Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä on hyvin aggressiivinen tauti muutamia hoitovaihtoehtoja. Tässä tutkimuksessa tutkimme rooli proteiinikinaasi C zeta (PKCζ) haiman syöpäsoluja. PKCζ on osoitettu toimivan joko tuumorisuppressorina tai kasvaimen promoottori riippuen solujen yhteydessä. Huomaamme, että PKCζ ilmentyminen joko ennallaan tai koholla ensisijainen ihmisen haiman kasvaimia, mutta ei koskaan häviä, sopusoinnussa PKCζ pelissä edistävää rooli haimasyövän fenotyyppi. Geneettinen inhibitio PKCζ vähentää kiinnittynyt kasvu, solun eloonjäämisen ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua ihmisen haimasyövän soluja in vitro. Lisäksi PKCζ esto pienentää potilaalle tehdä kasvaimen kokoa in vivo estämällä kasvainsoluproliferaation ja lisäämällä tuumorinekroosi. Lisäksi PKCζ esto vähensi kasvainten etäpesäkkeitä in vivo, ja aiheutti vastaavan alennuksen haiman syöpäsoluinvaasiota

in vitro

. Signaali anturin ja aktivaattori transkription 3 (STST3) on usein konstitutiivisesti aktiivinen haimasyövän, ja sillä on tärkeä rooli haimasyövän solujen eloonjäämistä ja etäpesäke. Mielenkiintoista, esto PKCζ vähensi konstitutiivinen STST3 aktivointi haiman syöpäsoluissa

in vitro

ja

in vivo

. Farmakologinen esto STAT3 jäljitellä fenotyyppiä PKCζ inhibition, ja ilmentymistä konstitutiivisesti aktiivisen STAT3 konstrukti pelastettiin transformoidun fenotyypin PKCζ-vajaiden solujen. Olemme päätellä, että PKCζ tarvitaan haimasyövän transformoitu kasvua ja invaasiota in vitro ja kasvainten synnyssä in vivo, ja että STAT3 on tärkeä alavirtaan välittäjänä pro-syöpää aiheuttavia vaikutuksia PKCζ haiman syöpäsoluja.

Citation: Butler AM, Scotti Buzhardt ML, Li S, Smith KE, Fields AP, Murray NR (2013) proteiinikinaasi C Zeta säätele ihmisten Haimasyöpä transformoidun kasvua ja Invasion kautta STST3 riippuva mekanismi. PLoS ONE 8 (8): e72061. doi: 10,1371 /journal.pone.0072061

Editor: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 16, 2013; Hyväksytty: 05 heinäkuu 2013; Julkaistu: 28 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Butler et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoitus by: NIH /NCI R03 CA143164, NIH /NCI R01CA140290 (NRM), Daniel Foundation of Alabama Postdoctoral Fellowship (MLS), NIH /NCI F31 CA168117 (AMB), NIH /NCI R01 CA081436-16 (AFP), Mayo Clinic Foundation (NRM, APF). APF on Monica Flynn Jacoby Endaumentin professori Cancer Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijät ovat seuraavat edut: väliaikainen patentti liittyy tähän tutkimukseen on jätetty (MSB, APF, NRM, menetelmät ja materiaalit hoitoon haimasyöpä, US-patenttihakemus # 20110190390). Co-kirjailija Alan Fields on Academic Editor PLoS ONE. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Haimasyöpä on kymmenes yleisimmin diagnosoitu syöpä Yhdysvalloissa, ja sijoittuu neljänneksi kuolleisuutta [1]. Yleinen 5 vuoden pysyvyys haimasyövän on alle 5% ja ei ole merkittävästi parantunut viimeisten 30 vuoden aikana. Kuolleisuutta haimasyövän johtuu osittain vastustuskyky nykyinen chemotherapies [2]. Luonnehdinta novel onkogeenisten signalointireittien haimasyövän voi johtaa tunnistamiseen tehokkaampia terapeuttisia kohteita haimasyövän hoitoon.

