Krooninen sairaus

tiivistelmä

rooli peroksisomiproliferaattorin – aktivoitu reseptori δ (PPAR δ) -geenin paksusuolen syövän synnyn edelleen hyvin kiistanalainen. Täällä, loimme nude-hiiriin ksenograftimallia käyttäen ihmisen koolonisyöpäsolulinja KM12C joko PPAR δ vaiennetaan tai normaali. Vierassiirrännäiset PPAR δ-vaiennettu ryhmä kasvoi huomattavasti suurempia ja raskaampia vähemmän erilaistumista edistetty soluproliferaatiota, lisääntynyt ilmentyminen verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) ja niiden kaltaiset apoptoosin indeksi verrattiin PPAR δ-normaali ryhmä. Sen jälkeen käsitelty erityisen VEGF-estäjä bevasitsumabi, kapasiteetin kasvun ja leviämisen -ksenografteja väheni molemmissa ryhmissä samalla merkitsevästi suurempi PPAR δ-vaiennettu ryhmä kuin PPAR δ-normaali ryhmä. Anto PPAR δ agonistin merkittävästi vähentynyt VEGF ilmentymisen PPAR δ normaalia KM12C soluissa, mutta ei PPAR δ-vaiennetaan soluissa. Nämä havainnot osoittavat, että knockdovvn PPAR δ edistää kasvua paksusuolensyöpä indusoimalla vähemmän erilaistuminen nopeuttaen leviämisen ja VEGF ilmentyminen tuumorisoluissa in vivo, ja vähentää kasvaimen herkkyyttä bevasitsumabi. Tämä tutkimus osoittaa, että PPAR δ vaimentaa paksusuolen syövän syntymistä.

Citation: Yang L, Zhou J, Ma Q, Wang C, Chen K, Meng W, et al. (2013) knockdovvn PPAR δ Gene edistää kasvua Colon Cancer ja Vähentää Herkkyys Bevasitsumabilla nude-hiirissä Model. PLoS ONE 8 (4): e60715. doi: 10,1371 /journal.pone.0060715

Editor: Alan P. Fields, Mayo Clinic College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 02 maaliskuu 2013; Julkaistu: 08 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat tunnustaa apurahan tuella Natural Science Foundation of China (nro 30801332; https://www.nsfc.gov.cn/), Ph.D. Ohjelmat Säätiö Opetusministeriön Kiinassa (nro 200806100058, https://www.chinapostdoctor.org.cn/), ja ruotsalainen Syöpäsäätiön (https://www.cancerfonden.se/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peroksisomiproliferaattorin – aktivoiman reseptorin-δ (PPAR δ), jäsen ligandin aktivoimien PPAR ytimen reseptorin perhe [1], ilmentyy kaikkialla useimmissa kudoksissa ja erittäin ilmaistaan ​​epiteelin, erityisesti ihon ja suoliston [2], [3]. Vastaavia muita nukleaarihormonireseptorit, PPAR δ heterodimerizes kanssa retinoidi-X-reseptori ja vaikutusmekanismien kautta geenien transkription säätelystä kun ligandin sitoutumisen [4]. Paras-ominaista roolia PPAR δ mennessä on säädellä rasva-aineenvaihduntaan ja energian homeostaasiin, kuten asiakkuutta käänteinen kolesterolin, ylentävä HDL-, lisäämällä rasvahappojen hapettumista ja energia irrotuksen [5], [6]. Lisäksi PPAR δ on myös osallisena alkion istutusta, haavan paranemista, tulehdusvastetta, endoteelisolujen proliferaatiota, angiogeneesiä, ihon ja paksusuolen ja peräsuolen syövän synty [7], [8].

