Krooninen sairaus

tiivistelmä

aiemmin kuvattu uusi itsemurhan (tai ”solukohtalo- ohjaus ’) geeniterapia entsyymi /aihiolääke järjestelmä perustuu suunniteltu variantti ihmisen tymidylaatin kinaasin (TMPK), joka tehostaa atsidotymidiini (AZT) aktivointi. Toimitus itsemurhageenistä sekvenssin kasvaimia lentiviraalinen transduktion ilmentää syövän geeniterapian että voisi palkata sivullinen soluntappokyky mekanismina ajo merkittävä kasvainregressio

in vivo

. Tässä esittelemme osoiteta huomattavaa sivullisten solutapon

in vitro

ja

in vivo

välittyy TMPK /AZT itsemurhageenille akselilla, joka on riippuvainen muodostumista funktionaalisen kuilu-junktionaalinen solujen välisen viestinnän ( GJICs). Voimistuminen AZT aktivoitumisen muokatut TMPK ilmaistuna ihmisen eturauhassyövän solulinjaa PC-3, johtanut tehokkaaseen sivullisten tappamisen PC-3 soluja, joista puuttuu TMPK ilmaisu – vaikutus, joka voidaan estää, että GJIC estäjä, karbenoksoloni. Vaikka GJICs pääasiassa muodostettu konneksiinit, uuden perheen GJIC molekyylien nimetty pannexins on äskettäin tunnistettu. PC-3-solut ekspressoivat sekä connexin43 (Cx43) ja Pannexin1 (Panx1), mutta Panx1 ilmaisu vallitsevia solukalvolle, kun taas Cx43 ilmentymistä pääasiassa lokalisoitu sytosoliin. Osuus naapurisoluvaikutusten vähentämiseen kiinteän ksenograftien perustettu PC-3-solulinjan arvioitiin eläinmallissa. Osoitamme osuus sivullisten solujen tappamisen kasvaimen taantumisen ksenograftimallia vedoten toimituksen ilmentymisen TMPK itsemurha-geenin kasvaimia suoralla kasvaimensisäistä injektion yhdistelmä-terapeuttinen lentiviruksen. Yhdessä meidän tiedot korostavat, että TMPK /AZT entsyymi-aihiolääke akseli voidaan tehokkaasti hyödyntää itsemurhan geeniterapiassa kiinteiden kasvainten, jossa merkittävä kasvaimen regressio voidaan saavuttaa naapurisoluvaikutusten välittämiä GJICs.

Citation: Sato T, Neschadim A, Lavie A, Yanagisawa T, Medin jA (2013) Engineered tymidylaattisyn- Kinase (TMPK) /AZT entsyymi-Aihiolääke Axis tarjoaa tehokasta Bystander Cell tappaminen Suicide Gene Therapy of Cancer. PLoS ONE 8 (10): e78711. doi: 10,1371 /journal.pone.0078711

Editor: Joseph Najbauer, Pécsin yliopisto Medical School, Unkari

vastaanotettu: 03 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 16 syyskuu 2013; Julkaistu: 23 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Sato et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoitettiin osittain Grant-tuki tieteellisen tutkimuksen (C) (20590533) TS alkaen Japan Society for Promotion of Science (JSPS) ja tutkimuksen avustusta Saito Kiitollisuus säätiötä T.S .. A.N. rahoittivat Kanadan Institutes of Health Research (CIHR) Training Program regeneratiivisen lääketieteen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Geeniterapia lähestymistapoja käyttäen yhdistelmä-DNA-oncoretroviral tai lentivirusvektoreita antaa geenejä, jotka voimistavat eri farmakologisten hoitojen suoraan kiinteitä kasvaimia pitää lupauksen hoitaa kiinteitä pahanlaatuisia kasvaimia, jotka ovat vaikeita poistaa kirurgisesti, kuten syöpä vaivaava aivoissa [1]. Itsemurhan syövän geeniterapian (SGTC), jota kutsutaan myös geeni-suunnattu entsyymin aihiolääketerapia (GDEPT), tyypillisesti tukeutuu kasvaimeen toimittamisen itsemurhan geenien, jotka helpottavat selektiivistä ja paikallinen aktivoimalla tiettyjä aihiolääkkeitä niiden sytotoksinen efektorisolujen johdannaiset. Transcriptional- ja pseudotyyppi perustuvaa kohdentamista virionien syöpäsoluja edelleen laajentaa mahdollisia sovelluksia sisällyttää etäpesäkeleesioita ja laajentaa toimitustapa systeemistä antoa [2,3]. Merkittävä liittyvät haasteet tuottaa itsemurhan geeni jokaisen pahanlaatuisten syöpäsolujen usein voittaa luottamalla sivullisten solujen tappaminen tai naapurisoluvaikutusten, jotka luovat paikallisia tapon ympäröivällä onnistuneesti transdusoidut kasvainsolut että toiminnallisesti ilmentävät itsemurhageenille mikä parantaa yleinen SGTC teho [4].

