Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

ksenotrooppiset hiiren leukemiaan liittymätöntä retrovirus (XMRV) on äskettäin löydetty retrovirus, joka on yhdistetty ihmisen eturauhassyövän ja krooninen väsymysoireyhtymä (CFS). Molemmat taudit vaikuttavat suuri osa maailman väestöstä, eturauhassyöpä vaikuttaa yksi kuusi miestä, ja CFS esiintyy arviolta 0,4-1% väestöstä.

Keskeiset havainnot

neljäkymmentäviisi yhdisteitä, kuten kaksikymmentäkahdeksan lääkkeet hyväksytty käytettäväksi ihmisillä, jotka arvioitiin XMRV replikointi

in vitro

. Olemme havainneet, että retroviruksen integraasinestäjät, raltegraviiri, oli voimakas ja selektiivinen vastaan ​​XMRV on submikromo- laarisena pitoisuuksina, MCF-7 ja LNCaP-solut, rintasyöpä ja eturauhassyöpä-solulinjaa, vastaavasti. Toinen integraasinestäjät, L-000870812, ja kaksi nukleosidiset käänteiskopioijaentsyymin estäjät, tsidovudiini (ZDV), ja tenofoviiridisoproksiilifumaraatin (TDF) myös esti XMRV replikointi. Yhdistettynä nämä lääkkeet näkyvät useimmiten synergiavaikutuksen virusta vastaan, mikä viittaa siihen, että yhdistelmähoito saattaa hidastaa tai estää resistenttien virusten.

Johtopäätökset

Jos XMRV osoittautuu kausaalinen tekijä eturauhasen syöpä tai CFS, nämä löydöt voivat sallia järkevä kliinisten kokeiden suunnitteluun.

Citation: Singh IR, Gorzynski JE, Drobysheva D, Bassit L, Schinazi RF (2010) raltegraviiri voimakas estäjä XMRV, virus sekaantunut Eturauhassyöpä ja krooninen väsymysoireyhtymä. PLoS ONE 5 (4): e9948. doi: 10,1371 /journal.pone.0009948

Editor: Peter Sommer, Institut Pasteur Korea, Korean tasavalta

vastaanotettu: 18 helmikuu 2010; Hyväksytty: 11 maaliskuu 2010; Julkaistu: 01 huhtikuu 2010

Copyright: © 2010 Singh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat osittain NIH apurahan 2P30-AI-50409 (CFAR ja RFS), ja Department of Veterans Affairs (RFS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: RFS on perustaja ja pääomistaja RFS Pharma, LLC, joka kehittää Amdoxovir kliinisesti ja hän saa rojalteja myynnistä 3TC. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

ksenotrooppiset hiiren leukemiaan liittymätöntä retrovirus (XMRV) on äskettäin löydetty tartunnanaiheuttajan [1 ], joka on yhdistetty ihmisen eturauhassyövän [2], ja krooninen väsymysoireyhtymä (CFS) [3]. Molemmat taudit vaikuttavat suuri osa maailman väestöstä, eturauhassyöpä vaikuttaa yksi kuusi miestä, ja CFS esiintyy arviolta 0,4-1% väestöstä [4], [5]. XMRV nukleiinihappo tai proteiineja löytyy 27% eturauhasen syöpiä ja 68%: krooninen väsymysoireyhtymä potilailla, ja alle 4-6% terveillä, mielikuvan kyseessä virus ja ihmisen sairauksien [2], [3 ].

CFS, sairaus, johon liittyy vakava heikentävä väsymys, on ollut epävarma etiologia koska sen tunnustamista. Vaikka sarja Virusaineiden ja ympäristömyrkkyjä on ehdotettu liittyvän CFS, ei ole selvää näyttöä näiden on koskaan esitetty (tarkistetaan [6]). Viimeaikainen yhdistys XMRV CFS päässä Whittemore Peterson Institute Reno, Nevada, vaikka läheskään todistettu syy, on vahvin virus yhdistyksen tehdään vielä. Kolme tuoreet raportit, käyttäen plasmidia DNA positiivisena kontrollina, ei löytänyt XMRV CFS potilaille Euroopassa [7] [8] [9]. Esiintyvyys XMRV eturauhassyövässä Euroopassa on epävarmaa, yksi saksalainen ryhmä raportoi läsnäolo XMRV ihmisen prostates [10], ja toinen ei havaita mitään [11]. Kuitenkin ajatus, että retrovirus voisi olla mukana sekä syövän ja neuroimmune ihmisen sairastumista ei ole ilman edelle. Ihmisen T-solun lymfotrooppisen viruksen, tyypin 1 (HTLV-1), toinen retrovirus, aiheuttaa sekä T-solulymfooma /leukemia sekä trooppinen spastinen parapareesi, joka on myelopatia johtuen immuunijärjestelmän vikoja, jotka aiheutuvat virusinfektio.

