Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Difteriatoksiini (DT) on hyödynnetty prospektiivinen solunsalpaajaksi varten kohdistettu annostelu solunsalpaajahoito muutoin untreatable neoplasia. DT on erittäin voimakas myrkky, jolle tulo yhden molekyylin soluun voi olla tappava. DT on syöpäsoluihin kohdennettujen poistamalla solun reseptoria sitovan domeenin ja yhdistämällä jäljellä katalyyttisen osan kanssa kohdistaminen proteiineja, jotka selektiivisesti sitoutuvat syöpäsolujen pinnalla. On oletettu, että ”receptorless” DT ei voi sitoutua, ja tappaa soluja. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme ilmoittaneet, että ”receptorless” rekombinantti DT385 on itse asiassa sytotoksinen erilaisia ​​syöpäsolulinjoja.

Methods

in vitro

sytotoksisuuden DT385 oli mitattuna solujen proliferaatiota ja värjäys ja apoptoosin määrityksiä. Sillä

in vivo

tutkimuksissa kanan suoni-kalvon (CAM) systeemiä käytettiin vaikutuksen arvioimiseksi DT385 angiogeneesiin. CAM ja hiirimallissa järjestelmää käytettiin vaikutuksen arvioimiseksi DT385 on HEp3 ja Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) kasvaimen kasvua vastaavasti.

Tulokset

18 ihmisen syövän testatut solulinjat, 15 vaikutti DT385 IC

50 vaihtelevat 0,12-2,8 uM. Lisäksi korkeat pitoisuudet DT385 ei vaikuta kasvu pysähtyy soluja. Solujen toksisuus DT385 johtui proteiinisynteesin inhibitio ja apoptoosin induktion.

In vivo

, DT385 vähentynyt angiogeneesi ja laski kasvaimen kasvua CAM järjestelmään, ja esti ihonalainen kasvua LLC hiirissä.

Johtopäätös

DT385 hallussaan antiangiogeenistä ja antituumorivaikutus ja voi olla potentiaalia terapeuttisena aineena.

Citation: Zhang Y, Schulte W, Pink D, Phipps K, Zijlstra A, Lewis JD, et al. (2010) herkkyys syöpäsolujen Katkaistu Diphteriatoksiinin. PLoS ONE 5 (5): e10498. doi: 10,1371 /journal.pone.0010498

Editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 5. marraskuuta 2009; Hyväksytty: 14 huhtikuu 2010; Julkaistu: 05 toukokuu 2010

Copyright: © 2010 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Nova Scotia Health Research Foundation (NSHRF). YZ tukee stipendi päässä Cancer Research Training Program Dalhousien yliopisto. JDL tukee apurahan # 018176 päässä NCIC /Terry Fox Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

difteriatoksiini (DT) syntetisoituu

Corynebacterium diphtheriae

yhtenä ketjun entsyymiä 535 aminohappoa, jonka molekyylipaino on 63000 [1], [2]. DT koostuu kolmesta tärkeimmän alan aminopäästä C, tai katalyyttinen, domain (tähteet 1-186); väli T, tai transmembraaninen, domain (tähteet 202-381); ja karboksipään R, tai reseptoria sitovan, domeeni (tähteet 391-535). Katalyyttinen domeeni on liitetty T-domeenin arginiini-rikas silmukka ja helposti pelkistyviä disulfidisilta (yhdistää C186 ja C201). DT on osoitettu tulla toksiini-herkkien nisäkässoluissa reseptorivälitteisen endosytoosin johon liittyy vuorovaikutus reseptorin sitovan domeenin proteiinin kanssa transmembraanisen solun pinnalla esiaste hepariinia sitovat epidermaalisen kasvutekijän kaltaisen kasvutekijä [3] [4]. Sitoutumisen jälkeen tämä solupinnan reseptori, DT endosytoosin, ja kaupataan happamaan vesicular osastoon, jossa se käy läpi pH-riippuvainen konformaation muutoksen, pilkkominen ja vapautumista katalyyttisen domeenin. T-verkkotunnuksen insertoituu vesicular kalvo ja tuloksena kanava käytetään translokaatiota katalyyttisen domeenin sytosoliin. Siellä, katalyyttinen alayksikkö katalysoi ADP-ribosylaatio elongaatiofaktori 2, jolloin proteiinisynteesi inhiboituu ja solukuolemaa (tarkistetaan [5]).