Useat itsemurha geenejä on ominaista ja arvioitu tähän mennessä suhteessa niiden hyödyllisyys SGTC. Niistä, herpes simplex virus-johdetut tymidiinikinaasin (HSV-tk) on yksi laajimmin tutkituista itsemurha geenit SGTC [5]. HSV-tk ja eri katalyyttisesti-avusteinen mutantteja Tämän entsyymin on laajalti käytetty itsemurha geeni yhdessä guanosiini analoginen, gansikloviiri (GCV), hoitoon eri syöpiä [1,6]. HSV-tk muuntaa myrkyttömiä GCV osaksi GCV-monofosfaatti (GCV-MP), joka on edelleen fosforyloituu solukinaasien tuottaa myrkyllisiä metaboliitti, GCV-trifosfaatti (GCV-TP), joka estää isäntäsolun DNA-replikaatioon tuloksena induktio apoptoosin [7]. Sivustakatsoja vaikutuksia on hyvin tunnettu HSV-tk /GCV itsemurha geeniterapian järjestelmä, ja ne ajatellaan kuuluvan levittämisen aktivoitua GCV, joko mono- tai moninkertaisesti-fosforyloitu muotoja, HSV-tk-ilmentävien solujen sivustakatsoja soluihin aukko-liitoskohtien solujen välisen viestinnän (GJICs), jotka yhdistävät sytosoleissa vierekkäisten solujen monia kiinteitä kasvaimia ja voidaan vaihtaa pienen molekyylipainon metaboliitteja diffuusion [8]. Useat tekijät rajoittavat yleistä tehokkuutta HSV-tk käytettäväksi SGTC lukien: huono aktivoituminen GCV HSV-tk osaksi sytotoksiseen muotoon, liittyy ensisijaisesti nopeutta rajoittava vaihe GCV aktivointi on fosforylaatio GCV-MP osaksi GCV -DP solukko guanylate kinaasi (GMPK) [9]; rajoitettu sytotoksisuuden GCV, erityisesti vastaan ​​hitaasti kasvavia kasvaimia, otetaan huomioon maan rajalliset vaikutusmekanismi perustuu yksinomaan DNA: n replikaatiota [10]; ja lopuksi huono lipofiilisuutta GCV mikä vähentää naapurisoluvaikutusten ja huono kyky läpäistä veri-aivoesteen mikä rajoittaa sovellettavuutta aivoissa kohdistetuissa SGTC [11]. Yhdessä SGTC lähestymisiä käyttäen HSV-tk /GCV akseli siis rajoittaa rajallinen sytotoksisuuden ja ongelmia tehokkaasti annostelusta GCV, joilla voi olla käytettävä pitoisuuksilla, jotka ovat systeemisesti myelosuppressiivisten saavuttaa merkittäviä kasvain ablaatio.

Olemme aikaisemmin kuvatun vaihtoehtoisen entsyymin aihiolääkkeen järjestelmiä itsemurhan (tai ”solun kohtalon ohjaus”), geeniterapia [12,13], joista käytetään katalyyttisesti-parannettu variantti ihmisen tymidylaattisyn- kinaasin (TMPK-F105Y), joka on otettu käyttöön voimistavan nopeaa käyttöönottoa aihiolääke atsidotymidiini (AZT) [12]. Katalyyttisesti, villityypin TMPK on suhteellisen hidas fosforylaatiota AZT monofosfaatti, joka on pullonkaula vaihe sen aktivaatioreitin nisäkässoluissa. F105Y-mutaation, hyväksyi vertailun perusteella homologisen alueen hiivan TMPK sekvenssin, johtaa variantti entsyymi, joka on paljon vakaampi on fosforyloimaan AZT monofosfaatti ja vähemmän aktiivinen sen luonnollisen substraatin, ty- monofosfaatti [14]. Tämä uusi itsemurha geeniterapian akseli hyödyntää ihmisen alkuperä entsyymi minimaalisella mahdollisesti haitallisia immuunivasteita kohdistuu siirtogeeni, kun havaitaan HSV-tk-lähestymistapoja. Se hyödyntää myös entsyymin, joka on katalyyttisesti vankka ja toimii on nopeutta rajoittava vaihe AZT aktivoinnin. Edelleen, se hyödyntää aihiolääke, jonka sytotoksiseen muotoonsa voi tehokkaasti kohdistaa sekä jako- ja ei-jakautuvia soluja, koska kaksi eri sytotoksisuuden mekanismien [12]. Lopuksi, se hyödyntää aihiolääke, joka on parempi lipofiilisyys profiilin ja on todennäköisesti paremmin soveltuu käytettäväksi SGTC. Erityisesti, AZT arvioidaan olevan ainakin 30-kertaa enemmän lipofiilinen kuin GCV [11], joka ennustaa paremmin passiivisen diffuusion ja kasvoivat soveltuvuus AZT aihiolääke itsemurhageeni kiinteiden tuumorien hoidossa, samoin kuin parempi toimituksen aihiolääkkeen, että aivot, esimerkiksi. Koska nämä parempia ominaisuuksia TMPK /AZT itsemurha geeniterapian akseli, ryhdyimme sopivuuden arvioimiseksi tämän järjestelmän ja suuruus naapurisoluvaikutusten se synnyttää vuonna SGTC.

