Krooninen sairaus

tiivistelmä

Suurin kliinisiä tapauksia maksasyövän ei voida diagnosoitu, kunnes ne ovat kehittyneet pitkällä, mikä johtaa korkeaan kuolleisuuteen. On hyvin tunnettua, että täytäntöönpano varhaisen havaitsemisen menetelmiä ja kehittää kohdennettujen hoitomuotojen maksasyövän ovat välttämättömiä vähentää korkea kuolleisuus liittyy tähän tautiin. Näiden tavoitteiden saavuttamiseksi, molekyylinäytteitä kykenee tunnistamaan maksasyövän soluspesifisestä tavoitteita tarvitaan. Tässä kuvaamme paneeli Aptameerien pysty erottamaan maksasyöpä normaaleista maksasoluja. Aptameerejä, jotka valittiin solun perustuva SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), on Kd-arvot ovat välillä 64-349 nM kohti tavoitetta ihmisen hepatoomasolulinjasta HepG2, ja myös tunnustettava, munasarjasyövän solujen ja keuhkojen adenokarsinooma. Proteinaasi hoito koe osoitti, että kaikki Aptameerien voisivat tunnistaa kohde HepG2-soluissa läpi pinnan proteiineja. Tämä tulos viittasi siihen, että nämä Aptameerien voitaisiin käyttää mahdollisina koettimina lisätutkimuksia syövän tutkimuksiin, kuten kehittää varhainen havaitseminen määrityksiä, kohdennettuja hoitoja, ja kuvantaminen aineita, sekä tutkinnan yhteisten membraaniproteiineja näissä erotettavissa syöpiä.

Citation: Xu J, Teng IT, Zhang L, Delgado S, Champanhac C, Cansiz S, et al. (2015) Molecular Recognition of Human Liver Cancer Cells Käyttämällä DNA Aptameerit Luotu kautta Cell-SELEX. PLoS ONE 10 (5): e0125863. doi: 10,1371 /journal.pone.0125863

Academic Editor: Vittorio de Franciscis, Consiglio Nazionale delle Ricerchen (CNR), ITALIA

vastaanotettu: 26 helmikuu 2015; Hyväksytty 25 maaliskuuta 2015 Julkaistu: 4. toukokuuta 2015

Copyright: © 2015 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostot.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Institutes of Health GM079359 ja National Institutes of Health CA133086; Valtion Scholarship Fund, PI = Jiehua Xu; National Natural Science Foundation of China 81101866, PI = Jiehua Xu; National Natural Science Foundation of China 81430041, PI = Jiehua Xu; ja perustutkimus rahastoja Keski yliopistojen 11ykpy41, PI = Jiehua Xu. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksessa degign, tietojen keruun ja analysoinnin, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Maksasyövän on kuudes yleisin syöpä maailmassa ja kolmanneksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemaan [1], jolloin 0,7 miljoonaa kuolemantapausta vuosittain. Koska suurin sisäelinvaurio ja suurin rauhanen ihmiskehossa, maksassa palvelee monia elintärkeitä toimintoja, kuten hajottaa ja varastointia ravintoaineita tarvitaan energian tuotantoon tai kudosten korjaamiseen, suodatus ja hajottavat myrkylliset jätteet veressä, syntetisointi useimmat hyytymistekijöiden jotka pitävät kehon massiivinen verenvuoto, ja tuottaa kemikaaleja ja hormoneja tarpeen säännellä monien elintoimintojen. Tästä huolimatta kriittinen rooli, kehittämiseen maksasyövän on harvoin diagnosoidaan alkuvaiheessa, koska useimmissa tapauksissa oireet eivät näy vasta myöhemmissä vaiheissa, mikä tekee siitä erittäin tappava maligniteetti pienellä 5 vuoden pysyvyys. Näin ollen kehittämällä varhaisen havaitsemisen menetelmiä ja kehittyneet kohdennettuja hoitoja on välttämätöntä taistelussa maksasyövän.

