Krooninen sairaus

tiivistelmä

epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT) on yksi mekanismi kehittynyt resistenssi inhibiittoreita epidermaalisen kasvutekijän reseptorin-tyrosiini- kinaasien (EGFR-TKI) ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Tarkka mekanismeja EMT liittyvien kehittynyt resistenssi EGFR-TKI: in NSCLC jää epäselväksi. Meillä syntyy erlotinibin kestävä HCC4006 soluja (HCC4006ER) kroonisen altistuminen

EGFR

-mutant HCC4006 solujen kasvavien pitoisuuksien erlotinibin. HCC4006ER solut hankkinut EMT fenotyyppi ja aktivoitumista TGF-β /Smad reitin, kun taas puuttuu sekä T790M toissijainen

EGFR

mutaatio ja

MET

geenimonistuman. Meillä työskentelee geeniekspression mikrosiruja vuonna HCC4006 ja HCC4006ER solujen paremmin ymmärtää mekanismia hankitun EGFR-TKI vastus EMT. MRNA-tasolla,

ZEB1 (TCF8) B, tunnettu säätelijä EMT, oli 20-kertainen in HCC4006ER soluissa kuin HCC4006 soluissa, ja lisääntynyt ZEB1 proteiinin taso havaittiin myös. Lisäksi lukuisat

ZEB1

reagoiva geenejä, kuten

CDH1 (E-kadheriinin) B,

ST14

, ja

vimentiinista

olivat säädellään keskitetysti yhdessä lisääntynyt

ZEB1

in HCC4006ER soluissa. Havaitsimme myös ZEB1 yli-ilmentymisen ja EMT fenotyyppi useassa NSCLC soluissa ja ihmisen NSCLC näytteiden hankittu EGFR-TKI vastarintaa. Short-häiritsevä RNA vastaan ​​

ZEB1

kääntänyt EMT fenotyyppi ja mikä tärkeintä, kunnostettu erlotinibi herkkyyttä HCC4006ER soluissa. Taso Mikro-RNA-200c, jotka voivat säädellä negatiivisesti ZEB1, väheni merkittävästi HCC4006ER soluissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että lisääntynyt

ZEB1

voi ajaa EMT liittyviä kehittynyt resistenssi EGFR-TKI: in NSCLC. Tulisi pyrkiä tutkimaan kohdistaminen

ZEB1

on resensitize TKI-resistenttejä kasvaimia.

Citation: Yoshida T, Song L, Bai Y, Kinose F, Li J, Ohaegbulam KC, et al. (2016) ZEB1 välittää hankittu resistenssi on epidermaalisen kasvutekijän reseptori-tyrosiinikinaasin estäjät in ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 11 (1): e0147344. doi: 10,1371 /journal.pone.0147344

Editor: Pier Giorgio Petronini, University of Parma, Italia

vastaanotettu: 23 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 01 tammikuu 2016; Julkaistu: 20 tammikuu 2016

Copyright: © 2016 Yoshida et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja. Microarray aineisto toimitettiin Gene Expression Omnibus (GEO) hakunumerolla GSE71587.

Rahoitus: työ osittain rahoittama avustuksia Moffitt Cancer Center SPORE Lung Cancer (P50-CA119997), NCI 1R01 CA121182, ja Colorado Keuhkosyöpä SPORE NCI-CA58187 (HD, PN, RMG). Tämä työ on tukenut myös osittain molekyylibiologian ja Sequencing Core, Tissue Core, ja Microarray Core klo H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, joka on NCI nimetty Kattava Cancer Center (P30-CA076292). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

huolimatta hyödyksi epidermaalisen kasvutekijän reseptori-tyrosiinikinaasin estäjät (EGFR-TKI) ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilailla, joilla on

EGFR

mutaatio [1], kehittynyt resistenssi näiden hoitojen on kriittinen kliininen ongelma. Vaikka T790M toissijainen

EGFR

mutaatio [2] ja

MET

geenimonistuman [3] voi osuus on 70% tämän resistenssin mekanismeja loput 30% ovat epäselviä. Epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on negatiivisesti yhteydessä EGFR-TKI herkkyyttä NSCLC [4-7]. Mukaisesti nämä tulokset, viimeaikaiset tutkimukset raportoitu EMT mahdollisena mekanismi hankitun EGFR-TKI resistenssin NSCLC solulinjassa malleja [8,9]. Lisäksi EMT havaittiin alaryhmässä NSCLC potilaista, joille kehittyi EGFR-TKI vastus [10,11]. Kuitenkin yksityiskohtaiset mekanismit EMT liittyvien kehittynyt resistenssi EGFR-TKI: in NSCLC, sekä strategiat voittaa se, jää epäselväksi [8,9]. Useita signalointireittejä, kuten FGFR [6,12], TGF-β [8,9], ja WNT [13], sekä transkriptiotekijöitä, kuten Zinc finger E-box-sitova homeobox 1 (ZEB1) [ ,,,0],14], ovat sekaantuneet EMT prosessissa.

