Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta ymmärtämystä peräsuolen syövän ja kohdennettujen lääkehoidon, metastaattista vaiheessa taudin esiintyminen ei reagoinut hoitoon. Koska vapautuminen normaalin apoptoosin myötävaikuttaa patogeneesiin peräsuolen syöpä, uusia nukleosidianalogeja syntetisoitiin täällä ja arvioitiin niiden kyky indusoida apoptoosia, ja aiheuttavat solujen kuoleman kahden peräsuolen adeno-sinoomasolulinjoja, Caco-2- ja HT-29. Kolme novel nukleosidianalogeja tässä arvioitava osoitti sytotoksista aktiivisuutta, mitattuna MTT-määritystä vastaan ​​molemmissa solulinjoissa: IC

50-arvot vaihtelivat välillä 3 ja 37 uM, jossa Caco-2-solut ovat herkempiä kuin HT-29-soluja. Verrattuna kamptotesiiniin, positiivinen kontrolli, nukleosidianalogien oli huomattavasti vähemmän myrkyllisiä normaaliin stimuloimattomasta leukosyyttien (

p

0,05). Lisäksi nukleosidien kykenivät indusoimaan apoptoosia mitattuna kasvu kaspaasi 8 ja kaspaasi 3: n aktiivisuuden edellä, että valvonnan. Tätä lisäksi tukee saatujen tietojen anneksiini V-FITC määrityksissä. Huolimatta marginaalinen muutokset mitokondrion kalvon potentiaalia, kaikki kolme nukleosidien aiheutti merkittävän kasvun sytosolin sytokromi c (

p

0,05), ja vastaava lasku mitokondrioiden sytokromi c. Morfologinen analyysi Molempien solulinjojen osoitti nopean ulkonäkö vacuoles altistumisen jälkeen kaksi nukleosidien, kun taas kolmas aiheutti solujen irtoamisesta, viivästynyt soluliman vakuolisaatiota ja ydinvoiman poikkeavuuksia. Alustavat tutkimukset, käyttäen autophagic ilmaisin monodansylcadaverine ja klorokiini positiivisena kontrollina, osoitti, että kaksi nukleosidien indusoi muodostumista autophagic vakuolien. Yhteenvetona uusi nukleosidianalogien osoitti selektiivinen sytotoksisuus kohti sekä syöpäsolun linjat ja ovat tehokkaita initiaattoreita epätavallinen apoptoottisen vasteen, joka osoittaa niiden mahdollisuuksia toimia rakenteellisen rakennustelineiden varten voimakkaampi analogeja.

Citation: Harmse L, Dahan -Farkas N, Panayides JL, van Otterlo W, Penny C (2015) Poikkeava apoptoottinen vaste peräsuolen syöpäsolujen Novel nukleosidianalogeja. PLoS ONE 10 (9): e0138607. doi: 10,1371 /journal.pone.0138607

Editor: Ferenc Gallyas Jr., University of Pecs Medical School, Unkari

vastaanotettu: 28 helmikuu 2015; Hyväksytty: 1. syyskuuta 2015 mennessä; Julkaistu: 21 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Harmse et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Kaikki tiedot sisältyvät käsikirjoituksen ja tukevat tiedot.

Rahoitus: Tätä työtä tuetaan tutkimuksen Niche alueet ohjelmaansa National Research Foundation (NRF) Etelä-Afrikan ja University of the Witwatersrand Terveystieteiden tiedekunta tutkimuskomitea . JLP tukivat NRF Scarce Skill Program opiskeluun kohti Ph.D. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tietojen kerääminen, analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on tapahtunut huomattavaa edistystä ymmärtämään molekyylitason mekanismien peräsuolen syöpä. Kuitenkin, vaikka käytetään kohdennettua lääkehoidon, peräsuolen syöpä pysyy liittyvät huonoon ennusteeseen. Vaikka huumeet kuten Bevasitsumabin ovat parantaneet selviytymisen aika etäpesäkkeitä yli 20 kuukautta, ne eivät ole pystyneet vaikuttamaan parannuskeinoa. Viime aikoina kliiniset kokeet ovat osoittaneet, etteivät tyrosiinikinaasin estäjät kuten sunitinibi, joka aiheutti lisääntymistä vakavuus ja vakavien haittavaikutusten minimaalisella terapeuttista hyötyä [1]. Siksi etsiä tehokas hoitava kehittyneen peräsuolen syöpä on edelleen etusijalla.

Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että normaali apoptoottinen prosessi on vahingollista kolorektaalisyövässä [2-5]. Dysregulaatio apoptoosin edistää resistenssin kehittyminen kemoterapiaa ja huonoon ennusteeseen [6]. Apoptosis, ensimmäisenä kuvannut Kerr vuonna 1972 [7], on ominaista joukko morfologisia muutoksia, kuten solukalvon kupliminen, kromatiinin tiivistyminen, ydin- pirstoutuminen ja muodostumista apoptoottisia kappaleita. Apoptoosin tuntomerkkejä ovat altistuminen fosfatidyyliseriinin ulko- seloste solukalvon [8, 9], muutokset mitokondrion kalvon läpäisevyyden [10] ja vapauttamaan sytokromi c: n päässä mitokondrion välisen kalvon tilaa, jossa myöhemmin aktivoinnin efektori caspases [11].

Apoptoosi on välttämätöntä sääntelyä normaalien solujen liikevaihdon suoliston epiteelin. Kuitenkin kolorektaalisyövässä, sekä ulkoisten ja luontaisten apoptoottisia reittejä vaarantuvat lisääntymistä edesauttavia neoplastisten solujen. Kolorektaalisyövässä, vaikka FAS-reseptorin ilmentymisen, solut ovat resistenttejä FAS-ligandi-välitteisen apoptoosin, joka osoittaa vian FAS-välitteistä signalointia, [12]. TNF liittyvää apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) reseptori välitteistä apoptoosia normaalisti yliaktiivista syöpäsoluja; kuitenkin, kolorektaalisyövässä, kestävyys TRAIL-reseptorin välittämien apoptoosia on havaittu [13]. P53-tuumorisuppressorin geenituote on mutatoitunut tai puuttuu 85% paksusuolen ja peräsuolen syöpiä. Tämä transkriptiotekijä on välttämätöntä aktivointi luontaisen apoptoottisen reitin sekä ilmentymisen sykliiniriippuvainen kinaasi-inhibiittori p21

waf1 /CIP1. Solut, jotka ovat virheellisiä p53 on vähentynyt tasolle apoptoottisten proteiinien, mikä suosii leviämisen neoplastisten solujen [14].

kemoterapeuttisia aineita, jotka kykenevät indusoimaan apoptoosia ovat hyödyllisiä, koska ne johtavat kuolemaan syöpäsoluja käynnistävät tulehdusreaktio ja tuumorilyysioireyhtymän liittyvät kuolion. Nukleosidianalogeja käytetään laajasti syövän hoitoon ja hallintaan virusinfektioiden kuten Herpes ja HIV. Lääkkeet, jotka kuuluvat tähän luokkaan tiedetään indusoivan apoptoosia syövissä, joissa ne ovat tehokkaita. [15]

Esillä olevassa tutkimuksessa, uusia nukleosidianalogeja seulottiin vastaan ​​kahden paksusuolen syövän solulinjat, tutkimaan sekä niiden sytotoksisia vaikutuksia ja niiden mahdolliset apoptoosin. Osoitimme, että huolimatta suhteellisen korkeat IC

50-arvot määritettynä MTT sytotoksisuusmääritys, jotkut nukleosidianalogit olivat verrattavissa kamptotesiiniin suhteen niiden kyky indusoida apoptoosia. Lisäksi yhdisteet aiheuttama epätavallinen mitokondrion vaste, joka voi antaa lisää vihjeitä taustalla apoptoottinen poikkeavuuksia kolorektaalisyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

HT-29 (HTB -38 ™) ja Caco-2 (HTB-37 ™) ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinjat saatiin ATCC: stä, viljeltiin vähän glukoosia Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), joka sisälsi 5% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia. Viljelyalusta ja vasikan sikiön seerumia saatiin Highveld Biologicals, Etelä-Afrikka. Soluja kasvatettiin 75 cm

2 kulttuuri pulloihin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2. Molemmat solulinjat alikasvatettiin jolloin se oli yhtymäkohta. Lyhyesti, solut pestiin kahdesti 10 ml: lla fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, minkä jälkeen lisättiin 4 ml trypsiiniä ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Erillinen solut siirrostettiin samaan pulloon. Kamptotesiini (Sigma), joka on tunnettu apoptoosin indusoija, ja inhibiittori topoisomeraasi-1, käytettiin positiivisena kontrollina kaikissa koemenetelmissä.

solujen elinkelpoisuuden arviointi

arviointi testi nukleosidin sytotoksisuus suoritettiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT), määritys (Sigma). Trypan Blue (Sigma) lukuun määritystä käytettiin arvioimaan elinkelpoisuuden syöpäsolujen ennen solujen nukleosidisille solujen elinkelpoisuuden määritykset. Solut ympättiin 96-kuoppalevyille solutiheyteen 9 000 solua /kuoppa, annetaan kiinnittyä kasvua pinnan 4 tuntia ja sitten altistetaan nukleosidien 48 tuntia pitoisuuksina välillä 1 ja 120 uM. MTT-määritystä suoritettiin oleellisesti, kuten on kuvattu Mossman [16], paitsi liuottamalla formatsaanikiteet DMSO: ssa. Lyhyesti, inkuboinnin jälkeen MTT, 100 ui elatusainetta korvattiin DMSO helpottamiseksi liukenemisen formatsaanikiteet. Absorbanssi liuennutta formatsaanikiteet mitattiin 540 ja 690 nm: ssä Labsystems iEMS levylukijalla. Tiedot saatiin kokeista, jotka toistettiin ainakin kolme kertaa, kukin datapiste määritetään neljänä kappaleena. Sigmoidinen annos vastekäyrät rakennettu GraphPad Prism, versio 5.