Infectious XMRV on eristetty seerumista CFS potilaiden [3]. Läsnäolo verenkierrossa tarttuvaa retroviruspartikkeleita, veren vetoaa skenaario ei toisin infektiota toisen retrovirus, ihmisen immuunikatovirus tyyppi 1 (HIV-1). Koska ei ole olemassa tehokasta hoitoa tähän syvästi heikentävä sairaus, käyttö antiretroviruslääkkeiden jotka ovat osoittautuneet kohtuullisen turvallinen ihmisten käyttöön, saattaa olla hyötyä. Löytö tehokkaiden antiretroviruslääkkeiden vastaan ​​XMRV mahdollistaisi järkevän suunnittelun kliinisissä tutkimuksissa etenemisen eturauhassyöpä tai hoitoon CFS.

Tässä tutkimuksessa me raportoimme vaikutus 45 yhdisteiden XMRV replikaation MCF- 7 ja LNCaP, solulinjat oli tuotettu ihmisen rinta- ja eturauhasen syöpiä, vastaavasti. Tutkimme lääkkeet, joita käytetään HIV-1-infektioita, sekä yhdisteitä käytetään hoitamaan muiden virusinfektioiden ihmisillä. XMRV on gammaretrovirus, läheistä sukua hiiren leukemia virus (MLV) [1]. Aminohappotasolla tasolla, se jakaa huomattavia identtisyys sekvenssien hiiren Moloney-leukemiaviruksen (MoMLV), prototyyppi MLV. Suurin samankaltaisuus XMRV ja MoMLV proteiineja löytyy sekvenssit viruksen proteaasin (96% identtisyys), ja ainakin samankaltaisuus on näiden kahden vaipan proteiinit (66%: n identiteetti) [1]. Valitettavasti ei monet aktiivisesti käytetty antiretroviruslääkkeiden on testattu aktiivisuus MLV, lukuun ottamatta ZDV, joka vaimentaa tehokkaasti MLV [12], ja se on äskettäin osoitettiin tehoavan XMRV samoin [13]. Sitä vastoin, kun taas on paljon tietoa antiviraalinen vaikutus välttämätöntä HIV-1-proteiineja, on hyvin vähän samankaltaisuutta HIV-1 ja XMRV proteiinien, kanssa proteaasien (PR) on kahden viruksen jakaminen 28%: n identtisyys aminohappotasolla hapon taso, käänteistranskriptaasin proteiinit (RT) jakaa 17% ja integraasin (IN) proteiineja jakaa vain 14% identiteetti. Tämä alhainen sekvenssin samankaltaisuus vaikeuttaa ennustaa, jos mikään, antiretroviruslääkkeiden jotka ovat tehokkaita HIV-1 olisivat tehokkaita XMRV. Valitsimme useita lääkkeitä kunkin suuren luokan retroviruslääkkeiden: nukleosidi- ja ei-nukleosidiset RT estäjien (NRTI ja NNRTI), IN-inhibiittorit, ja PR-estäjät (PI). Kuoreen proteiinit XMRV ja HIV-1 ovat hyvin erilaisia ​​kooltaan (70 kD ja 160 kD), käyttää erilaisia ​​reseptoreita viruksen sisäänpääsyn ja eivät jaa mitään merkittävää samankaltaisuutta. Siksi peptidomimeetit jotka vaikuttavat HIV-1 vaippaproteiini estämään viruksen sisäänpääsyn kuulumattomana tutkimuksessamme. Muutama inhibiittorit, joiden tiedetään estävän virusten replikaatiota muita kuin retroviruksia arvioitiin myös. Huomattava osa testatuista yhdisteistä Tutkimuksessamme eli. 28 kaikkiaan 45, on jo FDA-hyväksytty hoitoon infektion HIV-1 tai muita viruksia. Raportoimme tässä ensimmäistä kertaa, että integraasinestäjät, raltegraviiri (RAL), on erittäin voimakas ja selektiivinen vastaan ​​XMRV, kun niitä käytetään vähän submikromo- laarisena pitoisuuksina sekä soluviljelmissä. Toinen IN estäjä, L-000870812, ja kaksi NRTI, ZDV ja tenofoviiridisoproksiilifumaraatin (TDF), estävät myös XMRV replikaatiota, mutta suuremmilla pitoisuuksilla. Yhdistettynä nämä yhdisteet näyttää synergiavaikutukset, mikä viittaa siihen yhdistetyn yksityiskohtaiset hoitoon XMRV infektio, mikä viivyttää tai estää resistenttien virusten.

