Krooninen sairaus

tiivistelmä

Heikko solun pintatarttuvuuden solulinjojen kudosviljelmän pintoihin on yleinen ongelma ja on teknisiä rajoituksia suunnittelun kokeiluja. Tämän ongelman ratkaisemiseksi, erilaisia ​​pinnoite protokollia on kehitetty. Kuitenkin vertaileva ja tarkka reaaliaikainen mittaus niiden vaikutusta solujen käyttäytymiseen ei ole tehty. Eturauhassyövän LNCaP, joka on peräisin potilaan imusolmuke etäpesäke, on yleisesti käytetty malli järjestelmä eturauhassyövän tutkimukseen. Kuitenkin solujen tyypillisesti heikko kiinnittymistä pintaan solukkoviljelyn alusten ja peitinlaseja on haitannut niiden muuntelun ja analysointi sekä käytettäväksi tehoseulonnan. Parantaa kiinnittymistä LNCaP-solujen viljelmän pintaan, vertasimme eri pinnoite reagenssit (poly-L-lysiini, poly-L-ornitiini, IV-tyyppisen kollageenin, fibronektiinin ja laminiinin) ja viljelemällä olosuhteissa ja analysoitiin niiden vaikutus soluproliferaatioon, tarttuvuus, morfologia, liikkuvuus ja geenin ilmentyminen käyttäen reaaliaikaista teknologiaa. Tulokset osoittivat, että fibronektiini, poly-L-lysiiniä ja poly-L-ornitiini parannettu LNCaP noudattamista ja provosoi solumorfologia muutoksia, kuten kasvua ydin- ja solun alueella. Nämä pinnoite reagenssit myös indusoi suuremman ilmaus F-aktiini ja vähentää solujen liikkuvuutta. Sen sijaan, laminiini ja IV-tyyppisen kollageenin ei parantunut noudattamista vaan edistetään soluaggregaation ja vaikuttaa solujen morfologiaan. Soluja viljellään, kun läsnä on laminiinin näytetään korkeampi liikkuvuus kuin kontrollisolut. Kaikki pinnoitusolosuhteista vaikuttaa merkittävästi solujen elinkelpoisuus; mutta niillä ei ollut vaikutusta ilmaus androgeenireseptorin geenien. Suhteellista havainnot antavat tärkeää tietoa valintaa varten ihanteellisen päällysteen reagenssin ja viljelyolosuhteet syöpäsolun linjat suhteessa niiden vaikutus proliferaatioon korko, kiinnitys, morfologia, muuttoliike, transkription vastaus ja solujen solun tukiranka järjestely.

Citation: Liberio MS, Sadowski MC, Soekmadji C, Davis RA, Nelson CC (2014) Differential Effects of Tissue Culture substraattien pinnoitukseen eturauhasen syöpäsolu noudattaminen, morfologia ja Behavior. PLoS ONE 9 (11): e112122. doi: 10,1371 /journal.pone.0112122

Toimittaja: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 elokuu 2014; Hyväksytty: 12 lokakuu 2014; Julkaistu: 06 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Liberio et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: rahoitus tutkimuksen antamien Eskitis Institute Griffith University ja Australian Eturauhassyöpä tutkimuskeskuksen-Queensland kautta rahoituksen Australian hallituksen Department of Health . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

monisoluisen organismin kudoksissa solunulkoiseen tilaan ympäröivistä soluista on täytetty monimutkainen seos makromolekyylien kutsutaan solunulkoisen matriisin (ECM). ECM muodostuu polysakkarideista ja proteiineista, kuten laminiini, fibronektiini, elastiini, kollageeni, ja niiden suhteellinen määrä on kudosspesifistä. Nämä proteiinit on upotettu polysakkaridi geeli. [1] Vaikka ensimmäiset ajatukset palvella vain tukirakenteena solujen, nyt tiedetään, että ECM ei ole vain rakenteellinen mutta opettavainen, vastaten sääntelystä solujen käyttäytymistä ja vaikuttaa niiden leviämisen, muoto, toiminta, muuttoliike, selviytymisen ja kehityksen [2] – [5].

Monet ECM proteiineilla on tärkeä noudattamista toiminto. [1] Useimmat solut ovat kiinnittymisestä riippuvaisia ​​ja täytyy liittää ECM selviytyäkseen ja lisääntyä. [6] Integriinit ovat transmembraaniproteiineja muodossa αβ heterodimeerejä olennainen varten ECM proteiini-solujen kiinnittymistä. Tämä vuorovaikutus aiheuttaa solunsisäisten signaalien, jotka voivat myös ohjata ero geenin ilmentymistä. [7], [8] signalointi vastaus liittyy ECM molekyylirakenne muuttuu sen mukaan, solun vasteen niiden mikro-ympäristössä. [9], [10] Tällä tavoin, ECM on jatkuvassa muutoksen helpottamiseksi solujen vaatimusten kehittävän plastisuus. [11] Siitä huolimatta tiedetään vähän molekyylitason yksityiskohtia mukana signaalinvälitykseen. Solun vastaus ECM komponentit on vaihteleva ja riippuu jotka integriinin alayksiköt ilmentyvät solut. Monet tutkimusryhmät ovat käyttäneet erilaisia ​​ECM proteiinit kudosviljelmässä muuttaa solun käyttäytymistä, lähinnä solujen kiinnittymistä. [12] – [15] Kuitenkin lisäksi lisäämään liitetiedoston, pinnoite proteiinit voivat vaikuttaa muiden näkökohtien solubiologian, vaikuttavat lopulliset tulokset määrityksen [16].