eristäminen ihmisen ääreisvalkosoluista

Lupa eristää ihmisen leukosyyteistä terveiltä vapaaehtoisilta saatiin Human eettisen komitean tiedekunnan Health Sciences, University of the Witwatersrand (ulottuma numero, M070519). Kirjallinen, tietoon perustuva suostumus kustakin luovuttajasta saatiin koekäyttöä varten hänen /hänen valkosoluja tutkimukseen. Ääreisvalkosoluista yhdeltä luovuttajalta eristettiin verestä kerätään heparinisoidulle putkeen. Punasolut selektiivisesti hajotettiin käyttämällä Versagene veren DNA Kit (Gentra Systems). Juuri valmistettua leukosyyttien määrittämiseen käytettiin nukleosidi myrkyllisyys normaaleille soluille. Leukosyytit siirrettiin RPMI (Highveld Biologicals) viljelyväliaineessa, johon on lisätty 2 mM glutamiinia (Sigma) ja 10% vasikan sikiön seerumia (Separations). Sen jälkeen korjuuseen leukosyyttien, niiden elinkelpoisuus määritettiin trypaanisiniekskluusiolla määritys ennen niiden altistetaan nukleosidien 24 tuntia.

Arvio apoptoosin

induktio kaspaasi 3 ja kaspaasi 8 toimintaa.

kaspaasi 3 ja kaspaasi 8 erityisiä kolorimetrisiä määrityksiä, nimittäin CPP32- ja FLICE, käytettiin mittaamaan kaspaasiaktiivisuus kohti valmistajan protokollaa (BioVision Research Products). Taso kaspaasiaktiivisuus solulysaateissa oli suoraan verrannollinen absorbanssin

p

nitroaniliinin (pNA) mitattiin 405 nm: ssä Labsystemsin iEMS Multiscan levy lukija. Solut siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 50 000 solua per kuoppa, ja annettiin kasvaa 18 tuntia ennen käsittelyä nukleosidien. Proteiinipitoisuus standardoitu kaikissa testinäytteistä. Kaspaasi 3 ja kaspaasi 8-aktiivisuus mitattiin seuraavasti eri altistusaikojen jälkeen solujen testi nukleosidien, tyypillisesti 2, 4, 8, 12, ja 24 tuntia lisäämisen jälkeen nukleosidien viljeltyihin soluihin.

mittaus mitokondrion kalvon potentiaalia.

kationinen väriaine 5,5 ’, 6,6′-tetrakloori-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine jodidia (JC-1) on selektiivinen mitokondrioita ja sen luontainen fluoresenssi tekee hyödyllistä mitata sähkökemiallisen gradientin, joka vallitsee kaikkialla mitokondrion kalvon. Protokolla seurasi kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti (BD Pharmingen). JC-1 väriaine kerääntyy mitokondrioissa terveiden solujen fluoresoivan punaisina aggregaatteja. Solut siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 50 000 solua per kuoppa, ja annettiin kasvaa lähes konfluenssiin ennen käsittelyä nukleosidien. Virtaussytometria, jossa eksitaatio /emissio suodattimet 485/540 nm (vihreä fluoresenssi) ja 540/590 nm (punainen fluoresenssi), käytettiin mittaamaan vaikutuksen testin nukleosidien mitokondrion kalvon potentiaalia. Mitokondrioissa sisältää punaista JC-1 aggregaatit terveissä soluissa havaittiin FL-2 kanava (ylempi portti scattergraphs), kun taas vihreä JC-1 monomeerien apoptoottisia soluja havaittiin FL-1 kanava (alempi portti scattergraphs ).