proteiinikinaasi C (PKC) on tuumorigeneesiin yli 30 vuotta, koska se oli ensimmäinen tunnettu siitä, kun reseptori kasvaimen edistävien forboliesterit [3]. PKC on nyt tiedetään olevan sarja toisiinsa liittyviä isoformeja, ja viimeaikaiset tutkimukset ovat ominaista erityisiä rooleja yksittäisten isoformien alttius, ja kehitys, syöpä [4], [5], [6], [7], [8 ], [9], [10]. Vaikka jäsenet epätyypillisten PKC (aPKC) alaryhmä PKC-isoformit eivät kykene sitomaan ja aktivoidaan fosboliestereillä, niiden mahdollinen rooli syövän fenotyypin on myös tutkittu. Kaksi aPKCs, PKC iota (PKCι) ja PKC zeta (PKCζ), ovat rakenteellisesti samanlaisia; kuitenkin, alkion tyrmäyksellä jokaisen aPKC paljastaa ainutlaatuinen fenotyyppejä, mikä viittaa ei-tarpeeton toimintojen kehittämiseen ja syövän [11], [12]. PKCι edistää syövän kehitystä hiirimalleissa keuhko- ja paksusuolen syöpä, ja on onkogeenin keuhkosyövän ja munasarjasyövän [5], [6], [13], [14], [15]. Samoin olemme osoittaneet pro-karsinogeeninen rooli PKCι haiman syöpäsoluissa [16]. Sitä vastoin sekä kasvaimen edistävää ja tuumorisuppressoriproteiinia roolit ovat johtuneet PKCζ [4], [17], [18], mutta sen rooli haimasyövän ei ole arvioitu. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että PKCζ on kohonnut osajoukko ihmisen haiman kasvainten kudokset verrattuna vastaaviin normaaleihin haiman epiteelissä. Lisäksi osoitamme, että esto PKCζ haiman syöpäsoluissa on huomattavan haitallinen vaikutus syövän fenotyyppi. Tuloksemme myös tunnistaa STST3 tärkeänä välittäjänä PKCζ transformoiduissa kasvun ja invaasion haiman syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Biospecimens saatiin Mayo Clinic Tissue Registry hyväksytyn Mayo Clinic Institutional Review Board protokollaa. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin Mayo Clinic Institutional Animal Care ja käyttö komitea.

Potilasnäytteet

RNA eristettiin joukko haiman adenokarsinooma potilaan näytteitä, jotka jäädytetyn, pariksi kasvain ja ei- kasvain haimassa kudos oli saatavilla kuvatulla [16]. Hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

PKCζ on koholla osajoukko ihmisen haiman kasvainten

Aloitimme tutkimus arvioimalla PKCζ ilmentymisen ensisijaisen ihmisen haiman kasvaimissa ja ympäröivässä ei-kasvainkudoksessa (kuvio 1). Kliiniset ja demografiset tiedot tälle potilasryhmälle on julkaistu [16]. Immunohistokemiallinen havaitseminen PKCζ proteiinin edustavissa haiman kasvain kudosten paljasti vaihteleva taso PKCζ ilmaisu, joka lokalisoitu sekä tumassa ja sytoplasmassa (kuvio 1A). PKCζ ekspressiota havaittiin myös vaihteleva, mutta alemmalle tasolle kuin kasvain, haiman solutyypeissä (kuvio 1 B). Saarekesolujen ja asinussolut ei-kasvain haima oli pieni PKCζ ilmentymistä (kuvio 1 B, vasen paneeli). Ilmentymistä PKCζ tiehyen soluissa oli samanlainen tai hiukan suurempi kuin, ilmaisua saarekesolujen ja asinaarisoluissa (kuvio 1 B, oikealla paneelit). Me seuraavaksi arvioidaan PKCζ mRNA: n ekspression paneelin 28 pariksi ihmisen haiman adenokarsinooma ja vieressä, ei-kasvain haima. PKCζ mRNA-ekspressio havaittiin kaikissa 28 ensisijainen haiman kasvaimet analysoitiin (tuloksia ei ole esitetty). Analyysi pariksi näytteistä kävi ilmi, että PKCζ ekspressio oli merkittävästi suurempi kasvaimia kuin pariksi, ei-kasvainkudoksessa (kuvio 1C). PKCζ mRNA: n ekspressio on merkittävästi kohonnut 25%: haiman kasvaimet, verrattuna keskimääräiseen PKCζ mRNA: n ekspressio ei-kasvain haima, ja ei havaittu kasvaimia esiintyi merkittävä väheneminen PKCζ mRNA: n ekspressio (kuvio 1 D). Analyysi suhdetta PKCζ mRNA ilmaisun ja potilaan eloonjääminen tehtiin, mutta tämä pieni kohortin mitään korrelaatiota ei havaittu.

