) ympäristön rikastamiseen.

aikana leikkauksen jälkeen, kipu oli helpottunut jonka Ihonalaisen meloksikaamia (Metacam ruiskeena, Boehringer Ingelheim, 1 mg /kg kerran päivässä 3 päivän ajan) ja Baytril (Bayer) -supplemented vettä lisäksi annettiin hiirille 7 päivää ennen ksenografti ehkäisyyn infektion aikana 3 viikkoa leikkauksen jälkeen.

lopettamisien hiirillä suoritettiin käyttäen inhaloitava hiilidioksidianestesian mukaisesti eettinen toimikunta eläinkokeissa Marseille (C2EA-14) B

potilaille ja kudosten

Arkistointi kudoksia 192 peräkkäisen potilailla, joilla on vaiheiden I-IV peräsuolen karsinooma (CRC ) käsitellään meidän laitos (Institut Paoli-Calmettes, Marseille, Ranska) alustava kirurginen resektio kerättiin vuosina 1990 ja 1998. Staging käytettiin amerikkalaisen sekakomitean Cancer kriteerien [31]. Kaikki näytteet formaliinilla ja parafiiniin, ja arvioidaan Biopathology osastolla. Potilaat saivat adjuvanttia 5FU kemoterapian tapauksessa imusolmukemetastaaseja etäpesäkkeitä standardin suosituksia. Hoidon jälkeen loppuun, valvonta suoritettiin 3 kuukauden välein 2 ensimmäisen vuoden aikana ja 6 kuukauden välein. Potilaita seurattiin metastasoineeseen uusiutumisen kliinisen kokeen ja verikokeita, vuosittain rintakehän röntgen- ja maksan ultraääni ja /tai CT. Kliiniset ja patologiset ominaisuudet sekä lopputulos ominaisuudet poimittiin meidän takautuvasti säilyy institutionaalisten tietokantaan. Lisäksi tutkia mahdolliset erot PTK7 ilmaisun välillä metastasoitunut ja ensisijaisen kudoksissa, 7 PTK7-positiivisia maksametastaaseja ja pariksi ensisijainen CRC valittiin vertailevassa immunohistokemiaa.

kudossiruina rakentaminen

TMA valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [32,33]. Kutakin näytettä varten 3 edustava alueet valitaan hematoksyliinillä-eosiini-värjättyä osan luovuttajan lohkon. Core sylinterit, joiden halkaisija on 0,6 mm lävistettiin ja laittaa 3 erillistä vastaanottaja parafiiniblokit käyttämällä erityistä ryhmittelyn laite (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, USA). Vastaanottoblokista sisälsi paria kasvain ja normaali limakalvo, sekä ohjaus normaali ja hyvänlaatuisia kudoksissa (ohutsuoli, adenoomia) ja solulinjaa pellettejä. Viisi um osat tuloksena TMA lohko käytettiin IHC analyysiä siirron jälkeen lasilevyille. Kahden paksusuolen syöpäsolulinjoissa (Caco2, HT29) ja yksi mahasyövän solulinja (HGT1) käytettiin kontrolleina.

immunohistokemia analyysi

PTK7 värjäys vuohi-IgG, anti-humaani /hiiri /rotta PTK7 /CCK-4 affiniteettipuhdistettu polyklonaalinen vasta-aine saatiin R GAPDH fwd 5′-ATGGGGAAGGTGAAGGT-3 ’ja rev 5′-AAGCTTCCCGTTCTCAG-3’

Soluproliferaatiomääritys

Solujen proliferaatio määritettiin CellTiter 96 määritystä (Promega, USA). Solut ympättiin tiheydellä 5000 solua 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FCS: ia määritettynä ajankohtana. Sitten levyjä inkuboitiin CellTiter 96 37 ° C: ssa 2 tuntia. Absorbanssi 490 nm: ssä mitattiin käyttämällä 96-kuoppaista levylukijaa.

