Krooninen sairaus

tiivistelmä

Noin 500000 yksilöiden diagnosoitu virtsarakon syöpä Yhdysvalloissa rutiininomaisesti kystoskopialaitteita seurantaa seurata sairauden uusiutumisen tai etenemisen, jolloin yli $ 2 miljardia vuosittain menoja. Tunnistaakseen uusia diagnostisia ja seurannan strategioita selvästi tarpeen ja merkkiaineita, jotka liittyvät DNA: n metylaatio muutoksiin hyvin lupaavilta, koska niiden vakautta, objektiivisen, ja tiedossa oleviin tautiin ja sen kliiniset piirteet. Tunnistaa uusia epigeneettisiä markkereita aggressiivinen virtsarakon syöpä, käytimme suurikapasiteettisten DNA metylaatio helmi-array kahteen erilliseen väestöpohjaisen sarjan tapahtumasta virtsarakon syöpä (n = 73 ja n = 264, tässä järjestyksessä). Sitten validoitu yhdistyksen välillä metylaatio näiden ehdokkaan lokusten kasvaimen kolmannessa (n = 245) kautta bisulfiitin pyrosekvensointi ehdokas loci. Array analyysin perusteella tunnistettiin 5 loci edelleen vahvistusta bisulfiitin kanssa pyrosekvensointi. Havaitsimme ja vahvisti, että lisääntynyt promoottori metyloinnin

HOXB2

on merkittävästi ja itsenäisesti liittyvät invasiivisia virtsarakon syöpä ja metylaation

HOXB2

,

KRT13

ja

FRZB

yhdessä merkittävästi ennustaa laadukkaat ei-invasiivisia sairauksia. Metylointi nämä geenit voivat olla käyttökelpoisia kliinisiä havaintoja taudista ja voivat viitata geenejä ja polkuja ansaitsee lisätutkimusten uusina tavoitteita hoitotarkoituksiin.

Citation: Marsit CJ, Houseman EA, Christensen BC, Gagne L , Wrensch MR, Nelson HH, et ai. (2010) tunnistaminen Metyloidut liittyvien geenien Aggressiivinen virtsarakon syövän. PLoS ONE 5 (8): e12334. doi: 10,1371 /journal.pone.0012334

Editor: Michael Freitag, Oregon State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 17, 2010; Hyväksytty: 29 heinäkuu 2010; Julkaistu: 23 elokuu 2010

Copyright: © 2010 Marsit et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat lentoemäntä Medical Research Institute [YCSA 052341 on CJM]; ja National Institutes of Health [R01CA121147, K07CA102327, ja P42ES007373]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kun Yhdysvallat vuonna 2009 arviolta 71000 syöpien virtsarakon diagnosoitiin ja yli 14000 kuolemantapausta syyksi tähän tautiin [1]. Valtaosa kuolemista tapahtuu potilailla, joilla on tapaus korkea vaiheessa, korkealaatuista, invasiiviset kasvaimet että tunkeutua lihaksikas kerrokset virtsarakon. Huono laatu, ei-invasiivisia sairauksia, toisaalta, voidaan hoitaa, vaikka tämä menestys tulee at suurta taloudellista taakkaa terveydenhuollon järjestelmään. Noin 500000 potilaat tarvitsevat valvontaa Yhdysvalloissa saavutetaan arviolta diagnoosi kuolemaan potilasta kohden kustannukset vaihtelevat $ 96.000 ja $ 187.000, mikä johtaa $ 2.2 miljardia vuosittain menoja, mikä virtsarakon syöpä kallein kaikista syövistä [2], [3]. Täten kustannustehokas ennustetekijöiden strategioita arvioidaan tapaus ja uusiutuva sairaus olisi merkittävää kliinisen hyödyn.