Toisin kuin hyvin tunnettu roolit PPAR δ aineenvaihduntaan ja energinen homeostaasin, rooli PPAR δ peräsuolen syövän synnyn edelleen epävarmaa. Jotkut tutkimukset antavat todisteita siitä, että PPAR δ edistää kasvainten synnyssä, kun taas toiset tuottavat ristiriitaisia ​​tuloksia, kuten olemme aiemmin arvioitu [9]. Nämä ristiriitaisia ​​tuloksia sanella tarpeen tutkia tarkemmin toiminta PPAR δ synnyssä paksusuolen syövän. Viime aikoina olemme onnistunut PPAR δ-knockdown malleja koolonsyöpäsolulinjaa (KM12C jne) by lentivirusta välittämä RNA häiritsevää (RNAi) [10]. Huomasimme, että PPAR δ Knockdown merkittävästi indusoi vähemmän erilaistumista ja edistänyt näiden solujen [9], [10]. Nämä havainnot osoittavat, että PPAR δ voi olla tuumorisuppressorina rooli helpottamalla erilaistumista ja estämällä leviämisen paksusuolensyöpä. Kuitenkin puuttuu edelleen in vivo kokeessa todistamaan Nämä in vitro löydökset. Jos haluat tiukemmin määrittää PPAR δ rooli peräsuolen syövän synnyn, tutkimme vaikutus PPAR δ Knockdown annetun nude-hiirissä ksenografteissa perustettu KM12C solujen tässä tutkimuksessa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

ihmisen koolonisyöpäsolulinja KM12C (professori IJ Fidleriltä, ​​Anderson Cancer Center, TX), hoitamaton tai käsitellä lentivirusta välittämä RNA häiritsevää (RNAi) vastaan ​​PPAR δ geenin meidän edellisen tutkimuksen [10], käytettiin. Soluja ylläpidettiin Eaglen minimal essential (MEM), jossa oli Earlen suolat, L-glutamiinia ja ei-välttämättömiä aminohappoja (Sigma-Aldrich), jota oli täydennetty 1,5% NaHCO 3, 1 mm Na-pyruvaattia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1 x MEM-vitamiini Solution (Invitrogen), 1% penisilliini-streptomysiiniä (Invitrogen), 1 ug /ml puromysiinille (vain käsiteltyjen solujen säilyttämiseksi puhtaus) ja 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen). Ilmaisu PPAR ö on vakaasti vaiennettu soluissa käsiteltiin lentivirusta välittämä RNAi kuten tarkasteltu edellisessä tutkimuksessa [10].

perustaminen Kasvain nude-hiirissä

Neljäkymmentä-kahdeksan naispuolinen karvattomia hiiriä kuuden viikon ikäisiä ostettiin Sichuanin yliopiston Laboratory Animal Center (Chengdu, Kiina). Hiiriä seurattiin 7 päivää tavanomaisella eläinten hoito yksikkö ennen tutkimuksen alkua.

Hiiret nukutettiin intraperitoneaalisena injektiona pentobarbitaalia (65 mg /kg, Catalogue No.p3636, Sigma-Aldrich, Ruotsi). KM12C solut joko pysyvästi vaiennettu PPAR δ tai käsittelemättömiä injektoitiin sitten ihonalaisesti (2 x 10

6 solua /hiiri 100 ui PBS) oikeaan kylkeen kunkin hiiren (24 hiirtä ryhmää kohti). Kaksikymmentäneljä tuntia inokulaation jälkeen, kaksitoista satunnaisesti valittua hiiret kussakin ryhmässä injektoitiin bevasitsumabi (Avastin ™, Genentech, CA) häntälaskimon kautta 5 mg /kg kehon painoa. Kasvaimen kasvua seurattiin säännöllisin väliajoin mittaamalla kaksi kasvaimen halkaisijaa käytetään sähköistä jarrusatulat. Kasvaimen tilavuus laskettiin seuraavalla kaavalla: (pituus x leveys

2) /2. Hiiret tapettiin 25 päivää inokulaation jälkeen, ja kasvaimet kiinnitettiin 10% neutraaliin formaliiniin. Menettelyt operoitiin sokkona yhden tutkijan (L. Yang) ilman tietoa ryhmittelyinformaatiota.

