Krooninen sairaus

tiivistelmä

15-deoksi-delta-12,14-prostaglandiini -J

2 (15d-PGJ

2), joka on arakidonihapon metaboliitti ja luonnollinen PPAR-agonistin, tiedetään aiheuttavan apoptoosia kasvainsoluissa. Tässä tutkimuksessa selvitettiin uusien terapeuttisten potentiaalit 15d-PGJ

2 määrittämällä sen syöpää ehkäisevistä vaikutuksista villityypin ja doksorubisiiniresistenttejä munasarjakarsinoomasolut. Huolimatta korkeasta ilmentymisestä resistenssin indusoivan geenejä, kuten MDR1, Bcl2: n ja Bcl-xl, 15d-PGJ

2 indusoituu voimakkaasti apoptoosia doksorubisiini-resistenttejä (A2780 /AD) solujen samanlainen kuin villityypin (A2780). Tämä todettiin liittyvän kaspaasi-3 /7- ja NF-KB reittejä, mutta ei sen PPARy agonistista aktiivisuutta. 15d-PGJ

2 myös pystyi vähentämään doksorubisiiniresistenssiä on A2780 /AD soluja pienillä annoksilla vahvistanut estämällä geenin ilmentymisen MDR1 (P-glykoproteiinin) ja SIRT1 (lääkkeen vanhenemisen merkkejä geeni). Tutkimme myös vaikutuksia 15d-PGJ

2 solujen vaeltamiseen ja transformaatio käyttäen haavan paranemista määritys ja morfologiset analyysit, vastaavasti. Huomasimme, että 15d-PGJ

2 esti muuttoliike todennäköisesti johtuu NF-KB eston ja indusoi muutosta pyöreän muodon A2780 /AD solujen pitkänomainen epiteelisoluihin vuoksi HDAC1 eston. Käyttämällä 15d-PGJ

2 analogista, löysimme vaikutusmekanismi näiden uusien toimintojen 15d-PGJ

2 SIRT1 ja HDAC1 geeniekspressioiden ja entsyymin toimintaa. Johtopäätöksenä on, että esillä oleva tutkimus osoittaa, että 15d-PGJ

2 on suuri terapeuttinen potentiaali tappaa lääkkeille vastustuskykyisten kasvainsoluja ja äskettäin kuvatut estäviä vaikutuksia tämän syklo-oksigenaasin tuotteen SIRT1 ja HDAC tarjoavat uusia mahdollisuuksia syövän terapeuttiset.

Citation: de Jong E, Winkel P, Poelstra K, Prakash J (2011) Anticancer vaikutukset 15d-Prostaglandiini-J

2 Wild-Type ja doksorubisiiniresistenttejä munasarjasyöpäsoluja: Novel toimet SIRT1 ja HDAC. PLoS ONE 6 (9): e25192. doi: 10,1371 /journal.pone.0025192

Editor: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians Yliopisto, Saksa

vastaanotettu: 26 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 29 elokuu 2011; Julkaistu: 21 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 de Jong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Euroopan unionin hanke Innovatiivinen toimintaohjelman Groningen, Alankomaat, ja jonka Vici avustusta Alankomaiden Technical Foundation (STW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Prostaglandiinit (PG: t) ovat ryhmä biologisesti aktiivisten endogeenisen arakidonihapon aineenvaihduntatuotteet. He hallitsevat laaja valikoima fysiologisia toimintoja, kuten sääntely sileän lihaksen sävy, tulehdus, solujen kasvuun ja erilaistumiseen [1]. 15-deoksi-Δ

12,14-prostaglandiini J

2 (15d-PGJ

2) on nestehukka johdannainen PGD

2, joka tunnetaan myös luonnollisena agonistina ytimen reseptorin peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptorin gamma (PPARy). 15d-PGJ

2 on raportoitu näyttää useita farmakologisia vaikutuksia (tulehdusta, anti-fibroottisia ja apoptoottisten toiminta) joko PPARy riippuva reittien tai PPARy-riippumaton reittejä kuten Nuclear Factor-kappaB (NF-KB) – , KEAP-Nrf2-, STAT1 ja p53-riippuvaisten reittien [2], [3]. Meidän äskettäisessä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että 15d-PGJ

2 kykeni estämään kasvaimen etenemistä merkittävästi

in vivo

tuumoria kantavissa hiirissä. Sen vaikuttavuutta todettiin ohjata vahvan mutta palautuvia seerumialbumiinia sitovan ja myöhemmin tunkeutumisen albumiinin osaksi kasvaimia, jotka oli riippuvainen kasvaimen verisuonistossa [4]. Myös muut ryhmät ovat raportoineet anti-kasvain aktiivisuus 15d-PGJ

2 in vivo eri tuumorimalleissa [5], [6]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että mahdollinen käyttö 15d-PGJ

2 hoitotarkoituksiin syöpälääkkeenä voidaan kuvitella.