Measurement mitokondrioiden ja sytoplasman sytokromi c.

ihmisen sytokromi c Titerzyme Entsyymi immunometrisissä (määritys Designs Inc.) käytettiin mittaamaan pitoisuutta sytokromi c mitokondrion ja soluliman jakeet solujen altistetaan tutkittavalle nukleosideja. Solut siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 50 000 solua per kuoppa, ja annettiin kasvaa 18 tuntia ennen käsittelyä nukleosidien. Käsiteltyjen solut kerättiin ja huuhdeltiin jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Sytosolifraktion saatiin suspendoimalla solupelletti solun kanssa permeabilisointipuskuriin, (250 mM sakkaroosi, 137 mM NaCl, 70 mM KCI, 4,3 mM Na

2HPO

4, 1,4 mM K

2HPO

4, 0,2 mg /ml Digitonin ja 0,1% Hydorol M) toimitetaan mitokondrio eristyspakkausta, (määritys Designs Inc.), joka jätti mitokondriot ehjä. Tätä seurasi sentrifugointi erottaa sytosolifraktion ja pelletoimiseksi mitokondriot. Mitokondriot sitten lyysattiin RIPA-puskurilla, joka koostui 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoksikolaatti ja 0,1% SDS.

apoptoosin määritys mitattuna anneksiini V-määrityksellä.

fosfatidyyliseriini (PS) translokaatiota ulomman solukalvon määritettiin fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -leimattu anneksiini V Virtaussytometriset analyysit FITC-leimattua anneksiini V ja propidiumjodidia suoritettiin valmistajan protokollan (BD Pharmingen), solujen altistettiin 100 uM kutakin testin nukleosidien tai kamptotekiinin 24 tuntia. Solut siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 50 000 solua per kuoppa, ja annettiin kasvaa lähes konfluenssiin ennen käsittelyä nukleosidien. Solujen värjäytyminen arvioitiin käyttämällä anneksiini V-FITC (vihreä fluoresenssi) sekä eksluusio propidiumjodidia (PI) (negatiivinen punainen fluoresenssi), tallennus vähintään 10

4 tapahtumaa. Altistuksen jälkeen testi nukleosidien, solut kerättiin ja analysoitiin virtaussytometrialla BD LSR II virtaussytometrillä. Tiedot piirrettiin scattergraph FITC-anneksiini V (vihreä fluoresenssi) edustaa X-akseli

versus

PI (punainen fluoresenssi) Y-akselilla.

kaspaasi 9 toimintaa.

kaspaasi 9 aktiivisuus määritettiin kanssa Abcam® kaspaasi 9 aktiivinen FITC -värjäyspakkausta. Kaspaasi 9 selektiivinen LEHD-FMK konjugoituna FITC tunkeutuu elävien solujen sitoutumaan aktiiviseen kaspaasi 9 peruuttamattomasti. Solut ympättiin steriili peitelaseille (50 000 per peitelasi) annettiin tarttua neljä tuntia ja altistetaan nukleosidien ja camptothecin vastaavasti 24 tuntia. Tämän jälkeen solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin sitten alustaan ​​37 ° C: ssa yhden tunnin ajan. Objektilasit pestiin PBS: ssä ja katsella Olympus BX41 epifluoresenssimikroskoopilla. Kuvat otettiin Olympus DP72 kamera ja analysoitiin Olympus CellSens ohjelmistopaketti. Solut, joissa aktivoitu kaspaasi 9 näyttö kirkkaan vihreä fluoresenssi.

Assessment of HT-29 ja Caco-2 solujen morfologia

vaikutus nukleosidien solumorfologiaan arvioitiin faasikontrastimikro- ja fluoresenssimikroskopiaan . Sillä faasikontrastimikroskopialla, soluja kasvatettiin 6 viljelylevyille (50 000 solua per kuoppa), annettiin kiinnittyä yön yli ja sitten altistettiin nukleosidien eri ajanjaksoina. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. Solut havaittiin Olympus CKX41 käänteismikroskoo- ja kuvia otettiin kiinni Olympus DP21 kamera. Solujen morfologia arvioitiin edelleen kanssa Hoechst 33342 (Life Technologies) ja akridiinioranssia (Life Technologies) fluoresoivia väriaineita. Soluja viljeltiin lämpösteriloida lasipeitinlevyille ja altistetaan nukleosidien vaihtelevina pitoisuuksina. Käyttämällä sopivia suodattimia, soluja havaittiin Olympus BX41 epifluoresenssimikroskooppia. Kuvat otettiin Olympus DP72 kamera ja analysoitiin Olympus CellSens ohjelmistopaketti.

