Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

E

sophageal levyepiteeliperäinen karsinooma (ESCC) on erittäin yleistä Kiinassa ja muissa Aasian maissa, koska suurin syy syöpään liittyvää kuolleisuutta. ESCC näyttää monimutkainen kromosomipoikkeavuuksien, kuten useita rakenteellisia ja numeerisia poikkeavuuksia. Kromosomipoikkeavuuksien, kuten toistuvia monistukset ja homotsygoottisia deleetioita, suoraan edistävät kasvaimien syntyyn kautta muuttamalla ilmaus keskeisten onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille.

Menetelmät /Periaate Havainnot

T

o roolin ymmärtämiseksi geneettisten muutosten ESCC synnyssä ja tunnistaa kriittiset vahvistus /poisto tavoitteet, suoritimme genominlaajuisten 1-Mb array vertaileva genominen hybridisaatio (aCGH) analyysi 10 yleisesti käytettyjen ESCC solulinjoja. Toistuva kromosomi voitot olivat usein havaittu 3q26-27, 5p15-14, 8p12, 8p22-24, 11q13, 13q21-31, 18p11 ja 20q11-13, jossa usein tappioita myös löytyy 8p23-22, 11q22, 14q32 ja 18q11-23 . Gain 11q13.3-13.4 oli yleisin muutos ESCC. Tällä alueella

CCND1

onkogeeni tunnistettiin korkea vahvistus ja yli-ilmentymisen ESCC, kun taas

FGF19

ja

SHANK2

myös huomattavan yli-ilmentynyt. Lisäksi korkea konkordanssin (91,5%) geenimonistuman ja proteiinin yli-ilmentyminen

CCND1

havaittiin ensisijaisen ESCC kasvaimia.

CCND1

vahvistus /yli-ilmentymisen on myös korreloi merkitsevästi imusolmuke etäpesäke ESCC.

Johtopäätös

Nämä havainnot viittaavat siihen, että genomista voitto 11q13 on tärkeä mekanismi myötävaikuttaa vahvistusta. Novel onkogeenit tunnistettu sisällä 11q13 amplikonin lukien

FGF19

ja

SHANK2

voi olla tärkeä rooli ESCC kasvaimien syntyyn.

Citation: Ying J, Shan L, Li J, Zhong L Xue L, Zhao H, et al. (2012) Genome-Wide seulonta Geneettiset Muutokset ruokatorven syöpä mukaan aCGH Osoittaa 11q13 Amplification Onkogeenit Associated kanssa solmukohtien Etäpesäke. PLoS ONE 7 (6): e39797. doi: 10,1371 /journal.pone.0039797

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 06 lokakuu 2011; Hyväksytty: 30 toukokuu 2012; Julkaistu: 25 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Ying et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (# 30801344, # 30928012) ja Peking Nova Program (nro 2009A70). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ruokatorven syöpä on yksi aggressiivinen syöpäsairauksia alkunsa ruoansulatuskanavassa, ja riveissä kuudenneksi yleisin syy syöpään liittyvistä kuolemantapauksista maailmassa [1]. Sen esiintyvyys vaihtelee suuresti eri alueilla maailmanlaajuisesti, Kiinan kanssa korkean riskin alue. Joillakin alueilla pohjoisessa ja keskisessä Kiinassa, sen esiintyvyys on yli 100 tapausta /per 100000 vuodessa [2]. Histologisesti, ruokatorven syöpä on luokiteltu ruokatorven adenokarsinooma ja ruokatorven okasolusyöpä (ESCC). Suurin osa tapauksista raportoidaan Yhdysvalloissa ovat ruokatorven adenokarsinoomia kuitenkin Kiinassa ja muissa Aasian maissa, ESCC on hallitseva tyyppi, joka kattaa noin 90% kaikista tapauksista. Edistysaskelista huolimatta multimodaalisessa hoitoja, ESCC edelleen vakava syöpä hoidon ongelma monissa maissa erittäin alhainen 5 vuoden eloonjäämisluvut ( 30%) [3]. Näin ollen on erittäin kliinistä arvoa etsimään herkkä ja spesifinen biomarkkereiden varhaistoteamiseen ja ennusteen tämän maligniteetin, sekä uusia terapeuttisia kohteita.