A ja B) IHC havaitseminen PKCζ ilmaisun edustavissa ihmisen haiman kasvaimet (A; kasvain) ja viereisen ei-kasvainkudoksessa (B, normaali). B) Serial kohdat värjättiin H * P = 0,001 laskettu pariksi

t

-testi. D) PKCζ ilmentyminen on merkittävästi kohonnut alaryhmässä haiman kasvaimia. PKCζ oli yli-ilmentynyt 25% haimatuumorien analysoitu, jotka on määritelty kasvaimen mRNA runsaus yli 2 standardipoikkeamaa yli keskiarvon PKCζ mRNA runsautta kaikkien viereisten ei-kasvain haima näytteitä.

PKCζ säätelee transformoidun fenotyypin haimasyövän soluja in vitro

suoraan roolin arvioimiseksi PKCζ haiman syövän fenotyyppi, käytimme kahta eri RNAi-konstrukteja estää PKCζ ilmentymisen kaksi hyvin tunnettu ihmisen haimasyövän solulinjoissa, Panc- 1 (kuvio 2A) ja MiaPaca-2 (kuvio S1A). Pysyvästi valitut solupopulaatioiden johdonmukaisesti esiintyi 70%: n tai suurempi estäminen PKCζ mRNA ilmaisun, ja vastaava lasku PKCζ proteiinin ilmentymisen (kuvio 2A ja S1A). Selektiivisyys PKCζ kohdistetun RNAi-konstrukteja, vahvistaa vaikutuksen puuttuminen näiden konstruktien ilmenemistä koskevat läheisesti liittyvien epätyypillisten PKCι isotsyymi (kuvio 2A ja S1A). Inhibitio PKCζ ilmaisun johti pieneen mutta selvän laskun log-vaiheeseen, joka tarttuu solun kasvua (kuvio 2B ja S1B) ja kasvu tyvisolusyöpä kuolema (kuvio 2C). Lisäksi PKCζ kaataa (KD) laski merkittävästi haimasyöpä solujen kiinnittymisestä riippumattoman kasvun (pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen) (kuvio 2D ja S1C), mikä osoittaa, että PKCζ on kriittinen haimasyövän solujen eloonjäämistä ja transformoidun fenotyypin.

Pancin-1-soluissa stabiilisti kuljettavat lentivirukselle joka joko ohjaus, ei-kohdistaminen (NT) tai PKCζ kohdistamisen RNAi (z1 ja z2), arvioitiin A) PKCζ ja PKCι proteiinin ilmentymistä immunoblottausanalyysillä (ylhäällä), ja PKCζ mRNA runsaus by qPCR analyysi (alhaalla); B) solujen elinkykyä (MTT kolorimetristä määritystä); C) solukuolemaa (havaitsee Cell Death Detection ELISA) ja D) ankkurointi riippumattoman kasvun (pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa). Jokaisen paneelin Bars = keskimäärin 3 tai enemmän rinnakkaisnäytteiden ± SD ja kuvaaja edustaa 3 tai useamman itsenäisen kokeen. * P 0,05 vs NT.