Eettinen lausunto: Eläinten käsittely toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas Care ja laboratorioeläinten käyttöä National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi hyväksymä Animal Experimental eettisen komitean Sichuanin yliopistossa. Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) Värjäys

ksenografteja Hiirten säännöllisesti upotettu Paraffinum ja sitten leikattiin jonka paksuus on 5 um. Osat poistettiin parafiini ksyleenillä, niihin lisätään etanolia, huuhdeltiin tislatulla vedellä, ja sitten kiinnitettiin 4% formaldehydiä, värjättiin Ehrlichin hematoksyliinillä ja eosiinilla (Sigma-Aldrich), jota seurasi nestehukan arvostellaan alkoholia. Objektilasit kiinnitettiin ja analysoitiin valomikroskoopilla.

immunohistokemiallinen määritys (IHC) B

immunostaings suoritettiin 5 um parafinoidut kohdat aiemmin raportoidun [9]. Ensisijainen vasta-aineet olivat kanin polyklonaalista anti-PPAR δ IgG (ARP37889, Aviva Systems Biology, CA), anti-Ki67-Ig G (ab15580, Abcam, MA) ja hiiren monoklonaalinen anti-VEGF-IgG: tä (ab68334, Abcam, MA). Envision System Labelled Polymer-HRP Anti-Rabbit (DakoCytomation, CA) käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Osiot tiedetään osoittaa positiivista värjäytymistä varten PPAR δ, Ki67 tai VEGF sisällytettiin jokaisen ajon vastaanottaa joko ensisijainen vasta-ainetta tai PBS, kuten positiivisia tai negatiivisia valvontaa. Kaikissa värjäysmenetelmistä, positiivisesta kontrollista osoitti selkeän värjäytymistä, kun taas ei ollut värjäytymistä negatiivisessa kontrollissa.

IHC kalvot tutkittiin itsenäisesti sokkona kaksi tutkijaa (LY ja JZ) tietämättä ryhmittymän tiedot. Tutkijat teki kullekin osiolle värjäytymisintensiteettiä kasvainsolujen seuraavasti: 0 (negatiivinen värjäytyminen), 1 (heikko värjäytyminen näytteillä vaaleankeltaista), 2 (kohtalainen värjäytyminen näytteillä keltainen ruskea) ja 3 (voimakas värjäytyminen näytteillä ruskeana) . Jotta vältettäisiin keinotekoinen vaikutus, solut marginaalissa jaksoissa ja heikoilla morfologia ei laskettu. Niissä tapauksissa, joissa värjäytyminen pisteet olivat poikkeavia tuloksia, yksimielisyyteen pisteet päästiin uudelleenarvioinnin.

solukuoleman Detection

taso apoptoosin määritettiin terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasi (TdT) – välittämää dUTP nick end-merkintöjä (TUNEL) määritys käyttäen In situ Cell Death Detection Kit (Catalogue No. 11684817910, Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) noudattaen valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, leikkeet de-paraffinized, vedettömät, läpäiseviksi ja tasapainotettiin. Sen jälkeen leimausreaktion, tulokset arvioitiin käyttäen Leica DM IL HC fluoresenssimikroskoopilla. Yhteensä soluja tarkasteltiin at 330-380 nm DAPI värjäystä, ja apoptoottisia soluja tarkasteltiin at 465-495 nm FITC värjäystä. Osiot lisäämättä TdT- tai vastaanottaa DNaasi I sisällytettiin kussakin ajossa negatiivisina tai positiivisina kontrolleina vastaavasti. Kunkin näytteen viisi korkean tehon kentät (x 200) valittiin satunnaisesti, ja apoptoottisten solujen määrässä laskettiin kunkin kentän. Apoptoosi-indeksi (AI) = sellaisten positiivisten solujen määrä /koko soluja.

Reaaliaikainen Reverse-transkriptio (RT) PCR

Yhteensä RNA uutettiin kasvaimista käyttämällä TurboCapture mRNA Kit (Qiagen , Saksa), jota seurasi käänteistranskriptio High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, CA). MRNA: t, jotka koodaavat VEGF, Ki67, adiposyyttien erilaistumiseen liittyvä proteiini (ADRP), maksan rasvahappojen sitovan proteiinin (L-FABP), ja suolen alkalista fosfataasia (ALPI) kvantitoitiin käyttäen reaaliaikaista RT-PCR-analyysi SYBR green havaitsemiseen. PCR-reaktio suoritettiin Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System käyttäen vertailevaa kynnys (Ct) menetelmä (△△ Ct) kuten aiemmin on kuvattu [11]. Käytetyt alukkeet määrittämään mRNA: t luetellaan taulukossa 1. Expression normalisoitiin glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), ja 1 x sekoitus GAPDH-alukkeita (Pre-kehitetään TaqMan Assay Reagents, Applied Biosystems) käytettiin havaitsemiseen . Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena.