androgen-herkkien ihmisten eturauhasen adenokarsinooma solulinja, LNCaP, on yksi yleisimmin käytetty malli järjestelmien eturauhassyöpä (PCa) tutkimus. Se oli peräisin metastaattinen vaurio imusolmuke 50 vuotta vanha valkoihoinen mies vuonna 1977. [17] Heikko solun pintatarttuvuuden solulinjojen on yleinen ongelma solukkoviljelyn tutkimus- ja on teknisiä rajoituksia koesuunnittelu . Heidän tyypillisesti heikko kiinnitys pintaan solukkoviljelyn alusten ja peitinlaseja ovat estäneet niiden muuntelun, analysointi ja käyttö tehoseulonnan koska LNCaP-solut voidaan helposti irrota kautta vaatimaton mekaanisia voimia, kuten nestettä leikkausjännitys. Parantaa kiinnittymistä LNCaP-solujen viljelmän pintaan, vertasimme eri pinnoite reagenssit (poly-L-lysiini, poly-L-ornitiini, kollageeni IV, fibronektiini ja laminiini) ja viljelemällä olosuhteissa, esim. solutiheys, ja analysoidaan niiden vaikutuksia soluproliferaatioon, tarttuvuus, liikkuvuus ja morfologia kanssa reaaliaikaisen solu analysaattori (RTCA). Meidän havainnot ovat hyödyllinen työkalu valintaa varten ihanteellisen päällysteen reagenssin ja viljelyolosuhteet varten LNCaP solulinjan suhteen niiden vaikutusta proliferaatioon korko, kiinnitys, morfologia ja solujen solun tukiranka järjestely.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

LNCaP-soluja (American Tissue Culture Collection, Rockville, MD) viljeltiin rutiininomaisesti RPMI elatusaineeseen ilman fenolipunaista (Invitrogen), johon oli lisätty 10% (v /v) FBS: ää (Invitrogen) . LNCaP-soluja kasvatettiin enintään 40 kohtia.

Pinnoite olosuhteet

Kaikki pinnoite reagenssit valmistettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Volyymi ja pitoisuus käytettävien aineiden päällystämiseen kuopat olivat 1,3 ui laminiini (LAM, 0,5 mg /ml H

2O, Invitrogen), 1 ui kollageenia ihmisen istukasta tyypin IV (COL, 1 mg /ml H

2O, Invitrogen), 0,4 ui fibronektiini (FN, 1 mg /ml H

2O, Invitrogen), ja 0,32 ui poly-L-lysiiniä (PLL, 1 mg /ml H

2O, Invitrogen). Nämä päällysteen reagenssit sekoitettiin H

2O kokonaistilavuuteen 50 ui per kuoppa 96-kuoppaiselle levylle. 50 ui poly-l-ornitiinin (PLO, 0,01% H

2O, Sigma-Aldrich) on suoraan lisättiin kuoppiin, ja levyjä inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Inkubointiaika LAM ja FN oli 4 h käyttäen samoja edellä kuvattuja olosuhteita. Päällystetyn kuopat pestiin kerran DPBS: llä, jota välittömästi seuraa solun kylvö. Tilavuus päällysteaineisiin oli säädettävä kasvualue, kun eri kasvatusastiat käytettiin.

Reaaliaikainen solu analysaattori (xCELLigence System) B

reaaliaikainen solu analysaattori (RTCA) xCELLigence järjestelmä ( Roche Applied Science) koostuu neljästä pääosasta: RTCA analysaattori, The RTCA SP asemalle, joka pysyy sisällä kudosviljelmän yrityshautomo, The RTCA tietokone integroitu ohjelmisto, ja 96-E-levylle. Pohja kertakäyttöisen 96-E-levy on noin 80% peitetty kullalla mikroelektrodien että valvoa sähköisen impedanssin, havaitsemiseen fysiologisia muutoksia solujen. Solut kosketukseen elektrodin kanssa toimii eristeet, mikä nostaa impedanssi. Siten elektrodien impedanssi muuttuu suhteellisesti muutoksia lukumäärä, koko ja kiinnittyminen solujen kasvaa yksikerroksinen [18], [19].