Aptameerit ovat lyhyitä, yksijuosteista DNA: ta tai RNA-oligonukleotidit, jotka kykenevät sitoutumaan spesifisesti erilaisia ​​vastaavan kohdemolekyylien korkealla affiniteetilla. Menetelmä tuottaa aptameereillä kutsutaan SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Eksponentiaalinen Enrichment) [2, 3] seuraa sarja vaiheita: 1) kemiallinen synteesi oligonukleotidin kirjasto, jossa on 10

13-10

16 yksijuosteinen nukleiinihappomolekyylejä, 2) suora altistuminen kirjaston kohteille erottaa sitovia säikeet katsojaa, 3) kopiointi ja monistus perhe, 4) rikastamista aptameeriä eloonjääneiden iteratiivisilla kierroksilla, ja lopuksi 5) sekvensointi tunnistaa yksittäisiä ehdokkaita.

SELEX teknologia kehitettiin edelleen meidän lab käyttää koko soluja kohteina aptameeriä valintaprosessissa. Solu-SELEX-menetelmä varmistaa, että ehdokas oligonukleotidit sitoutuvat natiivissa tilassa proteiinin tavoitteita syöpäsolujen pinnalla [4]. Using cell-SELEX, aptameerit voidaan generoida sairaat solut ilman tietoa tietyn tavoitteen molekyyli- allekirjoitus, mikä tekee mahdolliseksi löytää molekyylinäytteitä tautien hoitoon aikaisemmin tuntemattomia biomarkkereita, joita voidaan myöhemmin tunnistaa käyttämällä kemiallisia ja molekyylibiologisia menetelmiä [5 , 6]. Useita Aptameerien kykenee tunnistamaan erilaisia ​​solutyyppejä, mukaan lukien punasoluja (RBC) [7], ja solujen lymfaattinen leukemia [4], myelooinen leukemia [8], peräsuolen syöpä [9], rintasyövän [10], munasarjojen syöpä [11], pienisoluinen keuhkosyöpä [12], ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [13, 14], ja haimasyövän [15], on kaikki tuotettu tällä menetelmällä. Lisäksi useat solun pinnan biomerkkiaineiden-aptameeri paria on tunnistettu, mukaan lukien alkalinen fosfataasi istukan kaltainen 2 (ALPPL-2) [15], Prominin-1 (CD133) [16], epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) [17] ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptoria 2 (HER2) [18, 19], immunoglobuliinien raskaan mu-ketju (IGHM) [20], proteiini tyrosiinikinaasin 7 (PTK7) [4, 5], ja niitä vastaavat aptameerejä. Löytö syövän erityisiä aptameereillä tarjoaa suuria mahdollisuuksia biolääketieteen sekä kehittämään soluspesifisestä diagnoosi ja terapeuttisia [21], varsinkin kun solun pinnalla biomarkkerit liittyvät usein solun asetuksia tai signalointireittejä.

Koska oligonukleotidit , aptameerit ovat helposti toistettavissa kemiallisen synteesin pienellä erä-erien vaihtelut. Lisäksi muokattu kemiallisesti, se on helppo ottaa käyttöön toiminnallisia moduuleja päälle aptameerien vastata erityistarpeisiin, kuten fluoroforeja [22-25], kemialliset linkkerit [26, 27], terapeuttisia [28-30], tai jopa nanohiukkaset [31- 33]. Edellä mainitut huomattavat ominaisuudet, kehitys Aptameerien on hyödynnetty eri aloilla, erityisesti niitä, joissa biolääketieteen sovelluksissa [34-41]. Lisätutkimuksia on johtanut parantamiseen spesifisyyttä ja tehokkuutta tuottaa kuvantaminen, diagnostinen tai terapeuttisten aineiden kanssa saattueen aptameerejä [24, 33, 42].

tavoitteena nykyisen tutkimuksen tarkoituksena oli löytää Aptameerien jotka tunnistavat hepatosellulaarinen karsinooma (HCC), joka on tärkeä muoto maksasyövän, osuus 90% kaikista maksasyöpien [43]. Tässä, solu-SELEX-menetelmää käytetään tuottamaan aptameerejä, jotka kykenevät erilaistumaan ihmisen hepatosellulaarinen maksakarsinooma HepG2 normaalin maksan epiteelisolujen line THLE-2. Nämä aptameerit voidaan käyttää välineinä edelleen biolääketieteen tutkimuksissa ja kliinisissä sovelluksissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja Puskurit