mittaus VEGF Tuotanto KM12C Cells

VEGF tuotantoa KM12C soluista mitattiin ihmisen VEGF Kolorimetrinen ELISA Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL). Lyhyesti, KM12C soluja (1 x 10

6), jossa PPAR δ äänieristys tai käsittelemätöntä viljeltiin seerumittomassa väliaineessa 18 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin ajoneuvon tai osoitettu pitoisuus GW501516 spesifinen agonisti PPAR δ (0, 1, 2, 4, 8 uM) 24 tuntia. Supernatantit altistettiin ELISA mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Värin intensiteetti kussakin kuopassa määritettiin mikrolevylukijassa (Anthos htIII, Itävalta) 450 nm: ssä. Kalibrointikäyrät muodostettiin kunkin määrityksen plottaamalla absorbanssin arvo vs pitoisuus kullekin kalibraattorin. VEGF pitoisuudet Sitten näytteet luetaan kalibrointikäyrältä ja normalisoidaan nanogrammaa 10

6 solua.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen merkittävyys määritettiin käyttämällä joko t-testiä, tai soveltuvin rank sum testi, varianssianalyysi (ANOVA) tai chi-square test SPSS 13.0 ohjelmistolla. Suhteellinen ilmentyminen mRNA analysoitiin käyttäen ohjelmistoa REST-XL

© (saatavilla https://www.wzw.tum.de/gene-quantification/), joka perustuu ΔΔCt menetelmään [11].

P

0,05 otettiin merkitsevyystaso. Esitetyt tulokset edustavat vähintään kolmea rinnakkaisnäytettä Jokaisen kokeen suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Tulokset

knockdovvn PPAR δ mainosvideosuosituksia Kasvaimen kasvu ja vähensi Herkkyys Bevasitsumabilla

vaikutuksen tutkimiseksi PPAR δ knockdown kasvaimen kasvua in vivo, meidän ympättiin KM12C soluja joko PPAR δ äänieristys tai normaali nude-hiirissä ja mitataan kasvainten jopa 25 päivää. Kuten kuviossa 1A, kulmakerroin ksenograftissa kasvukäyrän oli korkeampi koko ajan PPAR δ-vaiennetaan ryhmä, ja tämä ero kasvuvauhdin oli tilastollisesti merkitsevä (

P

0,05). Lopussa Kasvujakson keskimääräinen kasvaimen tilavuus oli 2,1 kertaa suurempi Knockdown ryhmässä kuin kontrolliryhmässä (2,8 cm

3 vs. 1,3 cm

3

P

= 0,015; Kuva 1A-C), joiden keskimääräinen paino on 4,0 ± 1,4 g knockdown ryhmässä ja 2,5 ± 0,6 g ohjaus (

P

= 0,021, kuvio 1 D).

(A). Kasvukäyrä ksenograftien. Kunakin ajankohtana vaiheessa vierassiirrännäiset PPAR δ-vaiennettu ryhmä (n = 12) kasvoi merkittävästi suurempia kuin kontrolliryhmässä (n = 12) (*

P

0,05), vaikka käsitellään bevasitsumabi (**

P

0,05) (keskiarvo ± SD, t-testi). (B). Edustava valokuva hiiristä kussakin ryhmässä otettiin 25 päivää inokulaation jälkeen. (C). Ksenografteja kun nude-hiirissä uhrattu. (D) vierassiirrännäiset PPAR δ-vaiennettu ryhmä olivat merkitsevästi painavampia kuin kontrolliryhmässä, kun nude tapettujen hiirten (keskiarvo ± SD; *

P =

0.021; **

P =

0.02 ; t-testi).

arvioimiseksi, jossa yhdistyvät PPAR δ knockdown bevasitsumabiin hoitoon, me pistetään bevasitsumabi hiirille. Huomasimme, että anto Bevasitsumabin vähensi kasvaimen kasvua molempien ryhmien, kun kasvaimia PPAR δ-vaiennettu ryhmä kasvoi huomattavasti nopeammin kuin PPAR δ-normaali ryhmä (

P

0,05; kuvio 1A). Keskimääräinen lopputilavuus kasvainten oli 1,4 kertaa suurempi Knockdown ryhmässä kuin kontrolliryhmässä (0,9 ± 0,11 cm

3 vs. 0,6 ± 0,15 cm

3

P

= 0,033; Kuva 1a- C), joiden keskimääräinen paino on 1,2 ± 0,5 g knockdown ryhmässä ja 0,8 ± 0,2 g valvonnalle (

P

= 0,02, kuvio 1 D).