Muutokset impedanssi on käännetty yksiköttömiä termi

solun indeksi

(CI). CI = (Zi-Z0) /15, jossa Zi on impedanssi yksittäisen ajankohtana kokeen aikana ja Z0 on impedanssi alussa kokeen. Siten CI on kvantitatiivinen ja komposiitti mitta yleistä tilaa solujen elektrodin, joka sisältää sekä [18], [19].

Ensimmäinen, 100 ui täydellistä alustaa lisättiin kuhunkin kuoppaan mittaus taustalla. Sitten, LNCaP-solut ympättiin 96-kuoppaiselle E-levyn päällystämätön tai päällystetty, jossa on esitetty reagenssien, kuten edellä on kuvattu, jonka tiheys on välillä 9,4 x 10

3 ja 6,25 x 10

4 solua /cm

2 kolmena kappaleena. E-levyn annettiin inkuboitua huoneenlämpötilassa 30 minuuttia ja asetetaan lukijan inkubaattoriin jatkuvan tallennuksen solun indeksin. E-Levyä inkuboitiin 96 tunnin ajan 37 ° C: ssa, 5% CO

2, ja kiinnitys solujen seurattiin CI-4 h välein 2 min. Tämän jakson jälkeen CI mitattiin tunnin välein 92 tunnin ajan.

Solulisääntyminen ja elinkelpoisuus

Solut ympättiin 96-kuoppalevyille päällystämätön tai päällystetty osoitti reagenssien tiheydellä 1,25 × 10

4 solua /cm

2. Kasvu funktiona kasvava yhtymäkohta mitattiin käyttäen eläviä sisällön solukuvauksessa IncuCyte HD-järjestelmän (Essen BioScience). Kuvat otettiin 10x tavoite 2 tunnin välein 3 erillistä syvennystä per pinnoite kunnossa, ja keskimääräinen ± SD yhtymäkohta prosentit laskettiin. Metabolinen aktiivisuus solujen kasvatettu eri pinnoitteiden mitattiin alamarBlue jälkeen 96 h mukaisesti valmistajan ohjeiden (Invitrogen, USA). Kineettinen analyysi suoritettiin GraphPad Prism (GraphPad Software). Keskiarvot kolmen rinnakkaisen laskettiin taustan korjauksen jälkeen.

Adhesion ja kvantifiointi morfologiset parametrien

LNCaP-solut ympättiin 96-kuoppalevylle, päällystämätön tai päällystetty, jossa on esitetty reagenssien tiheydellä 3.12 × 10

4 solua /cm

2. 24 tunnin kuluttua, 48 h, 72 h ja 96 h solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 20 min ajan jäillä, tehtiin läpäiseviksi 0,2% (v /v) Triton X-100 /PBS: llä 10 minuutin ajan, ja värjättiin CellMask Deep punainen Plasmamembraanin Stain (2,5 ug /ml, Invitrogen), ja 1 ug /ml DAPI (Invitrogen). Arviointi soluadheesion suoritettiin mittaamalla solujen määrä jätetään kiinni levyyn jälkeen pesuvaiheet käyttäen Operetti korkea Content Imaging System (PerkinElmer). Morfologiset parametrit solun alueella ja tumat alue kvantitoitiin.

Aikaväli kuvantaminen

pinnat 6 hyvin /levy päällystettiin edellä kuvatulla tavalla. LNCaP-soluja ympättiin tiheydellä 1,58 x 10

4 solua /cm

2 ja tarkkailtiin 96 h. 15 minuutin välein kuva otettiin Zeiss Axio Observer valomikroskoopilla (tavoite 20 x) seurata muoto muuttuu ja muuttoliikkeen aikana aikaa. Videot voidaan löydetty Video S1-S6.

jakelu F-aktiini

LNCaP soluja kasvatettiin lasipeitinlevyihin päällystämätön ja päällystetty ilmoitetuilla reagenssit 24 tunnin ja 96 tunnin. Solut kiinnitettiin sitten ja läpäiseviksi, kuten yllä on kuvattu, mitä seurasi värjäys rodamiini-phalloidin (01:40, Invitrogen) ja 1 ug /ml DAPI (Invitrogen). Immunofluoresenssikokeisiin Kompleksit visu- Olympus (FV1000 Spectral) -konfokaalimikroskoopilla käyttäen 60 x objektiivia. Optinen leikkuu suoritettiin hankkimalla pinon kuvia eri polttovälin asemissa pitkin z-akselia.