Epigeneettiset valvonta DNA ilmaisun on tunnettu ajaa sikiön kehitykseen erilaistumista. Rinnakkaisesti, yhteistuumin geneettisiä tapahtumia (mutaatio, deleetio ja geenimonistukseen) arvellaan, että epigeneettisellä muutokset voivat saostua tärkeitä patologisia piirteitä pahanlaatuisten rappeuma [4]. Virtsarakon syöpä, jossa on erilaiset kliiniset (ja patologiset) fenotyypit, esittelee kasvain malli, joka voi syntyä inaktivoimalla loci että itsenäisesti ohjata taipumus hyökkäyksen ja siten sanella vaiheessa ja arvosana, ja että tämä inaktivoituminen voi tapahtua monin epigeneettisellä prosessit mukaan lukien microRNA muutokset [5], muutokset kromatiinin [6], [7], ja muutokset DNA: n metylaatio [8]. Tässä tapauksessa on mahdollista käyttää epigeneettiset muutokset ja etenkin DNA CpG Metylointia biomarkkereita virtsarakon syöpiä, samoin kuin, mahdollisesti, erilaisia ​​muita ihmisen syövissä [8], [9], [10], [ ,,,0],11], [12], [13], [14]. Microarray perustuvia lähestymistapoja on myös yritetty tunnistaa uusia geenejä, jotka liittyvät invasiivisen sairauden mutta rajoitettu otoskokoja johtuen array strategian palveluksessa [15]. Viimeaikainen kehitys joukko lähestymistapoja mahdollistavat nyt soveltaa näitä tekniikoita väestöpohjaiset epidemiologisiin tutkimuksiin syövän hyödyntämällä suuria määriä näytteitä [16], [17], [18]. On olemassa lukuisia etuja käyttämällä väestöön perustuvaa lähestymistapaa, mukaan lukien vähentäminen bias, enemmän yleistettävyyttä tuloksista, ja pääsy näytteet kattavat kaikki vaiheet ja laatuja kasvain. Siksi olemme hyödyntää tätä array lähestymistapa tunnistaa kliinisesti ja biologisesti informatiivinen malleja ja uusia geenikohteet DNA CpG-metylaation väestöpohjaisen sarjan transitionaalista rakkosolukarsinoomaa.

Tulokset

tunnistaminen ehdokas loci

Hyödynsimme 2-vaiheelta tunnistamiseen ja validointi loci jotka liittyivät kehittämiseen invasiivisen virtsarakon syöpä (kuva S1). Vaiheessa 1, kaksi riippumatonta sarjaa kasvainten (taulukko 1) analysoitiin DNA: n metylaatio array tunnistamaan mahdolliset ehdokas loci ottaa ero metylaatio, ja vaiheessa 2, nämä ehdokkaat vahvistettiin lisäksi sarjassa kasvaimia ei profiloitu jono.

Kaikkialla oli yleinen kasvu metylaation invasiivisia kasvaimissa (kuvio 1A), mikä viittaa siihen, että tämä lähestymistapa on apuohjelma rajaamista tehokkaan biomarkkereita. Yleistetty lineaarinen malli vertaamalla metylaatiotasoilla invasiivisen vs. ei-invasiivisia kasvaimia kussakin lokuksessa vahvisti tämän visuaalisen vaikutelman. Sarjassa 1, 445 CpG loci olivat lisääntyneet voimakkaasti metylaation invasiivisia verrattuna ei-invasiivisia kasvaimet (

Q

0,05), kun taas vain 68 loci oli merkittävästi vähentynyt metylaatio. Samoin sarjassa 2, 606 loci olivat lisääntyneet voimakkaasti metylaatio ja vain 41 oli merkittävästi vähentynyt metylointi (taulukko S1). Mallinnus kunkin sarjan, itsenäisesti, jossa rekursiivisesti jaettiin seos mallit tuotti neljä metylaatio profiilia (kuvio 1B). Erityisesti huomattavasti enemmän invasiiviset kasvaimet olivat metylaatio luokan 4 (P 0,00001, permutaatio chi-neliö).

(A) scatterplot keskimääräisten metylaation beeta-arvot ei-invasiivisia virtsarakon kasvaimet (x-akseli) ja keskimääräinen metylaatio beeta arvot invasiivisia kasvaimia (y-akseli) sarjaan 1 (n = 73) ja sarjan 2 (n = 264) näytteitä. (B) Rekursiivinen osio seos malleja kunkin sarjan johtaa 4 luokat erottaa punaiset pystyviivat, jossa leveys luokat vastaten näytteiden lukumäärää kussakin luokassa. Loci ovat edustettuina rivien keskiarvo metylaation luokan kuvattu. Yllä kussakin luokassa esiintyvyys invasiivisia kasvain (n invasiivisen /yhteensä n) luokan sisällä. Metylointi profiileja merkittävästi erottaa virtsarakkokasvain ulkopuolisten sairastuneiden virtsarakkoepiteeliin (P 0,00001).

tunnistamiseksi loci eniten vankasti liittyy invasiivisia sairauksia, käytimme 3 erillistä, yleisesti käytettyjen tilastollisten lähestymistapoja yksilöidä geenilokusten (kustakin kolmesta tilastolliset lähestymistavat ja koko 2-sarja), että päällekkäin erottamaan invasiivisia ja ei-invasiivisia tauti. Viisi loci (

FRZB

_E186,

HOXB2

_P99,

KRT13

_P676,

RIPK1

_P868,

STAT5A

_P704) havaittiin liittyvän invasiivisen sairauden kaikissa kolmessa tilastollisista menetelmistä.