EMT mahdollistaa epiteelisolujen saada mesenkymaaliset liittyvä fenotyyppi lisääntynyt maahanmuutto (katsauksia [15-20]). Se on olennainen mekanismi plastisuus kehittämisen aikana ja kudosten korjaamiseen. Se on mukana haavan paranemista, fibroosi, ja kantasolujen biologiaan ja edistää etenemistä tautien kaltaisten elin fibroosia ja syöpään. EMT aktivoituu syöpäsoluissa ja mukana invaasio, etäpesäkkeitä, varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia, ja vastustuskyvyn tavanomaisilla antineoplastisia hoitoja [15,21,22]. EMT indusoi TGFli, muita kasvutekijöitä, ja hypoksia ja siihen transkriptiotekijöitä kuten Snail, Twist, ZEB1 /ZEB2, ja E12 /E47 muuttaa transkriptiokoneiston, muuttaminen käännös- ja proteiinin stabiilisuuteen, ilmaus ei-koodaavat RNA: t, ja vaihtoehtoisen silmukoinnin [16,23,24]. Klassinen ominaisuuksia EMT ovat menetys solu-soluadheesion ja solun tukirangan uudelleenohjelmointi. Low E-kadheriinin ja korkea vimentiinista ja N-kadheriinin lausekkeet ovat klassisia EMT markkereita. E-kadheriinipromoottorin, histoni demetylaasin LSD1 kumppaniaan Snail, transkriptiotekijä mukana alkuvaiheissa EMT induktio, mikä viittaa epigeneettiset muutokset aikana EMT [25,26]. Todellakin, H3K27 asetylointi aleni ZEB1 aiheuttaman EMT keuhkosyövän soluihin [27]. Äskettäin molekyyli piirteitä liittyy EMT määritelmänä integroiva lähestymistapa keuhkoadenokarsinooma ja osoitti yhdistyksen välillä tukirangan ja aktiini-sitovia proteiineja, EMT fenotyyppi ja invasiivisia ominaisuuksia [28]. Mielenkiintoista, EMT on ohimenevä ja palautuva, ja uusia kliinisiä terapeuttisia kohdistaminen EMT ovat kehitteillä [29].

Olemme perustettu HCC4006ER (erlotinibi kestävä) solujen mallina EMT liittyvien kehittynyt resistenssi EGFR-TKI by krooninen altistuminen herkkien HCC4006 NSCLC-solut, jotka sisältävät

EGFR

mutaatio (eksoni 19, L747-A750del insp) pitoisuuksia nostettiin erlotinibin. Tutkimme maailmanlaajuisia muutoksia geenien ilmentyminen tunnistaa molekyylejä ja polkuja, jotka saattavat edistää EMT liittyvää osti EGFR-TKI vastustusta NSCLC. Lisäksi ekspressiotaso mikro-RNA-200c (miR-200C) tutkittiin raporttien perusteella, että miR-200c säätelee negatiivisesti ZEB1 ja EMT prosessi [30-32].

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

LBH589, erlotinibi, BIBW2992, WZ4002, BEZ235, ja AZD6244 ostettiin Chemie Tek (Indianapolis, IN). PD173074, LY364947, salinomysiini, ja IWP2 ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). CNTO328 saatiin Centocor, Inc. (Horsham, PA). CL-387785 hankittiin AXXORA (San Diego, CA). Kantaliuoksia näiden reagenssien 100% DMSO laimennettiin suoraan median ilmoitettuina pitoisuuksina. Ihmisen TGF-β1 ostettiin R Invitrogen, Carlsbad, CA) 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

Generation EGFR-TKI-resistenttien solujen

HCC4006ER (erlotinibi vastustuskykyisten) solut syntyvät altistuminen HCC4006 solujen sisältävät