Tässä tutkimuksessa raportoimme että jatkuva ilmaus katalyyttisesti tehostetun, AZT-aktiiviset TMPK variantti, TMPK-F105Y, ihmisen eturauhasen syöpä syöpäsolu linja, PC-3, transduktiolla lentiviraalinen konstruktioita helposti herkistää näiden solujen hoidon AZT ja helpottaa parannettu solu tappaminen kautta sivustakatsoja vaikutuksia sekä

in vitro

ja

in vivo

. Osoitamme, että sivullinen tappava vaikutus, havaittu AZT hoito, on pitkälti riippuvainen olemassaolo funktionaalinen GJICs ja lakkautetaan käsittelemällä aukkoliitos estäjä. Lisäksi osoitamme Pannexin1, eikä Connexin43, todennäköisesti muodostaa toiminnallisen aukkoliitokset välillä PC-3-solut. Nämä tulokset korostavat hyödyllisyyttä lentivirus välittämän SGTC perustuu muunnetun-TMPK /AZT-järjestelmän ja takaa sen lisäarviointia

in vivo

tietyissä malleissa syövän.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

eläinten koetoimenpiteet seuraa protokollaa hyväksymä Animal Care komitean University Health Network (Toronto, oN, Kanada). Eläimet säilyivät Animal Resource Centre Princess Margaret Hospital (Toronto, ON, Kanada).

Soluviljely

Ihmisen eturauhasen adenokarsinooma PC-3 solulinja saatiin American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA) ja pidettiin RPMI: ssä (Roswell Park Memorial Institute) -1640 väliaineessa (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japani), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; PAA Laboratories GmbH, Pasching , Itävalta), 100 yksikköä /ml penisilliiniä (Nakalai Tesque, Inc., Kioto, Japani), 100 ug /ml streptomysiiniä (Nakalai Tesque, Inc.), ja 250 ng /ml amfoterisiini B: tä (Nakalai Tesque, Inc. ) on 37 ° C, 5% CO

2 ilmakehässä vakiokosteudessa. Ihmisen alkion munuaisesta peräisin 293T-solulinja saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) ja pidettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (D-MEM, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), jota oli täydennetty 10% FBS: ää , 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, ja 2 mM L-glutamiinia (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Rekombinantin LV /TMPK ja transduktio PC-3-solujen

Menettely tuotantoon rakkulasuutulehdusvirusta-glykoproteiinia (VSV-g) -pseudotyped rekombinantti lentivirus raportoinut aiemmin meidän ryhmä [12], käytettiin pienin muutoksin. Lyhyesti, transfektio kolme plasmidien (pHR ’geeni-siirron plasmidi, pakkaus plasmidi pCMVR8.91, ja vesicular stomatitis -viruksen glykoproteiini-vaippaa koodaavan plasmidin pMD.G) 293T-soluihin suoritettiin käyttäen polyetyleeni-imiini (PEI)-menettely [15 ] ja virus supernatantit kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen, suodatettiin 0,45 um: n suodattimen, ja konsentroidaan 50000 x g: ssa 2 tuntia. PC-3-solut infektoitiin konsentroidun viruksen kantojen läsnä ollessa 8 ug /ml protamiinisulfaattia. Infektoidut solut olivat sitten yksisoluiset kloonattiin rajoittavalla laimennuksella. Ilmentymistä transdusoidut PC-3-solujen vahvistettiin Western blot -analyysillä käyttämällä kanin anti-humaani TMPK (ystävällisesti toimittanut Dr. Manfred Konrad, Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Saksa). Tätä analyysiä varten, kokosoluliuotteista erotettiin 12,5% natriumdodekyylisulfaattia polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja blotattiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) suodattimen (Millipore, Billerica, MA). Membraani blokattiin 0,5% rasvattomalla rasvatonta maitoa 20 mM Tris-puskuroitua suolaliuosta, jossa oli 0,05% Tween-20, pH 7,4 (TBS-T, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Membraani tutkittiin kanin anti-humaani-TMPK (laimennettu 1: 5000), ja sitten sopiva piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (laimennettu 1: 5000, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Equal Proteiinilisäyksen varmistettiin hiiren anti-GAPDH vasta-ainetta (laimennettu 1: 5000, Ambion. Austin, TX, USA). Kalvot, seuraava kehitys kanssa Immobilon Länsi Kemiluminesenssiin HRP-substraattia (Millipore, Billerica, MA, USA), oli kuvattu käyttäen LAS-1000-järjestelmä (Fuji Film Corp., Tokio, Japani) veloitetaan-pari laitteen kameralla. Expression tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin (eGFP) on transdusoitu yksisoluiset klooneja vahvistettiin havaitsemiseen virtaussytometrialla (FACS Canto II, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