neljä näistä loci (

FRZB

,

STAT5A

,

KRT13

, ja

HOXB2

), bisulfiitti pyrosekvensointi määrityksiä pystyivät suunniteltava, ja käytettiin vahvistamaan array havainnot osajoukko rakkokasvaimista tutkitaan jono. Pyrosekvensointi määritys

RIPK1

ei onnistunut suunniteltu. Kaikista CpG sivustoja tutkittiin sekä keskimääräisen poikki sivustoja

FRZB

,

KRT13

, ja

HOXB2

, havaitsimme huomattavasti suurempi metylaation invasiivisia verrattuna ei- invasiivisia kasvaimet, sopusoinnussa array tuloksiin (kuvio S2A, S2C, S2D). Sillä

STAT5A

, vahvistimme merkittävästi enemmän metylaation tietyllä CpG mitattuna array, mutta ei noudata tätä yhdistys viereisessä CpG sivustoja (kuvio S2B), ja niin tämä loci ollut edelleen tutkittu.

Käsittelemällä Virtsarakon syövän Cell Line metylointi Inhibitor johtaa Re-ilmentymisen HOXB2

pyrosekvensointi suoritettiin määrittämään metylaatiostatuksen

HOXB2

,

FRZB

, ja

KRT13

virtsarakon syövän solulinjoissa HTB-9 ja UM-UC3. HTB-9 oli HOXB2 metylaation määrin 68,9, samanlainen kuin mitä oli havaittu joukossa ensisijainen virtsarakon tuumorin näytteissä, ja näin ollen valittiin jatkotutkimuksiin. Hoito HTB-9-solujen kanssa 1 tai 2 uM 5-atsa-2′-deoksisytidiinin lisännyt suurempi kuin 100-kertainen ekspression HOXB2 verrattuna mock-käsiteltyjen solujen (kuvio 2).

Kvantitatiivinen RT -PCR-analyysiä käytettiin määrittämään geenin ilmentymisen

HOXB2

ihmisen virtsarakon karsinoomasolulinja HTB-9, seuraavien 5 päivän hoidon 1 tai 2 uM 5-atsa-2′-deoksisytidiinin tai mock hoidon . Pylväät edustavat keskiarvoa kertainen muutos ilmaisun verrattuna mock hoitoa 4 tai 6 rinnakkaisnäytettä kokeita, ja virhepylväät ilmaisevat keskivirheet.

HOXB2 Metylaatio itsenäisesti liittyy invasiivisia virtsarakon syöpä

pyrosekvensointi promoottorin alueet

FRZB

,

KRT13

, ja

HOXB2

suoritettiin riippumaton sarja 263 virtsarakkokasvain potilailla ei ole tutkittu array sekä 4 ei-sairaiden kasvain näytteestä saatujen NDRI. Laajuus metylaation pyrosequenced alueiden ei-sairaiden virtsarakon epiteelin, ei-invasiivisia kasvaimia invasiiviset kasvaimet on kuvattu kuviossa 3, ja paljastaa merkittäviä eroja metylaatio yli 3 luokat kullekin geenien (

HOXB2

P 0,00001,

KRT13

P 0,05,

FRZB

P 0,003, Kruskal Wallis Test). Metylointi

HOXB2

ja

KRT13

ovat kumpikin merkitsevästi enemmän invasiivisia verrattuna ei-invasiivisia kasvaimet (suojattu Wilcoxonin summia testi, P 0,00001 ja P 0,02 vastaavasti). TP53 immunohistokemiallista (IHC) värjäytymisen intensiteetti on aiemmin liittynyt aggressiivisempi sairaus [19], [20], ja me mukana tämän muuttujan, kun suoritimme logistinen regressio ennustamiseen invasiivisia sairauksia, kunkin loci erikseen, dichotomizing metylointi määrin mediaani, ja valvoa muiden mahdollisten sekoittavien tekijöiden. Malleissa ohjattu iän, sukupuolen ja TP53 immunohistokemiallisella värjäyksellä intensiteetti kasvain, vain

HOXB2

promoottori metylointi osoitti itsenäinen yhdessä invasiivisen kasvaimet (taulukko 2). Kasvaimista

HOXB2

metylaatio oli OR 7,7 (95% CI 3,3, 18,2) siitä, invasiivisen kasvain. Tämä tulos kohotti mallissa valvoa kaikkien 3 loci sekä TP53 IHC värjäytymisen intensiteetti ja potilaan iän ja sukupuolen, jossa

HOXB2

metylaatio oli liittynyt 8,6 kertainen lisääntynyt riski joutua invasiivisen kasvain (95% CI 3,4, 21,7).

keskiarvo (täytetty ympyrä) ja 95%: n luottamusvälit laajuudesta metylaation promoottorin alueiden (A)