HepG2 (hepatosellulaarinen karsinooma) ja THLE-2 ( normaali maksa) solut valittiin positiivisia ja negatiivisia valinta soluja, vastaavasti. Muut solulinjat, mukaan lukien HeLa (kohdunkaulan syöpä), MCF-7 ja MDA-MB-231 (rinta-adenokarsinooma), PL45 (haimasyöpä), H226 (keuhkojen levyepiteelikarsinooma karsinooma), A549 (keuhko adenokarsinooma), Ramos (Burkittin lymfooma), CCRF-CEM (T-solu leukemia) ja TOV-21G (munasarjasyöpä), käytettiin tutkittaessa selektiivisyyttä aptameerin ehdokkaita. Kaikki solulinjat hankittiin American Tissue Culture Collection (ATCC). HepG2, A549, MCF-7, ja PL45 pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM); Ramos, CCRF-CEM, H226 ja HeLa-solut ylläpidettiin RPMI-1640. TOV-21G solulinjaa ylläpidettiin viljelmässä MCBD 105: Medium 199 (1: 1). Kaikki edellä mainitut media ostettiin Sigma-Aldrich. MDA-MB-231-solulinja viljeltiin Leibovitzin L-15 Medium (ATCC) 37 ° C: ssa ja estää yhteyttä CO

2. BEGM Bullet Kit (Lonza /Clonetics Corporation) käytettiin valmistamaan kasvualusta THLE-2-soluissa. Gentamysiini /Amfoterisiini (GA) ja Adrenaliini hylättiin sarjasta mutta ylimääräisen 5 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (EGF), 70 ng /ml fosfoetanoliamiiniin, ja kaikki muut lisäaineet kitin sisältyivät ruselatusaineeseen. Kaikki alustat täydennettiin 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä) (Gibco). Kaikki solut, paitsi MDA-MB-231, inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-ilmakehässä.

Pesu puskuria valmistettiin Dulbeccon fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), jossa kalsiumkloridia ja magnesiumkloridi (Sigma-Aldrich), jossa lisäksi glukoosia (4,5 g /l) ja MgCl

2 (5 mM). Sidonta-puskuri valmistettiin lisäämällä hiivan tRNA (0,1 mg /ml) (Sigma-Aldrich) ja BSA: ta (1 mg /ml) (Fisher) ja pesupuskurilla.

synteesi ja puhdistus DNA-kirjasto ja Alukkeet

eteenpäin ja käänteinen alukkeet leimattiin FAM ja biotiini, vastaavasti, niiden 5′-päät. Sekvenssi eteenpäin aluke oli 5′-FAM-AGA GAC CCT GAC TGC GAA-3 ’; sekvenssin käänteinen aluke oli 5’-Biotin-AAG AAG CCA CCG TGT CCA-3 ’. DNA-kirjasto koostui satunnaistetussa 25-nt alueelle, jota reunustavat pohjamaali sitoutumiskohtia: 5’-AGA GAC CCT GAC TGC GAA- (N

25) -TGG ACA CGG TGG CTT CTT-3 ’. Kaikki kirjasto ja alukesekvenssit hankittiin Integrated DNA Technologies (IDT) ja puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC: llä.

Polymerase Chain Reaction

PCR-monistuksen parametrit optimoidaan ennen valintaprosessin. Kaikki PCR sisälsivät 50 mM KCl: a, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl

2, dNTP: itä (0,2 mM kukin), 0,5 uM kutakin aluketta, ja Hot start Taq-DNA-polymeraasia (0,015 yksikköä /ul) . PCR suoritettiin joko BioRad T100 tai C1000 Thermo Cycler, ja kaikki PCR-reagenssit hankittiin Takara. Kukin monistaminen sykli suoritettiin 90 ° C: ssa 30 sekuntia, 57 ° C 30 sekuntia ja 72 ° C 30 sekuntia, minkä jälkeen lopullinen laajennus 3 min 72 ° C: ssa.