PKCζ on kriittinen rooli haiman kasvainten synnyssä

vieressä tutkineet vaikutus PKCζ KD haimasyöpäkasvainsoluissa ja kasvua käyttämällä aikaisemmin kuvattua Panc- 1 potilaalle tehdä kasvainmuoto [16]. Panc-1-soluja, jotka ilmentävät tulikärpäsen lusiferaasi-geeni (Psin-Fluc) ja joko NT tai PKCζ RNAi injisoitiin haimaan nude-hiirten muodostamiseksi ortotooppisten kasvaimia. Kasvaimen kasvu seurattiin bioluminenssina havaitseminen (kuvio 3A), ja hiiret kerättiin 5 viikkoa ymppäyksen jälkeen. Kasvainmuodostusta havaittiin kaikissa hiirissä injektoitiin Pancin-1 solut, jotka ilmentävät joko RNAi rakentaa; kuitenkin, lopullinen haima paino oli merkitsevästi pienempi hiirillä PKCζ RNAi kasvaimia vähäisemmän kasvaimen kokoa (kuvio 3B ja 3C). Oletimme, että samanlainen vaikutus PKCζ KD in vitro (kuvio 2B-D) vähensi kasvainten koko PKCζ KD Panc-1-soluja in vivo johtui vähentää kasvainsolujen proliferaatiota ja parannettu kasvainsolun kuoleman. Taso BrdUrd sisällyttäminen, mitta kasvaimen leviäminen, arvioitiin Pancin-1 PKCζ RNAi kasvaimia ja verrattuna tasoon BrdUrd sisällyttämistä Pancin-1 NT RNAi kasvaimissa [16]. Kuten ennustettiin, kasvaimen leviämisen väheni merkittävästi PKCζ RNAi kasvaimissa verrattuna NT RNAi kasvaimia (kuvio 4A). Mielenkiintoista on, emme havaita merkittävää vaikutusta PKCζ KD kasvaimen apoptoosiin, havaitaan pilkottu kaspaasi-3 (kuvio 4B). Kuitenkin PKCζ RNAi kasvaimia oli huomattavasti korkeampi kuolion kuin NT RNAi kasvaimet (kuvio 4C ja 4D). Tuumorinekroosi johtuu kertyminen kasvainsolun kuoleman, mikä voi tapahtua, kun kasvain kasvaa ulos sen verenkiertoa. Vaikka PKCζ RNAi kasvaimet ovat huomattavasti pienempiä kuin NT RNAi kasvaimet, niillä ei ole laskua kasvaimen verisuonten tiheys kvantifioidaan CD31-värjäyksellä (kuvio 4E). Nämä tiedot viittaavat siihen, että vähensi kasvainten tilavuuden PKCζ RNAi haimatuumorien on seurausta kumulatiivinen vaikutus laski solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen yli ajan kuluessa in vivo kokeessa.

A) edustaja bioluminesoiviin kuvantaminen hiirten potilaalle tehdä Pancin-1 NT ja PKCζ RNAi haiman kasvaimia. B) edustaja H n = 16; * P 0,001.

A) kvantitatiivinen analyysi kasvaimen leviämisen havaita BrdUrd sisällyttämällä; * P 0,003. B) kvantitatiivinen analyysi kasvaimen apoptoosin havaita lohkaistaan ​​kaspaasi-3 värjäystä. C) edustaja H * P 0,0002. E) kvantitatiivinen analyysi kasvaimen verisuonitus, joka määritetään prosenttia alueen CD31 värjäystä. A-E)

n

= 16 NT RNAi kasvaimia ja 15 PKCζ RNAi kasvaimia. F) Pancin-1 NT ja PKCζ RNAi soluja (z1 ja z2), arvioitiin solujen invaasio kautta Matrigel kuorrutettu kammioita. Bars = keskimäärin 3 tai enemmän rinnakkaisnäytteiden +/- SD ja kuvaaja edustaa 2 tai useamman itsenäisen kokeen. * P 0,05 vs NT.

PKCζ tärkeä rooli haiman syöpäsoluinvaasiota

Haiman potilaalle tehdä kasvain malli, Panc-1 solut muodostavat sekä ensimmäisen kasvaimia ja etäpesäkeleesioita [16]. Metastaasit munuaisen, maksan, kalvo, ja suoliliepeen havaittiin yli 50% hiiristä kätkeminen NT RNAi kasvaimia (taulukko 1, [16]). Sen sijaan ei kasvaimen etäpesäke suoliliepeen tai kalvo todettiin hiirillä kuljettavat PKCζ RNAi kasvaimet; vain 2 15 PKCζ RNAi on kasvain (13%) oli etäpesäkkeitä niiden munuaiset, ja vain 1 15 PKCζ RNAi kasvainta kantavissa hiirissä (6%) oli maksa etäpesäke (taulukko 1). Nämä tiedot ovat yhtäpitäviä estovaikutusta PKCζ KD haiman kasvainten etäpesäkkeitä. Emme kuitenkaan voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että alentunut metastaasien havaittu PKCζ RNAi kasvaimet voivat olla toissijainen vähensi kokoa kasvaimia. Jos PKCζ säätelee kasvaimen etäpesäke in vivo, se on todennäköisesti myös säädellä näkökohtia metastaattisen fenotyypin, kuten solujen invaasiota, in vitro. Todellakin, solujen invaasio oli merkittävästi vähentynyt PKCζ RNAi-soluissa, verrattuna NT RNAi haimasyövän soluja (kuvio 4F ja S2). Nämä tulokset osoittavat rooli PKCζ haiman syöpäsoluinvaasiota, ja ovat yhdenmukaisia ​​rooli PKCζ Metastasoituneessa fenotyypin haimasyövän soluja in vivo.