Lääkeaineresistenssi määrityksissä

Solut ympättiin tiheydellä 5 000 solua 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FCS varten 24. Sitten lääkkeet (Irinotecan, 5-fluoriurasiili, ja sisplatiini) lisättiin ja soluja inkuboitiin edelleen 72 tuntia CellTiter 96 Sitten lisättiin ja levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 tuntia. Absorbanssi 490 nm: ssä mitattiin käyttämällä 96-kuoppaista levylukijaa.

Cell migraatiokokeessa

Solut ympättiin tiheydellä 5 000 solua 6-kuoppaisille levyille aikaisemmin päällystetty Kollageeni I ja olivat inkuboitiin 24. Sitten solut nälässä yön yli ja stimuloitiin DMEM 10% FCS: ää tai DMEM ilman FCS kontrollina. Solumigraation mitattiin solujen seuranta käyttämällä video-mikroskopia ja Metamorph ohjelmistot (Molecular Device) 8 h.

Vieraslajisiirteen hiirimalleihin

NOD /SCID (ei-lihavilla diabeetikko /sekamuotoinen immuunivajavuustila) /yc null hiiret (NSG) saatiin Charles River Laboratory (Ranska). HCT15 solut, jotka ilmentävät shCTRL tai shPTK7 tartutettiin lentiviruksen ilmentävää LUC2 ja 2,10

6 solua injektoidaan subkutaani- 9 viikon ikäisiä NSG hiiriä (paino: 25 g). LUC2 ilmentymistaso kontrolloitiin ennen injektiota. Kasvaimen kehitystä seurasi aikana 8 viikkoa ja lasketaan kaavalla V = 0.52x (PxL

2). Päivänä 50 kasvaimen resektion suoritettiin ja kasvaimen paino mitattiin. Sitten kehittäminen etäpesäkkeiden seurasi bioluminenssina analyysi käyttäen Photon imageur (Biospace Lab, Pariisi, Ranska). Kun ulkonäkö metastasoituneen signaalien tai analyysin valmistuttua (päivä 130), hiiret ruumiinavaus ja urut luminesenssi suoritettiin. Kuva-analyysi tehtiin käyttämällä M3 visio ohjelmisto (Biospace lab). Kaikki kokeet suoritettiin yhteisymmärryksessä Ranskan suuntaviivojen eläintenkäsittelynormeja.

Tilastollinen

Comparison of kategorisen muuttujan jakelun suoritettiin χ2 tai Fisherin testiä. Jatkuvien muuttujien, Studentin t-testi ei-parametrinen U-testi käytettiin. Seuranta laskettiin diagnoosista, jona viimeinen uutinen potilaille hengissä. Etäpesäke-elinaika (MFS) mitattiin diagnoosista kunnes ensimmäinen metastaattista tapahtuman tai kuolema. Potilaille ei ole metastaattista uusiutumisen tai kuoleman aikaan viimeisen seurannan, sensurointi suoritettiin ajankohtana Viimeisimmässä seurannassa. Kokonaiselinaika (OS) mitattiin diagnoosista kuolemaan saakka tai viimeisimmän seurannan. Eloon jäämisestä arvioitiin kanssa Kaplan-Meier menetelmällä ja verrattiin ryhmien välillä kanssa log-rank-testi. Sillä Monimuuttuja-analyysissä, Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin. Tiedot ilmoitetaan mukaisesti raportoinnin suositusten tuumorimarkkeri ennusteita, (huomautus) [35]. Jotta vertailla kasvaimen kasvukäyrät prekliinisissä kokeissa kaksisuuntainen ANOVA suoritettiin. Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia. Tilastolliset analyysit tehtiin joko R ohjelmistoversio 2.15 tai Prism-ohjelmisto (Graphpad ohjelmisto, San Diego, CA, USA) B