EGFR

mutaatio (eksoni 19, L747-A750del insp) asteittain kasvavia pitoisuuksia erlotinibin, joka alkaa 3 nM , ja 3 kuukautta. Alkuvaiheen sovitusta varten erlotinibi pitoisuus nostettiin vähitellen 4 uM. H1975 BIBW-R ja H1975 WZ-R-solut syntyvät altistumisesta H1975-solujen, jotka sisältävät

EGFR

mutaatio (eksoni 21, L858R ja eksoni 20; T790M) asteittain kasvavia pitoisuuksia BIBW2992 (peruuttamaton EGFR-TKI afatinib ) tai WZ4002 (T790M selektiivinen EGFR-TKI), joka alkaa 3 nM 3 kuukautta. Alkuvaiheen sovitusta varten BIBW2992 tai WZ4002 pitoisuus nostettiin vähitellen 3 uM tai 15 uM, vastaavasti. Yhden solun klooneja näitä soluja saatiin kylvö erittäin alhainen tiheys.

Asema

EGFR

ja

KRAS

mutaatioita

Yhteensä genomista DNA vanhempien ja resistentit solut valmistettiin käyttäen DNeasy Veren Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) mukaisesti tuotekäsikirjasta. Suora DNA-sekvensointi havaitsemiseen käytettiin

EGFR

ja

KRAS

mutaatioita, kuten aikaisemmin on kuvattu [33]. Olemme myös soveltaa PCR-hyökkääjän määritys etsiä pieniä populaatioita T790M mutanttisolut, kuten aiemmin on kuvattu [34].

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkyky määritettiin käyttämällä CellTiter-Glo

® Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (Promega, Madison, WI) mukaisesti valmistajan suosituksia. Lyhyesti, solut maljattiin 3×10

3 solua per kuoppa musta seinä 96-kuoppaisille levyille (NUNC, luettelonro. 165305; Rochester, NY) ja inkuboitiin yön yli RPMI 5% FBS: ää. Sitten solut altistettiin sarjalaimennoksia estäjien 72 tuntia. Viisikymmentä mikrolitraa Cell-ainetiitteri Glo Reagent lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja luminesenssi mitattiin käyttäen VICTOR levylukijaa (PerkinElmer, Waltham, MA). Tulokset muutettiin prosenttia solujen elinkelpoisuuden vertaamalla käsiteltiin käsittelemättömien (100% elinkelpoisia) viljelmiä kolmesta itsenäisestä kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena. Yhdistelmä Index (CI) on IC50-annoksen yhdistelmän hoito on laskettu CompuSyn ohjelmisto (https://www.combosyn.com/; ComboSyn, Paramus, NJ). CI 1, CI = 1, ja CI 1 osoittavat antagonistista, lisäaineiden ja synergiavaikutukset, vastaavasti [35].

RTK array

HCC4006 ja HCC4006ER soluja inkuboitiin RPMI 5 % FBS 24 tuntia kunnes ~ 80-90% solun yhtymäkohta. Fosforylaation tasoja useita reseptori (RTK: t), mukaan lukien EGR, FGF, PDGF, insuliini, VEGF, EPH, Axl, ja MER perheet (muun muassa), tutkittiin käyttämällä Proteome Profiler Human Phospho-RTK array kit ( R 25 ug proteiinia, valmistettiin kutakin näytettä. Ensisijainen vasta EGFR (# 2232), MET (# 3127), pY1234/Y1235-MET (# 3129), Y1289-Her3- (# 4791), pT705-STAT3 (# 9131), pS536-NFKB-p65 (# 3031) , pS465 /467-Smad2 (# 3101), Akt (# 9272), pS473-Akt (# 9271), Erk (# 9102), pT202 /T204-Erk (# 4377), ja PARP (# 9542) saatiin Cell Signaling (Beverly, MA). Ensisijainen vasta pY1068-EGFR (# 44-788G) saatiin Invitrogen. Ensisijainen vasta vimentiinista (BDB550513) hankittiin BD Biosciences (San Diego, CA). Ensisijainen vasta ZEB1 (sc25388), fibronektiinin (sc29011), Her3 (sc285), E-kadheriinin (sc8426), N-kadheriinin (sc7939), PTEN (sc7974), Snail (sc28199), Slug (sc15391), Twist (sc6269 ), ja Lamin A /C (sc20681) saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Ensisijainen vasta-aineita P-aktiini (SigmaA-1978) ostettiin Sigma-Aldrich. Piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-hiiri (NXA931) ja anti-kani (NA934V) sekundääriset vasta-aineet hankittiin Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).