Perimän monistukset ja poistot edistää ihmisten kasvaimien syntyyn muuttamalla lauseke tasot kriittistä onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille (APT). Huolimatta sen suuri esiintyvyys, ESCC ei ole tutkittu yhtä paljon kuin sen adenokarsinooma vastine. On ponnisteltu tunnistaa brutto kopioluvun muutoksia sekä ESCC solulinjojen ja kasvaimia, mukaan lukien karyotyping, fluoresenssi

in situ

-hybridisaatio (FISH), tavanomaiset vertaileva genomin hybridisaatio (CGH) ja Heterotsygotian menetys (LOH) analyysit . Käytettävissä olevien tietojen julkaisemien nyt yleisimmin mainittu kromosomi monistuksia ESCC ovat 3Q, 4Q, 5p, 8p, 7q, 9q, 10q21, 11q13-q22, 18p11.3, 20q ja 22qtel [4] – [12]. Amplifikaatiot kätkeminen onkogeenien esim 11q13 (

CCND1

,

EMS1

), 3q26 (

EIF5A2

), 21q22 (

ETS2

), 8q24

(MYC)

, on johdonmukaisesti havaittu useampi kuin yksi tutkimuksissa [4] – [12]. Kromosominen tappiot toistuvasti liittyy 3p, 5q, 9P, 13q, 18q ja 21 q, jossa kohdegeeneihin kuten

FHIT

,

APC

,

RB1 ​​

ja

CDKN2A

sijaitsevat [4] – [12]. Viime vuosina, korkearesoluutioisia array-pohjainen CGH (aCGH) on sovellettu tunnistamaan kohde onkogeenien ja APT kautta määrittelemällä toistuvien voittoja ja tappioita erilaisissa syövissä. Viime aikoihin asti, kaksi tutkimuksia aCGH analyysi ensisijainen ESCC näytteistä, paljastaen toistuvat, korkean tason monistuksia 3q27.1, 7p11, 8q21.11, 8q24.21, 11q13.3, 11q22, 12q15-q21.1, 18q11.2 ja 19q13.11-q13.12, ja homotsygoottisia deleetioita 4q34.3-q35.1 ja 9p21.3 [13]; [14]. Kuitenkin verrattuna ”puhtaasti” ESCC solulinjoja, ensisijainen ESCC näytteet sisältävät paljon normaalien solujen, jotka voivat vaikuttaa aCGH tulokset eri tavoin. Vaikka useat kattava koko genomin tutkimuksia ESCC solulinjoissa on raportoitu, käytetyt solulinjat ovat pääasiassa peräisin Japani ESCC (TE-sarja) ja Etelä-Afrikkalainen ESCC lla [15] – [17]. Profilointi useiden ESCC solulinjojen peräisin eri korkean riskin alueilla Aasian kautta aCGH ei vain salli tunnistaa toistuvia kromosomimuutoksia Aasian ESCC, mutta myös arvokasta tietoa tuleville tutkimuksia käyttää näitä soluja rivejä ESCC malleja.

tässä tutkimuksessa olemme profiloitu 10 yleisesti käytetty ESCC solulinjojen peräisin mannerkiinalaisten (EC1, EC18 ja EC109), Hong Kong Chinese (HKESC1, HKESC2, HKESC3 ja SLMT1) ja japani (KYSE70, KYSE410 ja KYSE520) potilailla koko genomin DNA kopioluvun muutoksia käyttämällä aCGH analyysiä. Joukossa tunnistettu muutokset, monistaminen 11q13 on yleisin voitto havaittu, kätkeminen

FGF19

,

SHANK2

ja

CCND1

. Olemme lisäksi havainneet, että

CCND1

ilmentymistä usein yläreguloituja ensisijainen ESCC kasvaimia, ja DNA: n monistaminen vaikuttaa sen yli-ilmentymisen, joka korreloi imusolmuke etäpesäke ensisijaisen ESCC kasvaimia.

Tulokset

Perimän profiilit ESCC Cell Lines 1-Mb aCGH

Ten ESCC solulinjoja analysoitiin 1-Mb aCGH (Sanger 3040-BAC /PAC-klooni array). Signaalin voimakkuus suhde kunkin BAC käsiteltiin ja näytetään log2 tontteja käyttäen SeeGH ohjelmistojen [18]. Kuvio 1 esittää edustavan SeeGH karyograms yhden ESCC solulinja (EC18) analysoidaan, osoittaa tunnistaminen eri voittoja ja tappioita. Muut SeeGH karyograms on ESCC solulinjojen analysoitiin esitetään kuviossa S1. Kuvassa 2 esitetään tiivistelmä toistuvasti muuttunut (joilla log2 suhteet enemmän kuin 1 tai pienempi kuin -1). Yleensä kromosomi voitot olivat useammin havaittiin kuin tappioita. Yleisimmät muutokset ovat vahvistuksen 11q13 (70%) ja täydellinen menetys 18q11-23 (50%). Muut voitot esiintyy kolme tai useampia solulinjoja ovat 3q26-27 (40%), 5p15-14 (50%), 8p12 (30%), 8p22-24 (30%), 13q21-31 (30%), 18p11 ( 30%) ja 20q11-13 (40%). Muut menetykset kolme tai useampia solulinjoja ovat 8p23-22 (40%), 11q22 (30%) ja 14q32 (30%) (Fig. 2).