FRZB

, (B)

KRT13

, ja (C)

HOXB2

on kuvattu (y-akseli) verrattiin ei-sairaiden virtsarakon epiteelin, ei-invasiivisia kasvaimet ja invasiiviset kasvaimet (x-akseli). Erot laajuus metylaation poikki näistä ryhmistä on merkittävästi erilainen (Kruskal-Wallisin testi), ja

HOXB2

(P 0,00001) ja

KRT13

(P 0,04), ja

FRZB

(P 0,003). Vertailut erityisesti invasiivisen verrattuna invasiivisen sairauden paljasti myös huomattavia eroja

HOXB2

* P 0,00001 ja

KRT13

** P 0,02.

metyloinnin HOXB2, FRZB, ja KRT13 liittyvät Aggressiivinen Noninvasiiviset virtsarakon syövän

Koska olemme kiinnostuneita määrittää, kuinka metylaation edistää etenemistä ja aggressiivisuutta kasvainten, tutkimme yhdistyksen välillä metylaatio laajuus ja kasvaimen sisällä ei-invasiivisia kasvaimia. Kuvio 4 osoittaa, että on olemassa huomattavasti enemmän metylaation

HOXB2

(P 0,01),

KRT13

(P 0,01) ja

KRT13

(P = 0,0001) in high grade (3) verrattuna huono laatu (1,2) ei-invasiivisia kasvaimia. Voit hallita mahdollisia sekoittavia, suoritimme monimuuttuja logistista regressioanalyysiä tutkia yhdistyksen välillä geenin promoottorin metylaation laajuus ja kasvaimen. Aluksi me mallinnettu kunkin geenin promoottori erikseen, ja havaittu merkittäviä assosiaatioita

FRZB

(OR 2,9, 95% CI 1,1, 7,9), ja

KRT13

(OR 3,3, 95% CI 1,1, 10,1), mutta vain rajatapaus merkitsevästi yhteydessä

HOXB2

metylaatio ja korkea kasvaimen (OR 2,6, 95% CI 0,9, 6,9, taulukko S2). Sitten tutkittiin lisäaineen vaikutuksia metylaatio näistä 3 loci mallintamalla yhdistyksen välillä metylaatio kaikkien kolmen loci verrattuna, jolla ei yhtään, 1 tai 2 metyloidut ja laadukkaat ei-invasiivisia sairauksia (taulukko 3). Hallittu iän, sukupuolen ja TP53 IHC värjäytymisen intensiteetti, metylaatio kaikki 3 loci liittyi merkittävä 7,4-kertainen kohonnut ollessa korkealaatuista kasvain (95% CI 2,5, 22,1).

Keskimääräinen ( täytetty ympyrä) ja 95%: n luottamusvälit laajuudesta metylaation promoottorin alueiden (A)

FRZB

, (B)

KRT13

, ja (C)

HOXB2

on kuvattu (y-akseli) verrattiin alhainen (1,2) ja korkea (3+) luokka kasvaimet (x-akseli). P-arvot johtuvat Wilcoxonin Rank summat osoittavat, että nämä erot ovat merkittäviä

HOXB2

(P 0,01),

KRT13

(P 0,01) ja

FRZB

( P = 0,0001).

keskustelu

verrattuna geenin ilmentyminen perustuvat markkereita, DNA: n metylaatio kuviot ovat vakaampia ja voidaan havaita käyttäen erilaisia ​​lähestymistapoja, jotka vaativat suhteellisen pieniä määriä potilasaineistojen. Lisäksi nämä merkit voidaan objektiivisesti tunnistaa ja määrällisesti, mahdollisille parannus luotettavuus histologiseen subjektiivinen diagnoosit kuten kasvain laadut tai verrattuna immunohistokemiallisella värjäyksellä kuvioita, jotka ovat riippuvaisia ​​yksittäisistä tulkinnasta voimakkuus ja sijainti värjäystä. Esimerkiksi markkereita tunnistettu ja itsenäisesti validoitu tässä tutkimuksessa ruumassa lupauksen biomarkkereina käyttökelpoisia virtsarakon syövän seulonnan ja seuranta uusiutumisen ja etenemistä ja voitaisiin soveltaa ja testataan kliinistä käyttökelpoisuutta helppo kerätä virtsan sedimentin [9], [10 ], [11], [13], [21]. Lisäksi löytö geenien ja reitit epigeneettiseltä muuttunut rakkokasvaimista esittää uusia kohteita terapeuttiselle interventiolle, varsinkin kun otetaan huomioon huonon ennusteen liittyy invasiivisia virtsarakon syöpiä. Tunnistaminen tärkeitä ja hyödyllisiä DNA: n metylaatio perustuu markkereita ei ole ilman haaste, varsinkin kun ei ole usein korkea korrelaatio näiden muutosten [22]. Siksi asianmukaisia ​​tilastollisia lähestymistapoja täytyy käyttää tutkimaan näitä muutoksia ja tunnistaa ne muutokset, joilla on eniten kliinisen hyödyn. Uskomme, että 2 vaihe lähestymistapa tarjoaa vahvin ja yleistettävissä tunnistaminen DNA: n metylaatio muutoksia, jotka voidaan edelleen tutkia tulevaisuudentutkimusta. Käyttämällä useita erilaisia ​​tilastollisia lähestymistapoja, meidän valinta strategia informatiivinen markkereita pystyimme tunnistamaan hallittavissa olevan potentiaalisesti käyttökelpoisia ja vankka biomarkkereita laboratoriovalidointi sekä replikaation riippumattomia näytteitä. Tärkeintä on, meidän validoinnissa merkkiaineiden riippumaton ryhmä potilaita antaa vakuuttavia todisteita niiden mahdollinen hyödyllisyys ja biologisen merkityksen.