perustaminen HCC4006ER solujen vakaa Her3 yliekspressioon

vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) retroviruksen plasmidi jalomielinen lahjoitus tohtori Florian GREBIEN ja tri Oliver Hantschel (CEMM Institute, Wien, Itävalta). Alakloonaus Her3 osaksi retrovirusplasmidiin ja vakaiden solulinjojen yliekspressioon suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [36,38]. Lyhyesti, ihmisen Her3-cDNA hankittiin Addgene (Cambridge, MA) ja monistettiin PCR: llä käyttämällä forward-aluketta 5′-CACCATGAGGGCGAACGACGCTCT-3 ’ja reverse-aluke 5′-CGTTCTCTGGGCATTAGCCTT-3’. Her3 PCR-tuote insertoitiin pENTR D-TOPO-vektoriin ja lisätään sitten pfMSCV C-Strep-HA IRES GFP-GW vektori Gateway LR ClonaseTM II Enzyme Mix Kit (Invitrogen). Retroviruksia pakattiin Phoenix HEK293-soluissa ATCC: stä (Manassas, VA), ja niitä käytettiin infektoimaan HCC4006ER soluihin. Kaksi viikkoa infektion jälkeen GFP-positiiviset HCC4006ER solut lajiteltu FACSVantage (BD Biosciences) on Moffitt Flow Cytometry Core.

Migration (Scratch) määritys ja photomicroscopy

HCC4006 ja HCC4006ER solut maljattiin päälle 6 cm ruokia ja inkuboitiin yön yli RPMI 10% FBS luoda konfluentteja yksisolukerroksiin. Yksisolukerrokset kaavittiin suorassa linjassa, jossa on 1000-ul pipetin kärki ja inkuboitiin vielä 12 tunnin ajan. Solun ulkoasu katsottiin Olympus CKX41 käännettyä mikroskooppia (Olympus, Center Valley, PA) ja valokuvattiin Infinity Yksi kamera Infinity Capture /Analyze ohjelmisto (Lumenera Corp., Ottawa, ON).

TGF-β1 ELISA

HCC4006 tai HCC4006ER-soluja (5 x 10

5) ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin yön yli RPMI, jossa on 10% FBS: ää. Kasvualusta korvattiin seerumittomalla RPMI kanssa tai ilman erlotinibin (1 uM) ja niitä inkuboidaan vielä 24 tuntia. Supernatantit kerättiin ELISA ihmisen TGF-β1 (R MetaCore, CA) [40]. Verkon tiedot yhdistettiin ja visualisoitiin Cytoscape (https://cytoscape.org/) [41]. Meidän microarray aineisto toimitettiin Gene Expression Omnibus (GEO) hakunumerolla GSE71587.

Quantitative reaaliaikaisen RT-PCR-analyysi

Eristyksen jälkeen RNA kuten edellä, kvantitatiivinen reaaliaikainen RT -PCR suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [14,42]. Aikaisemmin raportoitu alukkeita käytettiin ZEB1, Snail, Slug, E-kadheriinin, EpCAM, ESRP1, ST14, vimentiinin, N-kadheriinin, ja FGFR1 [14].

ZEB1 yli-ilmentymisen H358-soluissa

Euroopan ZEB1 geeni kloonattiin pcDNA5-FRT-TO ja transfektoitiin H358-FlpIn TREX solujen jälkeen valitaan vastus 5 ug /ml blastisidiinia ja 100 ug /ml hygromysiiniä, kuten aiemmin on kuvattu [14]. 6-myc-ZEB1 yli-ilmentyminen indusoitiin stabiilisti transfektoiduissa soluissa käyttäen 10 ng /ml doksisykliiniä ja 5 päivää.

immunohistokemiallinen analyysi ZEB1

immunohistokemiallinen värjäys ZEB1 suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [14] . Lyhyesti, parafinoidut kasvain viipaleita poistettiin parafiini vuonna Histoclear ja rehydratoitiin seuraa antigeeni haku kiehuvaan Antigeeni paljasten Solution. Kasvain näytteet oli kerätty kirurgisesti resektoitiin yksilöitä, kuten on raportoitu aiemmin [10]). Institutionaalinen Review Board n hyväksymä kirjallinen tietoon perustuva suostumus käytön kasvaimen kudosnäytteiden saatiin kaikkien potilaiden tai heidän huoltajansa (Institutional Review Board yliopiston Occupational and Environmental Health, Japani; IRB numero 08-05). Endogeeninen peroksidaasit inhiboi (0,3% H