Olemme osoittaneet, että 15d-PGJ

2 indusoi apoptoosin erilaisissa syöpäsoluissa kautta PPARy-riippumaton NF-KB ja kaspaasiriippuvaisen reittien [4], kuten myös on esitetty muissa tutkimuksissa [7], [8]. Tietäen osallistumista NF-KB-reitin säätelyssä monilääkeresistenssin (MDR1) ja anti-apoptoottiset geenit (Bcl-2 ja Bcl-XL) [9], nyt tavoitteena oli tutkia, 15d-PGJ

2 kykenee apoptoosin indusoimiseksi doksorubisiini-resistenttejä syöpäsoluja verrattuna villityypin. Me tutkittiin lisäksi aiheuttamia vaikutuksia 15d-PGJ

2 oli välittyvät PPARy riippuvia ja /tai NF-KB-riippuvaista reittejä. Chu ja työtoverit ovat osoittaneet, että Silent Information Säädintyyppi 1 (SIRT1), luokan III histonideasetylaasi- (HDAC), yli-ilmentyy erilaisissa solunsalpaajaresistentti kasvainten syöpäpotilaiden ja esto SIRT1 geenin ilmentymisen johtaa laskevan MDR1 ilmaisun ja kasvaa huumeiden herkkyyden [10]. Siksi verrattiin SIRT1 ilmentymistä ihmisen villityypin ja doksorubisiinin resistenttejä munasarjasyöpäsoluja ja tutkittiin vaikutuksia 15d-PGJ

2 tämän SIRT1 geeniekspression. Näinä kokeissa havaitsimme, että 15d-PGJ

2-käsitellyn doksorubisiiniresistenttejä solujen muuttui pyöreän muotoinen solujen pitkänomainen tyyppiä. Tutkimme lisäksi tämän fenotyypin muutoksen ja totesi, että 15d-PGJ

2 indusoi näitä vaikutuksia estämällä luokan I HDAC-entsyymejä. Monet farmakologinen toiminta 15d-PGJ

2 esim. esto PPARy, NF-KB: n, p53 ja Nrf-KEAP reitit indusoi tekemällä stabiilin kompleksin vapaan kysteiinin näiden proteiinien kautta yksi elektrofiilisen hiiliatomin [11]. Sen määrittämiseksi, onko estäviä vaikutuksia 15d-PGJ

2 SIRT1 ja HDAC: t olivat myös liittyvät Jälkimmäinen mekanismi, teimme useita

in vitro

kokeita käyttäen analogi 15d-PGJ

2 . Tuloksemme osoittavat monia uusia toimintoja tämän endogeenisen arakidonihapon aineenvaihduntatuotteen syöpäsoluihin ja valaisemaan vaikutusmekanismi tämän syklo-oksigenaasi tuote.

Methods

Solukokeet

Wild tyyppinen (A2780) ja doksorubisiini-resistenttejä (A2780 /AD) ihmisen munasarjasyöpäsolulinjoihin saatiin University Medical Centre Groningen, Alankomaat. A2780 ja A2780 /AD (doksorubisiini-resistenttejä) solulinjoja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, BioWhittaker, Verviers, Belgia), jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) ja antibiootteja (penisilliiniä, 50 yksikköä /ml sekä streptomysiiniä, 50 ng /ml) 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2. A2780 /AD-soluja viljeltiin, kun läsnä oli doksorubisiinia (2 uM). Kaksi viikkoa ennen kokeiden Erillisessä pullossa doksorubisiinin-resistenttien solujen säilyi ilman doksorubisiinia. Näitä soluja käytettiin lisäkokeita vaikutuksen välttämiseksi doksorubisiinin meidän kokeita. Koska 15d-PGJ

2 in vitro menettää aktiivisuuden läsnä ollessa FCS, kaikki kokeet suoritettiin FCS-väliaineessa.

Solujen elinkelpoisuus tutkimuksissa.

Solut ympättiin 96-kuoppalevylle kuin 1 x 10

4 solua /kaivo 200 mikrolitrassa väliaineessa 10% FCS. 48 tunnin kuluttua solut pestiin seerumittomalla alustalla ja inkuboitiin sitten eri pitoisuuksilla 15d-PGJ

2 seerumittomassa väliaineessa 48 tuntia. Siinä tapauksessa, että hoidon peruuttamattomia PPARy-antagonisti GW9662 (2-kloori-5-nitrobentsanilidia, sigma), soluja esi-inkuboitiin GW9662 (10 uM) 3 tuntia ja sitten inkuboitiin seoksen kanssa 15d-PGJ

2 (Cayman kemikaalit, Ann Arbor, MI) ja GW9662 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen Alamar Blue väriainetta (Serotec, Oxford, UK), joka mittaa solujen lukumäärä perusteella mitokondrioiden toimintaa. 48 h kuluttua inkuboinnin väliaine sisälsi Alamar sinistä väriainetta (laimennettu 1:10) lisättiin soluihin ja inkuboitiin vielä 4 tuntia. Sen jälkeen metaboloituu väriaine (fluoresoiva) havaittiin fluorometrillä virityksellä 560 nm ja Emission 590 nm.