Tulokset

PTK7 proteiini merkittävästi säädellään ylöspäin CRC

jotta voidaan paremmin ymmärtää roolin PTK7 peräsuolen kasvainten synnyssä, tutkimme sen proteiinin ilmentymistä immunohistokemiallisesti on TMA sisältävä tuumorikudoksista 192 ensisijainen CRC (kliininen ominaisuudet on esitetty S1 taulukko) ja vastaaviin normaaleihin limakalvo. PTK7 immunovärjäys voitaisiin arvioida 138 CRC (72%) ja 142 normaaleissa kudoksissa (74%), vastaavasti. Havaitsimme PTK7 ilmaisun ensisijainen kasvaimia 78 potilasta (56%), jonka intensiteetti on 2 tai 3 48 potilaalla (35%) ja olennaisesti soluliman subsellulaarinen sijainti (kuvio 1A ja 1B). Vertailun vuoksi vain 32 potilasta (22%) oli havaittavissa immunovärjääminen vastaaviin normaaleihin limakalvon, jonka intensiteetti on 2 tai 3 20 potilaalla (14%) (p = 1.91.10

-8, chi-2 testi; kuvio 1A ja 1B). Lisäksi, kun PTK7 ilmaistiin, keskimääräinen prosentuaalinen määrä positiivisia soluja oli 31% (95% CI: 25-37%) kasvainkudoksessa verrattuna 2% (95% CI: 1,2-3,8%; p = 5,74. 10

-14, U-testi) in vastaaviin normaaleihin limakalvo (kuvio 1 C ja 1 D). Käyttäen cut-off on vähintään 10% positiivisia soluja, joiden intensiteetti on 2 tai enemmän (jota käytetään tämän jälkeen, koska määritelmän PTK7 yli-ilmentymisen), 47 potilaalla oli havaittavissa PTK7 yli-ilmentyminen kasvainkudoksessa (34%), mutta vain 3 normaali limakalvo (2%) (kuvio 1D). Siten PTK7 yliekspressoitui vuonna merkittävä määrä ensisijainen CRC, mutta ei tai tuskin normaalissa kudoksessa.

A- PTK7 ilmentymisen immunohistokemiallinen (IHC) on TMA sisältävät pää- CRC kudoksia: värjäys kasvain ytimien osoittaa korkea ( ylempi paneeli) ja no /low (alempi paneeli) ilmentyminen edustava syövän kudoksissa (suurennos x 400). B- intensiteetti PTK7 värjäyksen IHC perusterveydenhuollossa CRC ja vastaaviin normaaleihin limakalvo: värjäytymistä luokiteltiin 0, 1+, 2+ ja 3+ kuvatulla materiaalit ja menetelmä osassa. Osuudet vertailtiin Chi-2 testi. C-Mean prosentuaalinen solujen PTK7 värjäytymistä ensisijainen CRC ja vastaaviin normaaleihin limakalvo. D- Kasvain ytimet ensisijaisen CRC esittää PTK7 yli-ilmentyminen (määritelty värjäämällä 10% soluista tai enemmän, intensiteetti 2 tai enemmän) ja vastaaviin normaaleihin limakalvon (suurennos x 400). Prosenttiosuudet verrattiin käyttäen Mann-Whitneyn U-testiä. *** = P 0,001. E- Kaplan-Meier-analyysi etäpesäkkeiden-free (oikealla) ja yleinen (vasemmalla) jäänteitä ei-metastaattinen CRC potilaiden mukaan PTK7 ilmentymisen vaikutus TMA. Eloon jäämisestä verrattiin käyttäen log-rank-testi.