Tulokset

Testasimme yhteensä 45 yhdisteiden, jotka kuuluvat eri luokkien HIV-1-inhibiittorit, ja muutama inhibiittorit muita viruksia kuin retroviruksia, niiden kyky estää XMRV replikaatio soluviljelmässä. LNCaP ja MCF-7-solut on valittu niiden kyky tukea vankka

in vitro

replikaation XMRV. MCF-7-soluissa, koska niiden parempaan kasvuun ominaisuuksia viljelmässä alun perin käytettiin testaamaan kaikki 45 yhdisteet (kuvio 1). Yhdisteet, joilla on anti-XMRV aktiivisuutta tutkittiin myöhemmin sekä LNCaP ja MCF-7-solut (taulukko S1). Määrittää, jos vähennys viruksen vapautuminen voi johtua yhdisteen toksisuutta eikä vuoksi erityisiä antiretroviraalista vaikutusta solujen morfologiaa tarkkailtiin 24 tunnin välein mikroskooppitutkimuksella, ja MTT [3- (4,5-dimetyyli- tiatsol-2- yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi] kolorimetristä määritystä käytettiin mittaamaan mahdollisia sytotoksisuuden tuotettu yhdisteet. Supernatantit kerättiin 24 tunnin välein ja analysoitiin viruksen vapautumisen mittaamalla RT-aktiivisuuden. Esto RT-aktiivisuuden (katso kuva 2) oli keskimäärin 3-6 kokeita, kukin suoritettiin kahtena kappaleena, ja laskemiseen käytetään mediaanin (EY

50) ja 90% vaikuttavat konsentraatiot (EY

90) kunkin yhdisteen (Kuvio 1). Vertailun vuoksi, kaikki yhdisteet arvioitiin näissä tutkimuksissa testattiin myös HIV-1

LAI primaarisissa ihmisen lymfosyyteissä.

Kaikki yhdisteitä arvioitiin kahtena vähintään kolme kertaa. Arvot ovat keskimääräisiä rinnakkaisten määritysten. * (4

S

) -8-kloori-4-metyyli-5- (3-metyylibut-2-enyyli) -3,4,5,6-tetrahydro-1 H- [1], [3 ] diatsepino [4,5,6-cd] indoli-2 (2ah) -tioni.

estäjät HIV-1-käänteistranskriptaasin

seuraavat NRTI-inhibiittorit HIV-1 RT testattiin myös XMRV replikaatiomäärityksissä: ZDV, 3′-atsido-3′-deoksiadenosiini (AZA), 3′-atsido-3′-deoksiguanosiinin (AZG), 3′-atsido-3′-deoksi-5-metyyli sytidiinin (CS-92), lamivudiini (3TC), emtrisitabiini [(-) – FTC], tenofoviiri (TNV) ja sen aihiolääkemuoto TDF, 9- (β-D-1,3-dioksolan-4-yyli) guaniini (DXG) ja sen aihiolääkemuoto, amdoxovir (DAPD, AMDX), (-) – karboviiri (CBV), stavudiini (D4T) ja sen vastaavan sytosiini analogisen (D4C), Videx (ddl), tsalsitabiini (ddC), ja 3 ’ fluori-3’-deoksitymidiini (FLT). Olemme myös testanneet NNRTI efavirentsi, ja TIBO johdannaista, joka oli osoitettu olevan tehokas hiiren järjestelmän [14]. Näistä tehokkain XMRV inhibiittorit olivat ZDV ja TDF (kuvio 2, A, B). N

50 ja EY

90 MCF-7-solut olivat 0,11 uM ja 7,3 uM ZDV, ja 0,24 uM ja 15,3 uM TDF vastaavasti (katso kuva 1). N

50 ja EY

90-arvot määritettiin myös LNCaP-soluja, eturauhassyövän solulinjaa, ja siellä oli johdonmukainen ero on enintään 5 kertaa kahden solulinjoista, jotka voivat liittyä niiden erilaisista hinnat nukleosidin oton ja biomuuttamista aktiivisen nukleosiditrifosfaatissa analoginen. N

50 ja EY

90 LNCaP-solut 0,14 uM ja 1,1 uM ZDV, ja 0,9 uM ja 4,2 uM TDF, vastaavasti. CBV, AZA, FLT ja D4T kaikki osoittivat yli 70%: n inhibition XMRV replikaation (katso taulukko S1), mutta paljon suurempi pitoisuus 100 uM. AZG, CS-92, (-) – FTC, 3TC, ddI, DAPD ja DXG olivat olennaisesti inaktiivisia 100 uM (kuvio 1). TFV oli myös tehoton XMRV, mikä todennäköisesti johtuu sen luonteeltaan polaarisia, joka ei voi riittävästi lääkettä tunkeutua soluihin. NNRTI efavirentsi (EFV) ja TIBO johdannainen, ei osoittanut mitään merkittävää toimintaa vastaan ​​XMRV.