Normalized log2 signaalin intensiteetin suhde piirrettiin käyttämällä SeeGH ohjelmisto. Log2 signaali suhde 0 edustaa vastaavan kopion väliltä näytteen ja viite DNA (yksityiskohdat Materiaalit ja menetelmät). Cytoband malli jokaiselle kromosomi on esitetty vasemmalla. Pystysuorat viivat tarkoittavat log2 signaalisuhteet -2-2 kopio numero kasvaa oikealle ja vähenee vasemmalle. Jokainen tummansininen piste edustaa yhtä BAC klooni.

Epämuodostumat kanssa ≥20% taajuuden 10 ESCC solulinjoissa on esitetty. * Alueet, joilla poikkeavuuksia ≥50% solulinjoissa on lihavoitu.

monistaminen ja yli-ilmentyminen 11q13 geenien ESCC Cell Lines

Alueellisesti tunnistetaan toistuvia muutoksia, monistaminen 11q13 0,3-13,4 on yleisin vahvistus ESCC (Fig. 3A), erityisesti niissä solulinjoissa, jotka ovat peräisin kiinalaisen potilaista (6/7 solulinjat, 85%). Useita geenejä, joilla on potentiaalisia onkogeenisia toiminnot on tunnistettu tässä lokuksessa, kuten

CCND1

ja

CTTN

. Siten 11q13 tutkittiin tarkemmin vahvistuksen voitot ja tunnistaminen monistettujen geenien, jonka duplex genomista DNA PCR 10 ESCC solulinjoissa.

CCND1

kartoitetaan keskelle 11q13 amplikonin, ja korkean tason monistuminen

CCND1

vahvistettiin 6/10 solulinjoissa (Fig. 3B, C), kun taas

CTTN

näytteillä toiseksi korkein vahvistus (in 5/10 solulinjoissa).

, aCGH profiilit kuusi ESCC solulinjoissa

CCND1

lokuksessa. Normalisoitu log2 signaalisuhteet piirrettiin. Amplifikaatiot määriteltiin log2 signaalin intensiteettiä ≥1. Vaakaviivat merkitsevät log2 signaalisuhteet -1-3 kopio määrä kasvaa ylöspäin. Jokainen musta /värikäs piste edustaa yhtä BAC klooni. Nimet liittyvien BAC-kloonien on myös esitetty. Transcript kartta ydin 11q13 amplikoni näkyy alhaalla.

B

, Semikvantitatiivisilla duplex genomista DNA PCR-analyysi

CCND1

10 ESCC solulinjoissa ja 3 normaalin PBMC näytteitä. Signaalin voimakkuus suhteet

CCND1 Twitter /

GAPDH

näkyvät.

C

, yhteenveto geenikopiomäärä muutoksia useiden geenien sisällä 11q13 amplikonin. Numerot taulukossa ovat poimuihin kopio määrä ESCC solulinjojen suhteen keskiarvoja kolmesta PBMC näytteitä. PBMC, ääreisverenkierron mononukleaarisia soluja.

Useat geenit ympärillä

CCND1

at 11q13 tutkittiin edelleen semikvantitatiivinen RT-PCR ESCC solulinjoissa. Tulokset osoittivat, että

FGF19

ja

SHANK2

myös huomattavan yliekspressoituvat ESCC solulinjoissa, kun taas vain heikosti tai ei ilmentyy normaaleissa ruokatorvessa tai kuolemattomaksi normaalit solut (Fig. 4), vaikka mitään selvää vahvistusta on

SHANK2

havaittiin näissä solulinjoissa.

FGF3

(tuloksia ei ole esitetty) ja

4

olivat pohjimmiltaan ole ilmaistu mitään ESCC solulinjaa tai normaali ruokatorvi. Yliekspressio

CCND1

ja

CTTN

havaittiin myös useimmissa ESCC solulinjoissa verrattuna normaaliin ruokatorvi, vaikka ne ilmaistaan ​​yleensä normaali ruokatorven ja kuolemattomien solujen (Fig. 4). Yhdessä nämä tiedot vahvistivat, että 11q13 on yleisin Monistami- ESCC kuvattuja useita geenejä, mukaan lukien

CCND1

,

CTTN

,

FGF19

ja

SHANK2,

mahdollisina kriittinen onkogeenien vaikuttaa.

vahvistus tila 11q13 region aCGH ja

CCND1

by multiplex DNA PCR on lueteltu alareunassa. +, Monistettu; -, Ei täydennetty. 23x, 25x, 30x: RT-PCR sykliä. Kaikki muut geenit tutkittiin RT-PCR: llä 30 sykliä, jossa

GAPDH

vain 23 kierrosta.

