Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) ovat lyhyitä (~22 nukleotidiä) sääntelyn RNA: ita, jotka voivat moduloida geenien ilmentymistä ja ovat poikkeavasti ilmaistu monia sairauksia kuten syöpää. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA estävät käännös ja helpottaa hajoamista kohdennetuissa lähetti-RNA: t (mRNA: t) mikä tekee niistä houkuttelevia ehdokkaita käytettäväksi syövän hoidossa. Kuitenkin mahdollinen kliininen hyöty miRNA syövän hoidossa lepää raskaasti kyvystämme ymmärtää ja ennustaa seurauksia vaihtelut tasoilla miRNA puitteissa monimutkainen syöpäsoluja. Arvioidaan ennustavan voiman nykyiset mallit, taso miRNA ja niiden kohdennettua mRNA: t mitattiin laser jää mikro-leikellään (LCM) munasarjasyöpä epiteelisolut (CEPI) ja verrataan tasoja läsnä munasarjojen pinnan epiteelisolujen (OSE). Huomasimme, että ennustettu käänteinen korrelaatio muutosten tasojen miRNA ja tasot niiden mRNA tavoitteiden pidettävät vain ~11% ennustettujen tavoite mRNA: iden. Osoitamme, että tämä alhainen käänteinen korrelaatio muutosten tasojen miRNA ja niiden kohde-mRNA:

in vivo

ei ole pelkästään artefakti epätarkka miRNA kohde ennusteita mutta todennäköinen seuraus epäsuoria solun prosesseja, jotka moduloivat sääntelyn vaikutuksia miRNA

in vivo.

Tulosten korostavat monimutkaisia ​​miRNA-välitteisen asetukseksi

in vivo

ja tarve ymmärtää näiden monimutkaisuus syöpäsoluissa ennen terapeuttista potentiaalia miRNA voidaan täysimääräisesti .

Citation: Shahab SW, Matyunina LV, Mezencev R, Walker LD, Bowen NJ, Benigno BB, et al. (2011) Todisteet monimutkaisuus MicroRNA-säätelyyn munasarjasyövässä: Systems Approach. PLoS ONE 6 (7): e22508. doi: 10,1371 /journal.pone.0022508

Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 27 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 21 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Shahab et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Munasarjojen Cancer Institute, munasarjojen Cycle Foundation, Robinson Family Foundation, The Deborah Nash Willingham Endowment Fund, The Waterfall Foundation ja OBNET Naisten terveydenhuolto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat jäseniä runsas luokan pieni (~22 mukset) sääntelyn RNA: iden uskotaan olevan merkittävä rooli erilaisia ​​biologisia prosesseja ja tauteja sekä kasvien ja eläinten [1]. Viimeaikaisten etua on mahdollinen panos poikkeavasti ilmaisi miRNA syövän aloittamista ja kehitys [2], [3]. Lukuisat

in vitro

tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA kykenevät inhiboimaan käännös ja /tai helpottavat hajoamista [4], [5], [6], [7], niiden suunnattu mRNA: iden tekee niistä houkuttelevia ehdokkaita mahdollista käyttöä syövän hoidossa [8], [9]. Kuitenkin mahdollinen kliininen hyöty miRNA syövän hoidossa lepää raskaasti kyvystämme ymmärtää ja ennustaa seurauksia vaihtelut tasoilla miRNA puitteissa kasvainsolujen

in vivo

. Yleinen odotus, että muutokset tasot miRNA tullaan korreloi käänteisesti (IC) muutoksiin tasoilla niiden mRNA tavoitteet [10], [11], [12], [13], [14] ei ole vielä lopullisesti testattava yhteydessä kasvainsolujen

in vivo.

esimerkiksi edellinen riippumattomia arvioita suhteellisten miRNA tasojen munasarjasyöpiä kontrolleja usein ovat olleet ristiriitaisia, mahdollisesti johtuen eroista näytetyyppiä (

esim

., bulk kudosnäytteet vs. mikro-leikellään solut, jne.), biologinen vaihtelevuus eri syövän alatyyppiä ja yksittäisen potilaan näytteet (

esim

., [15], [16], [17], [18], [19], [20]) tai johtuen epätarkkuuksista ennustaminen mRNA tavoitteet [21], [22].