Viral vapautumista XMRV-tartunnan LNCaP läsnäollessa kasvavia pitoisuuksia (A) ZDV (B) TDF ( C) RAL ja (D) L-000870812, määritettiin mittaamalla RT-aktiivisuuden supernatanteissa. Prosentuaalinen esto laskettiin infektoidut solut altistettiin pelkästään DMSO: lla on asetettu 0%: n inhibition, ja naiivi solujen puuttuessa yhdisteiden asetettu 100%: n inhibition. Solujen elinkelpoisuus tarkistettiin mikroskoopilla, määrä mitataan MTT-määritystä, ja edustaa värillisiä palkkeja. Tulokset kustakin yhdistettä, joka on johdettu keskimäärin vähintään kolmen erillisen kokeen, joista kukin suoritettiin kahtena kappaleena.

estäjät HIV-1-integraasin

IN-inhibiittorit raltegraviiri (RAL tai MK- 0518) ja L-000870812 [15] arvioitiin myös niiden kyky estää XMRV kahdessa solussa järjestelmät (kuvio 1, kuvio 2 C ja D). Kaikista testatuista yhdisteistä, RAL oli voimakkain, jota EY

50 0,005 uM ja EY

90 3,5 uM MCF-7-solut, ja EY

50 0,03 uM ja EY

90 0,46 uM LNCaP-soluissa (taulukko S1). L-000870812, osoitti aktiivisuutta XMRV replikaatiota huomattavasti suurempina pitoisuuksina, jota EY

50 ja EY

90 0,16 uM ja 26,9 uM MCF-7-solut, ja 0,7 uM ja 4,5 uM LNCaP-soluissa, vastaavasti .

estäjät HIV-1-proteaasin

Yhdeksän tunnettuja HIV-1 proteaasinestäjien arvioitiin aktiivisuus XMRV (kuvio 1). Tehokkain oli nelfinaviiri, vaikkakin EY

50 34,3 uM. Seuraavat Proteaasinestäjät oli hyvin vaatimaton anti-XMRV toiminta: atatsanaviiri (EY

50 64,8 uM), amprenaviiri (EY

50 68,0 uM), lopinaviiri (EY

50 72,2 uM), ja ritonaviirin ( EY

50 76,4 uM). Darunaviirilla, indinaviiri, sakinaviiri ja tipranaviiri olivat pääasiassa tehottomia XMRV

in vitro

, testattaessa enintään 100gM.

estäjät virusten kuin HIV-1

Valitse määrä viruslääkkeiden tiedetään estävän virusten muuta kuin retroviruksia arvioitiin myös. Näihin kuuluvat anti-herpeksen lääkkeiden asikloviiri (ACV), gansikloviiri (GCV), vidarabiini (ara-A), 5-jodi-2′-deoksiuridiinia (IdUrd), pensikloviirin (PCV), foskarneetti (PFA), VISTIDE (HPMPC) ; anti-hepatiitti lääkkeet entekaviiri (ETV), telbivudiinin (LDT), ja ribaviriinin (RBV). ETV valittiin myös, koska se on äskettäin raportoitu inhiboivan HIV-1: n replikaation, sekä

in vitro

ja ihmisissä [16]. Muita yhdisteitä, joiden väitetään olevan tehokkaita XMRV, MLV, HIV-1 ja muut virukset, kuten klorokiini [17], dehydroepiandrosteroni (DHEA) [18], metyleenisinistä ja aspiriini arvioitiin myös anti-XMRV aktiivisuus

in vitro

. Metyleenisininen tiedetään olevan antiherpetic aktiivisuutta ja se voi myös inaktivoida HIV-1 [19]. Valitettavasti useimmat edellä luetelluista yhdisteistä, lukuun ottamatta IdUrd olivat tehottomia XMRV, tai ne olivat tehokkaita toksisten pitoisuuksien (kuvio 1). IdUrd osoittanut alhainen terapeuttinen indeksi (TI, suhde CC

50 /EY

50) ja ei voida pitää erityisenä viruslääke vastaan ​​XMRV.

Yhdistelmä vaikutuksia aktiivisten yhdisteiden XMRV replikointi

Binary yhdistelmiä voimakkaimmista yhdisteet, so. RAL, L-000870812, TDF ja ZDV testattiin aktiivisuus XMRV LNCaP-soluissa. Yhdisteet testattiin kasvavilla pitoisuuksilla, kolme erilaista, ja suhde näiden kahden yhdisteen pidetään vakiona. Aineisto analysoitiin käyttämällä CalcuSyn menetelmää alunperin kuvanneet Chou ja Talalay [20]. Tulosten yhteenveto kaikkien yhdistelmien arvioitiin LNCaP on esitetty kuvassa 3.