PKCζ säätelee STAT3 aktivointi

Signal anturin ja aktivaattori transkription-3 (STAT3) on transkriptiotekijä, joka yhdistää lukuisia solunulkoisia signaaleja säädellä syövän edistämiseen soluprosessien [25], [26]. Konstitutiivinen STAT3 aktivointi on tunnusmerkki monen ihmisen syövissä, kuten haimasyövän [27]. STAT3 aktivointi edistää kasvaimia synnyttävän fenotyyppi haimasyövän, ja menetys STAT3 estää haimasyövän kehittymistä ja etenemistä hiirimallissa on

Kras

-välitteisen haimasyöpä [27], [28]. Lisäksi esto STST3 aktiivisuuden haimasyöpäsoluissa vähentää myös solujen eloonjäämistä, invaasio ja kasvaimen kasvu [28], [29]. Koska silmiinpistävä samankaltaisuus raportoitu fenotyyppi STAT3 eston ja fenotyypin me havaittu esto PKCζ, kysyimme, onko PKCζ ilmaisu säätelee STST3 aktiivisuutta haimasyövän solulinjoissa. Merkittävä väheneminen STAT3 aktivointi, havaitaan fosforylaatio STAT3 on Tyr705, havaittiin haiman syöpäsoluissa ilmentävät PKCζ RNAi (kuviot 5A ja S3A). Lisäksi STAT3-aktivaatio vähentää huomattavasti PKCζ RNAi kasvaimissa verrattuna NT RNAi kasvaimia (kuvio 5B), mikä osoittaa, että PKCζ säätelee STAT3 aktivointi haiman syöpäsoluissa sekä in vitro että in vivo. Koska PKCζ on myös liitetty säätelyyn ERK1 /2 aktivointi syövän ja ei-syöpäsolujen tyyppejä [30], [31], [32], [33], olemme analysoineet vaikutuksia PKCζ RNAi on ERK1 /2 fosforylaation ihmisen haimasyövän soluja. Toisin STAT3 fosforylaatio, ERK1 /2 fosforylaatio ei muuttunut merkittävä väheneminen PKCζ lauseke (kuviot 5A ja S3A) viittaa siihen, että PKCζ ilmaisua ei säännellä signalointi kautta ERK1 /2 signalointireitille.

A) esto PKCζ ilmentyminen vähenee konstitutiivista STAT3 aktivaation (havaitaan fosfo-STAT3 Y705), mutta ei ERK1 /2 aktivointi (havaitaan fosfo-ERK1 /2). Immunoblot-analyysi suoritettiin kokosoluliuotteista alkaen Panc-1 NT ja PKCζ RNAi-solut (vasen) ja ilmaisun analyysi immunoblot-tunnistus suoritettiin (oikealla)

n

= 3. B) edustaja IHC havaitseminen p-STAT3 in potilaalle tehdä Pancin-1 NT ja PKCζ RNAi haimatuumorien (vasemmalla), bar = 50 pm. Kvantitatiivinen analyysi pSTAT3 IHC värjäyksen (oikea). C-E) vaikutus STAT3 estäjän (S3I-201) on C) STAT3 fosforylaatio, D) ankkurointi riippumatonta kasvua pehmeässä agarissa ja E) solujen invaasio kautta Matrigel kuorrutettu kammioita. Kaikissa määrityksissä, S3I-201 käytettiin 100 um, ja yhtä suuri tilavuus DMSO: Kontrollina käytettiin laimentimena. Sillä invaasiomääritys, solut, jotka on esikäsitelty S3I-201: ssa tai DMSO: ssa 48 tunnin ajan ennen kokeen aloittamisen. Bars = keskimäärin 3 tai enemmän toistojen +/- SD, ja kuvaaja edustaa 2 tai useamman itsenäisen kokeen. * P 0,05.