arviointi Bcl-2: n ja Bax ilmaisun

Ilmaus ja solujen sijainti sekä Bcl-2: n ja Bax vuonna HT-29 ja Caco-solulinjoissa määritettiin immunofluoresenssimikroskopialla. Soluja kasvatettiin peitinlaseilla (50 000 solua per peitinlasi), annettiin kiinnittyä yli yön, ja altistetaan nukleosidit ja kamptotesiini 6 tuntia. Huuhtelun jälkeen PBS: llä, solut kiinnitettiin 3% formaldehydiä PBS: ssä 20 minuutin ajan. Solut huuhdeltiin ja läpäiseviksi 5 minuuttia 0,25% Triton X100: aa, joka oli valmistettu PBS: ään, jossa oli 0,5% naudan seerumin albumiinia (BSA). Seuraavat läpäiseväksi, soluja blokattiin 1% (BSA) PBS: ssä 1 tunnin ajan. Tämän jälkeen solut pestiin ja niitä inkuboitiin yön yli vastaavien primaaristen vasta-aineiden (Bcl-2 tai Bax PBS: ssä, jossa oli 0,5% BSA) 4 ° C: ssa. Hiiren anti-Bcl-2 ja hiiren anti-Bax saatiin BioVision ja käytetään pitoisuutena 10 mg /ml. PBS-pesun jälkeen soluja inkuboitiin yhteensopivista lajeista Alexa-fluor 568 (Abcam) sekundaarisella vasta-aineella. FITC-konjugoitua -falloidiinia (Abcam), käytettiin visualisoimaan solun tukirangan ja tumat visualisoitiin Hoechst 33342 tahra, kuten aikaisemmin on kuvattu. Solut katsottu käyttäen Olympus BX41 epifluoresenssimikroskooppia asianmukaiset suodattimet kullekin fluorokromi-. Kuvat otettiin Olympus DP72 kameran ja analysoitiin Olympus CellSens ohjelmistopaketin.

arviointi solujen induktion autophagy

Soluja kasvatettiin steriileillä peitelaseille 6-kuoppaisille levyille 9 (50 000 solua peitinlasi) annetaan kiinnittyä yön yli ja käsiteltiin 50 uM testissä nukleosidien. Klorokiini (50 uM) käytettiin positiivisena kontrollina, koska sen tiedetään aiheuttavan laajan autophagic onteloiden muodostumisen [17, 18]. Solut altistettiin yhdisteiden testaamiseksi, klorokiini ja kamptotesiini 3 tuntia, pestiin PBS: llä ja inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa 50 uM monodansyl-kadaveriinia (MDC) (Sigma) PBS: ssa 15 minuutin ajan [19, 20, 21]. Camptothecin sisällytettiin negatiivisena kontrollina vacuole muodostumista, koska se ei aiheuta vakuoliin muodostuksen kahdessa solulinjassa. Peitelaseja huuhdeltiin PBS: llä ja elävät solut tarkasteltiin Olympus BX41 epifluoresenssimikroskooppia. Kuvat otettiin Olympus DP72 kamera ja analysoitiin Olympus CellSens ohjelmistopaketti.

Nukleosidiset testiyhdisteitä

Uudet nukleosidijohdannaisiin, nukleosidi- 1, 2 ja 5 arvioitiin tässä tutkimuksessa syntetisoitiin School of Chemistry, University of the Witwatersrand, ja jolle on ominaista 1

H ja

13C-NMR, IR ja HRMS spektroskopia. Ne syntetisoitiin erilaisia ​​lähtöaineita Sigma-Aldrich mukainen modifioitu kuvattujen menetelmien Sproat, 1994 [22]. Nukleosidi 2 on tunnettu yhdiste, ja spektrejä kaksi muuta yhdisteet ovat saatavilla tekijöistä. Kantaliuokset (20 mM) Testin nukleosidien valmistettiin kudosviljelmän DMSO.

Tietojen analysointi ja tilastot

Kaikki tiedot analysoitiin ja annosvastekäyrät rakennettu käyttämällä Graph Pad Prism versio 5. erot valvontaa ja nukleosidi Käsitellyt näytteet testattiin merkitystä kanssa Prizm3 Instat ohjelmistopaketti, käyttäen varianssin analyysiä (ANOVA) sekä opiskelijan-t-testi, jossa on merkitys raja-arvo

p

0.05.

Tulokset

Nukleosidianalogit ovat sytotoksisia HT-29 ja Caco-2-solut

kolme novel pyrimidiiniä ribonukleosidia analogit tunnistettiin seulontamenettelyyn kaksikymmentä kolme uutta nukleosideja sillä on sytotoksinen vaikutus sekä HT-29 ja Caco-2-solulinjoissa, kun testattiin konsentraatiossa 100 uM. Rakenteiden kolme aktiivista nukleosideja on esitetty kuviossa 1A. Nukleosidi- 1 ja 2 olivat uridiinia analogit ja nukleosidin 5 oli sytidiinianalogi. Pyrimidiiniemäkset emäkset kytkettiin kautta

N

-glycosidic sidoksen hiileen 1 riboosi sokeria. Kaikki kolme molekyylit substituoitu kookkaita fenyyliryhmät hiilellä 5 riboosi sokeria. Nukleosidi 1 oli C-O sidos jossa on 4,4-dimetoksitrityyliryhmä ja nukleosidit 2 ja 5 kytkettiin tert- butyldiphenyl ryhmä kautta vakaa Si-O-sidoksen. Nukleosidien oli mielivaltaisesti numeroitu yksi-kaksikymmentäkolme ja testi nukleosidit numero yksi, kaksi ja viisi havaittiin olevan aktiivisia alkuperäisen seulontamäärityksissä.

