Krooninen sairaus

tiivistelmä

CLPTM1L uskotaan liittyvän keuhkosyöpään. On kuitenkin vain vähän tietoa sen ilmentymistä ja toimintaa. Tästä käyttäen immunohistokemia, olemme huomanneet, että CLPTM1L ekspressio lisääntyy selvästi keuhkosyöpä kudoksissa suhteessa normaaleissa kudoksissa, erityisesti keuhkoissa adenokarsinooma. CLPTM1L ilmaisua ei todettu liittyvän vaiheisiin, tupakoinnista, imusolmuke etäpesäke, tai T-lymfosyyttien tunkeutumista, mutta eriytetty vaiheessa. Löysimme CLPTM1L rikastettu mitokondrion verrattuna solukalvon proteiinia otteita. CLPTM1L-EGFP transfektio osoittivat, että molekyyli tuote ilmennettiin sytoplasmassa ja osoitti mitokondrioiden lokalisointi värjättiin mitokondrioiden merkki MitoTracker. CLPTM1L siirretään keuhkosyövän solulinjassa 95-D ei osoittanut kasvun estäminen tai solun apoptoosin, mutta se ei näytä inhiboi herkkyys cis-diamminedichloroplatinum (II) (sisplatiini, CDDP). Knockdovvn CLPTM1L RNAi eivät häirinneet solujen lisääntymistä, mutta se nousi solun herkkyyttä CDDP ja kaspaasi-9 ja kaspaasi 3/7. Nämä tiedot osoittavat, CLPTM1L on mitokondrioita proteiini ja että se voi liittyä anti-apoptoottisten mekanismi, joka vaikuttaa lääkeresistenssideterminantit puolestaan.

Citation: Ni Z, Tao K, Chen G, Chen Q, Tang J, Luo X, et al. (2012) CLPTM1L yliekspressoituu Keuhkosyöpä ja Associated kanssa Apoptosis. PLoS ONE 7 (12): e52598. doi: 10,1371 /journal.pone.0052598

Editor: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Saksa

vastaanotettu: 05 syyskuu 2012; Hyväksytty: 16 marraskuu 2012; Julkaistu: 26 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Ni et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Shanghai Science and Technology komitea (No.09JC1412900, No.10411969100), Shanghai Educational komitea (No.10YZ54), Shanghai Putuo District Science and Technology komitea (2010), ja innovaatio-ohjelman Shanghai Municipal Education komissio (13ZZ096). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

suulakihalkiokeskuksen transmembraani- 1 kaltainen (CLPTM1L), jota kutsutaan myös

c

isplatin

r

esistance

r

riemuissaan geeni 9 (CRR9), tunnistettiin keskuudessa osallistuvia geenejä resistenssin syöpälääke sisplatiinin munasarjasyöpäsoluja [1]. CLPTM1L sijaitsee 5p15.33 lokuksessa lähellä telomeraasin käänteistranskriptaasin [TERT]. Viimeaikaiset geneettiset tutkimukset paljastivat, että tämä lokus on alttius alue keuhkojen ja useita muita syöpiä [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [ ,,,0],10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]. Näyttää todennäköiseltä, luonnollista, että geneettisiä variantteja aiheuttaisi epänormaalia ilmentymistä proteiinitasolla ja että tämä voi vaikuttaa geenin toiminnon keuhkosyöpä. Useat tutkimukset ovat osoittaneet CLPTM1L olevan erittäin ilmaistaan ​​munuaissyöpä solulinjassa ja kurkunpään okasolusyöpä [17], [18].

Se, että CLPTM1L on niin hyvin konservoitunut osoittaa, että se on todennäköisesti tärkeää perustiedot toiminto. Kuitenkin vähän tiedetään mitä CLPTM1L ja sen tuotteesta tai tuotteista itse tehdä. Molekyylin on kuitenkin havaittu olevan lääkeaineen resistenssin kerroin [1]. Ilmentyminen CLPTM1L havaittiin voimistuvan kaikki sisplatiini-resistenttejä solulinjoja tutkittiin. Yli-ilmentyminen CLPTM1L on sisplatiini-herkän solulinjan todettiin aiheuttavan apoptoosia, ja CLPTM1L yli-ilmentyminen on havaittu olevan mitään vaikutusta sisplatiinin-resistentit solut.