in vitro

Selection

solu-SELEX-menetelmä suoritettiin perustuu protokolla [44] kehittämän ryhmämme tietyin muutoksin. Valinta suoritettiin yksisoluiset kerrokset, koska sekä positiiviset HepG2 ja negatiiviset THLE-2 käytetään tässä ovat kiinnittyneet solulinjat. Ensimmäisen kierroksen valinta, DNA-poolin koostui 20 nmol oligonukleotidin kirjaston 700 ml: aan sitoutumispuskuria. Sillä myöhemmillä kierroksilla, 250 nM oligonukleotidien monistettu edellisestä loput altaan käytettiin. DNA-kirjasto, kuumennettiin 95 ° C: ssa viisi minuuttia, mitä seurasi nopea jäähdytys jäillä 5 minuuttia ennen inkubointia, jolloin DNA-sekvenssit muodostavat edullisimman sekundaarirakenteita. DNA-kirjasto inkuboitiin sitten yksikerroksinen HepG2-soluissa 1 tunti 4 ° C: ssa poistamisen jälkeen väliaineen ja pesu kahdesti pesupuskurilla. Inkubointiaika pieneni valinnan edetessä: 60 min kierroksilla 1 ja 2, 45 min pyöreälle 3, ja 30 min kaikille myöhemmissä kehitysvaiheissa. Kunkin jakson välillä, solut pestiin kolme kertaa pesupuskurilla poistamaan sitoutumaton sekvenssejä. Pesuaika ja tilavuus pesu- puskuria kasvoi valinnan eteni poistaa heikkoja ehdokkaita ja saada Aptameerien korkea spesifisyys ja selektiivisyys. Sitten solut irrotettiin maljalta solukaapimella, ja roskat kerättiin 500 ui: aan sitoutumispuskuria. Monimutkainen kuumennettiin 95 ° C: ssa 10 minuuttia ja sitten sentrifugoitiin 14000 rpm: llä 5 minuutin ajan. Supernatantti kerättiin ja oli valmis PCR-monistus aikana kaksi ensimmäistä kierrosta, kun mitään negatiivista valintaa oli mukana. Myöhemmin kierrosta negatiivisen valinnan, supernatantti inkuboitiin yksikerroksista negatiivisten solujen THLE-2 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantit kerättiin.

sisältävä supernatantti sidottua DNA-sekvenssit monistettiin PCR: llä käyttämällä per- ja biotiini-leimattuja alukkeita. Määrä optimoidut PCR-monistuskierrosta varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Streptavidiinilla päällystettyjä Sepharose-helmiä (GE Healthcare Life Sciences) käytettiin eristämään PCR-tuotteet reaktioseoksesta. Fluorofori-leimatun yksijuosteisen DNA: n (ssDNA) erotettiin sitten biotinyloidun antisense ssDNA eluoimalla 200 mM NaOH: lla. Lopuksi ssDNA poistettiin suola NAP-5 sarake (GE) ja liuotetaan uudelleen sitomispuskurissa.

Koko valintaprosessi toistetaan, kunnes jatkuva merkittävä rikastus saatiin klo 19. kierroksella. Rikastuminen altaat analysoitiin virtaussytometrillä (Accuri C6, BD).

Seuraavan sukupolven Sequencing and Analysis

Rikastettu allas 19 valittiin sekvensointiin. SsDNA erotettu allas 19 PCR-monistettiin jälleen lisätä sovittimen sekvenssit (CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG TCT CCG ACT CAG AGA GAC CCT GAC TGC GAA ja CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG ATA AGA AGC CAC CGT GTC CA ) ja puhdistetaan käyttäen PCR-puhdistuskittiä (Qiagen). Puhdistetut Näytteet toimitettiin Ion Torrent seuraavan sukupolven sekvensointi yliopistossa Floridan, ICBR sekvensointi Core Facility. Tuotteet linjattu tunnistaa runsain sekvenssit käyttäen Galaxy ohjelmistoa. Jokainen alle 10 kopiota poistettiin analyysistä. Loput lukee (501084) Sitten klusteroiduista ja 20 runsaimmin sekvenssit (taulukko S1 S1 File) syntetisoitiin kemiallisesti edelleen karakterisointia.