Aiemmat tutkimukset, joissa tutkitaan paneelit kandidaattigeenien ovat tunnistaneet geenejä ja paneelien lokusten jotka ennustavat sekä läsnäolo kasvain tarkasteltuna virtsan sedimentissä [23] ja etenemistä ei-invasiivisia invasiivisen sairauden [15], [24], [25], [26], kun tarkasteltu kasvainkudoksen. Geenit kuten

RASSF1A

,

WR

,

BAMBI

ja

SFRP

perhe on yhdistetty ylempään palkkaluokkaan ja korkeamman vaiheen virtsarakon syöpä [8 ], [27], [28]. Strategiamme ei yksilöinyt näitä erityisiä geenejä, ja tämä ero voi johtua useista eroja lähestymistapamme ja aiemmin käytetty. Olemme käyttäneet väestöpohjaisen tapauksessa sarja näyte, kun taas monet aiemmat tutkimukset ovat käyttäneet sairaalan johdolla mukavuutta sarja, ja näin on saattanut olla jonkin verran vaikutusta käyttöön tutkitut näytteet. Array alusta käytetään tässä tutkimuksessa on rajoitettu, että se tutkii vain osa kaikista geenien ja vain 1 tai 2 erityisiä CpG sivustoja niille geenejä, ja siten ne voivat menetä erityisiä geenejä DNA-kohtien aiemmin kuvattu. Lopuksi meidän analyyttinen lähestymistapa, koska se perustuu tunnistamiseen paneelien geenit voivat tunnistaa eri loci kuin ne, joita käytetään ehdokas analyysit, mutta hypermetylaatiota aiemmin kuvatut ehdokkaita, voi itse asiassa olla korreloi voimakkaasti metylaation tässä identifioitua . Lisätutkimuksia yhdistämällä aiemmin tunnistettu loci omalla uusia tavoitteita prospektiivisessa tavalla tarvitaan enemmän lopullisesti vahvistetaan ne lokusten suurimman kliinisen hyödyn.

biologinen perustuksista noninvasiivisten vielä uusiutuva sairaus versus invasiivisen sairauden vielä voida täysin selvitetty [29]. Tuloksemme osoittavat, että on olemassa suuria eroja metylaatio välillä invasiivisia ja ei-invasiivisia kasvaimia, invasiivisen kasvaimet näytteille yleinen kasvu metylaatio verrattuna ei-invasiivisia kasvaimia. Koska DNA: n metylaatio missä tahansa CpG on binaarinen mitta (joko sytosiini on metyloitu tai ei) ero aste metylaatio saattaa heijastaa mahdollisesti suurempi homogeenisuus valinnassa epigeneettiseltä muuttaa solujen kehitystä invasiivisen sairauden, tuloksena yhdenmukainen meidän edellinen työ tutkii vain rajallinen paneeli geenin promoottorit yhdessä sarjassa rakkokasvaimista [14]. Tämän lisääntyneen metylaatio voidaan ajaa ominaisuudet invasiivisen fenotyypin, tai vaihtoehtoisesti voi olla seurausta valikoivaa paineita, jotka liittyvät tähän fenotyypin. Vaikka lähestymistapa tutkittaessa tapaus tauti voi täysin erottaa näitä mahdollisuuksia, se tarjoaa tietoa kuvaavia kiireellisesti lisätutkimuksia tämän epigenetic ilmiön.

tunnistaminen erityisiä geenejä, joiden DNA metylaatiokuvion liittyy kasvaimen fenotyyppejä, mukaan lukien vaiheessa ja arvosana myös valaisee erityisen tärkeää biologisten prosessien ja väyliä tarvitaan genesis näiden histologisesti määritelty kudosta toteaa.