useita katkaistun, yhdistelmä-DNA-DT proteiineja on tuotettu jossa reseptoria sitovan domeenin on geneettisesti korvattu ligandeja, jotka voivat valikoivasti kohdistaa pahanlaatuisia soluja. Nämä fuusioproteiinit ovat uusi luokka sytotoksisia aineita, jotka, toisin kuin chemotherapeuticDT on osoitettu tulla toksiini-herkkien nisäkässoluissa reseptorivälitteisen endosytoosin johon liittyy vuorovaikutus reseptorin sitovan domeenin proteiinin lääkkeillä, tappaa suunnattu soluissa inhiboimalla proteiinisynteesiä ja näin ollen apoptoosin indusoimiseksi [6]. Nämä fuusioproteiinit sisältävät DT508-MSF [7], DT486-IL-2 [8], DT486-GM-CSF [9], DT390-IL3 [10], DT388-GM-CSF [11] – [13], DT388 -IL-3 [14], [15], DT385-VEGF [16], [17] ja DT388 yhdistettynä ATF domain uPA [18]. Niistä tuloksena huumeita, DT388IL-3 on osoittanut jonkin verran lupaaviksi kliinisissä kokeissa [19], [20], kun taas DT389-IL-2 yhdistelmä-toksiini (DAB389-IL-2, denileukiini diftitoksi-ONTAK) on hyväksynyt FDA kliiniseen käyttöön pitkälle ihon T-solulymfooma (katsaus [21] – [23].

on yleisesti hyväksytty, että tehoa DT fuusioproteiinien piilee kyky kohdistaminen ligandin komponentin suoraan DT syöpäsoluja johtaa kohdennettuja solutoksisuuteen. Lisäksi poisto DT-reseptorin sitova domeeni odotetaan johtavan katkaistun DT, joka ei kykene olemaan vuorovaikutuksessa reseptorin pinnalla eukaryoottisolut, ja näin ollen kykene sitomaan ja tappaa soluja. Tämä käsite on vahvistettu raportti, jonka katkaistun DT (DT385) ei sytotoksinen [16].

nykyisessä tutkimuksessa, osoitamme, että toisin kuin aiempien raporttien yhdistelmä-typistetty DT , DT385 on sytotoksinen monia syöpäsoluja. Havaitsimme myös, että DT385 estää niiden kasvun ihmisen ja hiiren kasvaimissa. Havaintojemme vahvistaa tehoa DT385 mahdollisena antituumoriaineena.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines

Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) saatiin Cell Applications, Inc. ja kasvatettu endoteelisolujen kasvualusta täysin kasvun lisäravinteet (Cell Applications, Inc.). Naudan keuhkovaltimon endoteelisolujen (BPAEC) ja ihmisen ihon mikroverisuonten endoteelisoluja (HDMEC) saatiin Lonza ja niitä kasvatettiin EBM väliaineessa plus EGM SingleQuots kasvun täydentää ja EBM-2 alusta plus EGM-2 SingleQuots kasvun täydentää (Lonza) vastaavasti. Glioomasolulinjoja U-87 MG ja U251 oli ystävällisesti antaa tohtori V. Wee Yong (University of Calgary, Calgary, Alberta, Kanada). Ihmisen epidermoidikarsinooma solulinjaa HEp3 oli antelias lahja tri Andries Zijlstra (Vanderbilt University, USA). Hiiren alkion fibroblasti (MEF-solut) eristettiin hiiren alkioiden ja käytettiin varhaisessa käytäviä (alle kanavan 4). U-87 MG, U251, HEp3 ja MEF-soluja viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS, Invitrogen) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä seokset (Invitrogen). Kaikki muut solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) ja niitä kasvatettiin DMEM: ssä, MEM tai RPMI (Invitrogen), joka sisälsi 10% (v /v) naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini-streptomysiiniä seokset mukaan ATCC ohjeita. Kaikki solut kasvatettiin inkubaattorissa 37 ° C: ssa, joka sisälsi 5% CO2. Kaikki endoteelisolujen ja primaarifibroblastin soluja ylläpidettiin ja käytettävä ennen yhdeksännen kulkua.

induktio ja puhdistus rekombinanttiproteiinien

Plasmidi pET17b-DT385 ilmentävien ”receptorless” DT385 oli jalomielinen lahjoitus tohtori Sundaram Ramakrishnan (farmakologian laitos, University of Minnesota Medical School, Minneapolis, MN). Plasmidi pET17b-p22 rakennettiin kloonaamalla ihmisen plasminogeeni-fragmentti p22 osaksi pET17b (EMD Biosciences) on Ndel- ja BamHI-restriktiokohdat. Plasmidi pLIC-DT385-p22 rakennettiin kloonaamalla ihmisen plasminogeeni-fragmentti p22 plasmidiin pLIC-DT385 Ncol ja Hindlll-restriktiokohdat, kun taas plasmidi, pLIC-DT385 rakennettiin insertoimalla DNA, joka koodaa DT385, mutta josta puuttuu lopetuskodoni pET -30 EK /LIC vektori noudattamalla valmistajan protokollan (Novagen). Plasmidi pSUMO koodaava cDNA SUMO (pieni ubikitiini liittyvät modifiointiaine, Saccharomyces cerevisiae, Smt3 geeni) luovutti ystävällisesti Dr. Kathon Zhou (Dalhousien yliopisto). Kaikki plasmidirakenteet varmistettiin DNA-sekvensoinnilla (DalGEN, The Dalhousie yliopiston DNA-sekvensointi laitos). Rekombinantti p22, SUMO, DT385, ja DT-p22 ilmennettiin