Kun pyritään vähentämään vaihtelua, joka voi peittää biologisesti merkittäviä suuntauksia, olemme suorittaneet mikrosiru (Affymetrix) analyysit miRNA ja mRNA: iden samasta munasarjasyöpä epiteelin (CEPI) solut eristettiin potilasnäytteistä laser kaapata mikro-leikkely (LCM). Monitoroimme eroista miRNA ilmaisun välillä CEPI ja munasarjojen pinnan epiteelisolujen (OSE) soluja (kerätään munasarjoista normaalin potilasta) ekspressiotasot niiden otaksutun mRNA tavoitteisiin määrittää erilaisilla Ennustusalgoritmien ja kokeellisesti validointi. Vaikka munasarjojen syöpiä voi syntyä joko Fimbriaproteiinia epiteelin munanjohtimen tai OSE, äskettäin on osoitettu, että molemmat luokat solut ovat osa siirtymäkauden epiteelin yhteistä alkuperää ja siten joko voi toimia edeltäjänä CEPI [23]. Koska OSE voidaan korjata pinnalta munasarjat minimaalisella saastumista, ne valitaan tarpeen valvontaa tutkimuksessamme.

Olemme havainneet, että vain ~11% mRNA tavoitteiden näyttämään merkitsevä (p 0,005) muutokset tasot ilmaisun CEPI suhteessa normaaliin olivat IC muutoksia tasoilla niiden säätö- miRNA (p 0,01). Tasot enemmistön (~79%) tavoitteesta mRNA: iden olivat muuttumattomia CEPI loput (~ 10%) mRNA tavoitteet näkyvät muutokset tasot korreloivat positiivisesti (PC) omien säätö- miRNA. Olemme päätellä, että alhainen ennustettavuus miRNA säätelyvaikutukset CEPIssä eristetty potilasnäytteistä johtuu monimutkaisuus miRNA toiminnon

in vivo

.

Tulokset

Suurin osa miRNA differentiaalisesti ilmaistut CEPI suhteessa OSE ovat säädelty

valvomaton hierarkkinen klusterointi ilmentymisen profiilit miRNA huomataan miRChip (Asuragen Inc, Austin, TX) suoritettiin kolme CEPI ja kolme OSE potilaan näytettä (kuva 1, katso taulukko 1 kliiniseen tietoa näytteistä). MiRChip sisältää yhteensä 13349 koettimien lukien 467 annotated ihmisen miRNA (Sanger miRBase v9.2 [24], [25], [26]), 455 miRNA selityksin eri muiden lajien ja 12894 (valmisteleva) antureista ennustettujen, mutta koska mutta ei validoitu /selityksin miRNA. Käyttämällä kynnys 2-kertainen tai suurempi muutos, 42 miRNA koettimet todettiin ekspressoitua eri (p 0,01) välillä syövän ja kontrollinäytteitä. Näistä 33 oli säädelty ja 9 alas-säädellä CEPI suhteessa OSE, mukaan lukien 12 aiemmin annotated ihmisen miRNA (9 säädelty ja 3 alassäädetty). Lämpöä kartta 42 differentiaalisesti ilmaisi miRNA koettimet on esitetty kuvassa 2a (Mirna sekvenssit näistä 42 antureista, log

2 ero CEPI ja OSE ja p-arvot t-testi on esitetty taulukossa S1). Itsenäisesti testata pätevyyden ero miRNA ilmentymiskuviot määräytyy microarray teimme mittaukset miRNA tasoa käyttäen kvantitatiivista (reaaliaikainen) polymeraasiketjureaktio (qPCR). Viisi (

miR-141, miR-429, miR-205, miR-383 ja miR-320

) 12 aiemmin selityksin ihmisen miRNA osoitettu ekspressoitua eri microarray valittiin qPCR analyysi kolmessa syöpä ja kolme kontrollinäytteitä. QPCR Tulokset vahvistivat eroja havaittiin mikrosirulla tutkimuksessa (kuva 2b).

valvomattoman hierarkkinen klusterointi CEPI ja OSE näytteitä suoritettiin käyttäen kaikki havaitut probesets annetun Ambion miRChip joukko riippumatta differentiaalikaavojen. Probesets kanssa keskihajonta 0,5 kaikissa näytteissä poistettiin ennen klustereiden. Klusterointi osoittaa, että CEPIn ja OSE näytteet klusterin eri ryhmiin, mikä viittaa siihen, varianssi ryhmien välillä on suurempi kuin ryhmien sisällä.