STAT3 inhibitio vähentää transformoidun fenotyypin haimasyöpäsoluissa

Sen määrittämiseksi, onko vähentää STAT3 aktivaatio saattaa olla vastuussa joidenkin vaikutusten PKCζ KD, arvioimme vaikutus farmakologisen estäjä STAT3 on transformoitu fenotyyppi haimasyövän soluja. Hoitoon haimasyövän soluja S3I-201, pieni molekyyli, joka häiritsee STAT3 SH2-fosfo-tyrosiini vuorovaikutuksia [34], vähentää STAT3 aktivointi (kuvio 5C ja S3B) ja merkittävästi vähensi kiinnittymisestä riippumattoman kasvun (kuviot 5D) ja solujen invaasiota ( Kuvio 5E ja S3C), samanlainen vaikutus PKCζ inhibition. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että estäminen PKCζ ilmaisun vähentää STST3 aktiivisuutta haimasyöpäsoluissa, ja että PKCζ ilmaisun ja STAT3 aktiivisuus positiivisesti säädellä haimasyöpä transformoitu kasvua ja invaasiota.

konstitutiivisesti aktiivinen STAT3 voi muodostaa uudelleen transformoidun fenotyypin in PKCζ RNAi haimasyöpäsoluissa

Sen hypoteesin testaamiseksi, että STAT3 on kriittinen alavirtavaikuttajainhibiittorit PKCζ haiman syöpäsoluissa, arvioimme onko ilmentymistä konstitutiivisesti aktiivisen STAT3-konstrukti (STAT3-C) voivat pelastaa vaikutuksia PKCζ esto in Pancin-1-soluissa. Pancin-1 NT ja PKCζ RNAi solut infektoitiin adenoviruksella ilmentävien lippu-merkitty, STAT3-C tai ohjaus (nolla) adenovirus (kuvio 6A). Expression of STAT3-C merkitsevästi talteen kiinnittymisestä riippumatonta kasvua Pancin-1 PKCζ RNAi soluja, vaikuttamatta merkittävästi kiinnittämisestä riippumaton kasvu NT RNAi-solujen (kuvio 6B). Lisäksi vähennetään soluinvaasion fenotyyppi PKCζ RNAi-solujen merkittävästi talteen ilmentyminen STAT3-C (kuvio 6C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että lisääntynyt solujen STST3 aktiivisuus voi pelastaa anti-onkogeenisiä fenotyyppi PKCζ RNAi soluja, ja osoittaa, että PKCζ välittää haimasyöpä solutransformaatiota, ainakin osittain, säätelemällä STST3 aktiivisuuden.

Pancin-1-solut ilmentävät NT tai PKCζ RNAi tartutettiin adenoviruksen jotka ilmentävät joko nolla (kontrolli), tai konstitutiivisesti aktiivinen, FLAG-merkitty STAT3 (STST3-C). A) immunoblottianalyysi p-STAT3, STAT3, FLAG, PKCζ ja β-aktiini ilme. Solut arvioitiin B) ankkurista riippumaton kasvu pehmeässä agarissa ja C) solujen invaasio kautta Matrigel kuorrutettu kammioita. Kunkin kuviossa: Bars = keskiarvo 3 tai enemmän rinnakkaisnäytteiden ± SD ja kuvaaja edustaa 2 tai useamman itsenäisen kokeen. * Merkittävästi vähentää verrattuna NT /null, p 0,05; ** Huomattavasti verrattuna null saaneista, p 0,05.

Keskustelu

Funktionaaliset tutkimukset ovat osoittaneet, että rooli PKCζ säätelyssä syövän fenotyypin vaihtelee kasvaimen tyyppi, malli järjestelmä ja taudin vaiheeseen. Esimerkiksi, inhibitio PKCζ ilmentymistä koolonisyöpäsolulinja vähentää proliferaatiota in vitro, ja kasvaimen kokoa in vivo; kuitenkin, geneettinen inhibitio PKCζ hiiren suoliepiteeliin ei vaikuta kasvainten synnyssä on APCmin /+ hiirimallissa suoliston syövän taudin alkamisen ja etenemisen [7], [35]. Sitä vastoin geneettinen inhibitio PKCζ hiirimallissa on

Kras

G12D

indusoima keuhko- kasvainten synnyssä paljastaa tuumorisuppressori rooli [4], kun taas inhibitiota PKCζ ilmentymisen keuhkosyövän soluja ei ole vaikutusta transformoitu kasvua in vitro [20]. Esillä olevassa tutkimuksessa arvioimme erityinen rooli PKCζ biologiassa haimasyövän soluja, käyttäen PKC isotyyppispesifisessä RNAi inhiboida PKCζ ilmentymistä. Osoitamme, että PKCζ KD vähensi haimasyövän solujen lisääntymisen ja solujen eloonjäämistä in vitro. Olemme osoittavat lisäksi, että PKCζ KD haiman syöpäsoluissa vähensi transformoitu kasvua in vitro, jotka vastaavat merkittävää kasvaimen koon pienentyminen in vivo. Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että PKCζ vaaditaan ylläpitoa transformoidun fenotyypin haimasyövän soluja.