PTK7 yliekspressio liittyy huono selviytyminen ei-metastasoituneen CRC

olivatko PTK7 yliekspressio korreloi tärkeimpien kliinisiä ja patologisia piirteitä. Kuten on esitetty S2 taulukossa, ei merkittävää assosioitunut PTK7 yli-ilmentymisen ja muuttujia kuten ikä, sukupuoli, paksusuolen tai peräsuolen sijainti, kasvain vaiheessa imusolmuke laajennus, etäpesäkkeitä, Lympho-verisuoni- invaasiota (LVI), erilaistuminen laatu ja kolloidin limakalvojen komponentti. Huomionarvoista oli ei-merkitsevä suuntaus kohti alempaa ilmaus kasvaimissa mikrosatelliittien epävakaus korkea fenotyypin. Sitten keskittyneet vaiheen I-III, M0 CRC potilaat ja arvioitiin vaikutuksia PTK7 ilmentymisen vaikutus eloonjäämiseen. Vuoteen univariate analyysi yhdessä imusolmuke osallistumista ja kolloidin limakalvojen komponentti, PTK7 yliekspressio liittyi merkittävästi vähentää MFS (taulukko 1). 5 vuoden MFS oli 75,7% (95% CI: 65-88,1%) in PTK7-syöpäkasvain vs. 54% (95% CI: 38,8-75%) in PTK7-positiivisia kasvaimia (HR = 2,1 [1-4,1] ; p = 0,034, log-rank-testi; kuvio 1 E). Monimuuttuja-analyysissä vain kolloidi limakalvojen komponentti säilyttää itsenäisen ennustetekijöitä vastinetta MFS, mutta PTK7 lähestyi tilastollista merkittävyyttä (taulukko 1). Samanlaisia ​​suuntauksia havaittiin kannalta kokonaiselinaikaa (kuvio 1 E, taulukko 1). Niinpä PTK7 yli-ilmentyminen ei-metastasoituneen CRC liittyi haitallisia tulokseen. Selvittämään mahdollisia eroja ensisijaisen ja etäpesäkkeitä, tutkimme lisää ensisijainen kudoksiin pieni kohortin 7 PTK7-positiivisia maksametastaaseja. Kaikissa näytteissä, PTK7 ilme oli samankaltainen molemmissa kudoksissa (S1 kuvio)

PTK7 downregulation ei vaikuta solujen lisääntymistä ja lääkeresistenssideterminantit, mutta se vähentää solujen kulkeutumista ihmisen CRC solulinjojen

tutkimiseksi biologinen perusta lisääntynyt aggressiivisuus PTK7 yliekspressoivat CRC, loimme knockdown malli PTK7 ihmisen CRC solulinjoissa HCT15 ja HCT116, jotka ilmentävät suuren määrän endogeenisen PTK7 (kuvio 2A). Solut infektoitiin lentivirukset ekspressoivat ei-kohdistuksen shRNA ohjaus (shCTRL) tai kahden eri shRNA kohdistaminen PTK7 (shPTK7-1 ja shPTK7-2) ja tehokkuutta PTK7 pudotus tarkistettiin mRNA ja proteiini tasoilla (kuvio 2A ja 2B).

PTK7 ilmentymistasoon shCTRL- tai shPTK7 (1 ja 2) infektoiduista HCT15 ja HCT116 solulinjoissa tarkistettiin western blot (A) ja Q-PCR-analyysi (B). Solujen elinkelpoisuus määritettiin kvantitatiivisesti solujen tiitteri määritys 3 päivää (C-D). Solujen elinkelpoisuus shCTRL- ja shPTK7 (1 ja 2) infektoituihin HCT15-solujen arvioitiin solun tiitterin määrityksessä, 72 h sen jälkeen, kun adjunction sisplatiinin, Irinotecan, ja 5-fluoriurasiili (E).

analysoidaan vaikutus PTK7 soluproliferaatioon ja eloonjäämisen käyttämällä solun tiitteri määritys. Tämän leviämisen määrityksessä, alas-ekspressiota sääteleviä PTK7 on HCT15 ja HCT116 solulinjoja ei ollut vaikutusta proliferatiivista kapasiteettia syöpäsolujen (kuvio 2C ja 2D). Koska PTK7 on mukana WNT polkuja, me tarkistetaan onko sen mahdollinen vaikutus proliferaatioon voi olla riippuvainen Wnt ligandia stimulaatiota [14,18]. Siten, proliferaatio tutkittiin edelleen, kun läsnä oli elatusaine L-solut ilmentävät Wnt3a ja Wnt5a, jotka ovat tunnettuja aktivaattoreita kanonisen ja ei-kanoninen polkuja, vastaavasti. Kuitenkin jopa Wnt stimulaation, emme havaitse mitään vaikutusta PTK7 ilmaisun CRC soluproliferaatioon (S2 Kuva).