(A) Hierarkkinen klusterointi normaalin ja syöpäpotilaan näytteiden perusteella on ilmennetty eri miRNA välillä CEPI solujen ja OSE solut (p 0,01, ≥2fold muuttua). Dendogram vasemmalla osoittaa, että koettimet klusterin kahteen ryhmään, jotka vastaavat säädelty ja alassäädetty miRNA ilmentyvät eri normaalin ja syöpä. Tunnukset valittujen koettimien annetaan oikealla (mukaan lukien selityksin ihmisen miRNA, katso taulukko S1 täydellinen luettelo). Avain: HSA-miR-x: selityksineen ihmisen miRNA; HSA-ASG /Ca-x: ennusti ehdokas ihmisen miRNA; ppy-:

Pongo pygmaeus

miRNA; cel-:

C. elegans

miRNA. (B) Vahvistus ilmentymisen kaavoja valittujen miRNA mukaan qPCR. Suhteellinen ilmentyminen Kunkin miRNA logaritminen yksiköissä solujen 3 syöpäpotilaiden näkyy verrattuna soluihin 3 normaalin munasarjat jälkeen normalisoinnin RNU6B (ΔΔCt menetelmä). Nämä todettiin olevan tilastollisesti merkitsevä, jonka suhteellinen Expression Software Tool (REST®), jonka satunnaismenetelmää. Satunnaistaminen tehtiin 5000 kertaa. Yhdenmukainen microarray tuloksiin, miR-141, miR-205 ja miR-429 varmistettiin olevan merkittävästi säädellään ylöspäin syövän, kun taas miR-320 ja miR-383 todettiin olevan huomattavasti alassäädetty. Virhepylväät edustavat keskivirhe keskiarvon.

Toisin kuin joissakin aikaisemmissa tutkimuksissa [15], [16], [18], [19], [20], tuloksemme osoittavat että valtaosa miRNA näyttämään merkittäviä eroja ilmentymistasoissa välillä CEPI ja OSE ovat säädellään ylöspäin munasarjasyöpään. Tämän perusteella erotus on tuntematon, mutta se voi johtua eroista näytteen tyyppi (esim., Bulk kudosnäytteet vs. mikro-leikellään solut, jne.) Ja /tai biologisia vaihtelevuutta potilaan näytteitä. Meidän havainto, että suurin osa miRNA ovat säädellään ylöspäin munasarjasyöpää on yhdenmukainen sen kanssa, että miRNA tavoitteet on täydennettävä (hypergeometrisen jakelu, p 0,05) keskuudessa mRNA: t alassäädetty meidän syöpänäytteissä, kun taas ylös geenien on suhteellisen muutaman miRNA tavoitteet (kuva S1; lämpö karttoja hierarkkinen klusterointi näytteistä käyttäen kaikkia probesets on esitetty kuvassa S2 ja käyttämällä vain ilmennetty eri mRNA kuviossa S3, listan kaikista ilmentyvät eri mRNA: ita on esitetty taulukossa S2). Mahdollinen biologinen selitys miksi miRNA ovat säädellään ylöspäin CEPI saattaa piillä siinä, että toisin kuin muiden syöpien [27], [28], siirtyminen OSE ja CEPI oletetaan ottamaan muuttuu vähemmän eriytetty entistä eriytetty valtion [29], [30], [31].

Niistä 12 aiemmin selityksineen miRNA näyttämällä merkittävä muutos tasot CEPI näytteistä miR-205, miR-141, ja miR-429 ovat kaikki merkitsevästi sääteli yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten avulla nämä miRNA säilyttämisen kanssa solujen eriytetty epiteelin tila [32]. Niistä miRNA joita alassäädetty CEPIssä suhteessa OSE, miR-320 ja miR-383 sijaitsee alueilla liittyy usein DNA: n kopioiden määrä tappioita munasarjasyöpä [19]. miR-320 on aiemmin todettu estäjä keuhkosyöpä leviämisen [33]. Sen alassäätöä CEPIssä viittaa siihen, että se voi toimia tuumorisuppressori munasarjojen syövät sekä.

Vain ~11% ennustetuista mRNA tavoitteet miRNA differentiaalisesti ilmaisi välillä CEPI ja OSE näyttää odotetun käänteinen malli muutoksen geenien ilmentyminen