2O

2) ja kudokset permeabilisoitiin 0,5% Triton (20 minuuttia). Objektilasit blokattiin 3% BSA /5% vuohen seerumia, inkuboitiin 2 tuntia ensisijainen kanin anti-ZEB1 (01:50), ja pestiin perusteellisesti. Leikkeitä inkuboitiin sitten 1 tunti biotinyloidun anti-kani-vasta-aineita, pestiin ja kehitettiin Vectastain ABC, mukaan valmistajan protokollan (Vector Laboratories, Inc.).

kvantitointi miR-200c

Kokonais-RNA uutettiin TRIzolia (Invitrogen). Käänteistranskriptio kypsän miR-200c ja RNU6B suoritettiin 20 ng kokonais-RNA: ta TaqMan MicroRNA käänteistranskriptio-paketin, joka sisältää MuLV-käänteistranskriptaasia (Applied Biosystems, Foster City, CA). Vastaava TaqMan MicroRNA määritystä käytettiin kvantitatiivista tosiaikaista PCR: llä GeneAmp 7500-järjestelmä (Applied Biosystems). Data on ilmaistu prosenttia RNU6B, 100×2

-ΔCt, jossa ACt = Ct

miR-200c- Ct

RNU6B.

transfektio lyhyen häiritsevän RNA

Pre-validoitu lyhyen häiritsevä RNA (siRNA; Invitrogen, luettelonro. HSS110549) käytettiin inhiboimaan endogeenisen ZEB1. ON-TARGET plus Non-kohdistaminen negatiivinen kontrolli altaat saatiin Dharmacon (Lafayette, CO) ja käytettiin negatiivisena kontrollina. Transfektio suoritettiin Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen käyttäen päinvastaisessa transfek- menettelyä kuin valmistajan suosittelemia.

Tulokset

Krooninen erlotinibin altistusta HCC4006 solujen luo vakaata solu-autonominen vastustuskykyä EGFR-TKI ilman T790M tai

MET

vahvistus

Jos haluat luoda EGFR-TKI-resistenttien kloonien peräisin

EGFR

-mutant NSCLC solulinja, otimme esiin EGFR-TKI-herkkien HCC4006 solujen

EGFR

mutaatio (eksoni 19, L747-A750del INSP) ja kasvavia pitoisuuksia erlotinibin (enintään 4 uM) ja 3 kuukautta. HCC4006ER solut tuli kestävät hyvin sekä erlotinibin ja peruuttamattomia EGFR-TKI, CL387,785 (kuvio 1A). Tämä vastus oli vakaa, koska sitä ei peruuteta viljelemällä HCC4006ER soluja jopa 6 kuukautta erlotinibin väliaineessa (S1 Kuva). Olemme myös perustettu 5 yhden solun klooneja HCC4006ER soluja (HCC4006ER-S1 -S5 soluja), jotka olivat kukin erikseen resistenttejä erlotinibin samassa määrin kuin pääosa HCC4006ER väestöstä (S2A kuvio). Näin ollen resistentti fenotyyppi oli vakaa ja solujen autonomisten.

A, HCC4006 ja HCC4006ER soluja käsiteltiin 72 tunnin ajan kasvavien pitoisuuksien kanssa erlotinibin tai CL387,785. Tuottamien tietojen solunelinkykyisyysmääritys (CellTiter-Glo) ilmaistaan ​​prosentteina arvoa käsittelemättömillä soluilla. Virhepalkit edustavat SEM 3 riippumattoman kokeen. B, HCC4006 ja HCC4006ER soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan ~ 80-90% solun konfluenssiin. Kokosolulysaatissa kustakin solulinjasta kerättiin ja alistettiin Proteome Profiler Human Phospho-RTK Array Kit tutkia fosforylaation tasoja useita RTK: iden. Havaitut fosfo-RTK on array on ympyröity. Pilkut on neljä kulmaa RTK array ovat positiivisia kontrolleja. C, HCC4006 ja HCC4006ER soluja inkuboitiin 6 tunnin ajan ± erlotinibi (1 uM). Solulysaatit altistettiin proteiinin ilmentymisen analyysin vasta pEGFR, EGFR, pMET, MET, pHer3, Her3-, PTEN, Pakt, Akt, Perk, Erk, ja β-aktiini.