kaspaasi 3/7 entsyymimäärityksillä.

kaspaasi-3 ja -7 entsyymit aktiivisuus määritettiin käyttämällä Caspase 3/7 Glo iinianalyysikitissä (Promega, Medison, WI). 1 x 10

4-solut ympättiin 96-kuoppaisen levyn 200 ul viljelyalustasta. 48 tunnin kuluttua solut pestiin seerumittomalla alustalla ja inkuboidaan eri konsentraatioilla 15d-PGJ

2 100 ul: ssa väliaineessa 5,5 tuntia. Sen jälkeen, 100 ui kaspaasi 3/7 käyttövalmiiksi saattamista reagenssia lisättiin soluihin ja inkuboitiin 30 min inkubaattorissa. Luminesenssi määritettiin luminometrillä (Lumicount, Packard, Meriden, CT).

anneksiini V-värjäys.

anneksiini V-värjäys suoritettiin solujen määrittämiseksi apoptoosin induktion jälkeen hoidon 15d-PGJ2. 1 x 10

4 solut ympättiin 8-kuoppalevyllä (Lab-Tek, Nunc, Roskilde, Tanska) 400 ul viljelyalustasta. 72 tunnin jälkeen solut pestiin seerumittomalla alustalla ja inkuboidaan eri konsentraatioilla 15d-PGJ

2 200 ul: ssa väliaineessa 6 tunnin ajan. Sen jälkeen soluja inkuboitiin 100 ui anneksiini V-FITC: tä (Roche, Mannheim, Saksa) 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä. Sitten solut kiinnitetään DAPI sisältävän asennus liuosta ja värjäys tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla.

Geenien ilmentyminen tutkimuksessa.

1 x 10

5 solua kuoppaa kohti ympättiin 12 kuoppaiset levyt ja viljeltiin 48 tuntia ja sitten inkuboitiin eri yhdisteiden 48 tuntia. Solut hajotettiin käyttäen hajotuspuskuria, ja RNA eristettiin käyttäen Ehdottomasti RNA microprep (Stratagene, La Jolla, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA-pitoisuus kvantitoitiin UV-spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Sitten cDNA syntetisoitiin yhtä suuret määrät RNA: sta käyttäen Superscript III ensimmäisen juosteen synteesiin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Alukkeet ihmislajin saatiin Sigma-Genosys (Haverhill, UK). Alukesekvenssit selviävät taulukossa 1. Gene ekspressiotasoja eri geenien mitattiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä (Applied Biosystems, Foster City, CA) käyttämällä SYBR Green kuten fluoresoiva koetin (Applied Biosystems). Lopuksi kynnyssykli numerot (Ct) käytettiin laskettaessa geenin ilmentymisen kohde normalisoimalla taloon-GAPDH.

Transfektio ja Lusiferaasikoe NF-KB: n aktiivisuutta.

NF-KB: n aktiivisuus määritettiin käyttäen Luciferase toimittaja perustuvaa määritystä kuten aiemmin on kuvattu [4]. Lyhyesti, PNF-KB-Luc (Clontech, Mountain View, CA), joka sisälsi spesifistä sitoutumista sekvenssi NF-KB: n ja tyhjä lusiferaasiplasmidia, pTAL-Luc (kontrolli) käytettiin transfektioon tutkimuksiin. 1 x 104 solua kuoppaa kohti ympättiin valkoinen 96-kuoppaisille levyille ja plasmidien transfektoimiseksi suoritettiin käyttämällä FuGENE 6-transfektioreagenssia (Roche) 24 tunnin jälkeen. Soluja käsiteltiin monimutkainen 0,17 ug DNA: ta /0,5 ui FuGENE 6 100 ul: ssa normaalia media 10% FCS: ssa 24 tuntia. Sen jälkeen solut pestiin seerumittomassa alustassa ja inkuboitiin 15d-PGJ

2, BAY 11-7082 (Sigma), siglitatsoni kanssa tai ilman TNF-α (Peprotech, Rocky Hill, NJ), 4 tuntia. Tämän jälkeen solut pestiin PBS: llä ja hajotettiin 20 ul: lla solujen hajotuspuskuria, ja johon oli lisätty 100 ui Luciferase substraattia (Promega). Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin luminometrillä (Lumicount, Packard). Luminesenssi yksikköarvoja PNF-KB-Luc neutraloitiin vähentämällä pTAL-Luc arvoja.

Haavan paranemista määrityksessä.