Sitova Analysis

Keräyspaperi aptameeriin ehdokasta syntetisoitiin standardi fosforamidiittimenetelmällä käyttämällä 3400 DNA-syntetisaattorilla (Applied Biosystems) ja puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC: llä (Varian Prostar käyttäen C18-pylvästä ja asetonitriili /trietyyliammoniumasetaatissa liikkuvana faasina). Reagenssit synteesi hankittiin Glen Research. BD Accuri C6 virtaussytometrialla (BD Immunocytometry Systems) levitettiin seurata rikastumista ssDNA sekvenssien altaat valintavaiheessa ja arvioida sitoutumisaffiniteetti ja spesifisyys valitun aptameerin ehdokkaita. Ei-entsymaattiset soluhajotusprosessin liuosta käytettiin irrottamiseksi soluihin, ja dispergoitiin sitten solut pestiin pesupuskurilla. Kun proteaasilla käsiteltyä soluja tarvitaan, trypsiiniä sijasta käytettiin ei-entsymaattisten soluhajotusprosessin ratkaisu. Trypsiinillä ja ei-entsymaattinen soluhajotusprosessin liuosta sekä ostettiin Sigma-Aldrich. Sitoutumismääritykset suoritettiin virtaussytometrillä inkuboinnin jälkeen 4 x10

5 dispergoitiin solut 200 pl sitomispuskuria altaat tai aptameerien 250 nM 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa (tai 37 ° C: ssa kuten on osoitettu). Kunkin aptameerin ehdokas, sitoutumisaffiniteetti (K

d) kohti tavoitetta HepG2 arvioitiin käyttämällä Sigma Plot sovittamalla suhteellisen keskimääräisen fluoresenssin intensiteetin sitoutumista versus pitoisuus aptameerit käyttämällä kyllästymisen yhtälön Y = B

maxX /(K

d + X) (Y on erityinen sitova, pitoisuudella aptameerin = X nanomolaariseen, ja BMAX on maksimaalinen sitova.) Soluja inkuboitiin 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan eri pitoisuuksia (0,1, 0,5, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 nM), kunkin talteen aptameerin biotiinilla leimattu 5′-päähän. Sitten solut pestiin kahdesti 1 ml: lla pesu- puskuria, suspendoitiin 200 ul: aan sitovaa puskuria, joka sisälsi streptavidiini-PE, ja värjättiin 20 minuutin ajan. Solut pestiin jälleen kaksi kertaa 1 ml: lla pesupuskuria ja suspendoitiin sitten 100 ul: aan sitoutumispuskuria ja virtaussytometria-analyysiä. Biotiini-leimatun valitsematta kirjastoa käytettiin negatiivisena kontrollina määrittämiseksi tausta sitova. Keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus valitsematta kirjaston vähennettiin, että vastaavan aptameerin kanssa kohdesolujen määrittämiseksi spesifisen sitoutumisen leimatun aptameerin. Kaikki sitoutumismääritykset toistettiin kolme kertaa.

Tulokset ja keskustelu

valintaprosessin alkoi satunnainen kirjasto, joka sisälsi noin 1,2 x 10

16 (20 nmol) ssDNA sekvenssit 61 nukleotidin ( nt), ja sen jälkeen peräkkäin sidonta kohteena HepG2-soluissa, eluointi ja sen jälkeen PCR-monistusta varten yhteensä 19 kierrosta. Counter-valinta THLE-2-solut otettiin käyttöön kolmannella kierroksella ja toteutettiin kaikissa seuraavissa kierrosta poistamaan mahdollisuus tahansa oligonukleotidien tunnustaa yhteinen solupintamarkkerien tavoite- ja negatiivisia solulinjoja. Rikastus etenemistä seurattiin testaamalla sitoutumisen talteen ssDNA kunkin kierroksen kohdesoluihin käyttämällä virtaussytometria. Ajoittaisen siirtymisen fluoresenssin intensiteetissä havaittiin myöhemmissä kehitysvaiheissa. Fluoresoiva signaali pysäytetään lisäämällä kierrosten välillä 17 ja 19, mikä tarkoittaa, että tyydyttynyt sitoutumisen rikastetun altaat oli saavutettu (kuvio 1A). Ei ilmeistä fluoresenssin intensiteetin kasvu havaittiin normaalilla THLE-2 maksasoluja altaassa 19 (kuvio 1 B), mikä osoittaa, että verrattuna alkuperäiseen kirjastoon, rikastettu ssDNA allas 19 osoitti preferentiaalisesta sitoutumisesta HepG2-soluissa, ei THLE-2-soluissa.