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ihmisen miRNA tukahduttavat geeniekspressiota pariksi komplementtijaksoja sijaitsevat 3’alueet (3 ’UTR) kohdennetun mRNA: iden tuloksena translaation tukahduttamisen ja mRNA: n hajoamisen [6 ], [7]. Näiden tulosten perusteella, muutokset ekspressiotasot miRNA yleensä ennustetaan korreloivan käänteisesti muutosten kanssa ekspressiotasot kohdennetuissa mRNA: iden [10], [11], [12], [13], [14]. Tämän hypoteesin testaamiseksi yhteydessä solujen eristetty potilasnäytteistä vertasimme määrän muutoksia aiemmin selityksin ihmisen miRNA tasoihin niiden ennakoi maalin mRNA meidän CEPI näytteissä suhteessa OSE valvontaa. N oletettu mRNA tavoitteet Näiden aiemmin selityksin ihmisen miRNA tunnistettiin aluksi käyttäen Miranda algoritmia [34], [35], [36]. Tulokset osoittavat, että vain ~11%: n muutokset mRNA ilmaisun välillä CEPI ja OSE olivat käänteisesti verrannollisia (IC), jossa havaitut muutokset miRNA tasoilla (taulukot 2 S3). Aiemmat tutkimukset tasoja miRNA ja kohdennettuja mRNA: iden sarjassa solulinjoja raportoitiin samanlaisia ​​havaintoja [13], [37], [38]. Ilmaisu enemmistön (Ei muutosta, NC: ~79%) ennustetuista mRNA tavoitteita ei ollut merkitsevää eroa (p 0,005 ja /tai taita muutos 2) väliin CEPI ja OSE näytteitä, kun taas -10%: n kohdennettuja mRNA: t siirtyvä korreloivat positiivisesti (PC) kanssa oletettavasti säätö- miRNA.

Voit selvittää yllättävän pieni osa IC muutokset voivat olla laskennallinen artefakti käytämme Miranda algoritmin ennustaa kohdennettuja mRNA: iden , me toistuva analyysi itsenäisesti käyttäen PicTar (www.pictar.org) ja TargetScan (www.targetscan.org) miRNA kohde ennustaminen algoritmeja. Molemmissa tapauksissa tulokset olivat yhdenmukaisia ​​alkuperäistä havainto, että vain pieni osa muutoksista mRNA ilmaisun välillä CEPI ja OSE ne ovat käänteisesti verrannollisia (IC), jossa havaitut muutokset miRNA tasolla (PicTar: IC 9,4%, PC 10,1%, NC 80,5%; TargetScan: IC 10,4%, PC 10,3%, NC 79,3%; katso taulukot 3, S4 S5). Lisäämään tiukkuutta kohde ennustukset, me analysoitiin uudelleen datan käyttämällä vain miRNA tavoitteita, jotka olivat yleisesti ennustivat kaikki kolme algoritmeja (risteys). Olemme havainneet, että päällekkäin kolme riippumatonta Ennustusalgoritmien, kukin miRNA oli vähemmän ennustettu tavoitteet, mutta käyttämällä näitä yleisesti ennustaa tavoitteet, vain noin 7%: n mRNA: n muutosten välistä CEPIn ja OSE havaittiin korreloivan käänteisesti (IC), jossa havaitut muutokset in miRNA tasoilla (taulukko 4). Olemme myös Analysoimme dataa risteyksiä ennusteita kahden algoritmin kerrallaan (Miranda + TargetScan Miranda + PicTar, ja PicTar + TargetScan), ja jälleen huomasimme, että muutokset tasot vain 6-9% ennustetuista mRNA tavoitteet olivat käänteisesti verrannollisia muutoksiin miRNA tasoilla (taulukot S6, S7 ja S8).

Kokeellinen vahvistus pidetään tällä hetkellä kaikkein tiukimmat tapa vahvistaa miRNA tavoitteet [39], [40]. Siten edelleen mahdollisuuden testaamiseksi, että alhainen käänteinen korrelaatio muutosten miRNA tasoilla ja kohde-mRNA: iden havaittiin kudosnäytteistä oli vain heijastusta rajoitetun tarkkuuden kohde Ennustusalgoritmien, teimme sarjan transfektion kokeissa käytetään kahta miRNA, jotka olivat merkitsevästi säädellään ylöspäin CEPI (miR-7 ja miR-128) tunnistamiseksi kokeellisesti validoitu tavoitteet näiden miRNA CEPIssä.

sarja riippumattomien transfektiokokeis- toteutettiin miR-7, miR-128 ja sovitetun joukon negatiivinen kontrolli miRNA on vakiintunut munasarjasyövän solulinja (HEI) [41]. Tehokkuuden määrittämiseksi meidän transfektioiden (positiiviset kontrollit), me seurataan ekspressiotasot kahden aiemmin vahvistettu mRNA tavoitteiden miR-7 (epidermaalisen kasvutekijän reseptori, EGFR [42] ja miR-128 (B lymfooma Mo-MLV lisäys alue 1 homologin , BMI1 [43]) asetus. tulokset vahvistavat tehokkuutta molempien transfektioiden (kuva S4). RNA kerättiin soluista transfektion jälkeen ja suhteelliset tasot mRNA: iden läsnä määritettiin Affymetrix mikrosiru analyysit (HG-U133 Plus 2.0, taulukot S9 ja S10).