CCND1 yli-ilmentyminen in Primary ESCC ja sen kliinispatologiset Association

Expression of CCND1 proteiinin lisätutkimuksia immunohistokemia ESCC kudosten microarray (TMA) 171 ensisijaisen ESCC ja viereisen kirurgiset marginaali histologinen normaali ruokatorven kudoksia. Tapauksissa 10% syöpäsoluja positiivisia tumavärjäystä pisteytettiin CCND1 yli-ilmentymisen. Yhdeksänkymmentä neljä 171 tapausta (55%) osoitti CCND1 yliekspressio, kuten 42 tapausta grade 1+, 35 tapausta grade 2+ ja 17 tapausta grade 3+ (Kuva. 5A). Sitä vastoin vain hajanaisia ​​positiivisia soluja havaittiin tyvisoluissa normaalin ruokatorven epiteelin.

.

,

Top paneelit

, immunohistokemiallinen värjäys

CCND1

.

Vasen

, hajallaan positiivisuus

CCND1

etenkin Tyvisolukerroksessa, nähdään normaaleissa ruokatorven epiteelissä (alkuperäinen suurennos, × 200).

Middle

, kyse ESCC on negatiivinen

CCND1

lauseke (alkuperäinen suurennos, × 200).

Oikea

, hajanainen ja vahva tumavärjäystä varten

CCND1

tässä tapauksessa ESCC (alkuperäinen suurennos, × 200).

Bottom paneelit

, FISH-analyysillä. Green signaalit viittaavat viite anturi chr 11 sentromeeriantigeenin taas punaiset signaalit ovat tavoite koetin

CCND1

.

Vasen

, unamplified normaalissa ruokatorven epiteelin,

Lähi

, joka on unamplified ESCC tapaus.

Oikea

, monistettu ESCC tapaus.

B

. Tulokset

CCND1

vahvistusta ja ilmentymistason 94 parafinoidut ensisijainen ESCC.

testataan korrelaatio CCND1 yli-ilmentymisen ja kliinis ominaisuuksia, kuten kasvaimen koko, laatu, imusolmuke etäpesäke, ja potilaan ikä. CCND1 yliekspressio oli merkitsevästi yhteydessä imusolmuke etäpesäke (

p

= 0,006) (taulukko 1), mutta ei pT, laatu, tai potilaan iän (

p

0,05, vastaavasti). Niissä tapauksissa, joissa CCND1 yliekspressio, ei ollut merkittävää eroa koskien imusolmuke etäpesäke, välillä CCND1 korkean ilmentymisen ryhmät (grade 2+ ja 3+) ja alhaisen ilmentymisen ryhmässä (grade 1+) (

p

= 0,37).

CCND1 yliekspressio johtuvalta Geeniamplifikaation mutta ei aktivoidu β-kateniinin signalointi

vahvista geenimonistuminen

CCND1

perusterveydenhuollossa ESCC ja tutkia yhdistys sen yliekspressio, haimme fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) analyysi kaupallisten

CCND1

anturi yhdessä CEP 11 anturi 94 tapauksissa.

CCND1

monistettiin 50 tapauksessa (53,2%) ja ei-monistettiin 44 tapausta (46,8%) (kuvio. 5B). Lisäksi geenin monistaminen FISH ja proteiinin yliekspressio immunohistokemiallisesti varten

CCND1

osoitti 91,5% (

κ

= 0,69) vastaavuutta.

immunohistokemiallisesti, tumavärjäystä varten β-kateniinin oli positiivinen vain 4/94 tapauksissa (4,3%). Kaikki β-kateniinin positiivisia tapauksia olivat negatiivisia CCND1 immunohistokemiallisesti.

Keskustelu

ESCC on kuudes kohtalokkain syöpä maailmassa ja on 90% tapauksista kaikista ruokatorven syöpiä Kiinassa [19]. Vaikka ilmaantuvuus ESCC on alhainen länsimaissa, tämä kasvain on yleinen Aasiassa, erityisesti joillakin alueilla Kiinassa kuten Henanin maakunnassa ja Shantou kaupungin [20]; [21]. Kuten muutkin syövät, ympäristö- ja geneettiset tekijät ESCC synnyssä. Tupakka, alkoholi, kuuma juoma /ruoka, ravinnon puute ja akalasia on katsottu merkittävä ympäristöongelma riskitekijöitä ESCC, mistä kertoo epidemiologisiin tutkimuksiin [21]; [22]. Samalla sytogeneettiset ja molekyyligenetiikan analyysit osoittivat useita geneettisiä poikkeavuuksia ESCC, kuten kromosomi tappiot ja voitot. Selvittäminen Näiden poikkeamia johtaa ymmärtämään paremmin ESCC synnyssä, ja kehittää hoitomuotoja ja biomarkkereita ennustamiseen etäpesäkkeiden ja ennustetta. Tässä tutkimuksessa olemme tehty kattava tutkimus perimää poikkeavuuksien ESCC korkean resoluution array-pohjainen CGH, rajaamiseksi minimaalinen kromosomi alueilla monistukset ja poistot. Tulokset antavat yksityiskohtaisia ​​kuvia useiden geneettisten vaurioiden ESCC genomeja, ja myös antaa vihjeitä edelleen kriittisten onkogeenien ja APT tässä maligniteetti.