Combination Index (CI) arvot määritettiin poissulkevalla vuorovaikutuksen avulla CalcuSyn- ohjelma, jossa CI 1 osoittaa synergismiksi CI = 1 osoittaa additiivista vaikutusta, ja CI 1 tarkoittaa antagonismia. Painotettu keskiarvo CI-arvo (CI

p) nimitettiin [CI

50 + 2CI

75 + 3CI

90 + 4CI

95] /10. RAL, raltegraviiri; TDF, tenofoviiridisoproksiilifumaraattia; ZDV, tsidovudiini.

yhdistelmät testattu (RAL kanssa TDF tai ZDV tai L-000870812; TDF kanssa ZDV tai L-000870812, L-000870812 kanssa ZDV), lisäaine tai enimmäkseen synergistinen vuorovaikutus oli huomattava kaikilla vaikutus tasoilla ilman näkyvää sytotoksisuutta korkeimmalla käytetyillä pitoisuuksilla. Vuonna laskennallisen analyysin joko yksi neljästä huumeita (RAL, TDF, L-000870812, tai ZDV), lineaarinen korrelaatiokerroin (

r

arvot) mediaani-vaikutus juoni tai niiden jatkuva suhdeyhdistelmiä vaihteli 0,92-0,99 (tuloksia ei ole esitetty), mikä vastaa lain massa-toiminta.

in vitro

vaikutus yhdistelmän RAL joko TDF tai ZDV, suotuisasti annoksen pienentäminen ollenkaan suhteissa. Lisäksi, kaikki yhdistelmä indeksi (CI) arvot (katso materiaalit ja menetelmät), olivat vähemmän kuin 1, mikä viittaa siihen, synergiaa yhdistelmä suhteet joko TDF tai ZDV ja RAL analysoitiin (kuvio 3). Lisäksi kaksi yhdistelmiä joko ZDV ja L-000870812 tai TDF testattiin myös. Painotettu CI (CI

painosta) arvot +0,1-,5 varten TDF + ZDV, merkitty synergistisiä vaikutuksia kaikissa suhteissa testattiin (kuvio 3). Lisäksi kaksi yhdistelmä L-000870812 ja ZDV vaihdekertoimella 01:02 osoitti lähes additiivinen vaikutus (CI

paino 1,0); kuitenkin at suhde 1:0.4, CI-arvo oli 0,3, mikä osoittaa, synergia (kuva 3). Merkittävää oli, että kaikki kahden yhdistelmiä sisältävien RAL, tehokkain antiviraalinen aine vastaan ​​XMRV, osoittautunut huomattavan synergiaa kaikilla vaikutus tasoilla ilman ilmeisiä sytotoksisuutta. Mielenkiintoista on, että näiden kahden yhdistelmä IN-inhibiittorit ei ollut antagonistinen tai lisäainetta, mutta sen havaittiin olevan synergistinen, viittaa siihen, että nämä kaksi yhdistettä voi olla eri antiviraalinen mekanismeja (ks keskustelua).

Keskustelu

Koska selkeää etiologia, hoidossa CFS on ollut sekä empiirisen ja epätavanomaisia. Therapies ovat olleet immunostimulant terapian kautta injektioita Staphylococcus toksoidia [21], suonensisäisen immunoglobuliini hoito [22] [23], [24], ja hydrokortisonia [25] kullakin on epätasainen tuloksia. Interferoni-β ja TNF-α-estäjien on kokeiltu hyvin vähän potilaita. Masennuslääkkeet, tulehduskipulääkkeet, anksiolyyttisessä lääkkeet, stimulantit, anti-allergia lääkkeet ja anti-verenpainetta alentavaa lääkkeitä on käytetty kokonaan, mutta eivät ole yleisesti myönteisiä [26]. Puute tehokasta hoitoa on johtanut käyttää kasviuutteiden [27], homeopatia [28], [29], hypnoosi [30], akupunktio [31], ja koko kehon määräajoin kiihtyvyys stressiä [32], ei yhtään, jatkuvia etuja. Ainoa hoitomuodot että mitään todistetusti hyötyä ovat kognitiivinen käyttäytymisterapia ja arvostellaan käyttää ohjelmia, jotka molemmat näyttävät tukea parantamalla selviytymiskeinoja sijaan vähentää oireita [33]. Jos XMRV todetaan olevan syy-yhteydestä ihmisen sairauden, niin tiedetään, että tietyt antiretroviruslääkkeiden estävät XMRV at submikromo- laarisena pitoisuuksilla

in vitro

, ja on yhteisvaikutukset, kun yhdistetään, kuten tässä tutkimuksessa, saattaisi johtaa kliinisissä tutkimuksissa. Huomasimme, että RAL, L-000870812, ZDV, ja TDF voimakkaasti estävät XMRV soluviljelmässä, jossa RAL ollessa voimakkaimpia, klo EY

50 0,005 uM, ja muut, kuten L-000870812 (EY

50 = 0,16 uM), ZDV (EY

50 = 0,11 uM) ja TDF (EY

50 = 0,24 uM) ollessa varsin tehokas kuin hyvin. Lisäksi nämä yhdisteet oli korkeat terapeuttiset indeksit, jossa arvot ZDV = 591; TDF = 218; RAL = 18460 ja L-000870812 = 378, mikä osoittaa, että pitäisi olla mahdollista saavuttaa terapeuttisia antiviraalinen tasoilla minimaalinen myrkyllisyys.