PKCζ on liitetty invasiivista fenotyypin ihmisen syövissä [36], [37], [38]. RNAi-välitteinen, spesifinen esto PKCζ vähentää rintasyövän ja glioblastoomasolulinjan invaasiota in vitro [37], [38] ja vähentää eturauhasen syöpäsolujen invaasiota in vitro ja in vivo [36]. Kiinnostavaa kyllä, jokainen näistä raporteista attribuutteja PKCζ erilliseen invasiivisia signalointireitin, mikä viittaa laajaan rooli PKCζ syöpäsolujen invaasiota [36], [37], [38]. Yhdenmukainen fenotyyppi havaittu muissa syövissä, olemme päättäneet, että esto PKCζ ilmaisun paitsi esti muuttaneet kasvua haimasyöpäsoluissa, mutta myös tukahdutettu niiden invasiivisia potentiaalia in vitro. Lisäksi PKCζ KD merkittävästi vähentää haiman kasvainten etäpesäkkeiden, mikä osoittaa, että PKCζ säätelee haimasyöpäkasvainsolulinjo- invaasiota in vivo, samoin kuin in vitro.

prognostinen arvo PKCζ ilmentymisen syöpä ei ole hyvin dokumentoitu. Kuitenkin useat viimeaikaiset raportit ovat sekaantuneet PKCζ ennustajana huono tulos syöpäpotilaille. Korkea PKCζ ennustaa huono tautikohtaisia ​​eloonjäämistä potilailla, joilla pehmytkudossarkooman [39]. Samoin PKCζ on kohonnut eturauhassyövän ja korkea PKCζ ilmaisun ennustaa huono selviytyminen eturauhassyöpäpotilaalla [36]. Arvioimme ilmaus PKCζ haimasyövän, ja todennut, että PKCζ oli selvästi koholla sub-sarja haimasyöpä. Kuitenkin meidän pieni otoskoko yhdistettynä huono yleistä ennuste haimasyövän potilaat poissuljettu määrittämisen mahdollisen prognoosi- roolia PKCζ ilmaisua. Meneillään kudos kokoelmat helpottaa tulevaisuuden tutkimus kyky PKCζ ilmaisun ennustaa lopputulosta suuremmassa kohortin haimasyövän potilaille.

Vaikka PKCζ ilme on hiljattain ominaista koholla ja ennustaa huono selviytyminen useisiin syöpiin [36 ], [39], tiedetään vähän sääntelyyn PKCζ ilmaisua. Kuitenkin PKCζ on osoitettu aktivoida useita signalointireittejä tiedetään edistävän onkogeenisen signalointia haimasyöpä. Fosfatidyyli-3,4-5-trisfosfaatti (Ptdlns-3,4,5-P3), tuote fosfoinositidi 3-kinaasi, voi suoraan sitoa ja aktivoida PKCζ, ja myös aktivoi Ptdlns-3,4,5-P3-aktivoitua fosfoinositidi-riippuvainen kinaasi 1-välitteisen fosforylaation ja aktivaation PKCζ [40], [41], [42]. Pään ja niskan levy- karsinoomasoluja, PKCζ on tyrosiinifosforyloidulla ja aktivoidaan epidermaalisen kasvutekijän reseptori [31]. Jatkotutkimuksissa tutkii, onko jompikumpi näistä reiteistä, sekä usein väärin säädellystä haimasyövän, moduloi PKCζ signalointia haimasyövän solulinjoissa.

Toisin havaintomme, että esto PKCζ tukahdutettu haiman kasvainten kasvua ja etäpesäkkeiden, geneettinen inhibitio of PKCζ in

Kras

G12D

indusoimaan keuhkokasvaimia edistää kasvaimen kasvua ja etenemistä [4]. Kasvaimen suppressiivinen rooli PKCζ K-ras-välitteistä keuhkojen kasvaimien syntyyn välittää tukahduttamisen STAT3 aktivaation kasvainsoluissa [4].