(A) sitoutumismääritykset osoittivat havaittavissa siirtymä irtotavarana sitoutumisen altaan maksan syöpäsoluja (HepG2) ja kasvu pysähtyi, kun 17

th kierroksen valinta. (B) Hienovarainen väheneminen fluoresenssin intensiteetissä havaittiin normaali maksan soluihin (THLE-2), on saavutettu vähintään muutos 19

th kierros. Punainen käyrä edustaa soluja inkuboitiin valitsemattomat alkuperäisen kirjaston.

ssDNA talteen kierros 19 toimitettiin seuraavan sukupolven syvä sekvensointi. Runsain 20-sekvenssit (taulukko S1 S1 File) syntetisoitiin kemiallisesti, biotiinilla leimattu 5′-päähän, ja sitten puhdistettiin HPLC: llä. Sekvenssit kvantitoitiin (UV 260/280) ja laimennettiin standardin pitoisuuksia.

Sidonta-analyysi suoritettiin inkuboimalla positiivisia tai negatiivisia soluja 250 nM kutakin aptameerin ehdokas. Mukaan virtaussytometria analyysitulokset, yksikään oligonukleotidien näytetään sitova THLE-2 normaalit epiteelin maksasolut, kun taas seitsemän aptameeri ehdokkaita osoitti ilmenee muutoksia fluoresenssin intensiteetissä HepG2-solujen suhteen satunnaisessa järjestyksessä (kuvio 2, taulukko S2 S1 -tiedosto), mikä tarkoittaa, että kaikki valitut aptameerit voivat erilaistua maksan syöpäsolujen normaali maksan soluihin.

valittu aptameerejä osoitti ilmeistä sitoutumista hepatooma HepG2-soluissa (A), kun taas mitään fluoresenssin parannus havaittiin normaalin epiteelin maksasoluja (B), käyttämällä virtaussytometria. Kokeet suoritettiin 4 ° C: ssa.

sitoutumisaffiniteetit valitun aptameerit määritettiin sitten arvioimalla dissosiaatiovakiot (K

d). Pienempi K

d-arvo osoittaa voimakkaampaa sitoutumista valitun aptameerin kohdesoluihin. Kuten taulukossa 1 aptameerit tässä tutkimuksessa osoitti Sitoutumisaffiniteetit kohti HepG2-soluissa nanomoolialueella (64-349 nM), mikä viittaa siihen, että nämä aptameerien tiukasti sidottu tavoitteensa HepG2-soluissa.

estää sitoutumisen sekvenssit on sisäistetään, teimme

in vitro

valinta 4 ° C: ssa, samoin kuin sitoutumismäärityksissä edellä. Valittua Aptameerien eivät menettäneet tunnustamista kohdentaa HepG2-soluissa fysiologisessa lämpötilassa (kuvio 3A). Fluoresenssin muutos soluista inkuboitiin aptameerien verrattuna soluihin inkuboitiin kirjasto säilytettiin kun sitova kokeet suoritettiin 37 ° C: ssa.

(A) siirtyminen fluoresenssin intensiteetin HepG2 inkuboitiin kunkin valitaan aptameerit pidettiin 37 ° C: ssa. (B) fluoresenssin ei siirry, kun HepG2-solut käsiteltiin trypsiinillä 30 min ennen inkubointia, mikä osoittaa, että kalvo-proteiinit ovat todennäköisiä kohteita.

On raportoitu, että aptameerit spesifisesti vuorovaikutuksessa pintojen kanssa kohdesolujen valinnan aikana [5, 20]; Näin ollen, toinen joukko sitoutumisen kokeet (37 ° C) käyttämällä HepG2-soluissa käsitellään trypsiinillä 30 min ennen inkubointia koettimilla suoritettiin tutkimaan, onko valittu aptameerit kohteena oli kalvon proteiinien HepG2. Kuten on esitetty kuviossa 3B, kaikki valitut aptameerit menettivät edullisen sitoutumisen kirjaston kanssa proteaasilla käsiteltyä HepG2-soluissa, mikä osoittaa, tavoitteet näiden aptameerien ovat todennäköisesti membraaniproteiinit.