Useat yhdisteet, jotka arvioimme oli rajallinen vaikutus XMRV replikointi

in vitro

. Jotkut näistä vaikutuksista voidaan selittää tällä hetkellä ymmärretään mekanismeja. Esimerkiksi sekä 3TC ja (-) – FTC tarvitsevat toiminnallinen YMDD motiivi RT olla aktiivinen. M184V-mutaatio HIV-1 RT tekee resistentti virus 3TC ja (-) – FTC [34]. Nämä lääkkeet ovat tehottomia MoMLV, koska MoMLV RT, V on luonnollinen jäännös tässä motiivi sijasta M. Samoin V on myös luonnollinen tähteen tämä kohde XMRV RT, minkä 3TC ja (-) – FTC tehoton. Miksi yksikään HIV-1 proteaasinestäjien olivat tehokkaita XMRV (toteamisen on raportoitu valittu proteaasinestäjien ennen [13]) on epäselvää tällä hetkellä, mutta voisi liittyä kokoon PI tasku sekä muita biokemiallisia ja rakenteellisista tekijöistä.

oli eroa toimintaan yhdisteitä testattaessa eri solutyyppejä, jotka voivat liittyä huumeiden ottoa solujen eri luonnon dNTP soluihin, samoin kuin eri solunsisäistä fosforylaatiota kapasiteetti [35]. Yleisesti, n

50 aktiiviset yhdisteet edellä luetelluista olivat alhaisempia MCF-7 kuin LNCaP-soluissa viittaa siihen, suurempi teho. Suhteessa HIV-1, yhdisteet olivat yleensä tehottomampia vastaan ​​XMRV kuin HIV-1, varsinkin EY

90 tasoa.

käyttö ainoana lääkkeenä hoidettaessa HIV-infektioiden on johtanut ulkonäön huumeiden resistentti virus [36], [37]. Havainto, että RAL, L-000870812, TDF ja ZDV on vahva yhteisvaikutukset, kun yhdistetään kaksi yhdistelmä lupaa hyvää yhdistelmähoitoa tapauksessa XMRV infektio. Jos XMRV infektio yhtäläisyyksiä muiden retrovirusinfektioista, sitten käyttö antiretroviraalisen yhdistelmähoidon voisi ylläpitää XMRV tukahduttaminen, estävät resistenssin antiretroviruslääkkeille ja mahdollisesti myös aiheuttaa paranemisen tauti. HIV-1, yhdistelmähoito toimii erityisen hyvin, kun yhdistetyt lääkeaineilla on eri virusproteiini tavoitteita, tai jos kyseessä on nukleosidien, käyttää erilaisia ​​kinaaseja ja niiden aktivointi NTP-analogien [31]. Me siis valita harkitusti lääkeyhdistelmien jotka estävät XMRV, kuten RAL kanssa ZDV tai TDF tai L-000870812. Kun tiedot analysoitiin käyttämällä vankka menetelmää Chou ja Talalay, lisäaine tai synergistiset vaikutukset havaittiin kaikilla vaikutus tasoilla, kun näitä aineita testattiin LNCaP. Merkitystä oli, että ei antagonismia huomattiin tahansa yhdistelmät arvioitiin näissä soluissa. Yllätykseksemme jopa kaksi IN-inhibiittorit näkyy synergistinen vaikutus. Sekä inhibiittorit toimivat estämällä juosteensiirtoreaktio, mutta jos niiden vaikutusmekanismi olisivat identtisiä, ne näyttää additiivinen vaikutus yhdessä. Synergistinen vaikutus viittaa siihen, että saattaa olla hienoisia mekanistista eroja toimiin näiden kahden IN inhibiittorit, päätelmä tukee julkaisemattomalla biokemiallisia kokeita (henkilökohtainen tiedonanto, Dr. Daria Hazuda, Merck Research Laboratories, West Point, PA). On tärkeää huomata tässä, että XMRV eroaa HIV-1 eräässä, joka on merkittävä näissä tutkimuksissa: XMRV eristää osoittavat hyvin vähän sekvenssi monimuotoisuuden verrattuna HIV-1 tai MLV. Kaikista sekvensoitiin XMRV isolaatit tällä hetkellä voimassa, niin tapauksissa eturauhasen syöpä sekä CFS, saadaan maantieteellisesti kaukaisiin osiin Yhdysvaltoja, kaksi vähiten liittyvää genomit eroavat toisistaan ​​vain 27 kaikkiaan yli 8100 nukleotidit. Samanlainen verran rajoitettu geneettisen monimuotoisuuden on löydetty HTLV-1 [38], toinen retrovirus olevan yhteydessä sekä syövän ja neuroimmune sairaus. On ehdotettu, että tämä puute monimuotoisuuden XMRV sekvenssit merkitsee, että määrä lisääntymään syklien kuluessa tartunnan saaneesta yksilöstä on rajoitettu [39]. Tämä viittaisi siihen, että XMRV on huomattavasti pienempi mahdollisuus kehittää lääkeresistentin mutaatioita, verrattuna HIV-1. Lisäksi on todennäköistä, että yhdistelmä vain kahta lääkettä saattaa olla riittävä ehkäistä lääkkeille vastustuskykyisten mutantti virus, vaikka tämä olisi testattava ennen kuin terapeuttinen suositukset voidaan tehdä. Olemme yrittäneet valita RAL resistenttien virusten viljelyssä jo useita kuukausia, ja ei ole vielä onnistunut eristää lääkkeille vastustuskykyiset virukset.