Yhdenmukainen aiempien havaintojen [4] – [14], toistuvat voitot mukaan lukien 11q13 (

CCND1

,

EMS1

), 3q26 (

EIF5A2

), 21q22 (

ETS2

) ja 8q24

(MYC)

, ja tappiota 3p, 5q, 9P, 13q, 18q ja 21 q tavoite geenejä, kuten

FHIT

,

APC

,

RB1 ​​

ja

CDKN2A

, tunnistettiin ESCC solulinjoissa tässä tutkimuksessa. Joukossa amplikoneja havaittu, 11q13.3-13.4 on useimmin monistettu kromosomialueen. Kaksi geeniä,

CCND1

ja

CTTN

sijaitsevat tällä alueella, tunnistettiin korkean tason monistuksia useita ESCC solulinjoissa. Vaikka tutkittu mRNA-tasolla, löysimme useita geenejä, kuten

CCND1 CTTN, FGF19

ja

SHANK2

, olivat usein yli-ilmentynyt ESCC solulinjoissa. Äskettäin Sawey ym todettu, että

CCND1

ja

FGF19

oli kaksi ajo onkogeenien maksasolukarsinoomassa [23]. Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet

CCND1

. Tutkimuksemme vahvisti usein vahvistusta (53,2%) ja yhdenmukaisten proteiinin yliekspressio (51,1%) on

CCND1

perusterveydenhuollossa ESCC. Lisäksi positiivinen korrelaatio

CCND1

vahvistus /yli-ilmentymisen ja imusolmuke etäpesäke in ESCC havaittiin, mikä osoittaa, että

CCND1

voi toimia ennustetyövälineenä merkkiaine ESCC, linjassa muiden tutkimusten ([ ,,,0],24] – [27]. sen lisäksi vahvistus, CCND1 yliekspressio voidaan ajaa transkription säätelyyn, kuten Wnt-signalointireitin. Beta-kateniinin on keskeinen jäsen Wnt-signalointireitin, joka on ehdotettu mukana ruokatorven syöpä aloittamisen ja etenemiseen [28]. tässä tutkimuksessa vain 4,3% (4 94) ESCC tapauksessa havaittiin beeta-kateniinin ydinvoiman ilme. tulokset osoittavat, että genominen voitto 11q13 vuonna ESCC on ensisijainen mekanismi johtaen

CCND1

vahvistusta ja yli-ilmentymisen. Tämä mekanismi on myös raportoitu muissa elimissä, kuten pään ja kaulan syöpä [29], aivolisäkkeen kasvaimet [30], ja rintasyövän [31].

CTTN on aktiini liittyvä rakennustelineet proteiinia, sitoo ja aktivoi aktiini liittyvien proteiini-kompleksin (Arp2 /3) ja siten säätelee haarautunut aktiini verkkojen muodostumista dynaamisen aivokuoren aktiini liittyviä rakenteita.

CCND1

ja

CTTN

usein yhteistyössä monistettiin syövissä [32] – [34]. Aiemmin

CTTN

on tunnistettu

bona fide

onkogeeni sijaitsee 11q13 mukana ESCC Karsinogeneesin edistää etäpesäkkeiden eri caners kuten ESCC, rinta-, hepatosellulaarinen, ja pään ja niskan levy- solukarsinoomat [32] – [34]. FGF19, fibroblastikasvutekijän yhdessä CCND1, äskettäin raportoitu merkittävä kuljettaja onkogeeni maksasolukarsinoomassa [23]. Osallistuminen FGF19 ja muihin uusiin oncogenes yksilöityjen ESCC synnyssä ja sukuinen molekyyli mekanismeja on tutkittava tarkemmin.

Muiden usein kromosomi voittoja, 3q26-27 on uusi amplikonin havaittu ESCC. Tunnettu onkogeenien asuvat tällä alueella kuuluu

EVI1

,

EIF5A2

ja

PIK3CA

, joiden on raportoitu olevan potentiaalisia onkogeenisia toimintoja. Lisäksi

TRIO

ja

CTNND2

at 5p,

MYC

klo 8q22,

KLF5

ja

POU4F1

at 13q ja

NKX2.2

klo 20p katsottiin myös pelata onkogeenisen rooleja muissa kasvaimissa [35]; [36] ja saattaa myötävaikuttaa ESCC syövän synnyn. Alueet korkean tason poistot sisältää tunnettuja tai ehdokas APT havaittiin myös, mukaan lukien 18q11-23 sisältävä