On raportoitu, että tietyt proteiinit ovat syöpään liittyvän [45, 46]. Siksi tunnistaminen yhteinen proteiinit esittämän syöpäsolujen ja tutkimalla niiden merkitys syöpiä voidaan antaa vihjeitä syövän kehittymisen. Sen jälkeen todistetaan valitun Aptameerien kykenivät erilaistumaan maksasyövän normaaleista maksan epiteelisolujen me tutki vielä sitova valikoivuus aptameereillä vastaan ​​solulinjoja muiden syöpien, kuten keuhko- levyepiteelikarsinooma syöpä (H226), keuhkon adenokarsinooma (A549), kohdunkaulan adenokarsinooma (HeLa), rinta-adenokarsinooma (MCF-7, MDA-MB-231), munasarjan adenokarsinooma (TOV-21G), haiman adenokarsinooma (PL45), ja leukemia (Ramos, CCRF-CEM) (taulukko 2). Todettiin, että seitsemän aptameerit näytetään myös merkittäviä sitovia kohti keuhkojen adenokarsinooma, munasarjasyöpä ja alkion munuaissoluissa, osoittaa erittäin todennäköistä, joitakin yhteisiä proteiinien ilmaistuna nämä solut, kun taas, samanaikaisesti, ne eivät osoittaneet mitään affiniteettia leukemia tai kohdunkaulan syöpäsoluja. Koska keuhkosyöpä on yhteinen määränpää maksasyövän etäpesäke [47], tämä tulos voisi tukea niiden käyttöä aptameerit molekyylikoettimina tutkia syövän etäpesäkkeiden. Lisäksi, kaikki aptameerit esillä tunnustamista kohti yksi rintasyöpäsolulinja MCF-7, mutta ei muita rintasyövän solulinjan MDA-MB-231. Tämä ero voi johtua siitä, että ne ovat kaksi eri alatyyppien rintasyöpä. Esimerkiksi MCF-7 lankeaa Luminal A: n alatyypin erittäin ilmaistaan ​​estrogeenireseptori (ER) ja progesteroni reseptorin (PR), ja MDA-MB-231 kuuluu Basal kaltainen alatyyppi, joka on negatiivinen ER ja PR [48] . Näin ollen tämä tulos viittaa siihen, että nämä aptameerejä voidaan soveltaa hormoniriippuvaisen syövän tutkimuksia.

Johtopäätös

Kaikki seitsemän aptameerit raportoitu tässä voidaan erottaa hepatoma normaaleista maksasolut; he osoittivat suuret affiniteetit kohti HepG2-solulinja 4 ° C: ssa (K

d’s 64-349 nM), sekä 37 ° C: ssa, kun taas mitään havaittavaa sitova normaali maksan soluihin havaittiin. Proteinaasi hoito osoittivat, että kaikki seitsemän Aptameerien tunnistavat kohdesolun HepG2 läpi pinnan proteiineja. Lisäksi nämä aptameerit osoitti tunnustusta kohti keuhkosyöpä, munasarjasyöpä, ja Luminal A: n alatyypin rintasyöpä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että nämä Aptameerien saattavat olla mahdollisia koettimien lisätutkimuksia syövän tutkimuksiin, kuten kehittää varhainen havaitseminen määrityksiä, kohdennettuja hoitoja, ja kuvantaminen aineita, sekä tutkinnan yhteisten membraaniproteiineja näissä erotettavissa syöpiä.

tukeminen Information

S1 File. Yhdistetty tiedot tukipöydät.

Taulukko S1: lukumäärä lukee ja prosenttiosuus 20 runsain sekvenssit. Sequence # on nimetty järjestyksessä runsaudesta. Yhteenlaskettu # of lukee koko DNA allas on 501.084. Niistä runsas kaksikymmentä sekvenssit, seitsemän niistä raportoidaan Aptameerien kohdistamista HepG2-soluissa. Taulukko S2: Fluoresenssin voimakkuus havaitaan soluja inkuboitiin 250 nM kutakin aptameerit tai satunnainen 61-meeri-DNA-kirjastosta. (G-keskiarvo: geometrinen keskiarvo) B doi: 10,1371 /journal.pone.0125863.s001

(DOCX) B

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää tohtori Kwame Sefah suunnitteluun alukkeita ja antaa hyödyllisiä neuvoja, jotka ovat osallistuneet tähän työhön, tohtori Kathryn R. Williams hänen kriittinen tarkastelu käsikirjoituksen, ja DNA: n sekvensointi ydin, ICBR, University of Florida apua aikana seuraavan sukupolven syvä sekvensointi.