1 x 10

5 solua kuoppaa kohti siemennettiin 12 kuoppaiset levy ja viljeltiin 48 tuntia viljelyalustassa. Sen jälkeen tyhjästä (haava) otettiin käyttöön yhtenäinen so- kerros käyttämällä keltainen kärki sijoitetaan tukirakenteen, jolloin standardointi tyhjästä. Solut pestiin kolme kertaa väliaineen poistamiseksi irrottaa solut. Sitten soluja inkuboitiin eri yhdisteiden 48 tuntia ja kuvia määritelty haavan paikka tehtiin tietokoneavusteinen vaihekontrastimikroskoopilla (Olympus) t = 0, 24 ja 48 tuntia. Alueella on haava mikroskooppisen kuvia mitattiin Image J ohjelmisto (National Institutes of Health, MD) eri ajankohtina. Prosenttiosuus haavan paranemisen jälkeen 24 h tai 48 h laskettiin suhteessa koko haava-alueen t = 0 h saman haavan päällä.

SIRT1 ja HDAC1 entsyymiaktiivisuuden määrityksiä.

SIRT1 ja HDAC1 entsyymi eston määritykset suoritettiin määrittämään vaikutuksen 15d-PGJ2 toimintaansa käyttäen kaupallisia sarjat Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). SIRT1 ja HDAC1 entsyymin määritykset suoritettiin mikrotiitterilevyillä mukaan valmistajan ohjeiden. Ensimmäinen, määrityspuskurissa, SIRT1 tai HDAC1 entsyymin ja liuotin (DMF) tai eri pitoisuudet hoitoja (15d-PGJ2 tai CAY-10410 liuotettuna DMF) sekoitettiin. CAY-10410 (9,10-dihydro-15-deoksi-Δ

12,14-Prostaglandiini J

2), analogi 15d-PGJ

2, ostettiin Cayman kemikaaleja. Sen jälkeen alustalevy, joka koostuu p53-sekvenssin Arg-His-Lys-Lys (e-asetyyli) -AMC peptidin ja co-substraatti-NAD +: n SIRT1 aktiivisuuden lisättiin entsyymi seokseen ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 45 minuuttia. Mitata HDAC1 aktiivisuutta, joka on asetyloitu lysiiniä substraattia lisättiin entsyymi seokseen ja inkuboitiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen, pysäytys- /kehittämiseen, joka sisälsi seosta, kehittäjä ja nikotiiniamidi (SIRT1 estäjä) tai trikostatiini A (HDAC1 estäjä) lisättiin mikrolevyn, ja inkuboitiin 30 min ja 15 min, vastaavasti huoneenlämpötilassa. Deasetyloitu peptidi reagoi kehittäjä ja vapauttaa fluoroforin. Fluoroforien sekä määritykset analysoitiin käyttäen eksitaatioaallonpituutta 350 nm ja emissio aallonpituudella 450 nm. 100% entsyymin laskettiin inkuboimalla DMF yksin, ja prosentuaalinen inhibitio SIRT1 tai HDAC1 aktiivisuus laskettiin suhteessa vastaavaan liuottimen pitoisuudet.

Tilastollinen analysointi

Data esitetään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM) ellei toisin mainita. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen paritonta kaksisuuntaisella Studentin t-testi

p

0,05 vähimmäistasoa merkitystä. Cell-elinkelpoisuus data sovitettiin mukaan sigmoidisten annos-vastekäyrä laskea IC

50 käyttäen GraphPad Prism 4 ohjelmisto (La Jolla, CA).

Tulokset

15d-PGJ

2 indusoi apoptoosia sekä A2780 ja A2780 /AD solujen PPARy-itsenäisesti

vahvistaneet, että A2780 /AD-solut ovat hyvin resistenttejä doksorubisiinille verrattuna villityypin A2780 soluissa IC

50 doksorubisiinin A2780 ja A2780 /AD olivat 1,3 ja 120 uM (kuvio. 1A). Kuitenkin hoito 15d-PGJ

2 aiheutti solukuoleman molemmissa A2780 soluissa (IC

50 = 4,3 uM) ja A2780 /AD soluja (IC

50 = 2,6 uM) 48 tunnin jälkeen inkubaation. 15d-PGJ

2 on tunnettu PPAR-agonistin, mutta huomasimme, että induktio solukuoleman molemmissa solutyypeissä oli PPARy-riippumattomia esikäsittely kanssa peruuttamattomia PPARy-antagonisti GW9662 eivät muuttaneet vaikutukset 15d-PGJ

2 kumpikaan villin tyypin (Fig. 1 B) eikä resistenttejä (Fig. 1 C) solulinjat. Lisäksi olemme havainneet, että 15d-PGJ

2 indusoi apoptoosia sekä villityypin ja doksorubisiini-resistenttien solujen aktivaation kautta kaspaasi-reitin kaspaasi-3/7 entsyymin toimintaa merkittävästi indusoi 15d-PGJ

2 nämä solut sen jälkeen, kun 5,5 tunnin inkuboinnin (Fig. 1 D). Vaikka A2780 /AD (resistentit solut) olivat hieman herkempiä 15d-PGJ

2 solun elinkelpoisuuden määrityksessä, oli hieman pienempi induktion kaspaasiaktiivisuus näissä soluissa verrattuna A2780-soluja, mikä osoittaa osallistumista kaspaasi-riippumaton määrityksissä. Apoptoosin induktio näissä soluissa vahvistettiin myös anneksiini V-värjäyksellä, merkki varhaisen apoptoosin. Huomasimme, että molemmat solutyypit tulivat positiivisiksi anneksiini V värjäytymistä (vihreä väri) käsittelyn jälkeen 15d-PGJ

2 ja useita positiivisia soluja kasvatettiin suurempina pitoisuuksina molemmissa solulinjoissa (Fig. 1 E).