Ensisijainen keuhkosyöpä on johtava syy syöpäkuolemista useimmissa teollisuusmaissa [19]. Tehokas geneettinen yhdistyksen välillä CLPTM1L ja keuhkosyövän inspiroi meitä käsittelemään ilmentymistä ja toimintaa tämän geenin yksityiskohtaisesti. Esillä olevassa tutkimuksessa kuvaamme laajuus CLPTM1L immunohistokemiallisella ilmentymisen keuhkosyöpä kasvain näytteet, ja analysoimme suhdetta niiden ilmaisun ja kliinis muuttujia. Teemme myös oikeudenkäynti määrittää mahdollisia toimia tämän geenin.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaan ominaisuudet

Ensisijainen kasvain näytteet saatiin kirurgisesti 151 keuhkosyöpäpotilaita (110 miehet, ikä 39-81, mediaani ikä diagnoosin 67 vuotta, 41 naista, ikä 36-85, mediaani ikä diagnoosin 64 vuotta), jotka eivät ole suorittaneet mitään ennen leikkausta hoitoa. Leikkaus suoritettiin Shanghain Changning keskussairaala, Shanghai, Kiina, vuosina 2003 ja 2010. Nämä kasvaimet mukana 55 tapausta adenokarsinooma, 63 tapausta okasolusyöpä, 13 tapausta squamous-adenokarsinooma, 5 tapausta pienisoluinen keuhkosyöpä ja 15 tapausta laaja-keuhkosyöpä. Potilaat lavastettu mukaan kirurgisen ja patologiset löydökset suuntaviivoihin perustuvaa kuvattu

American sekakomitean Cancer Staging Manual

[20]. Kaksikymmentäkaksi potilasta määritettiin olevan Ia, 51 Ib, 6 vaiheessa IIa, 16 vaiheessa II b ja 56 vaiheessa III. Kaikista näistä potilaista, kirjaa leikkauksen in-potilaskertomustaan, keuhkoröntgen elokuvia, koko kehon tietokonetomografia (CT) elokuvien ja luun skannaus kalvot tarkistettiin. Parilliset normaalit kudokset otettiin näytteet, joista vastaavat näytteet. Tutkimuksen hyväksyi etiikkaa komitean Putuo sairaala, Shanghai University perinteisen kiinalaisen lääketieteen ja kaikille potilaille tarjotaan kirjallinen lupa.

Cell Line ja huolto

Ihmisen keuhkosyöpä solulinjat 95-D hankittiin Institute of Cell Biology (Shanghai, Kiina) ja pidettiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS.

CLPTM1L Expression Analysis Käyttämällä Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

eristettiin kokonais-RNA viljellyistä soluista käyttäen Trizol reagenssia (Invitrogen, Shanghai, Kiina), mukaan manufactuery protokollan. Ensimmäisen juosteen cDNA valmistettiin käyttämällä satunnaista hexamer aluketta ohjeiden mukana SuperScriptIII ™ ensimmäisen juosteen synteesi (Invitrogen). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin käyttämällä Universal Master Mixer (Roche Applied Science, Shanghai, Kiina) on 7300 Reaaliaikainen PCR System (Applied Biosystems, Shanghai, Kiina). Alukkeet ja koettimet olivat seuraavat: Forward, 5’TGCATTACCTGCCCATCCT -3 ’; Reverse, 5’CGCCCCAGTGAGACCTTG -3 ’; Probe, 5’-per- TCATCGACCAGCTCAGCAACCGC -tamra-3 ’. GAPDH toimi kontrollina, F: 5’-CCACTCCTCCACCTTTGAC -3 ’, R: 5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA -3′, Probe: 5’-per- TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC -tamra-3 ’. Kukin määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena. PCR-olosuhteet, joita käytetään kaikissa reaktiot olivat seuraavat: 10 minuuttia 95 ° C: ssa, mitä seurasi 40 kaksivaiheista sykliä (95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min). Suhteellinen ilmentyminen tasot CLPTM1L geenin normalisoitiin vastaan ​​GAPDH ja analysoitiin 2

-ΔΔCt menetelmä [ΔΔCt = (Ct

CLPTM1L – Ct

GAPDH) näyte – (Ct

CLPTM1L – Ct

GAPDH) ohjaus].

kloonaus ja sekvensointi Ihmisen CLPTM1L

Kokonais-RNA eristettiin 95-D-soluihin käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen) ja käytettiin templaattina ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi käyttäen RT-PCR SuperScriptIII ™ ensimmäisen juosteen synteesi (Invitrogen). CLPTM1L avoimet (1617 bp, GenBank NM_030782) monistettiin PCR: llä cDNA: sta syntyy käänteistranskriptio mRNA: ta. Käytetyt alukkeet monistamiseen CLPTM1L geenin olivat seuraavat: F: 5′-GGAAGATCTACCATGTGGAGCGGCCGCAG -3 ’; R: 5’-AGACGTCGACGTCCGTGTGGGGCGCC -3 ’. Monistettu tuote puhdistettiin ja kloonattiin pMD18-T Simple Vector (Takara, Shanghai, Kiina). Koostumus plasmidi varmistettiin sekvensoimalla.