Scratch haava määritys

LNCaP (3,12 x 10

4 solua /cm

2) ympättiin 96-kuoppaisen Essen ImageLock levyn (Essen BioScience) päällystämättömiä tai päällystettyjä, kuten aikaisemmin on kuvattu, ja niitä kasvatettiin konfluenssiin on CO

2: ssa kosteassa inkubaattorissa. 24 tunnin kuluttua, naarmu tehtiin käyttämällä 96-pin WoundMaker (Essen BioScience). Haavan kuvat otettiin joka 1 h 36 h, ja tiedot analysoitiin integroidun metrinen Suhteellinen Haavan tiheys osan elävästä sisällön solun kuvantamisjärjestelmä IncuCyte HD (Essen BioScience). Koe tehtiin kolmena kappaleena.

Herkkyys simvastatiinin

vaikutus FN, PLO ja PLL pinnoite solun herkkyyttä simvastatiinin tutkittiin. LNCaP-soluja ympättiin kolmena kappaleena ja kasvatettiin 96-kuoppaisilla E-levyille kuten edellä on kuvattu. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla simvastatiinin (Sigma-Aldrich) ja seurataan jokaisen 1 h 60 h käyttäen RTCA järjestelmää. IC

50 24 tuntia, 48 tuntia ja 72 tuntia hoidon jälkeen lasketaan ohjelmistolla GraphPad Prism 5 (GraphPad Software).

qRT-PCR

pinnat 6 hyvin levy päällystettiin kuten edellä on kuvattu, ja LNCaP-solut ympättiin tiheydellä 1,05 x 10

4 solua /cm

2. 72 tunnin jälkeen kasvatusliuos korvattiin hiilellä erotettua (androgeenin köyhdytettyä) seerumin RPMI-elatusaineeseen (CSS, Invitrogen, USA), johon oli lisätty 5% (v /v), CSS ja soluja viljeltiin 48 tuntia. Lopuksi, LNCaP-soluja käsiteltiin 20% (v /v) etanolia valvontaa tai androgeenien R1881 (1 nM) ja DHT (10 nM) 30 h.

Kokonais-RNA saatiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Määrä ja laatu RNA mitattiin käyttäen NanoDrop UV-spektrofotometri (ThermoFisher Scientific, USA). Näytteet, joissa on 260/280-suhde suurempi kuin 2,0 käytettiin myöhemmin menettelyjä. Näytteet käsiteltiin DNAasi Amp luokan I, ja 2 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin käyttämällä cDNA-synteesin menetelmä qPCR (Invitrogen). QRT-PCR suoritettiin SYBR Green master mix (Invitrogen) käyttäen 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Aineisto analysoitiin SDS2.3 ohjelmisto (Applied Biosystems). MRNA: n ilmentymisen tasot laskettiin ΔΔCt menetelmällä ja normalisoitiin suhteessa ilmentymistasoihin talon pitää geenin (GAPDH tai RPL32) vastaavien hoitoon ja lasketaan suhteessa etanolin päällystämättömän ohjaus. Sekvenssit käytettyjen alukkeiden on lueteltu taulukossa S1.

Tulokset

FN, PLO ja PLL parantaa solu-alustan kiinnittyminen

reaaliaikainen solu analysaattori (RTCA) xCELLigence on merkkivapaalla menetelmää, joka mittaa proliferaationopeus, tarttuvuus ja morfologia perustuu impedanssin muutoksiin. Muutokset impedanssi on käännetty yksiköttömiä termi

solun indeksi

(CI). Me tehdään RTCA analyysi LNCaP ympätään kuopissa esikäsitelty erilaisten pinnoitteiden solutihe- välillä 9,4 × 10

3-6,25 x 10

4 solua /cm

2 96 kuopan levylle, ja tutki sekä kiinnityksen vaiheessa (24 tunnin kuluttua istuttamisesta) (Fig. 1) ja leviämisen vaihe (24 h 96 h ymppäämisestä) soluviljelmän (Fig. 2). Oletettiin, että kiinnitys solujen pois suspension alustalle ja solun morfologian muutoksia, jotka liittyvät tähän prosessiin olivat tärkeimmät tukijoista CI ensimmäisten 24 tunnin kokeen (Fig. 1). Niinpä osuus leviämisen että CI tällä kaudella pidettiin marginaalinen, jota tukee lisäksi se, että LNCaP kasvatettu samanlaisissa olosuhteissa näyttöön kaksinkertaistamista aikaa 36 tuntia. [20] Itse asiassa vertailu eri kylvö tiheydet ohjaus ja pinnoitteen reagenssit 3,12 x 10

4 solua /cm

2 96 kuopan levylle 24 tunnin jälkeen paljasti, että PLL lisäsi CI samanlaisen määrin kuin kaksinkertaistaa siemennetyn solujen, eli 3,12 x 10

4-6,25 x 10

4 solua /cm

2 (Fig. S1). Kaikilla solutiheyksiin, pinnoite fibronektiinin (FN) johti siihen, että ylin CI 24 tunnin kuluttua, minkä jälkeen poly-L-lysiiniä (PLL), ja poly-L-ornitiinin (PLO). PLL ja PLO kasvatti CI hyvin samankaltainen hinnat jopa 3,12 x 10

4 solua /cm

2, kun taas PLO laski rinteen ollenkaan solutihe- (Fig. 2). Laminiinin (LAM) pinnoite ei vaikuta CI verrattuna kontrolliin, kun taas tyypin IV kollageenilla (COL) aiheutti CI nousta hitaammin. Kiinnostavaa kyllä, tämä järjestys ei vaikuttanut lukumäärä kasvaa kylvetään soluja. Nämä havainnot ehdotti, että FN, PLL ja PLO koheni kiinnitys LNCaP, jossa ECM-proteiinia on parempi kuin poly-aminohappoja.