(A) doksorubisiini tapettu A2780 soluissa täysin 5 uM taas A2780 /AD solut olivat erittäin resistenttejä doksorubisiinille. Sen sijaan, 15d-PGJ

2 solukuolema sekä villityypin A2780 (B) ja doksorubisiini-resistenttejä A2780 /AD (C) solulinjat annosriippuvaisesti 48 tunnin jälkeen. Nämä vaikutukset eivät olleet PPARy riippuvaisen preinkubointi irreversiibelin PPARy-antagonisti GW9662 (10 uM) ei estänyt näitä vaikutuksia. Tulokset on esitetty% on ohjain, joka on laskettu olettaen, että käsittelemättömät solut 100% elinkelpoisia määritettynä alamarBlue-määrityksellä. (D) 15d-PGJ

2 tehostetun kaspaasi 3/7 entsyymejä aktiivisuutta (t = 5,5 h) molemmissa solutyypeissä pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM keskimäärin vähintään 3 erillisestä kokeesta. Erot vastaan ​​kontrollit näkyvät *

p

0,05, **

p

0,01. (E) edustaja valomikroskooppikuvat osoittaa anneksiini V värjäytymistä (vihreä väri), indikaattori apoptoosin induktio, A2780 ja A2780 /AD solujen linjat kuluttua hoidon 15d-PGJ

2-pitoisuuden riippuvaisesti. DAPI-värjäyksellä (sininen väri) ilmaisee solujen kokonaismäärässä. Suurennus, 200 ×. Laatikot osoittavat kuvia suuremmalla suurennoksella 480 x.

15d-PGJ

2 indusoi apoptoosia estämällä NF-KB: n reitin

Koska indusoiman apoptoosin 15d-PGJ

2 oli PPARy-riippumaton, tutkimme osallistumista NF-KB-reitin, tärkeä säätelijä solujen eloonjäämistä ja lisääntymistä, A2780 ja A2780 /AD soluihin käyttäen NF-KB lusiferaasireportterilla määritys. Olemme indusoi NF-KB: n aktiivisuutta näissä soluissa ihmisen rekombinantti-TNF-α, joka on suora aktivaattori NF-KB-reitin kautta. Olemme havainneet, että käsittely TNF-α (100 ng /ml) paransi merkittävästi NF-KB: n aktiivisuutta sekä solutyypeissä mutta korostuneesti A2780 (13-kertainen) verrattuna A2780 /AD (6,0-kertainen) (Fig. 2A) . Hoito 15d-PGJ

2 vähensi pohjapinta ja TNF-α aiheuttama NF-KB-aktiivisuutta molemmissa solutyypeissä pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio 2B ja 2C). Silti estäviä vaikutuksia olivat vahvempia A2780 /AD kuin A2780 kuten voidaan huomannut 2,5 ja 5,0 uM pitoisuuksina. Nämä tulokset osoittavat, että apoptoosin indusoiva vaikutus 15d-PGJ

2 oli välittyvät NF-KB-reitin. Lisäksi, PPARy-agonisti siglitatsoni ei estänyt pohjapinta NF-KB: n aktiivisuutta 10 uM, mutta vain suurilla pitoisuuksilla. Muissa kokeissa siglitatsonia siksi pitoisuudet, jotka aiheuttavat vain PPARy-konkreettisia vaikutuksia (EY

50 = 3,0 uM) [12] eikä NF-KB-välittyvät vaikutukset. Tunnettu NF-KB-spesifisen inhibiittorin, eli BAY-11-7082 inhiboi NF-KB: n aktiivisuutta sekä solutyypeissä samalla, ja tämä inhibiittorin käytettiin lisäkokeita vaikutuksen määrittämiseksi NF-KB: n inhibitio näissä soluissa.

mittaamiseksi NF-KB: n aktiivisuutta, sekä A2780 ja A2780 /AD-soluja transfektoitiin ohimenevästi plasmidilla, joka sisälsi NF-KB-promoottorin lusiferaasireport- elementti (PNF-KB-Luc) 24 tuntia. 24 tunnin kuluttua, 15d-PGJ

2, siglitatsoni tai BAY-11-7082 inkuboitiin ilman TNF-α: ssa 4 tuntia ja sen jälkeen lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttäen luminesenssia sen määrittämiseksi NF-KB-aktiivisuutta. (A) NF-KB-reitin aktivaattori, TNF-α (100 ng /ml), indusoi NF-KB: n aktiivisuutta sekä solutyypeissä, vaikka oli suurempi A2780-soluissa. Hoito 15d-PGJ