Plasmidin rakentaminen ja Gene transfektio

CLPTM1L CDS alueella uutettiin pMD18-T- CLPTM1L plasmidit restriktiodigestiolla ja kloonattiin pEGFP-N3 vektori. Konstruoitu plasmidi nimettiin pEGFP-N3-CLPTM1L ja sitä käytettiin määrittämään sijainti solun CLPTM1L. Alukkeita (F: 5′-GGAAGATCTACCATGTGGAGCGGCCGCAG -3’and R: 5′-CCGCTCGAGTCAGTCCGTGTGGGGCGCC-3 ’) käytettiin monistamaan CLPTM1L CDS alueen rakentaminen pcDNA3.1 (+) -CLPTM1L vektori. Monistettu tuote puhdistettiin ja pilkottiin käyttämällä BglII: lla ja Xho I. Sen jälkeen kloonattiin pcDNA3.1 (+) -vektori pilkottiin BamH I ja Xho I. rakennettu plasmidi nimettiin pcDNA3.1 (+) -CLPTM1L ja käytettiin CLPTM1L yli-ilmentymisen. 3 x 10

5 95-D Sitten soluja transfektoitiin väliaikaisesti joko pEGFP-N3-CLPTM1L tai pEGFP-N3 käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Shanghai, Kiina) 24 tunnin ajan. Sitten solut kerättiin talteen ja solujen lisääntymisen tai sisplatiinin herkkyysanalyysissä.

fluoresenssimikroskopialla

määrittämiseksi solunosasijaintia CLPTM1L-EGFP, solut ensin transfektoitiin väliaikaisesti pEGFP-N3-CLPTM1L käyttäen Lipofectamine 2000. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen soluja inkuboitiin MitoTracker väriainetta (Invitrogen) 30 minuuttia kasvuolosuhteissa. Inkubaation jälkeen solut havaittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia.

immunohistokemia

resektoitiin kudosnäytteet kiinnitettiin formaliiniin, valettiin parafiiniin, leikattiin 4 um: leikesarjojen, ja sitten asetettiin lasilevyille. Antigeeni haku suoritettiin käyttäen sitraattipuskuria (0,01 mmol /l, pH 6. 0) Jälkeen haku antigeenin, objektilasit pestiin kolme kertaa PBS: llä ja inkuboitiin 10% normaalia vuohen seerumia estämään ei taustan värjäytymistä. Sitten leikkeitä yön yli inkuboitiin kanin anti-humaani CLPTM1L vasta-aineita (Sigma, Shanghai, Kiina) 4 ° C: ssa. Leikkeitä pestiin kolme kertaa PBS: llä, ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) -anti-kani-IgG (Maixin Bio, Fuzhou, Kiina) 30 min. Ne pestiin sitten kolme kertaa PBS: llä. Leikkeitä visualisoidaan diaminobentsidiiniä liuosta (DAB). Objektilasit arvioitiin samanaikaisesti kahdella patologit käyttäen kaksipäinen valomikroskoopilla. Patologit ei ilmoitettu kunkin potilaan kliininen ennätys. CLPTM1L ilmentyminen oli semi-kvantitatiivisesti sijoitettiin perustuu värjäytymisen intensiteetti ja suhteellinen solujen lukumäärä värjätään. Unstained kudokset pisteytettiin 0, heikko värjäytyminen, kohtalainen tai voimakas värjäytyminen 25% soluista pisteytettiin 1, kohtalainen värjäytyminen tai voimakasta värjäytymistä 25-50% soluista pisteytettiin 2 ja vahva värjäytymistä 50% solut pisteytettiin 3. Solulaskennat suoritettiin × 400 vähintään viidessä kenttien satunnaisesti valitun syöpä alueilla.

tutkittiin suhdetta CLPTM1L ja tason TIL tunkeutumisen, valitsimme kentän, jolla on suurin määrä CLPTM1L ilmaisun, ja lasketaan määrä CD45