viidenkymmenen prosentin kasvua estävä pitoisuus (IC

50 ) arvot saatiin kolmelle aktiivisia nukleosideja ja on esitetty kuvassa 1B. Kahdessa solulinjassa näytetään ero herkkyys kolme aktiivista testiyhdisteiden ja kamptotesiini. HT-29-solut olivat herkempiä kamptotesiiniin kuin Caco-2-solut, joiden IC

50-arvo 5,7 uM verrattuna 10,6 uM. Nukleosidi 5 oli tehokkain vastaan ​​HT-29-solujen IC

50 arvo 3,4 uM ja osoitti samanlaista toimintaa kuin Caco-2-solujen IC

50 arvo 4,8 uM. HT-29-solut, nukleosidi 1 ja 2 oli IC

50-arvot 6,4 ja 3,4 kertaa suurempi kuin kamptotesiinin, näyttää IC

50-arvot 36,3 ja 19,1 uM, vastaavasti. Tämä on ristiriidassa sen kanssa, Caco-2-solut, joissa nukleosidi 1 oli samankaltainen aktiivisuus kamptotesiiniin nukleosidianalogikäänteiskopioijaentsyyminestäjiin 2 oli 3 kertaa aktiivisempi kuin kiinilla jossa IC

50 arvo on 3,5 uM. Tyypillinen annos-vaste-käyrät on esitetty S1 kuviossa

Altistuminen juuri eristettyjä leukosyyttejä kunkin kolmen nukleosidianalogien ja kamptotesiini, vastaavasti osoittivat, että nukleosidi 2 oli suurin inhiboiva vaikutus leukosyyttien, aiheuttaen 38,5%: n lasku Leukosyyttikontaminaatiotaso elinkelpoisuuden pitoisuutena 100 uM. Tämä oli kaksi kertaa pienempi kuin vaikutus kamptotesiinin on leukosyyttien. Nukleosidi 1 nukleosidianalogikäänteiskopioijaentsyyminestäjiin 5 olivat vähiten myrkyllisiä leukosyyttien solujen elävyys pidettäessä 82,7% ja 99,9%, tässä järjestyksessä (katso kuvio 1 C).

nukleosidit aiheuttaa kaspaasin 8 ja kaspaasi 3 aktiviteetti

kaspaasi 8 on initiaattori kaspaasi, joka aiheuttaa pilkkoutumisen ja aktivointi efektori kaspaasien, kuten kaspaasi 3. Kuva 2 esittää kaspaasin 8 ja kaspaasi 3 aktiivisuus määritetään eri aikavälein, lisäyksen jälkeen testin nukleosidien, sekä solulinjoja. Kolme nukleosidit aiheutti lisääntymisen kaspaasi 8 ja kaspaasi 3: n aktiivisuuden molemmissa solulinjoissa verrattuna negatiiviseen kontrolliin. Kuitenkin, lukuun ottamatta nukleosidin 2, kaspaasi-aktiivisuus ei ollut yhtä korkea kuin aiheuttama kamptotesiini. Nukleosidi 2 oli tehokkain indusoija kaspaasiaktiivisuus molemmissa solulinjoissa, asiakkuutta kaspaasi 8 ja 3 toiminnan samalle tasolle kuin kamptotesiiniä. Kuitenkin sekä HT-29 ja Caco-2-solu- linjat, induktio maksimaalisen kaspaasi 8 ja 3 toiminta kesti kauemmin saada aikaan (12 tuntia verrattuna 2-4 tuntia). Tärkeää on, että aktiivisuus molempien caspases laski hitaammin kuin camptothecin käsiteltyjä soluja, jäljellä yli camptothecin 24 tunnin kuluttua altistuksesta.

nukleosidit on minimaalinen vaikutus mitokondrion kalvon potentiaali (Δψm ) B

Δψm mitattiin virtaussytometrialla kationisen fluoresoivalla JC-1. Prosenttiosuudet Δψm nukleosidissa käsitelty HT-29 ja Caco-2-soluihin verrattuna negatiivisen ja positiivisen kontrollin soluissa on esitetty taulukossa 1. verrattuna negatiiviseen kontrolliin, HT-29-solujen, nukleosidi 2 ja 5 oli marginaalinen ( 3%) vaikutusta Δψm. Nukleosidi 1-hoito johti 4% soluista, joissa on vähentynyt Δψm edellä, että valvonnan. Sitä vastoin kamptotesiini käsitellyt solut oli 34,8% solujen vähentynyt Δψm kontrolliin verrattuna. Vuonna Caco-2-solut, nukleosidit 1 ja 5 vaikuttaa noin 17% soluista tuloksena on vähentynyt Δψm, kun nukleosidin 2 oli vähäinen vaikutus ( 3%) edellä, että valvonnan. Tämä on toisin kuin kamptotesiini, joka aiheutti 34,6% solut Δψm on Caco-2-soluilla. Scattergraphs esitetään täydentäviä S2 kuvassa.