2 esti merkittävästi NF-KB aktiivisuutta sekä A2780 (B) ja A2780 /AD soluja (C), joka oli huomattavampi TNF-α-aktivoitujen solujen. Siglitatsoni inhiboi NF-KB: n vasta korkeammilla pitoisuuksilla tai TNF-α-aktivoitua A2780 /AD-soluja. BAY-11-7082 inhiboi NF-KB: n aktiivisuutta sekä solutyypeissä kanssa samanlaisen tehokkuuden. Data edustaa keskiarvoa vähintään 3 erillisestä kokeesta. Tilastollisia eroja verrattuna verrokkeihin nähden näkyvät *

p

0,05 ja **

p

0,01.

15d-PGJ

2 vähentää mRNA: n ilmentymisen Bcl-2, Bcl-xl, MDR1 ja SIRT1

kun geenin ilmentymisen analyysit, olemme huomanneet, että A2780 /AD soluja oli merkittävä induktio anti-apoptoottisia geenejä, kuten Bcl-2 (120- kertainen) ja Bcl-xl (2-kertainen) verrattuna ei-resistenttejä A2780-soluja (Fig. 3A). Hoidon pieninä pitoisuuksina 15d-PGJ2 (1,0 ja 2,5 uM) 48 tunnin ajan vähensi Bcl-2 ja Bcl-xl ekspressiotasot A2780 /AD voimakkaammin kuin A2780-soluissa (kuvio. 3A), joka saattaa myös selittää korkeamman solutapon aktiivisuusedellytykset A2780 /AD soluja. Nämä vaikutukset eivät johdu PPARy agonistivaikutusta tai NF-KB-estäviä vaikutuksia 15d-PGJ

2 kuten tunnettu PPARy-agonisti siglitatsonia ja selektiivinen NF-KB-inhibiittori oli vain vähäinen vaikutus verrattuna 15d-PGJ

2 (Fig. 3A).

(A) A2780 /AD soluilla oli korkeampi geenin ilmentymistä Bcl-2 ja Bcl-xl verrattuna A2780-soluissa. Effects of 15d-PGJ

2, siglitatsoni ja BAY-11-7082 on geeniekspression määritettiin 48 tunnin kuluttua inkuboinnin molemmissa solutyypeissä. A2780 /AD solut oli myös korkeampi ilmentyminen MDR1 (B) ja SIRT1 (C) verrattuna A2780-soluissa. MDR1 geenien ilmentyminen ei ollut havaittavissa (ND) A2780 soluissa. Effects of 15d-PGJ

2, siglitatsoni ja BAY-11-7082 on MDR1 ilmentyminen määritettiin vain A2780-soluissa (B), kun taas vaikutukset SIRT1 ilmentyminen mitattiin sekä solutyypeissä (C). Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM vähintään 3 kokeita. Tilastollisia eroja verrattuna verrokkeihin nähden näkyvät *

p

0,05 ja **

p

0,01.

Lisäksi huomasimme, että siellä oli ylössäätöä monilääkeaineresistenssin (MDR1) ja luokka-III HDAC Sirtuin-2-homologin (SIRT1) mRNA: n ekspression doksorubisiiniresistenttejä A2780 /AD soluja verrattuna villityypin A2780-soluissa (kuvio. 3B ja 3C). MDR1 tasot A2780 soluissa olivat alle tunnistustasoa. Mielenkiintoista, hoito 15d-PGJ

2 estivät merkittävästi MDR1 ilmaisun resistenttien solujen ja nämä vaikutukset olivat todennäköisimmin johtuvan sen NF-KB estäviä vaikutuksia kuten BAY-11-7082 esti myös ilmaisua, kun taas siglitatsoni ei ollut vaikutusta (Fig. 3B). 15d-PGJ

2 esti myös SIRT1 ilmaisua molemmissa solutyypeissä mutta nämä estäviä vaikutuksia ei havaittu kanssa BAY-11-7082 (Fig. 3C). Toisaalta, siglitatsoni vähensi SIRT1 ilmaisun vain A2780 /AD jossa SIRT1 tasot olivat koholla.