Värinsuoia määritys käyttämällä virtaussytometria ja konfokaali mikroskooppinen tarkkailu

calcein merkintöjä, soluja kasvatettiin puolittain yhtymäkohta pestiin kahdesti PBS: llä (ilman kalsiumia ja magnesiumia), ja sen jälkeen värjättiin 15 min 20 uM kalseiini-asetoksi metyyli (kalseiini-AM; Doujin Chemical Co., Kumamoto, Japani) liuotettiin PBS: ään (ilman kalsiumia ja magnesiumia). Seuraavat värjäämällä kalseiini, solut pestiin RPMI-1640, joka sisälsi 10% FBS: ää. Sillä PKH26-merkintöjä, solut pestiin PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen liuotinta C (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), jonka tiheys on 10

7 solua /ml ja värjättiin 20 uM PKH26 (Sigma-Aldrich ) liuotettuna Liuotin C: ssa 5 min. Sitten solut pestiin 3 kertaa RPMI-1640, joka sisälsi 10% FBS: ää. Sekä kalseiini-leimattu ja PKH26-leimattujen solujen sekoitettiin ja viljellään yhdessä 6-kuoppaisille levyille (Corning Incorporated, Corning, NY, USA) ja 3 päivää. Värinsiirtoa analysoitiin virtaussytometrialla (FACS Canto II, BD Biosciences) mittaamalla fluoresenssi kalseiinin havaittu 514nm ja PKH26 havaitaan 567nm. Erillisessä kokeessa, 100 uM karbenoksoloni (CBX, Sigma-Aldrich) lisättiin soluviljelmiin tutkia sen kyky estää väriaineen siirtoa. Lisäksi voidaan havaita molekyylejä, jotka osallistuvat aukkoliitos muodostumista immunovärjäyty- PC-3-soluissa suoritettiin. Lyhyesti, PC-3-solut, kiinni Lab-TekII kammio slide (Nalge Nunc International Corp., Naperville, IL, USA), fiksoitiin 4% (paino /tilavuus) formaliiniin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0,1 M fosfaattipuskuri, pH 7,4, ja läpäiseviksi 0,1% (v /v) Triton X-100: ssa 15 min. Sitten soluja blokattiin 5% normaalia vuohen seerumia, ja lisättiin peräkkäin reagoimaan primaarisen vasta-aineen liuosta (1: 100 laimennos PBS: ssä, joka sisälsi 1% naudan seerumin albumiinia (BSA)), 4 ° C: ssa yön yli, minkä jälkeen inkuboitiin PBS: ssä, joka sisältää toissijaisen vasta-ainetta (1: 500 laimennos PBS: ssä, joka sisälsi 1% BSA: ta), joissa on Alexa488 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA) ja vastavärjättiin rodamiinifalloidiinia (Cytskelton, Inc., Denver, CO, USA) 3 h huoneen lämpötila. Vasta-aineet, joita käytettiin tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: kanin anti-connexin43-vasta-ainetta (Signalway Antibody, College Park, MA, USA), kanin anti-pannexin1-vasta-aine (EMD Millipore Corp., Billerica, MA, USA), ja Alexa488-leimattua vuohen anti- -rabbit IgG vasta-ainetta (Molecular Probes, Inc.). Fluoresenssisignaalien analysoitiin käyttämällä konfokaali laser-skannaus mikroskooppi LSM-5 ja LSM System versio 3.98 (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa) Biomedical Research Core of Tohoku University Graduate School of Medicine.

soluproliferaatiomäärityksissä

solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (Corning Incorporated) 5 x 10

5 solua /kuoppa 200 ul: ssa RPMI-1640-väliaineessa, jota on täydennetty kuten edellä on kuvattu, ja inkuboitiin kasvavilla pitoisuuksilla AZT (0, 0,1, 1, 10, 100 uM ja 1 mM, Sigma-Aldrich). Väliaine päivittyvät päivittäin. 4 päivän jälkeen viljelyn, solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (Doujin Chemical Co.). Määrittämiseksi optimaalisen solujen suhteen myöhemmin sivullisten kokeissa, sekä eGFP-ilmentävien solujen ja TMPK-F105Y-transdusoidut solut ympättiin 96-kuoppalevyille eri suhteissa, ja viljeltiin, kun läsnä oli 10 uM AZT varten 5 päivää. Solujen elinkyky määritettiin kuten edellä käyttäen Cell Counting Kit-8 (Doujin Chemical Co.).