+ solua 1000 yhteensä ytimeksi.

immunosytokemia

Expression of CLPTM1L proteiinin määritettiin käyttäen immunosolukemiallinen. Päivää ennen määritystä, yhteensä 1 x 10

5 solua ympättiin Millicell EZ Slide (Millipore, Shanghai, Kiina). 24 tunnin inkubaation jälkeen solut kiinnitettiin objektilaseille käyttäen 4% paraformaldehydillä. Solut permeabilisoitiin 3 kertaa 5 minuutin ajan 0,1% Triton X-100 PBS: ssä ja blokattiin blokkauspuskurilla (10% normaalia vuohen seerumia, 0,1% Triton X-100) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Blokkauksen jälkeen solut pestiin PBS: lla ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa kanin anti-ihmis-CLPTM1L vasta-aineita (Sigma, Shanghai, Kiina). Seuraavana päivänä solut pestiin 3 kertaa PBS: llä ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) -anti-kani-IgG: tä 30 minuutin ajan. Ne pestiin sitten kolme kertaa PBS: llä. Osat visualisoitiin käyttäen diaminobentsidiiniä liuosta.

Mitokondrioiden puhdistus ja Länsi-Bolt analyysi

Ensimmäinen, 2 x 10

7 95-D-solut kerättiin ja mitokondrioiden ja solulimafraktioita eristettiin käyttämällä mitokondrioiden fraktiointi Kit (Activemotif, Shanghai, Kiina). Mitokondrioiden ja solulimafraktiot erotettiin 10% SDS-PAGE, ja tämän jälkeen siirrettiin PVDF-membraanille. PVDF-membraani blokattiin 5% BSA: ta ja pestiin kaksi kertaa TBST: llä. Sitten membraania inkuboitiin CLPTM1L vasta-aineita (Abgent, Shanghai, Kiina) yön yli 4 ° C: ssa, ja pestiin kolme kertaa TBST: llä ja sen jälkeen inkuboimalla anti-kani-IgG-piparjuuriperoksidaasi sekundaarista vasta-ainetta (Cellsignal, Shanghai, Kiina) 2 tuntia huonelämpötila. Lopuksi immunoreaktiivisia vyöhykkeet havaittiin käyttäen ECL reagenssia (Millipore).

rakentaminen CLPTM1L RNAi lentivirustartunnat

siRNA sekvenssit vastaan ​​ihmisen CLPTM1L geeni (GenBank NM_030782) suunniteltiin ja syntetisoitiin Genechem (Genechem, Shanghai, Kiina). Niistä neljä ehdokasta siRNA: t ekspressiokasettien löysimme sense siRNA-sekvenssin (5-CAGTTTCTGGAAGAAGAAGAA-3) on paras häiritsevä vaikutus meidän 95-D-infektoitunut solu järjestelmä. SiRNA insertoitiin pGCSIL-GFP lentivirusvekto-. Kontrolli siRNA (5-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3) käytettiin negatiivisena kontrollina. Lentivirukset koodattu siRNA vastaan ​​CLPTM1L ja valvontaa tuotettiin transfektoimalla 293T-soluihin käyttäen lipofektamiinia 2000 (Invitrogen) standardimenetelmien mukaisesti. 5 x 10

4 95-D-solut infektoitiin joko CLPTM1L siRNA lentiviruksesta tai negatiivinen kontrolli siRNA vektori MOI noin 100 72 tuntia. Sitten solut kytketään täydelliseen alustaan. 72. tunnin viljelyn, solut kerättiin solujen lisääntymistä, sisplatiini herkkyys tai kaspaasi-3/7 ja kaspaasi-9 analyysiä.

Sisplatiini Herkkyysanalyysi ja Cell Proliferation Analysis

Ensimmäinen, 1 x 10

4 solua per-ja ympättiin 96-kuoppalevylle. 24 tunnin inkubaation, 25 uM, 50 uM ja 75 uM sisplatiinia (Sigma) lisättiin ja inkuboitiin 24 tuntia. 24 tunnin jälkeen elävien solujen populaation analysoitiin käyttäen Cell Proliferation Reagent WST-1 (Roche) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Proliferaatiota arvioitiin eri ajankohtina käyttäen WST-1.

analyysi kaspaasi-3/7 ja kaspaasi-9 Analysis

95-D infektoidut solut CLPTM1L lentiviruksen ja hallita lentivirukselle viljeltiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Lyhyesti, 1 x 10

4-solut ympättiin 96-kuoppalevylle ja inkuboitiin yön yli. 24 tunnin kuluttua, 95-D-soluja käsiteltiin 50 uM sisplatiinin (Sigma) 24 tuntia. 24 tunnin kuluttua, 100 ui kaspaasi-Glo 3/7 tai kaspaasi-Glo 9-reagenssia (Promega, Shanghai, Kiina) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Inkubaation jälkeen, luminanssi mitattiin käyttäen TD 20/20 Luminometer (Promega). Jokainen näyte mitattiin kolmena kappaleena.