Euroopan ksenoqraftit kanssa PPAR δ knockdown olivat vähemmän Differentiated

jälkeen Unified standardin kansallisten peräsuolen syövän patologia Research Kiinassa, erilaistuminen kasvaimen arvostellaan prosenttiosuutta rauhasmainen rakenteen komponentit seuraavasti: hyvin erilaistunut ( 95%), kohtalaisen (50 % -95%), heikosti (5% -50%) ja erilaistumaton (alle 5%). HE värjäystä, löysimme huomattavasti vähemmän erilaistunut (huonosti + eriyttämätön) vierassiirrännäiset PPAR δ-vaiennettu ryhmä kuin kontrolliryhmässä (85% vs. 17%,

P

= 0,025) (kuvio 2A, B). Olemme edelleen määrällisesti liittyvien geenien terminaali erilaistumista, ja totesi, että mRNA: t koodaavat ADRP, L-FABP tai ALPI olivat kaikki merkittävästi vähentynyt PPAR δ-vaimennettu ryhmä verrattuna kontrolliryhmään (

P

0,05 ; kuvio 2C).

(A). Edustavia valokuvia ksenograftien HE värjäys. Vierassiirrännäiset PPAR δ-vaiennettu ryhmä (n = 12) olivat ilmeisesti vähemmän eriytetty kuin kontrolliryhmässä (n = 12). × 400 suurennus. (B). PPAR δ- vaiennetaan ryhmässä oli merkitsevästi enemmän vähemmän erilaistunut ksenografteissa kuin kontrolliryhmässä (85% vs. 17%,

P

= 0,025; Chi-square test). (C). Näkyy kvantitatiivisella RT-PCR, koodaavien mRNA ADRP, L-FABP tai ALPI olivat merkittävästi vähentyneet PPAR δ-äänieristys ryhmä suhteessa kontrolliin ryhmään (

P

0,05).

PPAR δ knockdown edisti kasvainsolujen proliferaatio

Olemme aiemmin osoittaneet, että PPAR δ-vaiennetaan KM12C soluilla oli edistänyt kasvua in vitro [9]. Todistamaan sen in vivo, selvitimme ilmaus leviämisen merkki Ki67 että ksenografteissa. Kuten alla IHC määrityksessä PPAR δ-vaiennetaan oli merkittävästi korkeammat ilmaus Ki67 kuin PPAR δ-normaali ryhmä (tuloksen keskiarvo: 3,5 ± 0,4 vs. 2,0 ± 0,6,

P

= 0,026; Kuva 3A, B). Sen jälkeen bevasitsumabi hoito, ilmaus Ki67 oli merkittävästi vähentynyt molemmissa ryhmissä samalla merkitsevästi suurempi PPAR δ-vaiennettu ryhmässä kuin kontrolliryhmässä (tuloksen keskiarvo: 2,3 ± 0,5 vs. 1,2 ± 0,3,

P

= 0,031; kuvio 3A, B). Kvantitatiivinen RT-PCR tuotti yhtäpitävä tulos IHC mitattuna (

P

0,05, kuvio 3C).

(A). Edustavia valokuvia Ki67 ilmentymisen ksenografteissa värjätty IHC. × 400 suurennus. (B). PPAR δ- vaiennetaan ryhmä (n = 12) oli merkittävästi korkeampi pistemäärä Ki67 värjäytymisen kuin kontrolliryhmä (n = 12) (*

P

= 0,026), jopa sen jälkeen käsitellään bevasitsumabilla (**

P

= 0,031) (keskiarvo ± SD, t-testi). (C). MRNA taso Ki67 oli merkitsevästi korkeampi PPAR δ-vaiennettu ryhmä kuin kontrolliryhmässä (*

P

= 0,018), jopa sen jälkeen käsitellään bevasitsumabilla (**

P

= 0,025).