Tutkimme

EGFR

geenin asema sekä herkkien ja resistenttien solujen toissijaisen T790M eksonissa 20. Vaikka HCC4006ER soluja säilytetään eksoni 19 L747-A750del Insp, T790M ei havaittu edes PCR-hyökkääjiä määritys [34], joka on herkempi kuin suoralla sekvensoinnilla (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi emme löytäneet

KRAS

hotspot mutaatioita (eksoni 1 G12V ja eksoni 2 Q61H; tuloksia ei esitetty), joka on yhdistetty korkeaan EGFR-TKI resistenssin NSCLC [43]. Tutkia muita raportoitu mekanismien EGFR-TKI vastus kuten

MET

vahvistus [3], aktivointi IGFR signaloinnin [44], tai menetyksen PTEN-proteiinin [45], tutkimme avainmolekyylejä EGFR-reitin Western blot ja palveluksessa fosfo-RTK array kartoittaa eri aktivoitu RTK. Emme kuitenkaan havainneet aiemmin tunnistettu vastus mekanismin EGFR-TKI myös upregulated MET tai IGFR aktiivisuutta (kuvio 1 B) tai menetystä PTEN proteiinin HCC4006ER soluissa (kuvio 1 C). Kannalta EGFR signaloinnin, kyky erlotinibin inhiboida EGFR fosforylaatiota säilyi sekä HCC4006 ja HCC4006ER soluja. Kuitenkin fosfo-Akt ja Erk tasot olivat herkkiä erlotinibille vain vanhempien HCC4006 solut, toisin kuin HCC4006ER soluihin (kuvio 1 C).

Aiemmassa tutkimuksessa on todettu, että Her3- välittää PI3K /Akt-reitin signalointia gefitinib- herkkä NSCLC solulinjat [46]. Kuitenkin meidän Western blot analyysit osoittivat, että HCC4006ER solut täysin menetetty Her3- proteiinin ilmentymisen verrattuna HCC4006 soluihin, selittää menetys Her3 fosforylaation näissä soluissa havaittiin RTK array ja Western-analyysi (kuvio 1 B ja 1 C). Sen määrittämiseksi, ovatko HER3- menetys voisi selittää vastustuskykyä erlotinibin HCC4006ER soluissa, me syntyy Her3- yliekspressoivat soluja (HCC4006ER-Her3- solut) käyttäen lentiviraalinen infektio tutkia vaikutuksia erlotinibin soluproliferaatioon ja EGFR-reitin. HCC4006ER-Her3 solut säilyttivät vastustuskyvyn erlotinibi (kuvio 2A), sekä pysyvyys fosfo-Akt ja fosfo-Erk (kuvio 2B), samanlainen kuin alkuperäinen HCC4006ER solut ja valvonnan lentivirusta johdettu GFP yli-ilmentymisen (HCC4006ER-GFP). Nämä tulokset osoittavat, että Her3- menetys ei aja erlotinibi resistenssin HCC4006ER soluissa.

, HCC4006ER solujen vakaa GFP tai Her3- yli-ilmentymisen (HCC4006ER-GFP ja HCC4006ER-Her3- solut) sekä HCC4006 ja originaali HCC4006ER solut käsiteltiin 72 tuntia kasvavilla pitoisuuksilla erlotinibin. Tuottamien tietojen solunelinkykyisyysmääritys (CellTiter-Glo) ilmaistaan ​​prosentteina arvoa käsittelemättömillä soluilla. Virhepalkit edustavat SEM 3 riippumattoman kokeen. B, HCC4006, HCC4006ER, HCC4006ER-GFP, ja HCC4006ER-Her3-soluja inkuboitiin 6 tuntia ± erlotinibi (1 uM). Solulysaatit altistettiin proteiinin ilmentymisen analyysin vasta Her3-, pEGFR, EGFR, PTEN, Pakt, Akt, Perk, Erk, ja β-aktiini. C, HCC4006ER soluja käsiteltiin 72 tuntia kasvavilla pitoisuuksilla erlotinibin yksin, BEZ235 yksin, AZD6244 yksin tai BEZ235 ja AZD6244 yhdistelmänä. HCC4006 soluja käsiteltiin 72 tunnin ajan kasvavien pitoisuuksien kanssa erlotinibin 72 tuntia piirtää viittaus käyrä. Tuottamien tietojen solunelinkykyisyysmääritys (CellTiter-Glo) ilmaistaan ​​prosentteina arvoa käsittelemättömillä soluilla. Virhepalkit edustavat SEM 3 riippumattoman kokeen. Yhdistelmä-indeksi (CI) on IC50 annoksena BEZ235 yhdistettynä AZD6244 laskettiin CompuSyn ohjelmisto. CI 1, CI = 1, ja CI 1 osoittavat antagonistista, lisäaine, ja synergiavaikutukset, vastaavasti. D, Sekä HCC4006 ja HCC4006ER soluja inkuboitiin 6 tai 24 tuntia ± erlotinibi (1 uM), BEZ235 (500 nM) tai AZD6244 (1 uM) kuten on osoitettu. Solulysaatit altistettiin proteiinin ekspression analyysi vasta-aineiden kanssa pEGFR, EGFR, Pakt, Akt, Perk, ja Erk (näytteet 6 tuntia) tai PARP yhdessä vasta-aineita P-aktiini latauskontrollina (näytteet 24 tuntia).