nukleosidit muuttaa solunsisäisiä sytokromi-c-jakelu

soluissa, välillä 90 ja 100% koko solun sytokromi c normaalisti sijaitsevat mitokondrioissa. Kuvio 3A ja 3B osoittavat, että testi nukleosidien kasvoi sytosolin sytokromi c: osa sekä solulinjoja verrattuna negatiiviseen kontrolliin, mutta ei samassa määrin kuin kamptotesiini. HT-29-solujen, nukleosidi 2 aiheutti suurimman prosenttiosuuden sytokromi c muuttamaan sytosoliin (75,35 ± 1,15%), vaikka alempi kuin kamptotesiinin (85,19 ± 1,54%). Nukleosidit 1 ja 5 aiheutti 68,22 ± 0,62% ja 70,42 ± 0,62% sytokromi c muuttamaan sytosoliin, vastaavasti.

Solut altistettiin 100 uM nukleosidin 1, 2, 5 ja kamptotesiini, vastaavasti , 24 tunnin ajan. Palkit edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta Elisa määritykset suoritetaan kullekin nukleosidia.

Caco-2-solut, nukleosidin 5 aiheutti prosentuaalisesti eniten sytokromi c siirtyä sytosoliin (70.42 ± 1,76%), joka on alhaisempi kuin kamptotesiinin (86,94 ± 1,72%). Vaikutukset nukleosidien 1 ja 2 olivat verrattavissa nukleosidi- 5 sytosolin sytokromi c jakeet 63,87 ± 2,03% ja 68,23 ± 0,62%, tässä järjestyksessä. Tulokset näin ollen osoittavat, että hoito, jossa nukleosidianalogien vähensi mitokondrion sytokromi-c-ja samanaikainen sytosolisen sytokromi c.

anneksiini V: n sitoutumisen kasvu HT-29 ja Caco-2-soluihin

virtaussytometrianalyysissä määritys anneksiini V-FITC, osoittaa, että apoptoosi indusoitiin lisäämisen jälkeen aktiivisen nukleosidianalogeja molemmissa solulinjoissa, kuten on esitetty taulukossa 2 ja S3 kuviossa. 24 tunnin kuluttua altistumisesta nukleosidianalogin tai camptothecin oli lähinnä kahden populaation soluja: elinkelpoisten, ei-apoptoosia aiheuttaville soluja (anneksiini V-FITC ja PI negatiivinen) ja apoptoosin alaisten solujen (anneksiini V-FITC positiivisia ja PI-negatiivinen). Pieni populaatio soluja havaittiin olevan anneksiini V-FITC ja PI positiivinen, mikä tarkoittaa, että ne olivat loppuvaiheen apoptoosin tai nekroosin.

prosenttiosuus kustakin alaryhmästä solujen molemmissa solulinjoissa alttiina että nukleosidianalogeja on esitetty taulukossa 2. HT-29-solut, nukleosidi 1 oli tehokkain apoptoottisen induktori, jossa on 38,4% soluista havaitaan varhaisessa apoptoosin ja 5,9% soluista myöhään apoptoosin /nekroosin. Vaikka ylivoimainen kamptotesiiniin varhaisen apoptoosin kampotesiinilla hoito kuitenkin aiheuttanut joitakin 19,6% soluista siirtyä myöhään apoptoosin /nekroosin. Tämä osoittaa, että kamptotesiinin kykeni indusoimaan apoptoosin nopeammin kuin nukleosideja. Nukleosidi- 2 käsittely johti 20,5% soluista oli alussa apoptoosin ja 10,6% myöhään apoptoosin. Nukleosidi-5 oli 22,2% solujen alussa apoptoosin ja 2,3% soluista lopulla apoptoosin /nekroosi.

vaikutukset olivat erilaisia ​​Caco-2-solut, kaikki kolme nukleosidien osoitti samanlaista elinkelpoisten solujen prosentuaalinen, jotka vaihtelevat 61 66,3%. Nukleosidi 5 oli tehokkain 30,9% soluista havaitaan varhaisessa apoptoosin ja 4,8% myöhään apoptoosin tai nekroosin, kun taas jälkeen nukleosidi 1 hoidon, 17,4% soluista oli alussa apoptoosin ja 14,8% vuonna myöhään apoptoosin. Jotkut 21,7% soluja havaittiin varhain apoptoosin ja 11,4% soluista lopulla apoptoosin /nekroosia nukleosidin 2 hoitoa. Scattergraphs on esitetty S3 kuviossa.