PPAR δ knockdown ei vaikuttanut kasvainsolujen apoptoosin

vaikutus PPAR δ knockdown solujen apoptoosiin tutkittiin TUNEL määrityksessä. Kuten kuviossa 4 on esitetty, merkittävä ero AI ei löytynyt välillä PPAR δ-vaiennetaan ryhmän ja kontrolliryhmän (6,2 ± 4,7% vs. 7,0 ± 3,6%,

P

= 0,81), vaikka bevasitsumabi hoidon ( 10,8 ± 4,1% vs.11.2 ± 2,9%,

P

= 0,75).

(A). Edustavia kuvia kunkin ryhmän. Yhteenlaskettu solut tunnistettiin DAPI tahra, ja positiiviset apoptoosin solut tunnistettiin FITC tahra. × 200 suurennus. (B). Quantitative data apoptoosin indeksi (AI). Ei ollut merkitsevää eroa AI ryhmien välillä, vaikka käsitellään bevasitsumabilla (keskiarvo ± SD, *

P

= 0,81, **

P

= 0,75; t-testi).

knockdovvn PPAR δ aiheuttama VEGF ilmentäminen ksenoqraftit

analysoimiseksi korrelaatio PPAR δ VEGF, me tutki vielä VEGF: n ilmentyminen on ksenografteissa. IHC, huomasimme, että PPAR δ-vaiennetaan ryhmässä oli merkitsevästi enemmän tapauksia, joissa korkea-ilmaistaan ​​VEGF (pisteet ≥2.0) (77% vs. 33%,

P

= 0,03) ja suurempi intensiteetti pisteet kuin kontrolli ryhmä (3,1 ± 0,3 vs. 1,5 ± 0,2,

P

= 0,028; kuvio 5A, B). Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi osoitti, että mRNA VEGF lisättiin merkittävästi PPAR δ-vaimennettu ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään (

P =

0,032; Kuva 5C).

(A). Edustavia valokuvia VEGF ilmentymisen ksenografteissa värjätty IHC. X 400 suurennus; (B). PPAR δ- vaiennetaan ryhmä (n = 12) oli merkittävästi korkeammat pisteet VEGF värjäytymisen kuin kontrolliryhmä (n = 12) (*

P

= 0,028; rank sum test). (C). Kvantitatiivinen RT-PCR tulos (*

P =

0,032).

aktivointi PPAR δ Vähentynyt VEGF ilmentäminen KM 12C Solut

Vahvista yhdistyksen välillä PPAR δ ja VEGF, käsittelimme KM12C soluja GW501516 (erityinen agonisti PPAR δ) tai ajoneuvon ja määrällisesti VEGF solun supernatantti ELISA-määrityksellä. Kuten kuviossa 6 on esitetty, eritystä VEGF oli paljon suurempi PPAR δ-vaiennettu soluja kuin niissä, joilla oli normaali PPAR δ (kontrollisolut) ennen GW501516 antoa (

P

= 0,035). Hoidon jälkeen GW501516, VEGF väheni annoksesta riippuvalla tavalla kontrollisoluissa (

P

= 0,018), kun taas ei ollut merkittäviä muutoksia PPAR δ-vaimennettu solujen pitkin (

P

= 0,83).

KM12C soluja käsiteltiin sarjanumero pitoisuuksilla GW501516 tai ajoneuvon ja soluvapaat supernatantit kerättiin VEGF kvantifiointiin ELISA-menetelmällä. Käsitelty GW501516, ohjaus solut osoittivat annoksesta riippuvaisen laskun VEGF eritystä (*

P

= 0,018), kun taas PPAR δ-vaimennettu soluissa ei ollut merkittävää muutosta pitkin (**

P

= 0,83, ANOVA).