yhdenmukainen tuloksiin CEPI kudosnäytteistä, vain vähemmistö ennustettu mRNA tavoitteiden todettiin vähentää merkittävästi (IC) jälkeen miR-7 tai miR-128 transfektiota (taulukko 5). ennusti mRNA tavoitteet, jotka olivat huomattavasti alassäädetty näissä transfektiokokeissa otettiin ”kokeellisesti validoitu” mRNA tavoitteiden miR-7 ja miR-128 vastaavasti. Käyttämällä vain näitä tavoitteita, me analysoitiin uudelleen mikrosirun tiedot kudosnäytteistä ja todettiin, että vain ~8% (vaihteluväli 0-18%) ja ”kokeellisesti validoitu” mRNA tavoitteita siirtyvä ilmentymisessä IC muutoksiin miR-7 ja miR-128 ilmentymisen CEPI (taulukko 6). Yhdessä tuloksemme osoittavat, että alhainen käänteinen korrelaatio muutosten tasoilla miRNA ja niiden kohde-mRNA:

in vivo

ei ole pelkästään artefakti epätarkka tavoite ennusteita vaan heijastaa monimutkaisuus miRNA toiminta syöpäsoluissa.

keskustelu

on tunnettua, että geenejä ja niiden mRNA tuotteisiin sovelletaan laaja valikoima sääntelyn valvontaa. Suhteellinen osuus toimintahäiriöitä näitä säätimiä puhkeamiseen ja etenemiseen sairauksien, kuten syövän, voi olla vaihteleva ja monimutkainen [44]. miRNA ja muut pienet ei-koodaavat RNA: t ovat viime aikoina osoitettu olevan tärkeitä säätelijöitä geenin ilmentymisen, ja häiriöt miRNA ilmentyminen on liitetty moniin sairauksiin, mukaan lukien syöpä [3], [45], [46], [47], [ ,,,0],48]. Vaikka on todettu, että miRNA voivat toimia hyödyllisinä biomarkkereita diagnosointiin ja lavastus ihmisen erilaisten syöpien (esim [2], [49], [50]), miten ja missä määrin miRNA edistää prosesseihin taustalla syöpä on vasta alkamassa ymmärrettävä [2], [45]. Esimerkiksi säätelytoimintaa miRNA alunperin uskottiin toimimaan yksinomaan translaation tasolla [51], [52], mutta viimeaikaiset havainnot ovat osoittaneet, että nämä pienet säätelevä RNA: ita myös osansa modulaatioon mRNA vakautta ja että nämä kaksi ohjaustapa voi olla kytköksissä toisiinsa [7], [53]. Emme vielä eivät sulje pois mahdollisuutta, että sääntely joidenkin kohdegeenien saattaa esiintyä translaation tasolla ilman merkittäviä muutoksia mRNA tasolla, ja siksi ehkä huomiotta meidän analyyseissä.

Laaja

in vitro

ja

in vivo

tutkimuksissa aiemmin ovat osoittaneet, että ihmisen miRNA voidaan torjua geeniekspressiota pariksi sekvenssit sijaitsevat 3’alueille kohdennettuja RNA: iden (mRNA: t) johtaa translaation sorron ja myöhemmät mRNA: n hajoamisen [1 ], [6], [7]. Tähän mennessä on olemassa muutamia esimerkkejä miRNA lisäämällä transkription tai translaation kohdegeenien [54], [55], jolloin positiivinen korrelaatioita miRNA ja kohde- mRNA: iden. Näin ollen, yleisesti pidetään odotus on, että muutokset ekspressiotasot mRNA: iden on kääntäen korreloi määrän muutoksia niiden kohdistaminen miRNA [56]. Kuitenkin se, että yksittäiset miRNA voi kohdistaa useisiin mRNA: iden ja että yksittäiset mRNA: t voidaan kohdistaa useiden miRNA luo mahdollisuuksia monimutkaisen verkoston vuorovaikutusta syöpäsoluissa täynnä erilaisia ​​positiivinen ja negatiivinen palaute silmukoita [57], [58] . Lisäksi se, että miRNA ovat hyvin tunnettuja kohdistaa koodaavien mRNA erilaisia ​​solun transkriptiotekijöiden ja muut säätelyproteiinit lisää todennäköisyyttä, että suorat sääntelyn vaikutukset miRNA voidaan mukauttaa epäsuoralla tai ”alas-stream” vaikutuksia puitteissa syöpäsoluja. Tämä ei tarkoita sitä, että mekanismit osoittanut taustalla miRNA asetukseksi

in vitro

ovat epäkunnossa

in vivo

, vaan että toiminnalliset seuraukset näiden mekanismien voivat peittyä ja /tai moduloi sääntelyn monimutkaisuutta, joka luonnehtivat syöpäsoluja. Se, missä määrin nämä monimutkaisuus voivat lieventää kykymme ennustaa molekyylitason muutosten seurauksena tasojen miRNA puitteissa syöpäsolujen on merkitystä mahdollista käyttöä miRNA syövän hoidossa.