Kun määritys mittaamaan XMRV viruskuorma tulee saataville, virus veressä saattaa tulla objektiivinen surrogaattimarkkerina tehokas vastaus viruslääkkeiden lisäksi kliinisiä tuloksia. Vaikka se ei ole vielä selvää, jos jokin sairaudet aiheutuvat suoraan XMRV, meidän tiedot osoittavat, että XMRV infektioita voidaan estää tai hoitaa erityisiä antiviraalisia aineita. Läsnäollessa mitään todisteita syy ihmisten sairauksien, havaintomme tarjoaa pohjan suunnitella kliinisten tutkimusten käsitellä niitä.

Materiaalit ja menetelmät

XMRV, Solut ja tartunta XMRV

293T-solut (ATCC, CRL-11268), transfektoitiin pXMRV1, tarttuva klooni XMRV [2]. Virus vapautuu Supernatantti kerättiin ja titrattiin ymppäämällä MCF-7-soluja, rintasyövän solulinjan (ATCC HTB-22) 70% konfluenssiin, jossa on sarja kymmenkertaisia ​​laimennoksia XMRV seerumittomassa väliaineessa, jota seuraa 36-48 tuntia myöhemmin jumiutuminen solujen paraformaldehydin ja käsittely immunofluoresenssilla käyttäen kanin antiseerumia kehitetty vastaan ​​inaktivoitu XMRV [2]. Tyypillinen virus valmisteet antoi titterit noin 2-5 x 10

6 infektoivaa yksikköä /ml. Virus laimennettiin seerumittomalla alustalla ja käytettiin inokuloimaan solujen infektiokertoimella (MOI) noin 3, kun läsnä on eri antiviraalisten yhdisteiden, kuten on kuvattu alla. LNCaP, eturauhasen syöpä solulinja (ATCC, CRL-1740) ja MCF-7-soluja kasvatettiin noin 50% konfluenssiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, 100 ug /ml penisilliiniä, ja 100 IU /ml streptomysiiniä. Solut pestiin kahdesti Dulbeccon fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (DPBS, Gibco), ja niitä inkuboitiin viruksen ymppi 90 min ajan 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 95% ilmaa ja 5% CO

2, solut pestiin kaksi kertaa DPBS: llä , irrotetaan trypsiinillä-EDTA (0,25% trypsiiniä, Cellgro), ja laskettiin. Tuhat solua lisättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisella levyllä, sekä yhtä suureen tilavuuteen elatusainetta, joka sisälsi retroviruksen inhibiittoria 2-kertaisesti halutun pitoisuuden. Inhibiittorit liuotettiin DMSO: hon tai veteen, riippuen niiden liukoisuudesta, ja ne kaikki testattiin 0,01-100 uM 10-kertainen välein. Jossa lääkeaine havaittiin olevan aktiivinen 0,01 uM, vielä laimennokset 1 nM 0,01 nM, testattiin. Kukin estäjä testattiin kahtena vähintään kolme erillistä kertaa MCF-7-solut täysin sokea muoti käyttämällä koodattua yhdisteitä, ja tuloksista otetaan keskiarvot. Aktiiviset yhdisteet arvioitiin myös antiviraalinen aktiivisuus LNCaP-soluissa vahvistaa aktiivisuus toissijainen solulinjan tiedetään tukevan XMRV replikaatiota. Ohjauskalusteille, kuoppiin, jotka sisältävät vettä tai DMSO sopivina pitoisuuksina käytettiin.