E. coli

ja puhdistettiin Ni-NTA-affiniteettipylvääseen (Qiagen), yhdistettiin ja dialysoitiin yön yli fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS). Kaikki yhdistelmä-DNA-proteiinit puhdistettiin yhtenä nauhana, kuten kävi ilmi, SDS-PAGE-analyysi. LPS poistettiin puhdistettiin proteiineista käyttäen polymyksiini B helmiä (Detoxi-Gel Endotoksiinin poistaminen Gel, Pierce) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Useita kulkee pylvään läpi tehtiin vasta LPS taso oli alle 30 EU /mg.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin Cell Titer96 vesikerros Solution proliferaatiomääritystä (MTS-määritys -Promega) käyttäen valmistajan protokollaa. IC

50-arvot laskettiin epälineaarisella pienimmän neliösumman annos-vaste käyrät käyttäen avoimen lähdekoodin tietokoneohjelmaa QTI juoni. Tiedot analysoitiin neljän parametrin logistiseen yhtälöön f = (a – d) /[1 + (x /c) b] + d, jossa

on asymptoottinen maksimi,

b

on rinne parametri,

c

on arvo käännepiste (IC

50) ja

d

on asymptoottinen pienin. Kontrollille, 0,4 uM tai 1,2 uM DT385 lisättiin Kudosviljelyalustaan ​​ilman solujen jälkeen inkuboitiin MTS /PMS-reagenssia. Vähentäminen MTS ei havaittu näissä olosuhteissa, jossa vahvistetaan, että DT385 ei häiritse tätä määritystä.

kristalliviolettivärillä

Solulisääntyminen arvioitiin myös kristallin violetti värjäys. Lopussa hoidon DT385, solut kiinnitettiin 100% metanolia, ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla 20% metanolissa 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Stained solut valokuvattiin 25 x suurennus Zeiss Axiover 200 käännettyä mikroskooppia (Carl Zeiss, Saksa).

Apoptosis ja kuolion Pitoisuus

apoptoottiset ja nekroottista soluja tarkasteltiin kanssa apoptoosin ja nekroosin määritystä kit (Biotium, Inc.) valmistajan protokollan. Stained solut kuvattiin Zeiss Axioplan II fluoresenssimikroskooppia (Carl Zeiss, Saksa), jossa on asianmukainen suodatin asetukset fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) ja Texas Red fluoresenssi. Digitaaliset kuvat käsiteltiin Adobe Photoshop (Adobe Inc.).

Proteiinisynteesi määrityksessä

U-87 MG tai Hela-soluja siirrostettiin suhteessa 1:10 1 ml: aan DMEM plus 10% FBS kuoppaa kohti 12-kuoppalevyllä yössä. Soluja käsiteltiin 1 uM DT385 varten osoitetun ajan, inkuboitiin 15 minuuttia 37 ° C: ssa 0,5 ml merkintöjä väliaineen (metioniini-DMEM:, 10% dialysoitua FBS: ää ja 50-100 uCi Pro-Mix L – [

35 -S] – (Amersham)), ja solulysaatit analysoitiin SDS-PAGE: lla. Radioaktiiviset nauhat visualisoitiin radiografia käyttämällä phosphorlmager jälkeen yön yli valotuksen fosfori näytöllä. Kvantitoimiseksi, [

35S] inkorporaatio mitattiin nestetuikelaskennalla.

Chick-rakkokalvon (CAM) angiogeneesimääritys

anti-angiogeeninen aktiivisuus proteiinien testattiin CAM on kuvattu [24]. Kun analysoidaan kasvaimen aiheuttama vaskularisaatio, 50000 HEp3 solut korvataan bFGF /VEGF, sillä angiogeenisen ärsykkeen [25]. Neljä implantit asetettiin kuhunkin CAM ja kymmenen alkioita käytettiin kutakin koeyhdisteellä.