Soluja tarkkailtiin 24 tuntia analysoida solun alustan kiinnittyminen maasta kun soluja lisättiin kuoppiin (t = 0) käyttäen reaaliaikaista solun analysaattori (xCELLigence, Roche). Kukin datapiste edustaa sen avulla (n = 3) ± SD.

Soluja tarkkailtiin 72 tuntia analysoida vaikutuksia päällysteiden LNCaP 24-96 h käyttäen todellinen -Aika solu analysaattori (xCELLigence, Roche). Aineisto normalisoitui 24 tunnin vertailuun rinteillä. Kukin datapiste edustaa sen avulla (n = 3) ± SD.

Leviämisen vaihe seurattiin 24 tunnin kuluttua kylvö solujen 96 h (Fig. 2). Tärkeimmät avustajat Tämän vaiheen muutoksiin CI ovat solujen lisääntymistä, tarttuvuus ja morfologia. Kaikilla solutiheyksiin testattu, LNCaP-soluja kasvatettiin LAM näytetään nopeudella CI nousu, joka oli erotettavissa valvontaa. Sen sijaan, LNCaP kasvatettu COL alustalle osoitti viivevaihe jossa CI ei kasvanut jopa 48 tuntia ymppäyksen jälkeen, ja yleinen alennettua CI nousun (kuviot. 2B-E). Nämä vaikutukset olivat riippumattomia lukumäärästä kylvetään soluja. Kaikissa solu tiheydet PLL alustan aiheutti havaittavissa hidastumista CI lisäys. Sama vaikutus näkyi PLO alustaan ​​korkeimmalla istutustiheyteen (6,25 x 10

4 solua /cm

2, kuva. 2E), kun taas CI lisääntynyt nopeampaa PLO päällystetyn alustan alemmilla kylvö tiheydet (kuvio . 2A ja B). Sen lisäksi, että alin solutiheyden (9,4 x 10

3 solua /cm

2), CI määrä kasvaa solujen kasvatettu FN alustalle olivat jatkuvasti korkeampia kuin kontrolli (kuviot. 2B-E); vaikutus, joka näytti eivät vaikuta nousu määrän kylvetään soluja. Yhdessä korkea solutiheydet ( 4,69 x 10

4 /cm

2) vaikutti kielteisesti CI kun LNCaP soluja kasvatettiin alustoille päällystetty poly-aminohappoja (PLL ja PLO), mutta sillä ei ollut vaikutusta ECM proteiinit (COL, LAM ja FN). Tämä havainto on erityisen tärkeä soluviljelmässä kokeissa, joissa on korkea solun yhtymäkohta on toivottavaa. Lisäksi istutustiheyteen 9,4 × 10

3 solua /cm

2 oli kokonaisuudessaan haitallista soluviljelmässä LNCaP, jolloin puute solujen lisääntymistä, mikä johtui todennäköisesti niukkuuden solu-solu kontakteja.

Kaikki pinnoitusolosuhteista pienentää soluproliferaatiota mutta ei voimakkaasti vaikuta LNCaP solujen elävyyden

solu-indeksi on yhdistetty mitta proliferaationopeus, tarttuvuus ja solujen morfologia. Näin ollen, vaikutukset päällysteen reagenssien kunkin näiden parametrien tutkittiin erikseen. Solutiheys päällystettyihin kuoppiin kasvoi hitaammin kuin päällystämätön kuoppiin. Solut kasvatetaan FN, PLL, PLO ja LAM näytetään vastaavien kasvu (Fig. 3A). Kollageeni tyyppi IV oli päällyste aine, joka vaikuttaa negatiivisesti solujen lisääntymistä eniten. Tutkiminen elinkelpoisuuden /metabolista aktiivisuutta LNCaP kasvatettiin 96 h eri substraattien pinnoitukseen by alamarBlue määritys paljasti, että kaikki päällyste reagenssit pienentää solujen elinkykyä, jossa COL hieman huonompi kuin muiden pinnoitteiden (Fig. 3B). Tämä vaikutus oli samanlainen kuin saadut tulokset sekä yhtymäkohdassa eri pinnoitteiden (Fig. 3A). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että pinnoite reagenssit vaikuttavat solujen lisääntymistä ja aineenvaihduntaa aktiivisuus LNCaP.