tarkoitus meidän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida, missä määrin molekyyli muutosten seurausten miRNA tasoilla syöpäsoluissa eristettiin potilaan kudoksissa voidaan ennustaa nykyiset mallit miRNA-toiminto. Se, että ennen pyrkimyksiä saada ilmaisun profiileja miRNA ja niiden mRNA tavoitteet toteutetaan tyypillisesti kerättyjen näytteiden eri potilaiden ja /tai sekoitetusta (bulk) kudokset ovat vaikuttaneet epäjohdonmukaisia ​​havaintoja (esim [15], [16], [17], [18], [19], [20]). Pyrkiessään vähentämään kokeellinen vaihtelua, me testattiin muutokset tasoilla miRNA ja kohdennetuissa mRNA munasarjasyöpäsoluja eristetty samasta potilailta LCM. Tuloksemme osoittavat, että vain ~11%: n muutosten tasot mRNA ovat IC muutoksiin tasoilla niiden säännellään miRNA samassa munasarjasyöpä (CEPI) soluja. Sen mahdollisuuden eliminoimiseksi, että tuloksemme ovat pelkästään artefakti virheellisesti tunnistaa mRNA tavoitteet miRNA sääntelyn, me toistuva analyysien avulla tavoitteet ennustaa erilaisia ​​Ennustusalgoritmien sekä, tavoitteet kokeellisesti validoitu sarjassa transfektiokokeis- suoritettiin hyvin dokumentoitu munasarjasyövän solulinja (HEI). Tuloksemme johdonmukaisesti päätellä, että odotettavissa IC muutosten välinen miRNA tasot ja tasot niiden kohde-mRNA: iden esiintyy suhteellisen harvoin munasarjasyöpäsoluja eristetty potilasnäytteistä ja että tämä alhainen käänteinen korrelaatio ei ole pelkästään artefakti epätarkka miRNA kohde ennusteita. Pikemminkin, tuloksemme osoittavat, että alhainen käänteinen korrelaatio muutosten miRNA tasot ja tasot tavoitteensa mRNA: iden on todennäköinen seuraus epäsuoria solun prosesseja, jotka moduloivat tai peittää sääntelyn vaikutuksia miRNA

in vivo

. Meidän havainnot korostavat monimutkaisia ​​miRNA-välitteisen asetukseksi

in vivo

ja tarve ymmärtää paremmin Näiden monimutkaisuus syöpäsoluissa ennen terapeuttista potentiaalia miRNA voivat täysin toteutua.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteitä

Munasarjojen kasvain kerättiin klo Northside Hospital (Atlanta, GA) leikkauksen aikana ja jäädytettiin nestetypessä 1 minuutin kuluessa poistamisen potilaista. Kaikki munasarjakasvain käytettävät näytteet tässä tutkimuksessa olivat potilailta diagnosoitu vakavien papillaarisen munasarjan epiteelin syöpä. Harjausta normaalin munasarjan pinnan epiteelisolujen (OSE) säilytettiin välittömästi RNAlater (Ambion, Austin, TX). Potilaan suostumus ja hyväksyntä Institutional Review Boards of Georgia Institute of Technology ja Northside Hospital saatiin. Kirjallinen suostumus ja meidän protokollan (# H09227) on hyväksynyt IRB. Yksityiskohtaiset kliiniset tiedot kunkin potilaan Tässä tutkimuksessa käytetty annetaan taulukossa 1.

Laser capture mikro-leikkely (LCM) B

tuore kudoksia kasvaimista leikattiin seitsemän mikronin leikkeitä, sovelletaan ei-ladattu dioja, sitten kiinnitettiin 75% etanolilla 30 sekuntia, värjätään ja dehydratoidut käyttäen HistoGene LCM Frozen jakson Värjäys Kit (Arcturus, Mountain View, CA). LCM suoritettiin kanssa AutoPix Automated Laser Capture Mikrodissektiomenetelmiä Järjestelmä käyttämällä CapSure Macro Caps (Arcturus). Noin 10000 solua kiinni jokaisesta 5-6 korkit näytettä kohti. miRNA uutettiin kaapattu soluista käyttämällä Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion). mRNA eristettiin solujen samasta käyttävän potilaan PicoPure RNA: n eristäminen Kit (Arcturusta).