CAM kasvaimen kasvua määrityksessä

HEp3-GFP kasvainsoluja (100000 solua /10 ui DMEM) levitettiin suoraan suodattimelle levyn naarmutetun CAM 9-päivän ikäisten kananpoikien alkioiden kuten kerrotaan [26]. Chicks inkuboitiin vakio-olosuhteissa, kunnes päivä 15, jolloin kasvaimet kuvaamisen ja lajitellaan satunnaista jakautumista valvoa ja hoitoryhmissä. Päivittäinen systeeminen intravenöösien DT385 (2 ug 50 ul PBS: ää) tai PBS: ää (50 ui) suoritettiin päivänä 15, 16 ja 17. Päivänä 18, kasvaimet irrotettiin ja puhdistettu CAM ja sitten punnitaan. Vaihtoehtoisesti fluoresoiva (GFP) Hep3 kasvaimia oli kuvattu

in vivo

käyttäen Zeiss Lumar fluoresenssistereomikroskoo-. Ääriviivat kasvaimen määritettiin käyttäen fluoresenssisignaali kasvainsolujen (GFP kanava (EX470 /em525)). Erityisesti Volocity ohjelmisto oli kalibroitu valita alueita fluoresenssin intensiteetti vastaa 1 tai enemmän standardipoikkeamaa yli taustan. Alueen kasvaimen määriteltiin ja laskettiin käyttäen Improvision Volocity ohjelmistoa (Perkin Elmer, Inc.) (Versio 5.3.0 Build 0). Mittayksikkö (1 mm) kalibroitiin käyttäen verkkoon hemosytometrin. Määrittämistä tuumorin tilavuuden oletetaan, että tämä muoto ei hemiellipsoidal ja yhtälö tuumorin tilavuus on: V = π /6 • (pituus) • (leveys) • (korkeus), jossa height = 1.63√ (pituus • leveys). Tiedot analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä.

Hiiri kasvainmuoto

Kaikki eläin työ tehtiin eläin laitoksen Dalhousien yliopisto mukaisesti ohjearvojen mukainen Care ja käyttö Laboratory Eläimet Dalhousien yliopisto. Kaikki tutkimukset hyväksynyt Dalhousie Animal tutkimuseettiseltä. Naaras 6-8-viikon ikäisiä C57BL6 /J-hiiriä (Jackson Laboratories) käytettiin. Kasvaimia indusoitiin ihonalaisella LLC-soluja (10

6 solua) 100 ul: ssa steriiliä PBS: ää. Palpoitavissa kasvaimia perustanut kolme ja neljä päivää sen jälkeen injektion, jolloin hiiret satunnaistettiin kahteen koeryhmään, ne, jotka saivat yhdistelmä-SUMO (kontrolli) ja ne, jotka saivat yhdistelmä-DT385 hoitoa. SUMO ja DT385 annettiin hiirille, peritumorally 5. päivänä (25 ug 100 ui PBS: ssä), ja päivinä 9, 12 ja 15 (10 ug 100 ui PBS: ää kunkin injektion).

Protein Labeling FITC

DT385 ja BSA olivat FITC-leimattu käyttäen EZ-etiketti FITC proteiinin merkintöjä Kit noudattamalla valmistajan protokollan (Pierce).

Ammoniumkloridi huuhtoutumisen tutkimukset

U87-soluja inkuboitiin puuttuessa tai läsnä DT385 (2 uM) yksin tai yhdessä 10 mM ammoniumkloridia. Väliaine poistettiin eri ajankohtina ja korvattiin tuoreella kasvatusliuoksella. Kolmekymmentä kuusi tuntia lisäämisen jälkeen testiyhdisteiden, solujen elinkyky mitattiin MTS-määrityksellä.

Tilastollinen analyysi

merkitys tietojen määritettiin käyttämällä Studentin t-testiä (one-tailed ). P-arvot 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

karakterisointi DT385

Viimeaikaiset tutkimukset laboratoriossamme tunnistettu ja karakterisoitu uusi antiangiogeenisesti plasminogeenin fragmentti nimeltään p22 [ ,,,0],27]. Koska p22 oli tehokas ja spesifinen estäjä hiussuonten endoteelisolujen, se oli ajateltu, että tämä proteiini voitaisiin käyttää kohdentamaan DT äskettäin muodostaen verisuonistoon. Olemme ilmaisseet fuusioproteiinin

E. coli

joissa p22 korvattiin reseptoria sitovan domeenin DT (DT385-p22). Aktiivisuus Tämän fuusioproteiinin verrattiin rekombinanttiin DT385 ja rekombinantti-p22. Voit selvittää vaikutus näiden yhdisteiden solun elinkelpoisuuden MTS määritykset suoritettiin naudan keuhkovaltimon endoteelisolujen (BPAEC) jälkeen kolmen päivän hoitoon. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että toisin kuin p22 valmistettiin proteolyyttisellä digestiolla ihmisen plasminogeenin [27], yhdistelmä-p22 eivät estäneet elinkelpoisuuden BPAEC (kuvio 1A). Valitettavasti emme ole pystyneet tuottamaan aktiivista yhdistelmä-p22 in

E. coli

tai hiiva (tuloksia ei ole esitetty). Erityisen kiinnostavia oli havainto, että sekä rekombinantti DT385-p22-konstrukti ja yhdistelmä-DNA-DT385 dramaattisesti vähentänyt elinkelpoisia BPAEC. Olemme määritetään IC

50-arvo 0,21 uM ja 0,14 uM DT385-p22 ja DT385 vastaavasti (taulukko 1).