keskustelu

Tässä tutkimuksessa, huomasimme, että vierassiirrännäiset PPAR δ-vaiennettu ryhmä kasvoi huomattavasti nopeammin vähemmällä erilaistumista edistetty soluproliferaatiota kun vastaavat apoptoosin indeksi ja lisääntynyt VEGF verrattiin PPAR δ-normaali ryhmä, riippumatta bevasitsumabi hoitoa. Anto PPAR δ agonistin merkittävästi vähentynyt VEGF ilmentymisen PPAR δ normaalia KM12C soluissa, kun taas ei vaikuttanut, että PPAR δ-vaiennetaan soluissa. Nämä havainnot osoittavat, että knockdovvn PPAR δ edistää kasvua paksusuolensyöpä pienentämällä erilaistumista ja edistää leviämisen sekä VEGF ilmentyminen tuumorisoluissa in vivo, ja vähentää kasvaimen herkkyyttä bevasitsumabi. Nämä tulokset tukevat vaimennin roolia PPAR δ patogeneesissä paksusuolensyöpä.

Tässä tutkimuksessa, meidän havainto, että hiirissä kasvoi merkittävästi suurempia ja raskaampia jälkeen PPAR δ Knockdown osoittaa, että PPAR δ voivat heikentää kasvain kasvua in vivo. Sen mukaisesti tämän toteamuksen, viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että paksusuolen polyyppi muodostumista merkitsevästi enemmän PPAR δ-hiirissä verrattuna villityypin eläimiin [12], [13]. Toisin kuin näiden havaintojen, Park et al. [14] on raportoitu, että PPAR δ-null HCT-116-solut oli heikentynyt kyky muodostaa nude-hiirissä. Toisessa tutkimuksessa todettiin, että PPAR δ on tarpeeton polyyppi muodostumista paksusuolessa APC

min hiiret [15]. Nämä päätelmät perustuvat analyysiin alle 6 hiiret, rajoitetulla tilastollinen voima. Tulos tässä tutkimuksessa sisältyy tietoja yhteensä 48 hiirillä, jotka tarjoavat enemmän lopullista näyttöä toiminnallista roolia varten PPAR δ koolonin karsinogeneesissä.

selvennetään taustalla oleva mekanismi edistää kasvainten kasvua jälkeen PPARd knockdown, me analysoitava tarkemmin erilaistumista, solujen lisääntymisen, apoptoosin ja VEGF ilmaisun ksenografteissa. Huomasimme, että ksenografteista verrokkeja vähemmän erilaistunut histologiaa PPAR δ Knockdown, lisääntynyt ilmentyminen erilaistumisen liittyvien geenien ADRP, L-FABP ja ALPI. Nämä havainnot tarjoavat in vivo todisteita siitä, että PPAR δ voivat helpottaa erilaistumista paksusuolensyöpä. Tämä havainto on johdonmukainen viimeaikaiset tutkimukset, jotka sotkea PPAR δ säätelyssä epiteelisolujen erilaistumisen: aktivointi PPAR δ stimuloi terminaalin erilaistumista sarveiskalvosoluviljelmiä [16] – [18]; PPAR δ edistää erilaistumista Paneth solujen suoliston kryptissa [19]. Viime aikoina, osoitamme, että PPAR δ pudotus indusoi vähemmän erilaistumista koolonsyöpäsolulinjoissa, ja korkea ekspressio PPAR δ liittyy paremmin erilaistumista peräsuolen syöpä [10]. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​in vivo huomautuksensa tässä tutkimuksessa. Asetus erilaistumiseen voi taustalla edistävää vaikutusta PPAR δ Knockdown kasvaimen kasvuun, kuten tässä tutkimuksessa.

Tasapaino lisääntymistä ja apoptoosin on tärkeä rooli valvonnassa kasvaimen kasvua. Etenemisen kasvaimen kasvua on ominaista lisääntynyt proliferaatio ja /tai vähentynyttä apoptoosia, tai molemmat. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että ekspressio Ki67 lisääntyi merkitsevästi, kun kasvainsolujen apoptoosia ei muuttunut sen jälkeen, kun PPAR δ pudotus. Se osoittaa, että PPAR δ pudotus voi edistää proliferaatiota, kun taas ei ole vaikutusta apoptoosin paksusuolen syöpäsoluja. Tämä tulos on yhdenmukainen aiempien havaintojen in vitro, mikä osoittaa, että PPAR δ Knockdown edistää leviämisen HCT-116-soluilla ilman vaikutusta apoptoosin [20]. Epätasapaino lisääntymistä ja apoptoosin vastaa edistänyt kasvaimen kasvun jälkeen PPAR δ knockdown.