FRZB

-geeni (tunnetaan myös nimellä

SFRP3

) on jäsen erittyvän frizzled-reseptorin perhe liukoisia proteiineja, joka sitoutuu ja antagonisoi WNT reseptoriin. Me ja muut ovat aiemmin osoittaneet, että hypermetylaatiota

SFRP

geenejä voimakkaasti ja merkittävästi liittyvät invasiivisen virtsarakon syöpä ja vahvistavat tämän reitin tämän fenotyypin [8], [12]. Niistä

SFRP

geenejä, vain

SFRP1

, (lisäksi

FRZB

) on profiloitu on jono, ja on eri CpG sijainti kuin käytettyjen alukkeiden meidän ja aiemmissa raporteissa sen metylaation [8], [30]. Tämä saattaa selittää, miksi tämä loci ei ole yksilöity meidän seulontaan. Muita, enemmän genomisesti tiheä tutkinta WNT -systeemi perusteltua, koska tämä voi ehdottaa uutta reittiä terapeuttiseen interventioon tähän sairauteen.

HOXB2

on jäsen homeobox perheen transkriptiotekijöiden ja koodataan kromosomissa 17 osana geenin klusterin muiden HOX perheenjäseniä. Mielenkiintoista on, huomaamme, että ei-sairastunut virtsarakon epiteelin esiintyy samassa määrin metylaation on

HOXB2

ja

KRT13

kuin ei-invasiivisia sairauksia, kun taas

FRZB

ei -diseased kudos on huomattavasti alhaisempi määrin metylaation kuin joko 2 kasvaintyypeissä. Olemme myös tarkkailla, ihmisen virtsarakon masolulinjassa HTB-9, joka osoittaa määrin metylaation samanlainen kuin havaittiin invasiivisia kasvaimissa, että hoito Metylointilaitteistoon estäjän 5-atsa-2′-deoksisytidiini johtaa lisääntyneeseen ilmentymistä

HOXB2

, mikä viittaa siihen, että metylaatio tämä geeni voi olla toiminnallisesti johtavat tämän geenin. Tulokset

HOXB2

ovat sopusoinnussa kirjallisuudessa, joka on kuvattu bivalenttinen domeenirakenne kromatiiniin homeobox-geenien, jossa sekä pluripotenttien ja terminaalisesti erilaistuneita kudoksen osoittavat merkkejä sekä aktiivisen ja tukahduttavaa chromatin samalla alueella [31 ], [32], ja siten välissä laajuus DNA: n metylaatio. Invasiivinen virtsarakon syövät näyttävät suunnattu hypermetylaation tämän alueen, ilmiö aiemmin raportoitu kaikkialla Polycomb ryhmä kontrolloi geenien peräsuolen syöpäsoluissa [33]. Tällainen ero muuttaminen keskeinen kehityshäiriöitä geeni voi olla kriittinen määriteltäessä fenotyypit näistä kasvaimista ja selittää käyttäytymisen ja lopputulos näiden eri muodoista tämän taudin.

KRT13

koodaa sytokeratiinia-13 jonka on osoitettu olevan erityinen ilmaus kohdunkaulan levyepiteelikarsinooma kasvaimissa ja mucinous kohdunkaulan tyyppi adenokarsinooman [34]; tietojemme mukaan epigeneettiset muutokset tätä geeniä ei ole raportoitu. Epigeneettiset muuttaminen tämän geenin voi vaikuttaa sen ilme kuvio, ja tällaiset muutokset voivat olla merkkejä enemmän de-eriytetty fenotyypin, pidetään ominaista aggressiivinen, korkealaatuista kasvaimet.

Osoitimme riippumattomalla vahvistus sarja kasvainten laajuus metylaation

HOXB2

ja

FRZB

liittyy kasvaimen, ovat toisistaan ​​riippumattomia ja TP53 proteiinin immunohistokemiallisella värjäyksellä. TP53 värjäys on aikaisemmin tutkittu ja on mainostetut hyödyllisenä prognostinen markkeri tässä sairaudessa [35], [36], [37], vaikka on ristiriitaisia ​​tietoja sen hyödyllisyys [36], [38], [39], [40]. Tuore meta-analyysi tutkii sen hyödyllisyys viittaa siihen, että ei ole tarkoituksenmukaista näyttöä siitä käytetään tätä markkeri kliinisesti [20], koska se voi tarjota mitään lisäksi prognostista muita tietoja kuin vahva yhdessä invasiivisen fenotyypin taudin [41], [ ,,,0],42]. Emme voi vielä päätellä, että markkereita löydetty käyttämällä lähestymistapaa mahdu enempää kliinistä hyötyä kuin patologinen luokittelu ja lavastus kasvaimia, mutta uskomme, että tiedot viittaavat tiettyyn solureiteillä jotka häirinnyt tässä sairaudessa. Siten näitä reittejä voitaisiin tutkia tehokkaasti uusina kohteita terapeuttiselle strategioita. Lisäksi ehdotamme, että tulevaisuudessa työtä, tutkia hyödyllisyys näiden merkkiaineiden prospektiivisessa tavalla tarvitaan, koska ne voivat olla hyödyllisiä määritettäessä, mikä kasvaimia voi edetä. Todellakin, nämä merkit saattavat myös edistää kliinistä pyrkimyksiä seurata potilailla, joilla on vähemmän invasiivisia menetelmiä, onko heidän kasvain on uusiutunut tai edennyt, mikä edellyttää enemmän aggressiivinen hoito lähestymistapoja.