Rekombinantti p22, (ilmennetään pET17b-p22), DT385 (ilmennetään pET17b- DT385), DT385-p22 (ilmennetään pLIC-DT385-p22), (katso materiaalit ja menetelmät), tai vastaava määrä PBS: ää (kontrolli) inkuboitiin (A) BPAEC, (B), Hela ja HT1080-solujen, ja (C ) HUVEC ja HDMEC solujen kasvatusväliaineessa kolme päivää. Kun kolme vuorokauden inkuboinnin, elinkelpoisten solujen määrä kvantifioitiin MTS-määritys. PBS ajoneuvon hallinnan pidettiin 100% elinkelpoisia. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina PBS: llä käsiteltyjä soluja. Tulokset ovat keskiarvo ± S.D. 3 itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena (n = 9).

Koska yhdistelmä-p22 oli aktiivinen kun taas DT385-p22 säilyminen, se oli epäselvää näistä tuloksista jos p22 saattanut säilyminen ilmaistuna fuusioproteiinia, DT385-p22. Ottaen huomioon spesifisyys plasminogeenin johdettu p22 endoteelisolujen, odotimme, että jos p22 komponentti DT385-p22-fuusioproteiinia, sitten DT385-p22 pitäisi kohdistaa vain endoteelisolujen ja ei syöpäsolut, kuten on osoitettu plasminogeenin johdettu p22 [27]. Siksi testattiin sytotoksisen aktiivisuuden DT385-p22 ja DT385 syövän solulinjat. Näissä kokeissa olemme alun perin testattiin kaksi tavallista ihmisen syövän solulinjojen HT1080 fibrosarkoomasolulinjoilla ja HeLa kohdunkaulan karsinooma solu. Yllättäen huomasimme, että DT385 aiheutti dramaattinen menetys solujen elinkelpoisuus syöpäsolulinjoja annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1 B). Korkeimmalla tutkitulla annoksella (2,4 uM), 10% elinkelpoisia Hela-solujen säilyi, kun taas noin 50% elinkelpoisia HT1080-solujen pysyi. DT385-p22 ei myös aiheuttaa menetyksiä solujen elinkelpoisuus, mutta oli vähemmän tehokas kuin DT385. Voit selvittää, onko elinkelpoisuutta ihmisen endoteelisolujen vaikuttivat DT385-P22, me inkuboidaan HUVEC ja HDMEC näillä proteiineista (kuvio 1 C). Yllättäen elinkelpoisuus molemmissa solulinjoissa ei vaikuttanut DT385, D385-p22 tai p22 pitoisuutena 2,5 uM. Jatkoimme inkubaation aika 7 päivää 2,4 uM näiden yhdistelmä-DNA-proteiinien, eikä solun elinkyvyn menetykseen havaittiin (kuvio S1, A). Kuitenkin erittäin korkeat pitoisuudet DT385, elinkelpoisuuden menetys, HUVEC ja HDMEC havaittiin (kuvio S1, B). Määritimme IC

50 noin 5,77 ja 7,54 uM DT385 varten HUVEC ja HDMEC, vastaavasti. Nämä tulokset viittaavat siihen, että sytotoksinen aktiivisuus DT385-p22 johtui aktiivisuutta DT385 domeenin fuusioproteiinia eikä p22 verkkotunnuksen. Olemme myös, että DT385 voi tappaa ihmisen syöpäsoluja pitoisuutena ei vaikuta ensisijainen endoteelisolujen linjat. Havainto, että DT385 oli sytotoksinen aktiivisuus oli uutta ja odottamatonta. Siksi tutkittiin mahdollisuutta, että DT385 voi tappamaan muita syöpäsoluja.

sytotoksiset vaikutukset DT385 on syöpäsolulinjoissa

laajentanut sytotoksisuusmääritys 18 ihmisen syöpäsolulinjoissa (taulukko 1). Viisitoista syöpäsolulinjojen vaikuttivat DT385 ja tehoa DT385 vaihteli syöpäsoluja. Syöpäsolun linjat korkein herkkyys DT385 (IC

50 alle 0,5 uM DT385), mukana U-87 MG, U251, 293T, HEK293, Hela ja Calu-3-soluissa. Ryhmä, joiden välissä herkkyys DT385 (IC

50 0,5-1,5 uM) mukana Colo201, Colo205, LNCap, PC-3, HT1080, ja MDA-MB-231-soluja. Heikosti herkkä syöpäsolun linjat IC

50 yli 1,5 uM mukana MCF7, HCT116, BT-20, NB4, HL-60, ja HEp3 soluja. Sitä vastoin rekombinantti p22 ei ollut vaikutusta solujen elinkelpoisuuden pitoisuuksilla kuin 2,4 uM (tuloksia ei ole esitetty). Kolme ihmisen syövän solulinjat eivät vaikuta DT385 korkeimmalla testatulla annoksella (2,4 uM) olivat promyelosyyttinen leukemia solulinjoja (HL-60 ja NB4) ja epidemoid masolulinjassa (HEp3).