Smad2, Smad4

ja

DCC

(EC1, EC109, HKESC3, SLMT1 ja KYSE70), 8p22 joka sisältää

DLC1

(EC1, KYSE70, 410 ja 520) sekä alueen 14q32 sisältää

DLK1

ja

MEG3

(EC1, EC109 ja KYSE70). Muita korkean tason poistot sisältäviä ehdokas APT sisältää 4q21.23-21.3 (

MAPK10

,

PTPN13

ja

ARGAP24

), 7p21.2 (

DGKB

), 7q35 (

CNTNAP2

), 8q11 (

CEBPD

), 10p11 (

PARD3

), 13q31.1 (

SPRY2

) ja 16q22 -23 (

ATBF1

). Useimmat näistä poistettu alueet ESCC on raportoitu myös yhden tai useamman muun syövän tyypit [37]; [38]. Tärkeää on, geneettinen /epigeneettiset häiriöistä tai muuttunut ekspressiotasot joidenkin TSG ehdokkaiden edellä mainittiin, mukaan lukien

Smad2

,

Smad4

,

DCC

,

DLC1

ja

PARD3,

on raportoitu ESCC kasvaimia ja solulinjoissa, mikä osoittaa, että aCGH tutkimuksessa käyttämällä useita kasvainsolulinjoja voisi helpottaa kriittisten syövän geenien ihmisen kasvaimissa. [39] – [42].

Yhteenvetona useita minimaalinen alueilla poistoja ja amplikonien havaittiin 10 yleisesti käytetty ESCC solulinjojen tässä tutkimuksessa, ja useat uudet onkogeenit sijaitsee useimmin monistettu alue 11q13, kuten

FGF19

,

SHANK2

ja

CCND1

, on tunnistettu. Tutkimus tarjoaa keskeisiä tietoja edelleen ja luonnehdinta kriittisten onkogeenien ja APT mukana ESCC synnyssä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

Ten ESCC solulinjoissa (EC1, EC18, EC109, HKESC1, HKESC2, HKESC3 ja SLMT1 ovat Kiinan potilaista, kun taas KYSE70, KYSE410 ja KYSE520 ovat japanilainen potilasta) ja kolme kuolemattomaksi normaali ruokatorven epiteelisolu- linjat (Het-1A, NE1 ja NE3) käytettiin tutkimuksessa [ ,,,0],43]. Solulinjoja pidettiin RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone, Logan, UT), viljeltiin 5% CO

2 37 ° C: ssa.

kasvain näytteet

yhteensä 171 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) Chinese ESCC näytettä (2007-2008) ja viereisen kirurgiset marginaali histologisia normaali ruokatorven kudoksia saatiin, saatuaan potilaiden kirjallinen tietoon perustuva suostumus ja institutionaalisten Review Board (IRB) hyväksynnän Cancer Hospital, Kiina Academy of Medical Sciences, Peking, Kiina. Kaikki potilaat olivat aiemmin hoitamaton (eli ilman kemoterapiaa tai sädehoitoa), jossa kokoisen primaarikasvainten. Keski-ikä potilailla oli 58 vuotta (vaihteluväli 33-78), ja miesten ja naisten suhde oli 4.2: 1 (138: 33). Hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) -stained osat tarkistettiin diagnoosin varmistamiseksi ja määritellä kasvaimen alueilla. Kasvaimen vaihe (PT) ja laatu määriteltiin mukaan nykyinen WHO: n luokituksen kasvaimia.

Array CGH Analysis

Korkean molekyylipainon kromosomi-DNA eristettiin solulinjoista käyttämällä Qiagen (Qiagen , Hilgen, Saksa). Puhtaus ja molekyylipaino DNA tutkittiin agaroosigeeleillä. 1-Mb resoluutio koko genomin paneelit, 3040 BAC /PAC-kloonit toimittivat Sanger Institute, UK (https://www.sanger.ac.uk/Projects/Microarrays/) [44]. Kloonit yksityiskohtia luetellaan Ensembl (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html).