Arviointi apoptoosin

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille (Corning Incorporated) 10

6 solua /kuoppa 5 ml: ssa soluviljelyalustaa (RPMI-1640, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, antibiootteja ja antimykootteja, kuten edellä on kuvattu), kanssa tai ilman 10 uM AZT. 4 päivän jälkeen viljelyn, anneksiini V-värjäys suoritettiin valmistajan protokollan (anneksiini V-APC, BD Pharmingen, San Diego, CA). Vahvista vaatimus GJICs varten sivullisten tappamisen aiheuttama AZT, 100pM karbenoksoloni (CBX, Sigma-Aldrich) lisättiin samanaikaisesti AZT kulttuuriin. Suhteellinen apoptoottista indeksit laskettiin normalisoitu suhteet apoptoosin AZT-käsitelty AZT-käsittelemättömiin soluihin. Tutkia osuus liukoisen tekijät erittää AZT-käsitellyistä soluista, villityypin PC-3-soluja viljeltiin 5 päivää, että elatusaine kerätään villityypin TMPK tai TMPK-F105Y-ilmentävien solujen, joita oli käsitelty 10 uM AZT ja 5 päivää, jonka jälkeen arviointi apoptoosin näissä soluissa kuten yllä.

reaktiivisen hapen (ROS) määritys

Generation solunsisäisen reaktiivisen hapen (ROS) seurattiin dihydroethidium ( DHE) menettely [16]. Lyhyesti, sen jälkeen, kun osoitetun hoidon ajankohtina, soluja inkuboitiin edelleen kanssa DHE (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa pimeässä. Fluoresenssiemissiovoimakkuudessa 525 nm: ssä (seuraavat viritys 488 nm) mitattiin virtaussytometrillä (FACS Canto II, BD Biosciences). Muutos keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus (MFI) näytteiden mitattuna kussakin testiryhmässä ilmaistiin prosentteina DHE fluoresenssin käsittelemättömien kontrollisolujen.

arviointi sivustakatsojavaikutus in vivo jälkeen kasvaimeen injektion LV /TMPK

Ei-liikalihava diabeettinen /sekamuotoinen immuunipuutos (NOD /SCID) hiiriä (5-8 viikkoa vanhoja, ostettu Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) säilyivät Animal Resource Centre Princess Margaret Hospital (Toronto , ON, Kanada). Eläimet injektoitiin päivänä 0 heidän oikeaan selkäpuolen kylkeen 4×10

6 LV /eGFP Transdusoimattomia PC-3-solut, suspendoitiin 200 ul: aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS). Noin 10 ui LV /TMPK-F105Y (1.5×10

8 IU /ml) valmistetta injektoitiin kasvaimen päivänä 11. Eläimiä lääkettä saaneissa ryhmissä sai annoksen 50 mg /kg /päivä AZT intraperitoneaalisesti 6 vuorokautta alkaen päivänä 12. koeryhmät olivat seuraavat: PC-3-TMPK-F105Y käsiteltiin AZT ja PC-3-TMPK-F105Y vehikkeliä (PBS). Eläimet lopetettiin päivänä 18; kasvaimet kerättiin sitten ja punnittiin.

Tilastot

Tilastollinen merkitys ryhmien välillä arvioitiin yksisuuntaisella ANOVA analyyseja Bonferronin post-hoc -testi GraphPad InStat (ver. 3.0a Macintosh; GraphPad Software, San Diego CA).

tulokset

PC-3-solut ilmentävät funktionaalisia GJICs koostuu pannexin1

Gap junktionaalinen solunsisäinen viestintä (GJICs), lisäksi pelissä suora rooli syövän etenemistä [17], pidetään tärkeänä, että sivullinen solun tappaminen vaikutus SGTC sovelluksissa [18]. GJICs koostuvat tyypillisesti proteiinien konneksiini perheen, ja, kuten äskettäin on esitetty, proteiineista ja pannexin perheen sekä [19]. GJICs mahdollistavat passiivisen diffuusion pienten molekyylien (≤1 kDa kooltaan) vierekkäisten, kytkettynä soluja. Ilmaukset avaimen GJIC proteiinien, connexin43 ja pannexin1, vahvistettiin PC-3-solujen Western blot -analyysillä (kuvio 1A); ilmaisuja villityypin TMPK ja TMPK-F105Y vahvistettiin myös analogisesti (kuvio 1 B). Jakauma malleja connexin43 ja pannexin1, määritettynä konfokaali immunofluoresenssimikroskopian avulla analyysi osoitti kuitenkin, että PC-3-solut pääasiallisesti express connexin43 sytoplasman perinuclear osastoissa (kuvio 1 C, vasen paneeli), kun taas pannexin1 oli ensisijaisesti lokalisoitu solukalvon havaittiin täplät ja raitoja, jotka ovat tunnusmerkki GJIC ulkonäkö kuvio (kuvio 1 C, oikea paneeli). Tämä havainto viittaa siihen, että pannexin1 voi hallitsevia connexin43 muodostumista funktionaalisen GJICs tässä eturauhassyövän solulinjassa.