15d-PGJ

2 inhiboi haavan paranemista

Koska kemoterapia-resistenttien solujen voi on eri muuttoliike käytös kuin sen villityypin versio, olemme lisäksi tutkittiin, mikä vaikutus aiheuttama vastus näiden parametrien avulla

in vitro

haavoja määrityksessä. Määritys tyypillisesti mittaa solujen kulkeutumista mittaamalla sulkeminen standardin tyhjästä ajoissa. Olemme havainneet, että A2780 /AD soluilla oli huomattavasti hitaampaa muuttoliike kuin A2780-soluja (Fig. 4A ja 4B). 15d-PGJ

2 vähensi migraatiota sekä solutyyppien annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 4C). Vaikka 15d-PGJ

2 vähensi solujen elinkelpoisuuden A2780 /AD soluja 2,5 uM (kuvio. 1 C), emme nähneet solukuolemaa näissä kokeissa, jotka saattavat johtua yhtenäinen so- kerrokseen käytettiin näissä kokeissa. Löydettiin aiemmin, että yhtenäinen so- kerroksen 15d-PGJ

2 ei ollut vaikutusta solujen elinkelpoisuuteen A2780 /AD (tuloksia ei ole esitetty). Absence solukuoleman näissä kokeissa näkyy myös siinä edustettuna kuvia (Fig. 4A). Estovaikutus haavojen paranemiseen olivat myös nähty BAY-11-7082 mutta ei siglitatsonia osoittaa vaikutuksia 15d-PGJ2 saattaa johtua sen NF-KB estäviä vaikutuksia.

määrittämiseksi vaikutusten 15d- PGJ

2 solujen vaeltamiseen, haavan paranemista määritys suoritettiin A2780 ja A2780 /AD soluista, kuten materiaaleissa ja menetelmissä. (A) edustaja kuvia siitä tyhjästä (haava) t = 0 h ja t = 48 h /ilman eri hoitoja. Tavaramerkki (visualisoitu näissä kuvissa ylä- tai alapuoli) asetettiin paikantaa samalla alueella tyhjästä, kuvat tehtiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia ja avoin alue laskettiin tällä ilmoitettuina ajankohtina. Suurennus, 40 ×. (B) näkyy kaaviossa% haavan paranemiseen A2780 ja A2780 /AD soluja ilman hoitoja. A2780 soluissa oli korkeammat maahanmuuttoluku verrattuna A2780 /AD soluja. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM 3 eri kokeessa. **

p

0,01 versus A2780 /AD. (C) Käsittely 15d-PGJ

2 ja BAY-11-7082 esti haavojen paranemista vaste 48 tunnin inkuboinneissa vaikka siglitatsonia eivät osoittaneet estäviä vaikutuksia. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM 3 eri kokeessa. *

p

0,05 ja **

p

0,01 vs. arvot t = 0 h.

vaikutus 15d-PGJ

2 solumorfologiaan

aikana inkubaatioista 15d-PGJ

2, huomasimme, että solut muuttuivat laajentunut ja pitkänomainen soluja. Tämä fenotyyppinen muutos oli näkyvimmin näkyvissä DOX kestävä A2780 /AD soluja. Nämä solut perin pyöristetty ja kutistunut, mutta muunnoksen jälkeen he saavuttavat enemmän solulimassa erottuva solujen rajoja ja näytetään vaikutelman epiteelin kaltainen rakenne (Kuva. 5A). Käsittely siglitatsonia tai BAY-11-7082 ei aiheuttanut muutosta solujen morfologia osoittaa mitään roolia PPARy ja NF-KB reittejä. Koska se on raportoitu kirjallisuudessa, että HDAC estäjä trikostatiini voisi muuttaa munasarjakarsinoomasolut [13], käsittelimme solut trikostatiini A ja totesi, että solut sai muunnettava samalla tavalla kuin 15dPGJ

2 (Fig. 5A ). Vaikka A2780 soluissa myös näytti enemmän venytetty 15d-PGJ

2 ja trikostatiini A, erot verrattuna kontrolli solut eivät suuria (kuvio. 5B).

(A) edustaja kuvia osoittaa muutoksen solun morfologiassa A2780 /AD inkuboinnin jälkeen 15d-PGJ

2 (2,5 uM) ja trikostatiini A (70 nM). Sen sijaan muiden hoitojen, kuten siglitatsonia ja BAY-11-7082 ei vaikuttanut morfologiaan. Nuolet korostavat transformoituja soluja, jotka oli enemmän solulimaan ja epiteelisolujen rakenne. Suurennos, 200 x (B) edustaja kuvaa A2780 solujen inkuboinnin jälkeen eri hoitoja. Hoito 15d-PGJ

2 (2,5 uM) ja trikostatiini A (70 nM) johti selvään kasvuun sytoplasmassa. Suurennos, 200 x (C) suhde etana sähköiseen kadheriinin geeniekspression A2780 ja A2780 /AD soluja. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM 3 kokeita.

Koska muutos solujen saattavat liittyä epiteeli- mesenkymaalitransitioon (EMT) prosessi, emme tutki ilmaus etana ja sähköisen kadheriinin selostukset ja totesi, että suhde etana sähköiseen kadheriinin lisääntyi sekä solutyypeissä valotuksen jälkeen 2,5 uM 15d-PGJ

2 vaikka erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä. Nämä tiedot osoittavat, että muutos solujen morfologia aiheuttama 15d-PGJ

2 ehkä induktion vuoksi EMT prosessin.