Tilastollinen analyysi

assosiaatioita ilmaus CLPTM1L ja kliinis muuttujat analysoitiin käyttämällä Fisherin testiä, Khin neliö kokeet tai jatkuvuus korjaus chi-neliö testien SPSS16.0 ohjelmisto, ja niiden väliset suhteet määrä TIL ja CLPTM1L arvioitiin käyttäen Mann-Whitney-testiä käyttäen Instat3.36. Sillä suhdetta eri markkereita, yksinkertainen lineaarinen regressio suoritettiin käyttäen Statview SE + Graph.

Tulokset

1. Expression of CLPTM1L Human Lung Cancer

ekspressiokuvion CLPTM1L molekyylien pinnalla kasvaimen solut näyttivät hyvin hajanaisia ​​useimmissa tapauksissa. Mikroskooppisesti CLPTM1L molekyylin havaittiin sytoplasmassa (Fig. 1). Näiden näytteiden, infiltroituvat syöttösoluista havaittiin ilmentävän CLPTM1L voimakkaasti, mutta lymfosyytit eivät. Niistä 151 potilaalla edellyttäen yksilöt, 136 (86,8%) osoitti CLPTM1L ilmaisun ja CLPTM1L yliekspressoitui kasvainkudoksissa verrattuna viereisiin kudoksiin, mikä oli tilastollisesti merkitsevästi erilaisia ​​(p = 0,000, taulukko 1). Jakelu värjäytymisen intensiteetti kaikki näytteet on esitetty taulukossa 1. suhde värjäytymisen intensiteetti ja patologisten luokitus todettiin. Prosenttiosuus vahvaa värjäytymistä (++ ~ +++) ja CLPTM1L ilmentymisen adenokarsinooma oli korkeampi kuin squamous-cell carcinoma (p = 0,000, taulukko 1). Koska vähäistä nykyisen tutkimuksen positiivinen suhde laaja-cell carcinoma ja pienisoluinen keuhkosyöpä ei voitu määrittää lopullisesti. Suhteellinen määrä tummiksi värjäytyneet solut oli paljon suurempi adenokarsinooma näytteissä kuin verrokeilla. Useimmat viereisten kudosten osoitti joko heikkoa värjäytymistä tai ei lainkaan.

(A) Normaali keuhkokudoksessa (x 200); (B) jakson välillä keuhkoadenokarsinooma (x 200); (C) § keuhkosta squamous-cell carcinoma (x 200); (D) jakso alkaen keuhkoadenokarsinooma (x 400).

2. Suhde ennusteeseen viittaavia ominaisuudet ja CLPTM1L ilmentäminen keuhkosyöpä Potilaat,

Löysimme CLPTM1L ilmentyminen liittyy laadut eriyttäminen (p = 0,046, taulukko 2), mutta ei merkittävää yhteyttä ei havaittu CLPTM1L ekspressiotasot ja potilaan iän , sukupuoli, tupakointi tai TMN vaihe 151 keuhkonäytteissä (taulukko 2). Ei assosioitunut ilmaus CLPTM1L ja lymfosyyttien infiltraatio, joka osoitti, että ilmentyminen CLPTM1L ei liittynyt immunosuppression (Data ei tiedetä).

3. Mitokondrioiden lokalisaatio CLPTM1L

tarkka sijainti solun CLPTM1L suhteessa sen roolit keuhkosyöpä eteneminen on vielä epäselvä. Tutkiminen sekvenssin CLPTM1L käyttäen MITOPROT (https://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/mitoprot.html) osoitti 84% todennäköisyydellä CLPTM1L vietiin mitokondrioita. Määrittämään sijainti CLPTM1L proteiinin, mitokondrioiden ja sytosolifraktio 95-D-soluja uutettiin Western blot-analyysi. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, CLPTM1L proteiinia tavataan pääasiassa mitokondriofraktiosta soluihin. Tämän vahvistaa, rakensimme CLPTM1L ekspressiovektorin fuusioimalla EGFP: n C-päähän CLPTM1L (CLPTM1L-EGFP). Sitten 95-D-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti CLPTM1L-EGFP vektori ja värjättiin mitokondrioiden merkki MitoTracker. Fluoresoiva kuvat selvästi mitokondrioiden lokalisaation CLPTM1L proteiinin (Fig. 2B).