RNA munasarjojen pinnan epiteelisolujen

miRNA qPCR ja microarray, normaali munasarjojen pinnan epiteelisolujen oli pyöritettiin alas ja resuspendoitiin hajotuspuskuriin päässä Mirvana miRNA Isolation Kit (pienille RNA rikastamiseen), seuraten valmistajan suosittelemaa menetelmää (Ambion). cDNA qPCR syntetisoitiin RNA (10 ng) käyttäen TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).

mRNA qPCR ja mikrosirujen kokonais-RNA uuttamalla OSE suoritettiin käyttäen PicoPure RNA Isolation Kit, seuraten valmistajan suosittelemaa menetelmää (Arcturus). Johtuen rajoitettu määrä soluja kerätään pinnasta epiteelin brushings, OSE RNA uutettiin 5 joilla on ei-pahanlaatuinen munasarjat mRNA microarray ja kahdesta

eri

sarjojen kolme joilla on ei-pahanlaatuinen munasarjat miRNA (yksi asetetut miRNA microarray, toinen qPCR) (Katso taulukko 1 lisätietoja potilastiedon).

Quantitative (real-time) PCR

Yhteensä-RNA (10 ng) uutettu LCM jää munasarjojen kasvainsolut ja normaalit OSE solut muutettiin monistettiin cDNA qPCR. TaqMan miRNA määritykset (Applied Biosystems) suoritettiin seuraavasti valmistajan protokollaa HSA-miR-141, HSA-miR-429, HSA-miR-205, HSA-miR-320, HSA-miR-383 ja RNU6B endogeenisen valvonnan avulla StepOnePlus Real-Time PCR kone (Applied Biosystems). Aluke erityispiirteet Näiden miRNA ovat aiemmin osoittaneet [58] – [63] ja RNU6B on aiemmin vahvistettu ohjaus ihmisen munasarjakudoksen (https://www.ambion.com/techlib/tn/151/3.html; https://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldocuments/cms_044972.pdf). Tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttäen Suhteellinen Expression Software Tool (LEPO, [59]).

mRNA qPCR, kokonais-RNA (1-5 ug) uutetaan soluista muutettiin cDNA: ksi käyttäen Superscript III First Strand synteesi -järjestelmä (Invitrogen). cDNA puhdistettiin sitten käyttämällä QIAGEN PCR-puhdistuskittiä (QIAGEN) valmistajan ohjeiden mukaisesti. qPCR kokeet suoritettiin, että EGFR, BMI1 ja GAPDH-geenit käyttäen iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA). sekvenssin spesifisiä alukkeita käytetään SYBR green määritykset ovat seuraavat: EGFR-eteenpäin: GGAGAACTGCCAGAAACTGACC, EGFR-käänteinen: GCCTGCAGCACACTGGTTG, GAPDH-eteenpäin: GGTCTCCTCTGACTTCAACA, GAPDH-käänteinen: AGCCAAATTCGTTGTCATAC, BMI1-eteenpäin: ACTTCATTGATGCCACAACC, BMI1-käänteinen: CAGAAGGATGAGCTGCATAA. EGFR alukkeet kuin suunnitellut [60] ja GAPDH alukkeet kuin suunnitellut [61]. BMI1 alukkeet saatu qPCR pohjamaali tietokantaan RTPrimerDB [62]. GAPDH pohjamaali tehokkuus laskettiin olevan ~ 1. erityisyys muiden alukkeet voidaan saada asiaa julkaisuista /tietokantaan. Kaikki qPCR reaktioita (mRNA ja miRNA) optimoitiin ei-templaattikontrollien ja -RT (miinus käänteistranskriptaasi) ohjaa ennen kokeilla. GAPDH on valittu endogeeninen kontrolli kuin se näkyy minimaalinen muutos solujen välillä, jotka on transfektoitu miR-NC ja miR-7/128 mikrosirulähestymistavassa.

Kaikki qPCR reaktiot suoritettiin vähintään 2 biologisten rinnakkaisnäytettä ja kunkin biologisen jäljitellä vähintään 3 teknisen rinnakkaisnäytettä.