aiemmin havaittu, että PTK7 ilmaisu parantaa lääkeresistenssin akuutin myelooisen leukemian solujen [28]. Siksi tutkia sen vaikutuksia lääkeresistenssin CRC solulinjoissa, arvioimme solujen elinkelpoisuuden HCT15 soluja, jotka ilmentävät tai eivät PTK7 käsittelyn jälkeen eri annoksilla sisplatiini, irinotekaani ja 5-FU. Kuten kuviossa 2E, vähen- tämisessä PTK7 ilmaisua ei anneta mitään täydentävää herkkyys HCT15 ja sytotoksisille. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin HCT116 (S3 kuvassa).

vieressä tutkittiin miten PTK7 solujen muuttoliike. HCT15 soluja ilman ravintoa 24, stimuloitiin sitten FCS ja migraatiota seurasi elävien solujen seuranta. Kun FCS lisättiin stimuloiva tekijä, migraatio HCT15 shCTRL solujen määrä kasvoi 2,5-kertaiseksi. Kuitenkin PTK7-pudotus HCT15 soluja, FCS muuttoliikkeelle poistettiin. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin HCT116-soluissa (kuvio 3A ja 3B). Siten PTK7 ilmaisu ei vaikuta solujen lisääntymisen tai lääkeresistenssi, mutta se antaa pro-muuttavien valmiuksia ihmisen CRC solulinjoja.

shCTRL- ja shPTK7 (1 ja 2) infektoituihin HCT15 soluja nälässä yön yli ja inkuboitiin tai ilman FCS. Solumigraation mitattiin solujen seuranta käyttämällä video-mikroskopia ja Metamorph ohjelmistoja. Etäisyys muuttoliikkeen laskettiin jokaiselle kunnossa ja välineet verrattiin käyttämällä U-testi (A). Edustavia vaeltavat kurssia näytettiin (B).

PTK7 downregulation vähentää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden kehitys vierassiirrekokeissa hiirimalleissa

Tutkia kasvaimia aktiivisuutta PTK7

in vivo

, me ihonalaisesti bioluminesoiviin HCT15 soluja (shCTRL tai shPTK7) in NSG hiirillä ja seurataan sekä kasvaimen kasvua ja metastaattinen leviäminen. Kuten on esitetty kuviossa 4A ja 4B, tehokkuus PTK7 pudotus tarkistettiin kasvaimissa sekä mRNA: ta ja proteiinia tasolla. Vuonna PTK7 pudotus HCT15-solujen, kasvaimen tilavuus väheni lähes 50% (kuvio 4C; p = 0, 0125, kaksisuuntainen ANOVA) verrattuna kontrollisoluihin. Vastaavasti, tuumorisolukko laski 2,6-kertaisesti PTK7 taintumisen kasvaimissa (kuvio 4D, p = 0, 0025, Mann-Whitneyn U-testi). Siten PTK7 soittaa pro-tuumorigeenistä rooli

in vivo

. Sen arvioimiseksi, onko tämä pro-tuumorigeenisia vaikutus johtuu ero soluproliferaatioon, tutkimme Ki67 tilan tuumoriksenografteja, ja ilman PTK7 knockdown. Kuten on esitetty S4 kuviossa, mitään merkittävää eroa ei havaittu HCT15 shCTRL ja HCT15 shPTK7 ksenograftien suhteen Ki67-värjäys.

Expression of PTK7 tarkastettiin sen jälkeen, kun kasvaimen resektion Q-PCR: llä (A) ja Western blot-analyysi ( B). Kasvu ihonalaisen ksenograftin of shCTRL- ja shPTK7 infektoimissa soluissa HCT15 tutkittiin (C- D). Kuvat edustavasta HCT15 shCTRL ruiskutettiin hiiren ja niiden elimiä näytettiin vasemmassa paneelissa. Määrä metastase vapaa tai positiivisten hiirtä kussakin kunnossa arvioitiin ja näytetään oikeassa paneelissa. Mittasuhteet verrattiin käyttämällä Fischerin eksakti testi (E).