(A): Western blot analyysi CLPTM1L ilmentymisen kokosolu-uutetta, soluliman ja mitokondriofraktiosta 95-D-soluissa. (B): 95-D-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti CLPTM1L-EGFP vektori ja värjättiin mitokondrioiden merkki MitoTracker.

4. Vaikutus CLPTM1L yli-ilmentyminen in Infected 95-D solujen

määrittämiseksi toiminnallinen seuraukset kohonnut CLPTM1L ilmaisun keuhkosyöpä, CLPTM1L yliekspressoitui 95-D-soluissa. Yliekspressio vahvistettiin käyttäen reaaliaikaista PCR ja immunosytokemia (Fig. 3A ja 3B). Emme löytäneet kasvu estyy kuluttua 72 h yli-ilmentymisen, määritettynä leviämisen analyysi. Yli-ilmentäviä soluja CLPTM1L näyttivät olevan vähemmän todennäköisesti kuolee, kun inkuboidaan 25-75 uM sisplatiinin, vaikka tämä ero ei havaittu olevan tilastollisesti merkitsevä (Fig. 3C ja 3D).

(EN) CLPTM1L mRNA-tasolla mitattiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n pcDNA3.1 (+) – CLPTM1L tai pcDNA3.1 (+) plasmidi transfektoiduista soluista. *:

P

0,05 kontrolliryhmään verrattuna (p = 0,001). (B) ekspressio CLPTM1L proteiinin tutkittiin käyttäen immunosytokemia. (C) vaikutukset CLPTM1L ilmentymisen vaikutus soluproliferaation pcDNA3.1 (+) – CLPTM1L transfektoituja soluja 95-D-soluja verrattuna kontrolliin 95-D-soluissa. (D) yli-ilmentyminen CLPTM1L ei muuta kemosensitiivisyys sisplatiiniin ihmisen keuhkosyövän 95-D-solut transfektoitiin pcDNA3.1 (+) – CLPTM1L suhteessa kontrolleihin. Soluja käsiteltiin osoitetuilla sisplatiinin 24 h.

5. Vaikutukset CLPTM1L vuonna pudotti 95-D solut tartunnan CLPTM1L shRNA lentivirustartunnat

Käytimme lentivirusvektoria sisältävä shRNA kohdentaa spesifisesti ja pysyvästi kaataa ilmaus CLPTM1L keuhkosyövässä 95-D-soluissa. Reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, että CLPTM1L mRNA: n ekspression shRNA-CLPTM1L-transfektoiduissa soluissa oli merkittävästi alhaisempi kuin ohjaus 95-D-solut (Fig. 4A). Vähentynyt ilmentyminen CLPTM1L proteiinin varmistettiin myös immunosolukemiallisella (Fig. 4B).

(EN) CLPTM1L mRNA-tasolla, kun RNAi hoidon mitattiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR eri ryhmissä. *: P = 0,000 vs NC kontrolliryhmään. (B) ekspressio CLPTM1L proteiinin jälkeen RNAi hoidon tutkittiin käyttämällä immunosytokemian. (C) kasvu shRNA-CLPTM1L transfektoituja soluja 95-D-soluihin ja ohjaus 95-D-soluissa 72 tuntia. (D) shRNA-CLPTM1L transfektoituja soluja 95-D-soluihin ja ohjaus 95-D-soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden sisplatiinin 24 tuntia. *: P = 0,003 vs NC kontrolliryhmään (25 uM) ja #: p = 0,006 vs NC kontrolliryhmään (50 uM).

osoittamiseksi biologisen aktiivisuuden CLPTM1L, tutkimme vaikutuksia pieneni CLPTM1L ilme keuhkosyövän solujen kasvua in vitro. Käyttäen soluproleferaatiomäärityksessä, olemme huomanneet, että shRNA-CLPTM1L-transfektoitiin 95-D-soluja oli kasvu on samanlainen kuin kontrolli-soluista 72 tunnin ajan (Fig. 4C). CLPTM1L Knockdown ei vaikuttanut solujen lisääntymisen.