pysyviä fosforylaatioon Akt ja Erk kaupungista HCC4006ER soluissa, selvitimme vaikutuksia PI3K /mTOR-estäjä, BEZ235 ja MEK estäjä, AZD6244. Havaitsimme, että fosfo-Akt aktivoitiin fosfo-Erk esto kanssa AZD6244 sekä HCC4006 ja HCC4006ER soluja. Tämä fosfo-Akt aktivaation indusoima AZD6244 ei inhiboitui täysin BEZ235 vuonna HCC4006 ja HCC4006ER soluja (kuvio 2D). Yhdistelmä BEZ235 ja AZD6244 ei palauta soluproliferaation inhibointi tai PARP lohkaisu HCC4006ER indusoiman erlotinibin käsittely HCC4006 soluissa, vaikka yhdistelmä indeksi (CI) tämän yhdistelmän osoittaa synergistisen vaikutuksen (CI 1) (kuvio 2C ja 2D ). Nämä tulokset osoittavat, että kahden esto Akt ja Erk ei voittaa erlotinibi resistenssin HCC4006ER soluissa, vaikka fosfo-Akt ja Erk olivat pysyvästi aktivoitu riippumaton EGFR-reitin.

HCC4006ER solut näyttävät EMT ilmiasuun aktivointi TGF-β /Smad reitin

Voit selvittää resistenssi HCC4006ER soluissa liittyi EMT prosessi, testasimme solumigraatio käyttämällä tyhjästä määrityksiä. Vuonna HCC4006ER soluissa, ero oli kokonaan suljettu 12 tunnin kuluessa, kun taas yli 12 tuntia tarvittiin vanhempien HCC4006 soluja (kuvio 3A). Olemme myös havainneet, että lisääntymistä HCC4006ER solujen oli huomattavasti hitaampaa kuin vanhempien soluja (kuvio 3B), sopusoinnussa viimeaikaiset tutkimukset viittaa hitaampi kasvu lääkeaineresistenttien soluihin [47]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että EMT on yhdistetty korkeaan ja kehittynyt resistenssi EGFR-TKI NSCLC [4-11]. Lisääntynyt maahanmuutto, erlotinibi vastus, ja alentunut leviämisen HCC4006ER soluja yhdenmukaisia ​​EMT prosessi. Tehtäväksi tarkastella tätä mahdollisuutta, etsimme EMT liittyvien molekyylien HCC4006 ja HCC4006ER soluja. Tärkeää on, löysimme menetys E-kadheriinin ja ylössäätely N-kadheriinin, vimentiinin, ja fibronektiinin HCC4006ER soluja, jotka eivät vaikuttaneet erlotinibi hoitoon (kuvio 3C). Lisäksi olemme havainneet, että kaikki yhden solun resistenttien kloonien (HCC4006ER-S1 -S5) oli tehty EMT, sekä menetys Her3-proteiinin, joka on samanlainen tulosten havaittiin alkuperäisessä HCC4006ER solut (S2B kuvio). Edellinen tutkimus osoitti, että ylläpito gefitinibin esti EMT prosessia ja esti soluvaelluksen gefitinibin kestävä NSCLC-solujen

MET

-amplification (mutta ilman EMT fenotyyppi) [48]. Kuitenkin ekspressiotasot EMT markkereita (E-kadheriinin, N-kadheriinin, vimentiinin, ja fibronektiini), eivät vaikuttaneet edelleen altistuminen erlotinibin 72 tunnin ajan HCC4006ER soluissa (S3A kuvio). Lisäksi kyky maahanmuuton HCC4006ER solut olivat vielä parempi, että HCC4006 soluissa jopa inkuboitu erlotinibin (S3B kuvio). Nämä tulokset viittaavat siihen, EMT fenotyypin HCC4006ER soluissa olivat vakaat riippumatta läsnäolon erlotinibin.