DT385 -välitteisen menetys solujen elinkelpoisuus varmistettiin myös käyttämällä crystal violet värjäystä (kuvio 2). Esimerkiksi vähemmän kuin 10% gliooma U-87 MG-soluja jäljellä sen jälkeen, DT385 hoidon. Vahvista cross-lajien herkkyys DT385 testasimme hiiren ihon melanooma (B16-F10), Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) ja hiiren alkion fibroblasti (MEF) soluja. Vaikka B16-F10 ja MEF olivat erittäin herkkiä DT385, LLC olivat vain heikosti herkkiä (taulukko 1). Yhdessä tietoja MTS määrityksiä ja Crystal Violet värjäys osoittaa, että ”receptorless” DT, DT385, voi todellakin olla sytotoksinen monille tuumorisolulinjoissa. Molekyylimekanismin että selittää monenlaisia ​​herkkyydessä DT385 on parhaillaan tutkittavana.

Erilaisten syöpäsolulajien viljeltiin 2 uM DT385 tai yhdistelmä p22 (rP22) 3 päivää. Sitten solut värjättiin kristallivioletilla, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät, ja kuvat otettiin 25 x suurennoksella Zeiss Axiover 200 käännettyä mikroskooppia (Carl Zeiss, Saksa).

sytotoksiset vaikutukset DT385 muihin ensisijainen solulinjojen

arvioimiseksi sytotoksisuuden DT385 muilla ensisijainen solulinjojen primääriviljelmien kolmen ihmisen fibroblastisolulinjat (CCD-1064Sk, BJ, ja IMR-90) ja yksi monosyytti (SC) solulinjassa oli inkuboitiin kasvavien pitoisuuksien kanssa DT385 ja solujen elinkelpoisuus määritettiin MTS-määrityksellä. CCD-1064Sk ja BJ fibroblasteissa oli IC

50 2,22 uM ja 2,37 uM DT385, vastaavasti. Keuhkojen fibroblastit (IMR-90) oli IC

50 1,44 uM ja elinkelpoisuuden monosyyttien (SC) ei vaikuttanut DT385 pitoisuuteen saakka 2,4 uM (taulukko 1). Jälleen yhdistelmä-p22 ei ollut vaikutusta solujen elinkelpoisuuteen pitoisuuteen saakka 2,4 uM (tuloksia ei ole esitetty). Sen sijaan, kun konfluentteja CCD-1064Sk, BJ ja IMR-90-fibroblasteja käsiteltiin 3 päivää, 2 uM DT385, havaitsimme merkittävää solun elinkyvyn menetykseen (kuvio S2). Nämä tiedot osoittavat, että jopa silloin, kun DT385 on tehokas vähentämään elinkelpoisuuden lisääntyvien primäärisiä soluja, se ei tappaa näitä soluja, kun ne ovat lepotilassa /konfluentteja. Yhdessä nämä tulokset tukevat aiempien päätellä, että DT385 pelkästään sillä voidaan tappaa syöpäsolut pienellä vaikutuksia alkusolut.

Voit selvittää, vastustuskyvyn DT385 voitaisiin ratkaista jatkuvalla inkuboinnin solujen heikko tai mitään havaittavaa herkkyys saivat toisen annoksen 48 tuntia ensimmäisen käsittelyn jälkeen, ja solujen elinkyky mitattiin 2 päivää myöhemmin. Ihmisen epidermoidikarsinooma solulinjassa, HEp3 ja rintasyöpä MDA-MB-231 molemmat osoittivat herkempiä jatkuvalla inkubaation DT385. Verrattuna yhden hakemuksen DT385, jotka eivät vaikuttaneet HEp3 soluissa merkittävästi, kaksi sovelluksia DT385 pienensi solujen elinkykyä (IC

50 2,07 uM (kuva S3). Vastaavasti IC

50 varten rintasyövän solulinja, MDA-MB-231 laski 1,02 uM 0,66 uM, kun toisen inkubaation DT385 (taulukko 1). Sitä vastoin, toinen inkubaatio DT385 ollut vaikutusta ensisijaisen endoteelisolujen HUVEC tai HDMEC (kuva S3) . yhdessä nämä tulokset osoittavat, että receptorless DT muodossa DT385 on sytotoksinen suuri määrä kasvainsoluissa. vaikka herkkyys DT385 vaihtelee, jatkuva altistuminen vähenee elinkelpoisuuden jopa kaikkein resistenttejä syöpäsolulinjoja.

vaikutusmekanismi DT385

DT tappaa soluja mekanismilla, johon solujen apoptoosin. Havaitsimme myös lisääntynyt apoptoosin DT385 käsitellyissä soluissa (kuva 3). itämisaika viljeltyjen U-87 kanssa DT385 johti dramaattiseen lisätä solujen apoptoosin mitattuna kasvu anneksiini V-värjäys (85%) ja imeytymistä etidiumhomodimeeri (87%).