6. RNAi-välitteinen knockdovvn CLPTM1L Lisääntynyt Kemosensitiivisyys sisplatiiniin Human Lung Cancer 95-D Cells ja sisplatiini aiheuttama kaspaasi-9 ja kaspaasi-3/7

CLPTM1L havaittiin ensimmäisen Sisplatiinipohjaista kestävä munasarjakasvain solulinjassa. Täällä selvitettävä laski CLPTM1L ilmaus voisi lisätä kemosensitiivisyys sisplatiiniin keuhkojen syöpäsoluja. Eri sisplatiinin käytettiin hoitoon shRNA-CLPTM1L-transfektoitiin 95-D-solujen kanssa 24 tunnin ajan. Löysimme solujen kasvua voidaan merkittävästi estyy knockdown soluissa jälkeen sisplatiinihoitoon (Fig. 4D). Tämä osoitti, että CLPTM1L Knockdown voisi lisätä kemosensitiivisyys sisplatiiniin ihmisen keuhkosyövän 95-D-soluissa.

Mitokondrioita avainasemassa apoptoosin säätelyyn [21], ja niillä on tärkeä rooli sisplatiinin indusoiman apoptoosin. Sen jälkeen sisplatiinia, kaspaasi-9 ja kaspaasi-3/7 mitokondrioita aktivoitiin. Koska CLPTM1L proteiinin havaittiin viedään mitokondriot, mietimme jos CLPTM1L liittyi apoptostic proteiinia. Sitten tutkittiin kaspaasi-9 ja kaspaasi-3/7 in shRNA-CLPTM1L-transfektoitiin 95-D-soluihin ja hallita 95-D-soluja sen määrittämiseksi, onko CLPTM1L oli mukana mitokondrioiden apoptoosireittiä. Tuloksemme osoittivat, että sisplatiinin aiheuttama apoptoosin alkavat kaspaasi-9, jota seuraa kaspaasi-3/7 kummassakin solutyypeissä. Lisäksi pudotus on CLPTM1L aiheutti lisääntynyttä kaspaasi-9 ja kaspaasi-3/7 (Fig. 5). Tämä tarkoittaa sitä, että CLPTM1L pudotus solut ovat herkempiä sisplatiinia.

shRNA-CLPTM1L transfektoitiin 95-D-soluja ja kontrollisoluja käsiteltiin 50 uM sisplatiinia 24 tunnin ajan. Kaspaasi 3/7 ja kaspaasi-9-aktiivisuus mitattiin, ja tulokset olivat edustettuina kertainen aktiivisuuden soluja ilman sisplatiinihoitoon. *: P = 0,004 vs NC kontrolliryhmään (kaspaasi-3/7) ja #: p = 0,000 vs NC kontrolliryhmään (kaspaasi-9).

Keskustelu

toivo määritellään patogeneesin CLPTM1L keuhkosyövän keskityimme CLPTM1L ilmaisun, sijainti solussa ja toimiva yhdistys keuhkosyöpään. Huomasimme, että CLPTM1L ilmaistiin syöpä- keuhkokudoksessa, voimakkaimmin vuonna adenokarsinooma kudoksessa. Western-blot-analyysi ja CLPTM1L-EGFP transfektiota sekä osoitti, että molekyyli voi sijaita mitokondrioissa. Tarkka molekyylin toiminnalle, on edelleen epäselvä. Me varmistettu sen yhdessä kemosensitiivisyys sisplatiiniin ja aktivointi mitokondrioiden apoptoottista reitin riippuen RNAi knock-alas-tekniikkaa. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen todiste sijainti molekyylin.

Tämä tutkimus antanut enemmän todisteita siitä, että CLPTM1L liittyi keuhkosyöpä [22], joka oli yhdenmukainen julkaistun tutkimuksen James et al ja The Human Protein Atlas hanke [23]. James et al tutki ilmentymistä CLPTM1L mRNA tasolla ja löysi CLPTM1L mRNA: n ilmentyminen oli keskimäärin 2,24 kertaa suurempi tuumorikudoksissa verrattuna kasvaimeen viereisten kudosten [23]. Yhdistettynä Jamesin työtä, havaintomme näytti osoittavan, että kohonneet CLPTM1L proteiinin pitoisuus saattaa johtui kasvusta CLPTM1L mRNA. Lisäksi vertasimme suhde CLPTM1L ilmentyminen keuhkosyöpää sairastavien potilaiden potilaiden ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia. Löysimme CLPTM1L ilmentyminen oli vahvasti liittyy laadut eriyttäminen (p = 0,046, taulukko 2), mutta ei merkittävää yhteyttä ei havaittu CLPTM1L ekspressiotasot ja potilaan ikä, sukupuoli, tupakointi tai TMN vaihe 151 keuhkonäytteissä. Lisäksi prosenttiosuus voimakkaan värjäytymisen CLPTM1L ilmentymisen adenokarsinooma oli korkeampi kuin squamous-cell carcinoma, vaikka James et al ei ole löytänyt eroa CLPTM1L ilmaisun välillä NSCLC alatyyppejä. Ero tuloksemme ja Jamesin tulokset saattavat johtua potilaiden lukumäärä. James analysoitiin 22 adenokarsinooma ja 8 okasolusyöpä potilailla, kun analysoimme 55 adenokarsinooma ja 63 levyepiteelikarsinooma potilailla.