nukleosidien eivät indusoi kaspaasi 9 toimintaa

kyky testin nukleosidien edistää kaspaasi 9-aktiivisuus määritettiin sen jälkeen, kun solut altistettiin 50 uM kunkin nukleosidin 24 tuntia. Kamptotesiini (20 uM) käytettiin positiivisena kontrollina ja pystyi stimuloimaan kaspaasi 9 toimintaa, toisin kuin kolme nukleosidien, kuten on esitetty S4 kuviossa.

nukleosidit eivät vaikuta Bcl-2: n ja Bax

saadakseen lisätietoja uudelleenjako sytokromi c sytoplasmaan ilman näkyvä muutos mitokondrion kalvon potentiaalia, tutkimme ilmaus Bcl-2: n ja Bax HT-29 ja Caco-2 cell linjat ja niiden vaste nukleosidin hoitoon. Solut altistettiin 50 uM nukleosidien 6 tuntia.

Bcl-2 ilmentyy voimakkaasti, ja jotka liittyvät tuman sekä HT-29 ja Caco-2-soluihin.

käsittelemättömien ja käsiteltyjen HT -29 solujen Bcl-2 ilmaistiin vahva fluoresoivaa signaalia ja liittyvät tuman (S5 kuvio). Tämä vahvistettiin yhdistämällä Hoechst ja Bcl-2 kuvaa, joka esitti vaaleanpunainen yhdistetyn kuvan osoittaa kolokalisaation kahden fluorokromeista. Altistuminen testi nukleosidien ei ollut selvää vaikutusta Bcl-2: n ilmentymisen tasoa tai sen subsellulaarisista jakeluun. Caco-2-soluihin samalla tavalla, oli pääasiallisesti ydin- jakautuminen Bcl-2. Kuitenkin jotkin solut pääsee paljon heikompi signaali kuin toiset (S6 kuvio). Altistuminen nukleosidi- 1 ja 2 aiheutti vähäisiä uudelleenjako Bcl-2 olevan perinuclear tilaa, joka ei havaittu nukleosidin 5 hoitoon.

Bax huonosti ilmaistu HT-29 ja Caco-2 solut perinuclear jakeluun.

HT-29 ohjaus soluihin, Bax oli harvaan liittyy ytimet on pääasiallisesti perinuclear jakelu (S7 kuvio). Hoechst /Bax yhdistyivät kuvat tukevat havaintoa, että Bax on perinuclear jakeluun. Noteably, fluoresoiva intensiteetti Bax oli paljon pienempi kuin Bcl-2 osoittaa suhteellisesti alhaisemmat ekspressiotasoja. Altistuminen kolme nukleosidia osoittivat pientä kasvua Bax fluoresenssin verrattuna kontrolliin. Lisäksi hoito nukleosidin 5, aiheutti polarisoitunut ydin- klusterointi Bax (S7 kuvio). Hoechst /Bax yhdistettiin kuvassa kasvu vaaleanpunainen fluoresenssi osoittaa lisääntynyt yhdistys Bax kanssa tuma.

Expression ja solujen jakautumista Bax oli samankaltainen Caco-2-solut (S8 kuvio). Bax ilmentyminen oli alhainen Caco-2-solut ja kuvat jouduttiin parannettu näyttämään subsellulaariseen jakeluun. Sen vuoksi ei ollut mahdollista määrittää, onko nukleosidien oli suora vaikutus Bax ekspressiotasoja tai sen subsellulaarisista jakelun Caco-2-soluilla.

vaikutukset nukleosidien solumorfologiaan

Hoechst värjäystä tunnistaa apoptoottiset ytimeksi.

HT-29-solut, sekä nukleosidi- 1 ja 2 pystyivät indusoimaan apoptoosin, mikä heijastuu erityisen tumavärjäystä kuvio (merkitty kiinteä /lohko nuolella kuviossa 4). Ytimet hoitamattomien soluja tyypillisesti muodoltaan soikea, värjäämällä sininen tasaisen värin. Sen sijaan, nukleosidi 5 käsitellyissä soluissa, jotka olivat olleet kiinni kasvua pintaan 20 tunnin kuluttua, osoitti, epäsäännöllisen muotoisia ytimet (kuvio 4), mikä osoittaa, että solun tuma voi olla mahdollista kohde. Lisäksi nämä solut osoittivat korkean vää sytoplasmista vakuolisaatiota (kuvio 4), mikä viittaa siihen, soluliman vaikutus.

Solut altistettiin 50 uM nukleosidin 1, 2 ja 5 24 tuntia ja värjättiin Hoechst 33342 tahra . Mittatikku: 20 pm.

Käsittelemätön Caco-2-solut osoittivat tyypillisen soikea ydin- rakenne vieläkin värjätä jakeluun, kun Hoechstilla (kuvio 5).