Methods

Tutkimus Väestö ja näyte toteaminen

Kaikki TET kunhan kirjallinen lupa hyväksynnän nojalla institutionaalisten tarkastuslautakunta Dartmouth Medical School ja Brown University. Hyödynsimme kaksi, riippumaton, peräkkäisen väestöpohjaisia ​​sarjan virtsarakon syöpätapauksista. Ensimmäinen, joka koostuu kasvainten 344 yksilöiden osallisena tapauskontrollitutkimuksessa tapaus virtsarakon syövän New Hampshire, diagnosoitu välillä heinäkuun 1994 ja kesäkuu 1998 [43], ja toinen, joka koostuu kasvainten 264 yksilöiden diagnosoitu välillä 01 tammikuu 2002 ja 30 heinäkuu 2004 [44]. Vaikka erillinen ajoissa ja laajuus, nämä kaksi tutkimusta hyödynnetään samanlaista rekrytointimenettelyistä ja tutkimushenkilöstön sekä identtiset protokollia toteamiseen patologian materiaalit molekyyli tutkimuksia. Rakkokasvaimista molemmista sarjan tarkisti tutkimuksen patologi (A.R.S.) ja luokiteltu 1973 ja 2004 Maailman terveysjärjestön suuntaviivat rakkokasvaimista. Tutkimuksessa patologi tunnistettu sopiva lohko, josta kasvain näytteet Näissä analyyseissä käytetty saatiin, ja osuus pahanlaatuisia soluja kussakin näytteessä arvioitiin. Kaikki näytteet tutkimisessa käytettävät sisälsi 75% kasvaimen näyte. Karsinooma in situ jätettiin analyysin johtuen vähäisestä otoskoko. Taulukossa 1 kuvataan ominaisuudet aiheita sisällytetään lopulliseen analyysiin. Lisäksi neljä ei-sairaiden virtsarakkoepiteeliin näytteitä saatiin National Disease Research Interchange (NDRI) kaikkea ruumiinavauksen yksilöitä ihmisillä, jotka eivät ole diagnosoitu syöpä.

DNA Extraction ja metylointianalyysi

Kasvain jaksoon, joissa suurimman osan pahanlaatuinen kudos valittiin tutkimukseen patologi käytettäväksi meidän molekyyli- analyysejä. DNA uutettiin ja natriumbisulfiitin muuttaa, kun tavanomaisia ​​menetelmiä, kuten on kuvattu Marsit, et ai. [18]. Kaikkiaan 82 kasvainten ensimmäisestä sarjan ja kaikki 264 kasvaimia toisesta sarjan profiloitiin varten metylaatiostatuksen 1505 CpG loci käyttäen Illumina GoldenGate® metylointi helmi paneelit. Helmi taulukot ajettiin UCSF Institute for Human Genetics, Genomics Core Facility mukaan valmistajan protokollaa ja kuvatun Bibikova, et al. [45].

Tilastollinen

koottu tietoja BeadStudio Metylointi ohjelmiston array valmistaja (Illumina, San Diego, CA) ja laadun arviointi suoritettiin kuten Christensen et al. [16] johti seitsemän näytettä (9%), missä 75% loci oli havaitseminen p-arvo 1 * 10

-5, putoamatta analyysiin. Samanlainen laadunvalvonta CpG loci eliminoida ne lokusten mediaani havaitseminen p-arvo 0,05 (n = 8, 0,5%).