(A) Expression of GJIC komponentteja, connexin43 ja pannexin1, vahvistettiin Western blot on kokosolulysaateista ei-transdusoitujen, LV /TMPK-transdusoitu ja LV /eGFP-transdusoitujen PC-3-soluja. GAPDH ilmentyminen arvioitiin yhtä latauskontrollina. (B) ekspressio TMPK vahvistettiin Western blot on kokosolulysaateista ei-transdusoitujen, LV /TMPK-transdusoitu ja LV /TMPK-F105Y-transdusoitujen PC-3-soluja. GAPDH ilmentyminen arvioitiin yhtä latauskontrollina. (C) Expression pattern of connexin43 (vasen paneeli) ja pannexin1 (oikea paneeli) GJIC komponentit (vihreä fluoresenssi) arvioitiin konfokaali immunofluoresenssimikroskopian avulla. Solun tukirangan (F-aktiini) visualisoitiin rodamiinifalloidiinia (punainen fluoresenssi) värjäystä. (D) Dye siirto calceinia viereiseen PKH26-leimattujen solujen mitattiin virtaussytometrialla suorassa (normaali) tai siirtokuoppaan yhteistyössä viljelmistä PC-3-solujen prosentteina solujen kaksinkertainen positiivisia calcein ja PKH26 fluoresenssi (n = 3) . (E) Dye siirto kalseiinin viereiseen PKH26-leimattujen solujen merkittävästi inhiboi karbenoksoloni (CBX) (n = 3). Tilastollinen merkitys on osoitettu (p 0,0001).

vieressä tutki muodostumista funktionaalisen GJICs PC-3 solujen värinpäästävyyden kokeilu. Kaksi solupopulaatioiden, erikseen ja vakaasti merkitty yksi kahdesta eri värejä (calcein, joka ei ole kalvo läpäisevä ja loukkuun solun sytosoliin, ja PKH26, jossa nimenomaan etikettejä solukalvojen) näytteillä väriaineen siirto 2-päivän yhteis- viljelmillä osoituksena ulkonäkö kaksoislaimennettu leimattujen solujen (kuvio 1 D). Tämä Kalseiiniväriä siirto PKH26-leimattujen solujen tarvitaan suoraa solu-solu-kontakti, kuten väriaineen siirto ei ollut ilmeistä differentiaalisesti leimattuja soluja, jotka oli viljelty transwell (kuva 1D). Lisäksi väriaineen siirto estyi merkittävästi, kun läsnä on erityisiä aukkoliitos estäjä, karbenoksoloni (CBX) (kuvio 1 E). Kollektiivisestikaan tietojen mukaan Kalseiiniväriä siirtämistä PKH26-leimattujen solujen tarvitaan suora solu-solu yhteyttä, ja oli todennäköisesti helpottaa toiminnallisia GJICs.

Evaluation of AZT välittämiä solun tappamista LV /TMPK Transdusoimattomia PC-3-solujen ja sivullisten vaikutukset

PC-3-soluja transdusoitiin lentivirusvektoreita engineering ilmentymisen joko villityypin TMPK tai TMPK-F105Y. TMPK ja TMPK-F105Y ilmentyminen vahvistettiin Western blot -analyysillä käyttämällä kanin anti-humaani TMPK vasta-aineen yksittäisen solun kloonit eristettiin rajoittavalla laimennoksella (kuvio 1 B). Kun taas endogeeninen TMPK ilmentyminen oli havaittavissa ei-transdusoiduilla (NT) solut, merkittävä yliekspressio TMPK havaittu transdusoidut solut. Annoksesta riippuvainen AZT herkkyys PC-3 solun klooneja, jotka ilmentävät villityyppistä TMPK, jotka eivät pysty aktivoimaan AZT merkittävästi, tai AZT-aktiivisen TMPK-F105Y mutantti, arvioitiin soluviljelmässä. PC-solut, jotka ilmentävät TMPK-F105Y mutantti olivat erittäin herkkiä hoidon kasvavien pitoisuuksien kanssa AZT (IC50 1,8 uM) verrattuna ei-transdusoituja soluja tai yli-ilmentävät villityypin TMPK (IC50 1 mM ja 0,1 mM , vastaavasti) (kuvio 2A). Perustuen määritettiin annos-vasteita, annoksella 10 uM AZT valittiin seuraaviin kokeisiin, koska annos, joka oli erittäin tehokas TMPK-F105Y-ilmentäviä soluja, mutta ei esiintynyt havaittavaa toksisuutta ei-transdusoituja soluja tai yli-ilmentävät villityypin TMPK.