Tässä vahvisti, että CLPTM1L proteiinia korkeammin ilmaistu keuhkosyöpää, etenkin adenokarsinooma, kuin normaalissa kudos, Tämä osoitti, että käytännön soveltamiseen geenimuunnelmat geenin ei rajoitu käyttää geneettisiä markkereita. Ilmaantuvuus keuhkoadenokarsinooma on kasvanut merkittävästi. Etiologian on yleisesti uskotaan liittyvän ilman pilaantumisen ja käytettyjen savua. Kuitenkin syövän synty [19], [24] on monimutkainen, ja CLPTM1L geeni voi myös olla tärkeä rooli. Geneettinen analyysi on paljastanut, että CLPTM1L liittyy läheisesti keuhkojen adenokarsinooma ja geneettinen vaihtelu voi aiheuttaa epänormaalia geenin ilmentymisen, jolla on tärkeä rooli patogeneesissä keuhkosyöpä.

proteiini näyttää olevan lokalisoitu mitokondrioita, kuten osoitetaan Western-blot ja CLPTM1L-EGFP transfektiota. Tätä päätelmää tukevat proteiinia ennustuksen. Laskennassa hydrofiilisyys osoittaa, että CLPTM1L proteiini voi olla transmembraaninen proteiini. Näiden tietojen mukaan, me väitti, että tämä proteiini oli transmembraaniproteiini sijaitsee mitokondrioissa kalvo.

täsmällistä tehtävää CLPTM1L on vielä tuntematon. James et al osoitti, että CLPTM1L ollut apoptoottista rooli alavirtaan DNA-vaurioita ja säätelyn kautta Bcl-ilmaisun [23]. Tässä tutkimuksessa emme voineet määrittää tarkan biologinen muutoksia, jotka liittyvät CLPTM1L yli-ilmentymisen ja knock-alas keuhkosyövän solulinjoissa. Toisin tulos edellisen raportin [1], yliekspressio CLPTM1L 95-D keuhkojen solulinja ei indusoi apoptoosia ja solut yleensä vähemmän chemosensitive sisplatiinin [1]. Ero saattaa ovat aiheuttaneet ekspressiovektorit, jotka ovat saattaneet saada erilaisia ​​tuotteita: CLPTM1L-His tähän tutkimukseen ja CLPTM1L-GFP aikaisempien tutkimus. RNAi-välitteinen knockdovvn CLPTM1L nousi kemosensitiivisyys sisplatiiniin ihmisen keuhkosyövän 95-D-solujen ja sisplatiinin aiheuttama kaspaasi-9 ja kaspaasi 3/7. Lisääntynyt kaspaasi-9 ja kaspaasi-3/7 saattaa liittyä lisääntynyt aktivaatio mitokondrioiden apoptoosireittiä. Olemme edelleen havainneet, että syöttösolut ilmentyy suuresti proteiinin. On yleisesti hyväksyttyä, että syöttösolut liittyy syövän, ne lisäävät kasvaimen angiogeneesiä ja tehdä edistystä epäedullisempia [25]. Näiden tietojen mukaan, me ennustaa, että proteiini saattaa liittyä antiapoptooppinen mekanismi, joka vaikutti lääkeresistenssideterminantit. Edelleen analyysi on tarpeen vahvistaa tämän ennustuksen.

erityiset roolit CLPTM1L keuhkojen syöpäsoluja ansaitsevat lisätutkimuksia. On mahdollista, että CLPTM1L saattaa olla tärkeää ylläpito solujen vakautta ja että toiminnan menetys voi johtaa lisääntyneeseen kemosensitiivisyys sisplatiinille.