Seuraavat analyysit tehtiin R Package. Koekalastuksen /visualisointia varten, hierarkkinen klusterointi käyttäen Manhattan metriikka ja keskimääräinen sidoksen suoritettiin. Sillä lokukseen locus analyysejä, yhdistykset yksittäiset CpG loci testattiin yleinen lineaarinen malli (GLM). Jos oletetaan, että keskimääräinen beeta-arvot noudattavat beta jakelu [46], lähes -binomiaalimallin (logit linkki, binomiaalinen varianssi, ja ei-asteikko parametri) käytettiin; Huomatkaa, että logit linkin toiminto edellyttää asianmukaista rajoittaa keskimääräisiä beta. Säädä monimuuttujille vuonna skannaamalla 1413 peittyvästi CpG loci, P-arvot assosiaatiot keskimääräinen beeta ja invasiivisen sairauden käytetään vääriä löytö korjausta ja q-arvot lasketaan

qvalue

paketin R. FDR q -arvo 0,05 katsottiin merkitseväksi tutkimiseen.

Random metsät

[47] (https://www.math.usu.edu/~adele/forests/), oli tarkoitus rakentaa luokittelijoiden invasiivisen vaiheen (vs. invasiivisen) CpG keskimääräinen beeta-arvot. Analyysi tehtiin R käyttämällä

randomForest

paketin (versio 4,5-18) mukaan Liaw ja Wiener. Jokaisessa solmussa puu, satunnaisotos

m

ulos koko

M

muuttujat valittiin ja paras split löytyy joukosta

m

muuttujia. Oletusarvo

m

että Random Forest R paketti on. Tässä analyysissä testasimme useita

m myynnissä maassa puolet kahteen kertaan ja käyttää

m

joka antoi alhaisimman ennustevirhe; Tässä tapauksessa

m

= 38. OOB virheprosentti on prosentteina aika RF ennuste on virheellinen. Testi for yhteydestä metylaation (ennustavia) ja näyte tyyppi tehtiin vertaamalla OOB saatu data asetettu nolla jakelun OOB virheet saadaan permutoimalla näytetyyppiä etiketit ja käynnissä RF menettely 100 kertaa. Käytimme myös toisen sarjan 264 kasvainten validointi asettaa, virheen laskemiseksi nopeudella kuin jokainen puu on rakennettu, jotta saadaan arviolta virheprosentti riippumaton ensimmäisen sarjan. Lopuksi, käytimme vaihtelevasti tulokset, prosentuaalinen muutos keskimääräisen neliövirheen (MSE), tunnistaa loci joka oli suurin vaikutus luokitusta, valitsemalla ne loci joiden prosentuaalinen muutos MSE oli yli 5%.

varten päätellä, tiedot on ryhmitelty käyttäen seosta, jossa malli [48] kanssa, seoksen beeta jakaumat [49], ja luokkien määrä määritettiin Bayes tietoa kriteerin (BIC) [50], [51]. Seos malli sovitettiin rekursiivisesti eristämiseen datan käyttäen 2-luokan seos malli, jossa muunnelma BIC käytetään kriteerinä jaetun kuvatulla tavalla [46]. Luokan jäsenyys saatiin seoksesta malliin käyttäen empiirinen Bayes menettelyä, ja myöhemmin yhdistyksille invasiivisia vaiheessa testattiin kautta permutaatio testi 10000 permutaatioista kukin käyttää standardin chi-neliö hyvyys fit testi. Tuotos Seoksen mallien sisältää luokan betakertoimeen jakelu

F

jk

kunkin lokuksen

j

ja luokka

k

. Nämä jakaumat merkitsevät vastaanottimen toiminta käyrä (ROC) erottamiseksi kahteen luokkaan

k

ja

l

suhteella tai, kumpi käyrä yläpuolella identiteettiä linja. Kummassakin tapauksessa alue-alle-ROC (AUC), lasketaan, jota voidaan käyttää määrittämään vaikutuksen locus

j

eroa luokkien

k

ja

l

. Samanlaista menettelyä voidaan käyttää erottamaan luokan

k

muista: käytämme normaaliapproksimaatiota

G

jk

jakelua varten yhdistetyn Muiden kuin

k

, ja laskea. Sitten paremmuusjärjestykseen kunkin lokuksen j sen lasketun AUC

jk, ja valitaan ne, joilla AUC 0,90.

Tunnistaa loci myöhemmin validointi ennustajina invasiivisia vs. ei-invasiivisia sairauksia, me lasketaan risteyksessä että loci jotka olivat merkittävimmät (Q 0,05) locus-by-lokuksen analyysin huippuyliopistoja loci RF analyysi (% muutos MSE 6%), ja käyrän ottaa AUC 0,75 erottamaan luokan kiinnostava verrattuna muihin kussakin kasvain series ja yksilöi ne loci päällekkäin molemmissa sarjoissa.

bisulfiittimodifiointi pyrosekvensointi

kvantifiointi sytosiinin prosentin metylaatio suoritettiin pyrosekvensointi bisulfiitti-muunnetun DNA käyttäen PyroMark MD pyrosekvensointi järjestelmä (Qiagen, Valencia, CA).