Array-CGH suoritettiin vähäisin muutoksin [43] – [45]. Lyhyesti, näyte DNA (600 ng) leimattiin Cy5-dCTP (Amersham Pharmacia), kun taas viite DNA normaalin ääreisveren mononukleaarisissa soluissa (PBMC) terveiltä Chinese luovuttajilta Cy3-dCTP käyttäen BioPrime Array CGH Genomic merkintäjärjestelmä (Invitrogen, Carlsbad, CA). Yhtiöimätön nukleotidit poistettiin käyttämällä Puhdistus Module toimitetaan merkintäjärjestelmä. Merkitty näytteitä ja normaalin DNA: n (50 ui kutakin) sekoitettiin ja saostettiin etanolilla yhdessä 67,5 ui ihmisen Cot-1 DNA: ta (Invitrogen). Sitten sekoitettu DNA suspendoitiin uudelleen 30 ul: aan hybridisaatiopuskuria, denaturoitiin ja esihybridisoitiin kosteuskammiossa sisällä hybridisaatio uunissa 5 rpm 2 tuntia 37 ° C: ssa. Esihybridisaatioseokseen valmistettiin seuraavasti: 80 ui Herring Sperm DNA (10 mg /ml, Sigma) ja 67,5 ui ihmisen Cot-1 DNA: ta (Invitrogen) saostettiin, suspensoitiin uudelleen 120 ul: aan hybridisaatiopuskuria ja denaturoitu 10 min 72 ° C: ssa. Sen jälkeen esihybridisaatio, The esihybridoitiin koetin lisättiin luistin päälle, ja inkuboitiin 5 rpm 48 tuntia 37 ° C: ssa. Objektilasit huuhdeltiin ja pestiin kolme kertaa, ilmakuivattiin ja varastoitiin 4 ° C: ssa.

Hybridisoituja diat skannattiin käyttämällä Axon 4000B skanneri (Axon Instruments Inc, Union City, CA) ja analysoitiin GenePixPro 4.0 kuva analyysin ohjelmisto jossa täplät määriteltiin ja mediaani fluoresenssivoimakkuuksien laskettiin. Taustalla vähennetään fluoresenssivoimakkuuksien tuotiin mittatilaustyönä Microsoft Excel malliin. Erityinen paikka jätettiin jos kahtena paikkoja on ero 10%. Keskiarvot päällekkäisiä paikkoja esiteltiin graafista näyttöä muodossa keskimääräisen log2 (Cy5 /Cy3) suhde vastaan ​​matkan pitkin kunkin yksittäisen kromosomin (Mb). Kromosomi kopioluvun muutoksia pisteytettiin hemizygous tappio jos log2 suhde vaihtelee -0,2–0,7, ja homotsygoottinen poisto jos -0,7, tai genomisia vahvistuksen log2 suhde 0,2 0,5, ja vahvistusta jos 0,5. Kopioi numero muutoksia nähty sukupuolikromosomeiksi jätettiin analyysissä.

Multiplex Perimän PCR

Multiplex PCR mahdollistanut puolikvantitatiivinen arviointi DNA: n monistumisen /tappio.

GAPDH

geeni valittiin sisäisenä kontrollina. Amplifioimme

CCND1

ja sisäisen valvonnan samanaikaisesti. Sillä

CCND1

, alukkeiden parin (eteenpäin: 5′-tgctgcgaagtggaaaccat ja reverse: 5′-caacaagttgcagggaagtc) tuotti PCR-tuotteen 227 ep. Sillä

GAPDH

, alukkeiden parin (eteenpäin: 5′-gcctcactccttttgcagac ja reverse: 5′-gatgaccttgcccacagcct) tuotti PCR-tuotteen 157 ep. PCR-reaktiot suoritettiin lopputilavuudessa 20 ui, joka sisälsi 200 mM deoksinukleotiditrifosfaattia, 2,5 mM MgCl

2, 50 ng DNA: ta, 0,5 mM kutakin oligonukleotidia ja 0,5 U AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA). Reaktio-olosuhteet olivat seuraavat: ensimmäinen denaturointi 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 30 sykliä 95 ° C 30 s, 60 ° C: ssa 30 s, 72 ° C: ssa 30 s ja lopullinen pidentäminen 72 ° C: ssa 10 min. PCR-tuotteet erotettiin 2% agaroosigeeleissä ja visualisoitiin. Kaikki reaktiot suoritettiin vähintään kaksi kertaa itsenäisen kokeen.

Semi-kvantitatiivinen Käänteinen transkriptio-PCR

Yhteensä-RNA uutettiin solupelleteistä käyttämällä TRI Reagent (Molecular Research Centre, Cincinnati, OH). Käänteistranskriptio-PCR (RT-PCR) suoritettiin, kuten on kuvattu [43], käyttäen

GAPDH

kontrollina. Alukkeet kaikkien geenien annetaan pyynnöstä. PCR-ohjelma käyttää alustavan denaturoinnin 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 30 sykliä reaktion (94 ° C: ssa 30 s, 55 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C 30 s), (tai 23, 25 sykliä CCND1), jossa lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 10 min.