Soluviljely ja Solutransfektiot

HEI solut toimittanut Gordon B. Mills, Department of Systems Biology, University of Texas, MD Anderson Cancer Center. Soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä (Mediatech, Manassas, VA), johon oli lisätty 10% v /v lämpöinaktivoitua vasikan sikiön seerumia (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2 mM L-glutamiinia (Mediatech), 10 mM HEPES-puskuria (Mediatech ), penisilliiniä (100 U /ml), ja streptomysiinillä (100 ug /ml). Noin 12 h ennen transfektiota, nämä solut (kahtena tai kolmena kappaleena per transfektio, 1,5 x 10

5 per kuoppa) ympättiin kuudella-kuoppalevyille kasvualustaan ​​ja annettiin kiinnittyä yön yli 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ilmakehässä. Seuraavana päivänä sen jälkeen, kun kuopat oli pesty PBS: llä ja korvaamalla kasvualusta Opti-MEM (Invitrogen), solut transfektoitiin miRNA [HSA-miR-7 miRIDIAN matkivat, miRIDIAN miRNA matkivat negatiivinen kontrolli # 1 (miR-NC, joka on

C. elegans

miRNA, cel-miR-67, jossa on vahvistettu minimaalisen sekvenssin identiteetti ihmisillä), tai HSA-miR-128 miRIDIAN matkivat (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO)] käyttämällä Lipofectamine 2000 transfek- agentti ( Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden lopulliseen konsentraatioon 25 nM. Soluja inkuboitiin neljän tunnin ajan tässä alentunut seerumin ympäristön optimoida transfektion, pestiin PBS: llä, ja sen jälkeen inkuboitiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 44 h (yhteensä 48 h) kuluttua lisäämällä tuoretta elatusainetta kaivoihin . Transfektiotehokkuutta arvioitiin suhteellinen knock-down aiemmin validoitu tavoitteet (EGFR Mir-7 ja BMI-1 miR-128 [42], [43]), joka perustuu suosituksiin siRNA /miRNA reagenssia valmistajan (Thermo Fisher Scientific). Soluviljely kokeet suoritettiin käyttämällä ainakin kahta kolme riippumatonta biologinen rinnakkaista.

Microarray

Tissue mRNA mikrosirun.

biotiinileimattuja cRNA syntetisoitiin, hybridisoitiin Affymetrix HG- U133 Plus 2.0 oligonukleotidisirujen ja analysoitiin GeneChip- Scanner 3000 (Affymetrix, Santa Clara, CA).

HEI solun RNA: n eristys ja mRNA mikrosirujen.

Yhteensä-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini RNA eristäminen (QIAGEN, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eheyden RNA varmistettiin Agilent 2100 Bioanalyzer (1,8-2,0; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). mRNA: t muutettiin kaksijuosteiseen (ds) -cDNA ja monistettiin käyttäen Suosionosoituksia 3′-Amp System (NuGen, San Carlos, CA). Tämä jälkeen cDNA biotiinileimattua ja hajanaista käyttämällä koodaus Biotiini Module (NuGen). Leimattu cDNA hybridisoitiin Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 oligonukleotidisirujen ja analysoitiin GeneChip- Scanner 3000 (Affymetrix).

Microarray data-analyysi

Tissue miRNA microarray data-analyysi.

Näytteet meidän miRNA profilointiin tutkimuksen käsittelivät Asuragen Services (Austin, TX), mukaan yhtiön vakiotoimintamenettelyt. Custom-valmistettu Affymetrix GeneChip® Ambion suunniteltiin miRNA koettimet johdettu Sanger miRBase ja julkaistut raportit [24], [25], [26], [63], [64], [65]. Taustaa signaali arvioitiin antigenomisessa Koetinsekvenssit tarjoamia Affymetrix ja johdettu suuremman ohjausobjekteja käytetään Affymetrix ihmisen eksoni array. Spike-in ulkoinen viittaus tarkastukset perustuivat ei-miRNA ohjaus antureista, joilla ei ole homologiaa ihmisen genomin. Arrays tietyssä analyysi kokeilu normalisoitiin mukaan varianssi vakauttamiseen kuvattua [66]. Wilcoxonin-summa testiä käytettiin määrittämään havaitsemiseen puhelut miRNA koetin signaali verrattuna jakeluun signaaleja GC-pitoisuus täsmäsi anti-genomisen antureista.

Kahden otoksen t-testi, jossa oletus yhtäläinen varianssi, haettiin tilastollisen hypoteesin testaus. Tämä testi on määritelty, jotka koettimet pidetään merkittävästi eri tavoin ilmaistuna, joka perustuu p-arvo 0,01 ja log

2 ero ≥1. Signaali intensiteetit näistä ilmentyvät eri koettimet z-pisteet normalisoidaan ennen hierarkkinen klusterointi.

valvomaton hierarkkinen klusterointi näytteistä suoritettiin käyttämällä Spotfire Decisionsite for Microarray Analysis (DSMA), joka perustuu Z-score muunnetun signaalin arvojen kaikki probesets lukuun ottamatta, joiden keskihajonta 0,5.