Mitä tulee kliinistä vaikutusta PTK7 ilmentymisen vaikutus MFS ja sen pro-muuttavien vaikutus

in vitro

, me tutki PTK7 voisi parantaa etäpesäke ksenosiirrettyjä hiirimallissa. Sen jälkeen resektio HCT15 johdettujen kasvaimia, metastaattisen kehitys seurattiin

in vivo

käyttäen lusiferaasireport-. Oli ei-merkitsevä suuntaus vähemmän metastaattisen esiintymistä hiirillä ruiskutetaan PTK7-knockdovvn HCT15 soluissa, verrattuna shCTRL-HCT15 ruiskutettiin hiiriin (2 metastaattinen tapahtumia 15 hiirillä versus 6 metastaattisen tapahtumia 12 hiirille; p = 0,0871, Fischerin eksakti testi) (kuvio 4E).

tutkimiseksi edelleen potentiaalinen pro-metastasoitunut vaikutus PTK7, rakensimme solu malli PTK7 yli-ilmentymisen PTK7-negatiivisten syöpäsolujen ja tutkitaan sen vaikutus etäpesäkkeitä kehitykseen

in vivo

. Koska tahansa käytettävissä PTK7-negatiivisia ihmisen CRC-soluja, käytimme B16F10 melanooma solulinja, joka on PTK7-negatiivinen solu, jossa hyvin dokumentoitu kyky tuottaa keuhkometastaaseja ksenograftimalleissa [36], mallina. Transfektoimme B16F10 solujen PTK7 ilme tai tyhjän vektorin, ja tarkista, että PTK7 ilmentyi stabiilisti klo solukalvon FACS-analyysillä (S5a ja S5B kuvassa). B16F10 solut injektoitiin suonensisäisesti ja keuhkojen etäpesäkkeiden kehitystä analysoitiin. Huomasimme, että yliekspressio PTK7 merkittävästi parantanut metastaattinen kehitys (p = 0,0024) (S5c ja S5d kuvassa). Tarkasteltaessa koko etäpesäkkeiden, huomasimme, että PTK7 yliekspressio lisäsi määrä pieniä ja suuria etäpesäkkeitä (p = 0,0019 ja 0,0080, vastaavasti; S5E Kuva). Kuitenkin osa pienistä etäpesäkkeitä oli korkeampi PTK7 yli-ilmentävät solut, mikä viittaa vallitseva vaikutus solujen invaasiota ja tarttuvuus, eikä soluproliferaatioon. Siten PTK7 yli-ilmentyminen lisää metastaattisen fenotyypin

in vivo

.

Keskustelu

Vaikka poikkeava mRNA ilmentyminen PTK7 alunperin havaittu CRC [13], ei ollut käytettävissä tietoja siitä sen proteiinin ilmentymistä kliinisesti selityksin CRC näytteitä. Käyttämällä immunohistokemia, olemme vahvistaneet sen proteiinin yli-ilmentymisen asiaan osa CRC tapauksista (noin kolmannes potilaista), verrattuna terveisiin limakalvoille, kun ei ole tai tuskin havaittavissa. Tässä sarjassa ilmentymistä ei havaittu liittyvän mitään erityisiä kliinisiä tai patologisia piirteitä, kuten ikä, kasvaimen koon, imusolmuke osallistuminen, vaihe, LVI, kolloidi limakalvojen komponentti, ja erilaistumista laatu. Kuitenkin ei-metastasoituneen CRC, PTK7 yliekspressio liittyi merkittävästi pienentää MFS. Tämä huono-ennusteen vaikutus aikavälillä metastaattisen potentiaali havaittiin lähestyä tilastollista merkittävyyttä Monimuuttuja-analyysissä, kun taas imusolmuke osallistuminen hylättiin. Mitä OS, samanlainen suuntaus havaittiin mutta pääsemättä tilastollista merkitystä, todennäköisimmin rajallisen otoskoko. Huomattavaa on, että mitään merkittävää yhteys PTK7 yli-ilmentymisen ja etäpesäkkeitä diagnosointiin todettiin, nostamalla kiehtova hypoteesia, että PTK7 ilmaisua saattavat kadota, kun etäpesäkkeitä on perustettu.