LNCaP-soluja ympättiin 1,25 x 10

4 solua /cm

2 polysty- 96 hyvin Plate päällystämättömiä tai päällystetty poly-L-ornitiini, poly-l-lysiini, IV-tyyppisen kollageenin, laminiinin ja fibronektiinin. (A) Wells yhtymäkohta seurattiin joka 2 tuntia 96 tuntia käyttäen IncuCyte järjestelmää. (B) Metabolinen aktiivisuus /solujen elinkelpoisuus mitattiin alamarBlue määrityksen jälkeen 96 h. Kukin datapiste edustaa sen avulla (n = 3) ± SD. Merkittäviä tuloksia (p 0,05) on merkitty tähdellä.

COL ja LAM aiheuttama LNCaP aggregoitua

IncuCyte kuvia paljasti, että LNCaP-solut kiinnitetään pintaan kaikissa pinnoitus olosuhteissa 24 tunnin kuluttua (Fig. 4A). Soluja kasvatettiin kuoppiin ennalta päällystetty FN, PLL, PLO, LAM, sekä ohjaus näkyy fibroblasti-muotoon tyypillisiä LNCaP-soluja. [21] Sitä vastoin, LNCaP-solut viljelty COL oli pyöreämpi muoto. Solut kasvatetaan COL ja LAM myös taipumus aggregoitua. Lisäksi kuopat päällystettiin LAM ja FN sisälsi enemmän pyöreä soluja verrattuna muihin substraattien pinnoitukseen (Fig. 4A). Sama havaittiin kuluttua 96 h (Fig. 4B). Jälkeen 96 h, suurin osa soluista hankki karan muoto kaikissa päällysteen olosuhteissa. Solut KOL kasvoi aggregaatit 96 h (Fig. 4B).

LNCaP kuvantaa kuluttua 24 h (A) ja 96 h (B) IncuCyte järjestelmä, 10 ×. Asteikko bar = 300 pm. (C) Snap laukausta 96 h time-lapse mikroskopia video LNCaP. Nuolet osoittavat lamellipodioihin polarisoidun soluja. Asteikko bar = 50 pm (20 x, Zeiss Axio Observer).

Jotta vaikutuksen tutkimiseksi pinnoitteen reagenssien solujen liikkuvuutta ja morfologia yksityiskohtaisemmat reaaliaikaisesti, LNCaP-solut tutkittiin korkea suurennus nopeutus mikroskoopilla. Samanlainen IncuCyte kokeilu, nopeutus mikroskoopilla osoitti, että COL ja LAM (Fig. 4C) aiheutti LNCaP muodostaa aggregaatteja. Lisäksi, soluja kasvatettiin LAM-päällystettyihin kuoppiin näytetään läsnä lukuisia polarisoitunut solujen, tunnettu siitä, että läsnä on epäsymmetrinen soluja. PLL- ja PLO-käsiteltyjen näytteiden näkyy samanlainen morfologia verrattuna kontrolliin. Silti, LNCaP kylvetään seuraavilla alustoille näytti liittää nopeammin kuin kontrolli solut ja siirtyvät vähemmän. Videoita viiveen mikroskopia ajan 96 h löytyy Video S1-S6.

LNCaP kiinnittyy paremmin pinnat on päällystetty FN, PLO ja PLL, joka myös vaikuttaa solujen morfologiaan

Liite ja solujen morfologia, jotka muodostavat osan CI, tutkittiin korkea pitoisuus seulonta (HCS). HCS LNCaP-solujen mitattuna huomattavasti suuremman solutiheyden (parempi kiinnitys) esikäsittelyn jälkeen kaivojen kanssa PLO tai PLL verrattuna kontrolliin, FN, COL tai LAM kaikkina ajankohtina (Fig. 5A). Soluja viljellään, kun läsnä on FN kiinnitetty paremmin kuin kontrolli-soluilla 72 tuntia ja 96 tuntia. Suhteen solujen morfologia muuttuu, alueen ytimen ja koko solun alueella vaikuttivat maali- (kuviot. 5B ja 5C). Soluja viljeltiin PLO, PLL ja FN 96 tuntia oli kohonnut ydin- ja solujen alueilla vähintään 8% ja 18%: lla, verrattuna kontrolliin. Vertailuryhmään nähden, COL ja LAM pienensi ydin- ja solujen alueet 7% ja 10%, ja 15% ja 14%, vastaavasti.