Angiogeneesi on yksi tärkeimmistä tekijöistä, kasvaimen kasvu, kasvaimen on stimuloida isännän luoda oman verisuoniston edelleen kasvavan, kun se kasvaa suuremmaksi kuin 1-2 mm

3 [21]. VEGF on liipaisin angiogeneesin ja välttämättömiä verisuonten kehittymisen [22], [23]. Yhdessä VEGF, muiden kasvuun liittyviä geenejä ovat mukana angiogeneesiä. Tuore tutkimus osoitti, että aktivointi PPAR δ säädelty VEGF koolonkarsinoomasoluissa [24], syytetään PPAR δ että angiogeneesi paksusuolen syöpä. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että VEGF: n määrä oli lisääntynyt sekä KM12C solujen ja ksenografteissa jälkeen PPAR δ pudotus, ja laski PPAR δ normaalia KM12C soluissa, kun taas ennallaan PPAR δ-vaimennettu solujen käsittelyn jälkeen GW501516. Se osoittaa, että aktivointi PPAR δ estää VEGF: n ilmentymistä, ja siten ne voivat heikentää angiogeneesiä paksusuolen syöpä. Tämä tulos on yhdenmukainen Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että PPAR δ voi inhiboida verisuonten endoteelisolujen [7], [25], [26]. Edistäminen VEGF-välitteistä angiogeneesiä voi olla toinen tekijä taustalla edistänyt kasvaimen kasvua jälkeen PPAR δ knockdown.

vaikutuksen tutkimiseksi PPAR δ Knockdown on kemoterapeuttinen herkkyys, käsittelimme nude-hiirten kanssa bevasitsumabi. Käsittelyn jälkeen kasvaimen kasvu sekä proliferaatiota ilmeisesti hidastui ja apoptoosi lisääntyi molemmissa ryhmissä, kun taas PPAR δ-vaiennettu ryhmä oli vielä suurempaa kapasiteettia kasvaimen kasvua ja solujen lisääntymistä kuin PPAR δ-normaali ryhmä. Tämä havainto osoittaa, että PPAR δ pudotus vähentää herkkyyttä paksusuolen syöpä bevasitsumabille, taustalla joka voi olla lisääntynyt proliferaatiota ja vähentää erilaistumista kasvaimissa. Se merkitsee myös sitä, että VEGF välittämä reitti ei ole ainoa mekanismi, jolla PPAR δ säätelee kasvaimen kasvua. Tietääksemme tämä on ensimmäinen kerta ilmoittaa vaikutus PPAR δ on kemosensitiivisyys paksusuolen syöpä. Se merkitsee sitä, että paksusuolen syöpä on normaali tai korkea ilmentyminen PPAR δ ehkä parempi vaste bevasitsumabille kuin ne, joilla on alhainen ilmaus PPAR δ. Siten ilmaisu taso PPAR δ voisi olla potentiaalinen teho ennustaja bevasitsumabi, kehittäminen ja soveltaminen PPAR δ-agonistiaineella voi olla lupaava tapa edistää tehoa bevasitsumabin paksusuolensyöpä.

Yhteenvetona osoitamme tässä, että PPAR δ knockdown edistää kasvua paksusuolensyöpä, asiakkuutta vähemmän erilaistumista ja nopeuttamalla solujen lisääntymisen sekä VEGF ilmaisu, kun taas ei ole vaikutusta apoptoosiin, riippumatta bevasitsumabi hoitoa. Ligandin aktivointi PPAR δ vähentää VEGF: n ilmentymistä paksusuolen syöpäsoluissa. Nämä havainnot osoittavat, että PPAR δ voi estää kasvaimen kasvua indusoimalla erilaistumista, lieventävät soluproliferaatiota ja VEGF-välitteistä angiogeneesiä patogeneesissä paksusuolen syöpä, ja helpottaa kasvaimen herkkyys bevasitsumabi. Nämä tulokset tukevat perustelut kehittää PPAR δ agonistit ehkäisyyn ja /tai hoitoon paksusuolen syövän.

Kiitokset

Kiitämme Prof. I.J. Fidler (Anderson Cancer Center, Houston, TX) tarjoamiseen KM12C solulinjan.