Analyysit sytotoksisuuden ja XMRV replikointi

Jokaisessa hyvin huolellisesti seurata mahdollisten solutoksisuudesta johtuen inhibiittoreiden mikroskooppinen tarkkailu jokaisessa 24 h. Lisäksi, solujen elinkykyisyys mitattiin käyttämällä CellTiter 96 vesikerros Ratkaisu solulisäkasvumääritykselle valmistajan ohjeiden mukaisesti (Promega, Madison, Wis). Viruksen vapautumista soluista määritettiin mittaamalla RT-aktiivisuuden supernatantissa. Tätä varten supernatanttia kustakin kuopasta otettiin talteen 24 tunnin välein ja pakastettiin -20 ° C: ssa, kunnes se analysoitiin RT-määritys Viruksen vapautumisen kuten aiemmin on kuvattu [40]. Lyhyesti, oligo (dT) · poly (rA) aluke-templaatti määritykset suoritettiin, kun läsnä on radioaktiivisesti [α-

32P] dTTP ja Mn

2+. Inkuboinnin jälkeen virussupernatantteja RT-reaktioseosta 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, näytteet laikullinen DE81 DEAE-selluloosan (Whatman) ja leiman pestiin pois 2 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl ja 0,015 M nat- sitraatti). Virionin liittyvä RT analysoitiin käyttämällä Typhoon 9410 Phosphorlmager (GE Healthcare) ja määrällisesti kanssa Image J ohjelmisto (https://rsbweb.nih.gov/ij/). Esti virusten vapautuminen mitattuna 6. päivänä istuttamisen jälkeen oli keskimäärin 3-5 kokeiluja ja piirretään. Antiviraalinen EY

50 ja solumyrkyllisyyspitoisuutta (CC

50,) määritettiin pitoisuus-vastekäyrä käyttäen mediaanivaikutus menetelmä [20]. HIV-1: n replikaation määritykset suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu, käyttämällä periferaalisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) on saatu American Red Cross, Atlanta, GA, että stimuloitiin fytohemagglutiniinilla (PHA) 72 tuntia. [41]

yhdistelmä tutkimuksia

Sen arvioimiseksi, onko antiviraaliset vaikutukset dual lääkkeen yhdistelmiä: RAL kanssa TDF tai ZDV tai L-000870812; TDF kanssa ZDV tai L-000870812; L-000870812 kanssa ZDV olivat synergistisiä, lisäaineen tai antagonistisia, lääkkeen yhdistelmiä useita vakio-suhteet arvioitiin. RAL, L-000870812, ZDV ja TDF testattiin ensin yksin päättää EY

50 ja EY

90-arvot, ainakin kolme kertaa, kukin kahtena kappaleena. Sillä mediaani-vaikutus analyysin yhdisteet yhdistettiin useissa suhdelukuja kerrannaisia ​​niiden EY

50 tai EY

90 arvoja. Kunkin lääkkeen (yksin tai yhdistelmänä) kolme tai neljä itsenäistä koetta suoritettiin, ja kaikki näytteet käsiteltiin kahtena kappaleena. Analyysi suoritettiin käyttäen ohjelmistoa CalcuSyn (Biosoft, Ferguson, MO, USA) (katso kuvio 3 Cl-arvot), joka mahdollistaa automaattisen simulointi synergismiä ja antagonismia koko annoksen ja vaikutuksen tasot ja näyttää Chou ja Talalay [20] , mukaan lukien mediaanivaikutus juoni ja CI-arvot. Koska suuri vaikutukset ovat terapeuttisesti relevantti kuin alhainen vaikutusten lisäksi painotettu keskiarvo CI (CI

p) laskettiin, joka käyttää kaavaa: CI

p = [CI

50 + 2CI

75 + 3CI

90 + 4CI

95] /10, jossa CI

50, CI

75, CI

90, CI

95 ovat CI-arvot 50 %, 75%, 90% ja 95% inhibitio, vastaavasti. [20], [42].

tukeminen Information

Taulukko S1.

EC50, EC90 ja CC50-arvot yhdisteiden tehoaa XMRV MCF-7-soluissa, jotka on testattu XMRV-tartunnan LNCaP. Yhdisteet havaittiin olevan merkittävää aktiivisuutta MCF-7-solut testattiin LNCaP solujen aktiivisuuden. Kaikki yhdisteet arvioitiin kahtena vähintään kolme kertaa. Arvot ovat keskimääräisiä rinnakkaisten määritysten. Vastaavat arvot MCF-7-solut on esitetty vertailun vuoksi.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0009948.s001

(0,11 MB TIF) B

Kiitokset

Kiitos Mervi Detorio ja Melissa Johns erinomaisesta teknisestä avusta, ja Daniel Choe ja Robert Schlaberg heidän apua alustavia kokeita.