Solut analysoitiin solutiheyden (A), ydinalan (B ) ja solun alue (C) neljässä eri ajankohtina käyttäen suuri pitoisuus seulonta väline (Operetta).

eri päällyste reagenssit vaikuttaa F-Actin organisaatio

Tutkiakseen muutokset solujen morfologia ja liikkuvuus LNCaP-solujen yksityiskohtaisemmin, olemme suoritetaan konfokaali- fluoresenssimikroskopiaa ja tutkittiin F-aktiini organisaatio LNCaP-solujen, kuten läsnäolo lamellipodioihin 24 h (Fig. 6A) ja 96 h (Fig. 6B) post-kylvö. Nämä rakenteet koostuvat rinnakkain yhdistettyjä aktiinisäikeiden että koetin alustan päättää, missä ja miten paikallisia tarttumista olisi vahvistettava kiinnitys. Lisäksi nämä filamentit edistää muodostumista aktiini rasitukseen liittyviä säikeitä. [22], [23] tarttumista ja leviämistä solujen liittyy remodeling solun tukirangan. Dynaamiset rakenteet nimeltään paikallisissa kontakteissa ympärille muodostuu integriinien tarttumista sivustoja. Integriinit ovat sitoutuneet ECM komponentit toisella puolella, ja aktiinifilamenttien kutsutaan rasitukseen liittyviä säikeitä toisella puolella. Soveltaminen voima toisella puolella aiheuttaa reaktion toisaalta ja tämä yhdessä integriinin signalointireittien, määrittää solun muodon. [3] Yhdenmukainen havaitut tulokset viiveen mikroskopia kokeessa havaitsimme paljon polarisoitunut solujen kuluttua 24 h Fn ja LAM-käsiteltyjen lasipeitelevyihin (Fig. 6A). Lisäksi kun 96 h havaittiin, että kuidut tuli sekava joidenkin aivokuoren aktiini kerääntyminen solun elin ja pienempi määrä stressiä kuitujen läsnäollessa FN (Fig. 6B). Lisäksi FN aiheutti huomattavaa lisäystä aktiinivärjäyksen, ja solut menettivät päin (Fig. 6B).

Soluja kasvatettiin lasipeitinlevyihin ilman pinnoitetta (kontrolli), tai pinnoitettu fibronektiini (FN), laminiini (LAM), poly-l-lysiinillä (PLL), poly-L-ornitiinin (PLO), tai tyypin IV kollageenilla (COL IV). 24 h jälkeen (A) tai 96 h (B), solut värjättiin F-aktiini rodamiini–falloidiinia vastavärjättiin DAPI, ja analysoitiin konfokaalisella fluoresenssimikroskopialla (60 x, Olympus). Nuolet osoittavat lamellipodioihin polarisoidun solujen ja nuoli päät merkitse filopodia. Asteikko bar = 50 pm.

kasvaneet solut läsnäollessa PLL ja PLO (Fig. 6) osoitti hajanaisemman aktiini kuvio joidenkin väkevällä aktiinivärjäyksen solun reuna 24 tunnin ja 96 tunnin . Lukuisten aktiini nippujen ja säteittäisesti laajennettu aktiinisäikeiden solujen ympärille, joita kutsutaan filopodia, havaittiin. Ytimet viljeltyjen solujen on PLL näkyy voimakas DAPI intensiteetti 24 h (Fig. 6A), joka pelkistettiin 96 h (Fig. 6B). Lisäksi ytimet kasvoi koko jälkeen 96 h.

24 h, solut kuopissa päällystetty COL (Fig. 6A) osoitti aktiini kuvio samanlainen kontrolliin. Kuitenkin, kun 96 h kasvun aktiinisäikeiden tuli järjestäytyneen kuin vertailuryhmässä (Fig. 6B).

PLL, PLO, tai FN-päällystettyihin kuoppiin lisätä kiinnitys LNCaP ja väheni hieman solun liikkuvuus , kun taas LAM lisää muuttoliikettä

morfologiset muutokset liittyvät yleensä korjauksilla muiden solujen ominaisuudet, kuten liikkuvuuteen, erilaistumista ja metabolinen aktiivisuus. [24] Tämän mahdollisuu- den osoittamiseksi, motiliteettia LNCaP-soluja kasvatettiin polystyreeniä käsitelty eri päällyste reagenssien arvioitiin haavan paranemista määritystä (Fig. 7). LNCaP-solut ympättiin 24 tuntia kuopissa päällystetty FN, LAM, PLL, PLO tai COL, ja solukerros oli naarmuuntunut käyttämällä 96-pin WoundMaker. Laatu haavat generated PLL, PLO, tai FN-päällystettyihin kuoppiin olivat parempia kuin kontrolli (ei pinnoite) ja LAM, arvioituna suhteellinen sileys reunojen alusta sekä hyvin samankaltainen haava-alueelle (kuvio . S2). Toinen havainto oli, että LNCaP viljeltiin PLO tai PLL-käsiteltyjen kuoppien asuttivat hyvin puoliksi järjestetty kuvio, jossa pitkänomainen solukeskuksen linjassa rinnakkain (Fig. S2). Esikäsittely LAM ei parantanut kiinnittyminen LNCaP verrattuna kontrolliin, ja WoundMaker tuotettu haavat epätasaiset reunat ja eri alueella. LNCaP-solut irrotetaan niin suuri arkkia solujen COL-käsiteltyjen kuopissa, kun prosessoitu WoundMaker (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että COL oli huonompi päällystämättömän kuoppiin ja ei sovi tähän sovellukseen. Analyysi suhteellinen haavan tiheys osoitti, että kasvatettujen solujen läsnä ollessa LAM siirtynyt 62% nopeammin haavaan ala kuin kontrollisolut jälkeen 36 h (Fig. 7). Vertailun, PLL, PLO ja FN aiheutti LNCaP siirtyä hitaammin kuin kontrolli, näytetään vähentämistä haavan tiheyden 15%, 33% ja 20% kasvatettiin näissä olosuhteissa vastaavasti. Erityisesti LNCaP muotoutuneet kaksinkertaistaa ajan noin 36 h, minkä voi havaita RTCA kokeissa [20] viittaa siihen, että havaitut vaikutukset haavan tiheyden johtuivat pääasiassa solujen vaeltamiseen eikä lisääntymistä.