ESCC Tissue Microarray (TMA) B

kussakin tapauksessa, sekä kasvaimen ja normaaleissa kudoksissa monistettiin, jonka halkaisija on 1 mm lasilevyllä. Ennen näytteen ottamisen, HE-värjätään FFPE slide tapauskohtaisesti havaittiin mikroskoopilla ja sijaintipaikat tyypillisesti morfologia on tyypillinen ESCC ja ympäröivä normaali kudokset ympyröity. Näytteitä otettiin ympyröityä paikoista parafiiniblokkiin käyttäen Beecher Instruments Tissue ryhmittäjällä (Silver Springs, MD). Kunkin lohkon kaksi 1 mm ytimiä lävistetty ympyröityä alueiden luovutuslohkon ja puettu vastaanottoblokista edustuksen varmistamiseksi näytteiden, ja välttää puuttuvien tietojen takia menetys kudoksen sydämiä. Kaikkiaan 171 ESCC yksilöitä, 54 yksilöitä vastaavassa normaalissa limakalvon oli puettu kaksi vastaanottajalohkot. Tissue mikrosiru osat (4 pm) leikattiin 24 h ennen immunohistokemiallisesti.

Automatisoitu immunohistokemia

Immunohistokemia suoritettiin Ventana Benchmark XT Autostaineriin (Ventana, Tucson, USA), käyttämällä monoklonaalisia kanin anti ihmisen CCND1 /sykliini D1 (klooni SP4) ja monoklonaalisia hiiren anti-ihmisen β-kateniinin (Clone β-kateniinin-1) DAKO (Glostrup, Tanska) kanssa Ventana Ultraview sarjat (Ventana, Tucson, USA). Leikkeitä inkuboitiin 24 minuutin ajan 37 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden. Diaminobenzidine tai 3-amino-9-etyylikarbatsolia käytettiin kromogeeneina ja objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä ennen asennusta. Molemmat kromogeeneja käytetään säännöllisesti koko osiin ennen TMA testaus saatiin yhtäpitävät tulokset kannalta sekä pintojen ja intensiivisyys immunovärjäyksen. Negatiiviset kontrollit luotiin poisjättäminen ensisijaisen vasta-aineen ja korvaavan fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS).

CCND1 ja β-kateniinin ilmentymisen tasot määritettiin semi-kvantitatiivisesti käyttäen neljän porrastetusti pisteytysjärjestelmän, joka perustuu positiiviseen tumavärjäystä osa kasvainsolujen (arvosana 0 = 0-10%; luokka 1+ = 11-25%; luokka 2 + = 26-50%; luokka 3 + = 51-100%). Pistemäärä 0 pidettiin negatiivinen, kun pistemäärä 1+, 2+ tai 3+ pidettiin positiivisena. Sillä β-kateniinin, värjäytymistä sytoplasmassa saattanut olla läsnä, mutta ei ollut mukana määrittämisessä positiivisuus.

Fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) B

kaloille analyysi

CCND1

geenimonistuksen, kaksi suoraa-leimattuja koettimia käytettiin, Vysis

CCND1 Twitter /CEP11 FISH Probe Kit lukien LSI

CCND1

(11q13) SpectrumOrange vastaan ​​

CCND1

(11q13) ja CEP11 SpectrumGreen (Vysis /Abbott, IL, USA) vastaan ​​sentromeerin kromosomin 11 FISH-analyysillä tehtiin mukaan ”LSI Locus tunniste DNA-koettimet” peräisin Vysis.

CCND1

geenin kromosomiin 11 sentromeeriantigeenin suhde mitattiin vähintään 60 ytimet kasvainsoluista ja keskimääräinen pisteet otettiin. Havaintoja enemmän kuin kaksi kopiota

CCND1

jokaiselle kromosomi 11 pidettiin myönteisenä merkkinä

CCND1

geenimonistuman.

Tilastollinen analyysi

Statistical analyysi suoritettiin käyttäen SPSS versio 12.0. Yhdistyksen välinen FISH ja IHC tulokset sekä kliinis-patologisia muuttujat suoritetaan käyttäen χ

2 -testi. Kaikissa testeissä,

p

-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

tukeminen Information

Kuva S1.

Koko genomin profiilit 10 ESCC solulinjoista 1-Mb aCGH. Normalisoitu log2 signaalin intensiteetin suhde piirrettiin käyttämällä SeeGH ohjelmistoa. Log2 signaali suhde 0 edustaa vastaavan kopion väliltä näytteen ja viite DNA (yksityiskohdat Materiaalit ja menetelmät). Cytoband malli jokaiselle kromosomi on vasemmalle kutakin alaa. Pystysuorat viivat tarkoittavat log2 signaalisuhteet -2-2 kopio numero kasvaa oikealle ja vähentää vasemmalle. Jokainen musta piste edustaa yhtä BAC klooni.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0039797.s001

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme Dr Tzer Jing Seng varten avulla array-CGH, ​​Profs Gopesh Srivastava ja George Tsao (University of Hong Kong) joillekin ESCC ja normaali ruokatorven epiteelisolujen linjat, ja DSMZ (saksalainen kokoelma mikro-organismien Cell Cultures) ja KYSE solulinjojen (Shimada et al., Cancer 69: 277-284, 1992).