(A), U-87 MG kasvavien solujen 8- hyvin kammio dia käsiteltiin 1,2 uM DT385, tai ohjaus (PBS) vastaavasti 3 päivää. Seuraavista käsittelyistä, solut värjättiin apoptoosin FITC-anneksiini V: Solukalvon yhtenäisyyden arvioitiin etidiumhomodimeeri III (ETD-III). Kuvat ovat (100 x suurennoksia) esitetään.

nuoli

osoittaa soluja, jotka leimattiin molemmilla fluoresoivia väriaineita. (B), Graafinen esitys (A). Solu määrä per suuritehoisia kentän (HPF, × 400) oli keskimääräistä solun numeron saatu 5 random HPF. Irrotettuja soluja, jotka värjättiin sekä anneksiini V ja ETD-III positiivisia, olivat mukana myös solujen määrä määrittämistä. Tulokset ovat keskiarvo ± S.D. 3 kokeen.

DT on osoitettu tulla toksiini-herkkien nisäkässoluissa reseptorivälitteisen endosytoosin johon liittyy vuorovaikutus reseptorin sitovan domeenin proteiinin solunulkoisen reseptorin. Koska DT385 ei omista reseptoria sitovaa domeenia, sen pitäisi olla kykenemätön sitoutumaan soluihin ja tulee hintoihin. Tutkia, DT385 on sisäistetty, me vielä seurata fluoresoivasti leimattuja DT385 kanssa konfokaalimikroskopia. Kasvainsolut herkkiä DT385 inkuboitiin FITC-DT385 ja kuvaamisen kanssa konfokaalimikroskopialla. Kuten on esitetty kuviossa 4A, inkubointi solujen DT385 johti sisäistämisen toksiini, joka oli havaittavissa perinuclear rakkulat. Sen sijaan, inkuboimalla soluja, joilla on samankaltaisia ​​pitoisuuksia FITC-naudan seerumin albumiini eivät johda sisäistämisen proteiinin (kuvio S4). Tämä koe viittasi siihen, että ottoa DT385 solujen ei johtunut muiden erityisten solun sisäänoton proteiinin.

(A), Cancer soluja kasvatettiin 8 ja kammion dia. FITC-leimattua DT385 (1 uM) lisättiin kulttuuriin. Solut havaittiin ja valokuvattiin Zeiss LSM 510 fluoresenssi -konfokaalimikroskoopilla (Carl Zeiss, Saksa) jälkeen 36 h. Top ja oikealla puolella kuvien osoittaa ortogonaaliset näkymä konfokaali aineisto esitetään x- ja y-akselilla kuvia. Suurennukset esitetään alla kuvia. (B), U87-soluja inkuboitiin 2 uM DT385 yksin tai yhdessä 10 mM NH

4CL varten ilmoitettu kertaa. Media korvattiin sitten ja soluja viljeltiin yhteensä ajan 36 tuntia, jonka jälkeen solujen elinkelpoisuus oli näytetty kanssa MTS-määrityksellä. PBS ajoneuvon hallinnan pidettiin 100% elinkelpoisia. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina PBS: llä käsiteltyjä soluja. Esitetyt tulokset edustavat 2 itsenäistä koetta suoritettiin kolmena kappaleena.

Ammoniumkloridi on heikko emäs, joka diffundoituu endosomissa ja toimii protonin säiliö, estäen siten happamoituminen endosomissa. Hyödynsimme ammoniumkloridia hoitoon solujen tutkia DT385 tuli solun endosytoosin. Havaitsimme, että inkubointi U87-solujen DT385 niin vähän kuin 2 tuntia johti merkittävään solukuolemaan (kuva 4B). Kuitenkin samanaikainen lisääminen ammoniumkloridilla ja DT385 kumottu sytotoksista aktiivisuutta DT385. Se havainto, että ammoniumkloridi esti sytotoksisen aktiivisuuden DT385 viittaa siihen, että DT-385 menee soluihin hapan endosyyttisissä kautta.