15d-PGJ

2 estää HDAC 1, 2 ja 3 mRNA ilmaisun

Koska solutransformaatiota vaikutuksia 15d-PGJ

2 myös aiheuttama HDAC estäjä, tutkimme vaikutus 15d-PGJ

2 HDAC molemmissa solutyypeissä. Ensin verrataan mRNA tasoilla HDAC1, 2 ja 3 A2780 ja A2780 /AD-soluissa ja havainneet, että HDAC2 oli merkittävästi vaimentua siinä resistenttien solujen verrattuna villin tyypin soluihin (Fig. 6A). Hoito 15d-PGJ

2 esti HDAC1, 2 ja 3 mRNA ilmaisuja molemmissa solutyypeissä annosvasteisesti (Fig. 6B ja 6C). Vaikutukset olivat erityisen voimakas resistentit solut. Näitä estoja ei löytynyt siglitatsonia ja BAY-11-7082, mutta lisääntyi vuonna HDAC1 ilmaisun jälkeen NF-KB inhibitio BAY-117082.

(A) Reaaliaikainen qPCR tiedot osoittavat eroja pohjapinta-geenin ekspressiotasot HDAC 1, 2, ja 3 A2780 ja A2780 /AD-soluja. **

p

0,05 versus A2780 soluissa. Vaikutus eri hoitoja HDAC geenejä määritettiin A2780 (B) ja A2780 /AD soluja (C) jälkeen 48 tunnin inkuboinnin. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM 3 erilliselle kokeelle. Tilastollisia eroja verrattuna verrokkeihin nähden näkyvät *

p

0,05 ja **

p

0,01.

15d-PGJ

2 estää SIRT1 ja HDAC-entsyymien toimintaa, koska sen elektrofiilisen hiiliatomin

Koska huomasimme, että 15d-PGJ

2 voivat estää geeniekspression SIRT1 ja muiden HDAC: t, me pohtivat 15d-PGJ

2 kykeni inhiboimaan näiden entsyymiaktiivisuuksien suoraan. Käytimme p53-sekvenssin-substraatille (Arg-His-Lys-Lys (e-asetyyli) -AMC) sen määrittämiseksi SIRT1 aktiivisuuden ja HDAC1 käytimme asetyloitu lysiini alustaan ​​perustuva määritys. Jotta voitaisiin löytää onko C9 elektrofiilisen hiiliatomin on vastuussa toiminnasta, me sisältyi 15d-PGJ

2 analogista CAY-10410, josta puuttuu electrophilicity C9 (Fig. 7A). Huomasimme, että 15d-PGJ

2 esti SIRT1 aktiivisuutta annosriippuvaisesti jopa 71% estäminen taas CAY-10410 Vain osoitti vain kohtalainen inhibitio 23%, kun taas siglitatsonia ei osoittanut inhibitiota lainkaan (Fig. 7B). Vuonna HDAC1 entsyymimäärityksessä, 15d-PGJ

2 johti 40%: n inhibition, mutta CAY-10410 ja siglitatsoni eivät osoittaneet inhibitiota (Fig. 7C).

(A) kemiallinen rakenteet 15d-PGJ

2 (15-deoksi-Δ

12,14-Prostaglandiini J

2) ja sen analogi CAY-10410 (9,10-dihydro-15-deoksi-Δ

12,14-prostaglandiini J

2). Tähti osoittaa elektrofiilisen hiiliatomia ja joka voi olla mukana Michaelin additioreaktio. Paneeli (A) ja (B) esittävät pitoisuudesta riippuva vaikutus 15d-PGJ

2, CAY-10410 ja siglitatsonia on deasetylaasi- aktiivisuuteen SIRT1 ja HDAC1 vastaavasti käyttämällä

in vitro

entsyymimäärityksillä.

# P 0,01 versus siglitatsoni,

† p 0,05 ja

†† p 0,01 versus CAY-10410. (D) vaikutus CAY-10410 solun elinkelpoisuuden A2780 ja A2780 /AD soluissa mitattiin alamarBlue määritystä. (E) Käsittely CAY-10410 (2,5 uM) ei indusoinut solutransformaatiota kuluttua 48 tunnin inkuboinnin. Suurennus, 200 ×.

tutkittiin lisäksi vaikutuksia 15d-PGJ

2 näytettiin johtuen C9 elektrofiilisen atomin, testasimme vaikutuksia CAY-10410, josta puuttuu electrophilicity C9 hiiliatomin, solujen elinkelpoisuuden ja transformaatio. Olemme havainneet, että CAY-10410 ei ole todettu mitään solukuolemaa tai solujen muuntumista (Fig. 7D ja 7E).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, vaikutukset 15d -PGJ

2, tuote syklo-oksigenaasin aktiivisuutta ja koska endogeeninen PPARy-agonisti, apoptoosiin, lääkeresistenssi, solujen vaeltamiseen ja transformaatio syöpäsoluja. Tutkimme sen vaikutukset villityypin sekä doksorubisiiniresistenttejä munasarjasyöpäsoluja.