(A) annos-riippuvainen solujen tappamista LV-transdusoitujen PC-3-soluja inkuboitiin kasvavien pitoisuuksien AZT (keskiarvo +/- SEM, n = 3). (B) Apoptoosin 10 uM AZT arvioitiin anneksiini V-värjäyksellä käsiteltyjen TMPK-F105Y soluja. (C) Bystander solujen tappaminen arvioitiin suhteellinen arviointi anneksiini V-värjäyksen AZT-käsitelty käsittelemätön sivullisten eGFP-ilmentävät PC-3-solujen virtaussytometrialla suora (normaali) ja transwell co-viljelmistä eGFP-transdusoitu TMPK-WT – tai TMPK-F105-transdusoitujen PC-3-soluja (n = 3). Tilastollinen merkitys on osoitettu (p 0,0001). (D) määrittäminen optimaalinen suhde eGFP ilmentävien solujen TMPKF105Y ilmentävien solujen arvioida sivullisten tappamisen vaikutuksia 10pM AZT (keskiarvo +/- SEM, n = 4; * p 0,05, ** p 0,01 ). (E) Apoptoosin villityypin PC-3-soluista vakioitua elatusainetta AZT-käsitelty villin tyypin TMPK-transdusoitu ja TMPK-F105Y-transdusoitujen PC-3-solujen normalisoitu apoptoosin soluissa, joita käsiteltiin vakioitua elatusainetta AZT-käsittelemättömän soluja (n = 3).

edelleen vahvistaa tietyn apoptoosin induktion TMPK-F105Y-ilmentävien solujen kanssa inkuboinnin jälkeen 10 uM AZT, arvioimme altistuminen apoptoottista markkerin, fosfatidyyliseriini (PS ), solun pinnalla käsiteltyjen solujen värjäämällä APC-konjugoidun anneksiini V-proteiinin. TMPK-F105Y-transdusoidut solut viljeltiin, kun läsnä oli 10 uM AZT, mutta ei muita ohjaus solun ryhmiä, osoitti merkittävän apoptoosin induktio, kuten on esitetty enemmän kuin 3-kertainen nousu apoptoottisen indeksi näiden solujen (kuvio 2B).

arvioimiseksi sivullisten solujen tappaminen välittyy TMPK-F105Y-johdettu aktivointi AZT PC-3-solut, TMPK-transdusoitu ja ei-transdusoitujen ohjaus soluja suoraan viljeltiin yhdessä riippumaton PC-3-solujen muokattu ilmentävät stabiilisti tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin (eGFP). Co-käsitellyt viljelmät AZT arvioitiin anneksiini V (ja 7-AAD) värjäys induktion apoptoosin eGFP-positiivisia PC-3-solujen populaation. Kuten kuviossa 2C (valkoiset pylväät), ainoastaan ​​eGFP-positiiviset sivullisia soluja viljeltiin yhdessä soluja, jotka ekspressoivat AZT-aktiivisen TMPK-F105Y eikä villityypin TMPK osoitti merkittävää kasvua apoptoottisten indeksin yhteydessä AZT hoitoon. TMPK ilmentäviä efektorisolujen ja eGFP: tä ilmentäviä sivullisten solujen tarvitaan suoraa solu-solu-kontakti, koska ei lisää apoptoottisen indeksi sivullisten solujen havaittiin, kun solupopulaatioiden, joissa on erotettu transwell-järjestelmän (kuvio 2C, varjostetut pylväät). Sivullisten tappava vaikutus yhteistyössä viljelmissä, jossa on suhteessa 1: 4 eGFP-ilmentävien solujen (20%) ja TMPK-F105Y-ilmentäviä soluja (80%) oli erittäin merkitsevä johtaa yleisen 80%: n lasku solujen selviytymistä co -cultures seuraavat 5 vuorokauden AZT hoidon (kuvio 2D), mikä viittaa siihen, että voimakas sivullinen tappava vaikutus voitiin havaita. Edelleen vahvistaa, että sivullinen vaikutus havaittiin ei välittämä liukoisia tekijöitä erittyy TMPK-F105Y-ilmentävien, AZT-käsitellyissä soluissa, me viljeltiin ei-transdusoitujen PC-3-solujen käytetty elatusaine kerätään villityypin TMPK tai TMPK-F105Y ilmentävillä soluja käsiteltiin 10 uM AZT varten 5 päivää. Näissä viljelyolosuhteissa, transdusoimattomien PC-3-solut eivät osoittaneet merkittäviä solukuolemaa (kuvio 2E). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että sivullinen tappava vaikutus havaittiin välittyy siirtää sytotoksisten AZT aineenvaihduntatuotteiden mekanismilla, joka vaatii suoran solu-solu kosketukseen.