Difteriatoksiini tappaa soluja katalysoi ADP-ribosylaatio EF-2, mikä johtaa proteiinikinaasien synteesi [5], [28]. Sen tutkimiseksi, mikäli DT385 laski solujen elinkelpoisuuden estämällä proteiinisynteesiä, gliooma U-87 MG-soluja käsiteltiin 1 uM DT385 36 tuntia, minkä jälkeen leimausta [

35S] metioniinilla 15 minuutin ajan. Kuten on esitetty kuviossa 5A, SDS-PAGE-analyysi solulysaatin osoitti, että proteiinisynteesi oli vakavasti pienentää DT385 käsitellyissä soluissa. Tämä inhibitio tapahtui 24 tunnin sisällä hoidon ja jatkui aikana määrityksen keston ajan (48 h) (kuvio 5B). 36-h hoito antoi suurimman laskun proteiinin merkintöjä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että mekaanisesti, DT385 vähentää solujen elinkelpoisuus estämällä proteiinisynteesiä. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin HeLa-soluissa (tietoja ei esitetty).

(A), U-87 MG-soluja käsiteltiin 1 uM DT385 tai ohjaus (joko rP22, SUMO tai PBS: ää) 24, 36 tuntia ja 48 h, vastaavasti, ja sitten leimattiin [

35S] metioniinilla 15 minuutin ajan. Solulysaateista (10 ug) erotettiin SDS-PAGE (12% geeli) ja geelit värjättiin Coomassie-sinisellä (vasen), kuivattiin Whatman-paperi ja visualisoitiin radiografia käyttämällä Phosphorimager (oikealla). Kuvat ovat 36 tunnin hoidon näkyvät. (B), määrällisesti (A). Radioaktiivisuus solulysaateista määritettiin nestetuikelaskennalla. Tiedot on ilmaistu prosentteina vertailusta. Keskimääräinen CPM merkityksetön proteiinia, rP22 tai yhdistelmä SUMO tai PBS käsittely pidettiin kontrollina CPM-arvon. Tulokset ovat keskiarvo ± S.D. (N = 6, 2 itsenäisestä kokeesta). Solujen elinkelpoisuus mitattiin myös kuvatulla legenda kuvioon 1. Tulokset ovat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen suoritettiin kolmena kappaleena.

Chick rakkokalvon kokeessa

etenemistä ja etäpesäkkeiden neoplastisen taudin edellyttää laajaa vaskularisaatiota kasvaimen ylläpitämiseksi ravitsemukselliset ja hapen vaatimukset lisääntyvän syöpäsoluja. Tämä saavutetaan yleensä läpi kutsutaan angiogeneesiä [29]. Kanan rakkokalvon määritys (CAM) on hyödyllinen

in vivo

mallijärjestelmä vaikutusten tutkiminen toksiinien angiogeneesiä. Kuten on esitetty kuviossa 6A, DT385 pitoisuutena 40 nM (1,2 pmol 30 ui) aiheutti täydellisen inhibition HEp3-indusoidun (angiogeenisten) verisuonten itämistä. Tämä pitoisuus on kaukana IC

50: ssa syöpäsoluista ja siten suora vaikutus DT385 on HEp3 elinkelpoisuus on epätodennäköistä.

(A), HEp3 soluja käytettiin stimuloimaan angiogeneesi CAM. PBS ohjaus ilman HEp3 soluista osoitti lähtötasoon angiogeneesin. Angiogeneesi, kun läsnä on HEp3 solujen ja puuttuessa tai läsnä yhdistelmä-DNA-DT385 tai rekombinantti-ohjaus proteiinia (SUMO) analysoitiin. Tulokset ovat keskiarvo ± keskivirhe 80 datapistettä kaksi rinnakkaista analyysit * p 0,05 (Student t-testi). (B), DT385 laski merkittävästi kasvaimen kasvua. Hep3 kasvaimen kasvua CAM-järjestelmä arvioitiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tulokset ovat keskiarvo ± keskivirhe Keskiarvot kasvaimista DT385 tai valvonnan hoidot olivat 13,88 ± 1,56 mg (keskiarvo ± S.E .; n = 23) ja 23,33 ± 4,3 mg, (keskiarvo ± S.E .; n = 12), vastaavasti, p = 0,012. (C), DT385 laski merkittävästi kasvaimen tilavuus. Hep3 kasvaimen tilavuus CAM-järjestelmä arvioitiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tulokset ovat keskiarvo ± keskivirhe Keskiarvot kasvaimen koon DT385 tai valvontaa hoidot olivat 8,86 x 10

9 ± 2,42 um

3 (keskiarvo ± SE, n = 18) ja 2,97 x 10

9 ± 0,49 um

3 (keskiarvo ± SE, n = 8), vastaavasti, p = 0,02.

sen tutkimiseksi, DT385 voi vähentää tuumorin kasvua, HEp3 kasvaimia kasvatettiin CAM ja 6 päivän ikäisiä kasvaimia käsiteltiin sitten 2 ug: DT385 injektoitiin suonensisäisesti päivittäin kolmen päivän ajan.