Suhteellinen haava tiheys eri ajankohtina LNCaP-solujen aikana 36 h. Mittaukset ovat haavat, jotka on tehty yksisolukerroksen LNCaP-soluja viljeltiin eri pinnoituskäsittelyt ja valvontaa.

PLL herkistää LNCaP-soluja varten HMGCR estäjä simvastatiinin

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että pre-pinnoite ECM komponentit voivat vaikuttaa solujen herkkyys eri lääkkeitä. Esimerkiksi LAM ja FN on raportoitu lisäävän vastustuskykyä ionisoivaa säteilyä ja sytostaatin Ukrain ihmisen kasvainten ja normaalit solut

vitro

. [25] Lisäksi on raportoitu, että sitoutuminen FN alustaan ​​aiheuttama kolesterolin synteesiä aktivoimalla HMGCR ja lisäsi myös rasvahappojen synteesi ihmisen fibroblasteissa ja rotan maksasoluja, kun taas PLL alustan tai FN liuoksessa ei ollut vaikutusta näiden reittien [ ,,,0],26].

Näin ollen, vaikutusta päällysteen reagenssien PLL, PLO ja FN herkkyyteen LNCaP-solujen HMGCR estäjä simvastatiini tutkittiin RTCA, ja IC

50 laskettiin hoitojaksoa 24 h, 48 h ja 72 h (Fig. S3). LAM ja COL vaikutuksia ei ole analysoitu, koska nämä pinnoite reagenssit olivat kielteisiä vaikutuksia LNCaP solun pinnan tarttuvuus ja aiheutti solujen aggregaatiota. Vaikka IC

50 simvastatiini oli suhteellisen samankaltainen yksi neljästä päällysteen olosuhteissa 24 h, PLL lisääntynyt herkkyys LNCaP-solujen HMGCR inhibiittorin kaksinkertaiseksi 48 tunnin kuluttua hoidon verrattuna kontrolliin (kuvio. S3) . 72 h, LNCaP kasvatettu PLL alustalle näkyy kolme kertaa pienempi IC

50. Vastaavasti, PLO ja FN lisääntynyt herkkyys LNCaP-solujen simvastatiinin kaksinkertaisella suhteessa kontrolliin 72 tunnin ajan. Kuitenkin on havaittu, että PLO, PLL ja FN vähensi solujen elinkelpoisuuden kolmasosaa 96 h (Fig. 3B). Siten herkistymistä LNCaP solujen PLO ja FN simvastatiinin voisi olla todella vaikutusta näiden pinnoitteiden solujen elinkykyä. Tässä tapauksessa vain PLL voi merkittävästi herkistää LNCaP varten HMGCR estäjä simvastatiinin ajasta riippuva tavalla.

Androgeenien reagointikykyä ja AR signalointi olivat yleisesti ei vaikuta pinnoitusolosuhteista

terveen aikuisen ihmisen eturauhasen epiteelin, AR ilmaisun ja soluadheesiota alustaan ​​tapahtua erillisissä solukerroksissa, nimittäin luminal ja tyvisoluissa. Siten polkuja AR signalointi ja soluadheesiota todennäköisesti vuorovaikutuksessa suoraan. [29] kehittämisen aikana eturauhassyövän, pahanlaatuiset luminaalisen epiteelisolujen vaihtaa solu-solu-adheesio solujen substraattiin adheesion, ja signaalit soluadheesiota ja AR ovat ilmennetään rinnakkain. [27] LNCaP-solulinja on tärkeä malli järjestelmä tutkia androgeenireseptorin (AR) -välitteisen signalointi eturauhassyövässä. Hiljattain osoitettiin, että muutokset solu-solu-kontaktien ja soluväliaineen muuttaa vaste LNCaP-solujen androgeenien.