, Yksisolukerroksiset HCC4006 ja HCC4006ER solut kaavittiin suoraviivaisesti 1000-ul pipetin kärki. Yksikerroksinen valokuvia naarmuja jälkeen otettiin 12 tunnin inkubaation. B, HCC4006 ja HCC4006ER solut maljattiin 1×10

3 solua /kuoppa musta seinä 96-kuoppalevyille, niitä inkuboitiin RPMI, jossa on 10% FBS: ää, ja annettiin kasvaa osoitettuun päivää. Tuottamien tietojen solunelinkykyisyysmääritys (CellTiter-Glo) ilmaistaan ​​prosentteina arvoa käsittelemättömillä soluilla. Määritykset tehtiin kolmena kappaleena. Bars, SEM. * P 0,0001 HCC4006 vs. HCC4006ER (Student

t

testi). C, HCC4006 ja HCC4006ER soluja inkuboitiin 6 tunnin ajan ± erlotinibi (1 uM). Solulysaatit altistettiin proteiinin ekspression analyysi vasta-aineilla E-kadheriinin, N-kadheriinin, vimentiinin, fibronektiiniä, ja β-aktiini. D, HCC4006 ja HCC4006ER soluja inkuboitiin 6 tunnin ajan ± TGF-β1 (10 ng /ml) tai erlotinibi (1 uM), kuten on osoitettu. Solulysaatit altistettiin proteiinin ekspression analyysi vasta-aineiden kanssa pSMAD2 ja p-aktiini. E, HCC4006 tai HCC4006ER soluja inkuboitiin yön yli. Kasvualusta korvattiin seerumittomalla RPMI kanssa tai ilman erlotinibin (1 uM) ja niitä inkuboidaan vielä 24 tuntia. Supernatantit kerättiin ja altistettiin TGF-β1 ELISA. Määritykset tehtiin kolmena kappaleena. Bars, SEM. *

P

0,0001 verrattuna HCC4006 soluja tai ilman erlotinibin hoitoa (Student

t

testi). F, TGF-β-aiheuttama transkriptio lisääntyy yhtäaikainen käsittely TGF-β ja erlotonib häiriö- ja transfektioissa TGF-β-reagoiva lusiferaasin konstruktioita. HCC4006 ja HCC4006ER soluja transfektoitiin ohimenevästi p3TP-Lux toimittaja tai pSBE4 ja käsiteltiin DMSO: ta, 5 ng /ml TGF-β1, 1 uM erlotinibi, tai niiden yhdistelmää 5 ng /ml TGF-β1 ja 1 uM erlotinibin 48 tuntia. 48 tunnin kuluttua lusiferaasin aktiivisuus määritettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät.

Yhdenmukainen aiempien tutkimukset osoittavat, että TGF-β-reitti on kriittinen EMT liittyviä osti EGFR-TKI resistenssin NSCLC [8 , 9], löysimme korkeamman pohjapinta tasoilla Smad2 fosforylaation HCC4006ER soluissa. Kuten odotettua, Smad2 fosforylaatio entisestään jälkeen TGF-β hoitoa, ja tämä kasvu oli riippumaton erlotinibin hoidon (kuvio 3D). Lisäksi, verrattuna HCC4006 solujen määrä TGF-β1 alustassa yläreguloituja HCC4006ER soluissa (riippumaton erlotinibin hoito) (kuvio 3E), mikä viittaa siihen, että TGF-β-reitin aktivoitiin toissijainen lisääntyneeseen ligandin ilmentymistä. Aktivointi TGF-β-reitin HCC4006ER soluissa vahvistettiin transfektoimalla TGF-β-reagoiva lusiferaasireportteri plasmidit, pSBE4 ja p3TPlux, molempiin HCC4006 ja HCC4006ER soluja käsiteltiin 5 ng /ml TGF-β ja /tai 1 uM erlotinibi . Kuten voidaan nähdä kuviossa 3F, TGF-β-jentymisen on suurempi HCC4006ER soluissa kuin vanhempien soluja stimuloidaan TGF-β riippumatta läsnä erlotinibin (kuvio 3F). *

P

*

P