rooli GJICs välittämisessä sivustakatsoja vaikutus PC-3-solujen

edelleen tutkia mekanismeja sivustakatsojavaikutus havaittu PC-3-solujen helpotti TMPK-F105Y /AZT itsemurha-järjestelmä, arvioimme sivustakatsoja solun tappaminen havaittiin EGFP-positiivisilla suoraan viljeltiin yhdessä TMPK-F105Y-ilmentäviä soluja käsiteltiin 10 uM AZT puuttuessa ja läsnä oli 100 uM tietyn aukkoliitos estäjä, karbenoksoloni (CBX). Lisääminen CBX Yhteispäätösmenettelylle kulttuuri poistettu kokonaan sivustakatsoja soluntappokyky (apoptoottista indeksi 1) (kuvio 3A), mikä osoittaa, että sivullinen vaikutus meidän PC-3 co-kulttuureissa pääasiassa välittyy toiminnallinen GJICs.

(A) Bystander solujen tappaminen arvioitiin suhteellinen arviointi anneksiini V-värjäyksen AZT-hoitoa sivullisten eGFP-ilmentävät PC-3-soluja, viljellään yhdessä TMPK-F105Y-tranduced PC-3-solut, virtaus- cytometry. Co-viljelmiä joko jätetään hoitamatta tai käsitelty pannulla GJIC estäjä, karbenoksoloni (CBX) (n = 3). (B) Taitto-muutos reaktiivisten hapen lajien (ROS) johtuen AZT hoitoon arvioitiin villityypin TMPK ilmentävien ja TMPK-F105Y-ilmentävät PC-3-soluja (n = 3). (C) Käännä muutos reaktiivisten hapen lajien (ROS) johtuen AZT hoitoon arvioitiin eGFP-ilmentävät PC-3-soluja, viljellään yhdessä TMPK-F105Y-tranduced PC-3-solujen kanssa ja ilman karbenoksoloni (CBX ) hoito (n = 3). Tilastollinen merkitsevyys on osoitettu (p 0,0001).

määritetään, että AZT-aktivaation TMPK-F105Y ilmentävien solujen kasvaa reaktiivisen hapen (ROS) tuotanto (kuvio 3B). Koska se on hyvin tiedossa, että ROS tuotanto aiheuttaa usein soluvauriot johtaa solun kuolemaan, me arveltu, että tuotanto ROS voisivat edistää sivullisten solujen tappaminen havaittu tässä järjestelmässä. Todellakin, olemme osoittaneet, että CBX hoito yhteistyötämme kulttuureissa häiritsisivät toiminnallinen GJICs johti vähentäminen ROS tuotetun seuraavista AZT kohtelun sivustakatsoja solupopulaation (kuvio 3C), mikä viittaa siihen, että siirto aktivoitujen AZT aineenvaihduntatuotteiden Bystander soluihin indusoi tuotannon ROS ja mahdollisesti edistää solussa indusoituminen apoptoosin näissä soluissa.

Evaluation of AZT-välitteisen naapurisoluvaikutusten ihmisen eturauhassyövän ksenograftin malleissa in vivo

tehon arvioimiseksi sivullisten vaikutukset indusoidaan TMPK-F105Y /AZT itsemurha-järjestelmä

in vivo

ja soveltuvuutta tämän lähestymistavan SGTC, käytimme PC-3-ksenografti hiirimallissa. Koska heikon transduktion kasvainsolujen vektoreilla engineering ilmaus itsemurha geenien on yleinen rajoitus GDEPT lähestyessä meidän on halunnut tutkia sivustakatsojan vaikutuksia TMPK /AZT itsemurha-järjestelmä ovat riittävän vahvoja mahdollisesti kompensoimaan rajoitukset kasvaimen transduktiotehoja. Tässä NOD /SCID eläimet inokuloitiin subkutaanisesti transdusoimattomien PC-3 kasvaimia, ja sen jälkeen 11 päivää kasvaimen kasvua, palpoitavissa kasvaimia injektoitiin suoraan, kasvaimensisäisesti, jossa ~ 1.5×10

6 tarttuvien viruspartikkelien tekniikan ekspression TMPK-F105Y itsemurhageeni. Alkaen 24 tuntia injektion jälkeen, että virionien, eläimet saivat päivittäin intraperitoneaalisesti injektoimalla AZT (50 mg /kg /päivä) tai ajoneuvon hallinnan 6 peräkkäisen päivän ajan. Hiiret lopetettiin lopussa hoidon aikana, ja kasvaimen kudokset otettiin talteen ja punnittiin.