Krooninen sairaus

tiivistelmä

Poikkeava aktivoinnin ja mutaation asema proteiinien fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) /Akt /nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) ja mitogeeni aktivoitua proteiinikinaasia (MAPK) signalointireittien on sidoksissa tuumorigeneesiä erilaisten kasvainten kuten urothelial karsinooma (UC). Kuitenkin kasvainhoitojen kanssa pienmolekyylisalpaajien vastaan ​​mTOR-osoittautui menestyneet odotettua heikommin. Olemme tunnettu molekyylitason mekanismia väylän urothelial karsinooma häiritsemällä eri molekyylikomponentit käyttäen pieniä kemiallisia estäjiä ja siRNA teknologian ja analysoidaan vaikutuksia molekyylitasolla aktivoinnin tilan, solujen kasvua, lisääntymistä ja apoptoosia. Suurimmassa osassa testattiin solulinjojen konstitutiivisen aktivaation PI3K havaittiin. Manipulointi mTOR tai Akt ekspressiota tai aktiivisuutta ainoastaan ​​säänneltyä fosforylaatiota S6K1 muttei 4E-BP1. Sen sijaan tarjoamme näyttöä vaihtoehtoisesta mTOR riippumaton mutta PI3K riippuvainen sääntely 4E-BP1. Vain samanaikainen estäminen sekä S6K1 ja 4E-BP1 tukahdutetaan solujen kasvua tehokkaasti. Ylikuuluminen välillä PI3K ja MAPK -signalointireitistä välittyy kautta PI3K ja epäsuora mukaan S6K1 aktiivisuutta. Esto MEK1 /2 johtaa aktivoitumiseen Akt muttei mTOR /S6K1 tai 4E-BP1. Tuloksemme viittaavat siihen, että 4E-BP1 on potentiaalinen uusi kohdemolekyyli ja kerrostuminen markkeri anti syövän hoidon UC ja tukea huomioon usean kohdistaminen lähestymistapaa vastaan ​​PI3K, mTORC1 /2 ja MAPK.

Citation: Nawroth R, Stellwagen F, Schulz WA, Stoehr R, Hartmann A, Krause BJ, et al. (2011) S6K1 ja 4E-BP1 ovat riippumattomia valvotuilla ja valvonta Cellular kasvu virtsarakon syövän. PLoS ONE 6 (11): e27509. doi: 10,1371 /journal.pone.0027509

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 elokuu 2011; Hyväksytty: 18 lokakuu 2011; Julkaistu: 15 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Nawroth et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat Siegfried Gruber Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on viides yleisin syöpä maailmanlaajuisesti kanssa arviolta 357,000 uutta tapausta ja 145.000 kuolemaa vuonna 2010 [1]. Urothelial carcinoma (UC), joka edustaa 90% kaikista virtsarakon kasvaimet ovat heterogeeninen muodostama kokonaisuus papillaarinen kasvainten ja kiinteiden invasiivisia karsinoomia, jotka vaativat radikaalia hoitoa, kun ne ovat edenneet osaksi lihasten kerros virtsarakon. Hoitamattomana noin 85% potilaista, joilla invasiivisia virtsarakon kasvain kuolee sairauden eteneminen kahden vuoden kuluessa diagnoosista [2]. Radikaali cystectomy lantion imusolmuke leikkelyn on hoidon taso lihas-invasiivisia virtsarakon syöpä. Tämän lähestymistavan 5 vuotta ilman taudin etenemistä todennäköisyyksiä 65-68% voidaan saavuttaa kaikissa kasvain vaiheissa [3], [4]. Huolimatta edistysaskeleet sisplatiini- kemoterapiaa metastasoituneen sairauden, mediaani yleistä 5 vuoden elinaika on rajattu 14-15 kuukausi [5]. Näin uudet hoitomenetelmät ovat erittäin toivottavia. Parempi tietämys poikkeava aktivaatio solusignalointia polkuja, jotka ovat mukana tuumorigeneesiin rakon saattaa antaa sopivan molekyylitason tavoitteet Uusien hoitomuotojen [6], [7], [8]. Yksi tällainen reitti on PI3K /Akt /mTOR-signalointireitin, joka on yhdistetty tuumorigeneesiä monissa kudoksissa [9], [10].

Normaalisti aktivoitaessa tyrosiini- reseptorikinaaseja tai RAS-proteiinien PI3K muuntaa phosphatidylinositol- 4,5-bifosfaatin (PIP

2) osaksi phosphatidylinsositol-3,4,5-trisfosfaattia (PIP

3). Tämä reaktio voidaan kumota PI3K antagonisti PTEN (fosfataasi ja tensin homologi poistetaan kromosomissa 10). PIP

3 rekrytoi PDK1 (proteiini riippuvaisen kinaasin 1) solukalvoon, jossa se sitoo ja fosforyloi Akt aminohappotähteestä T308. Akt pidetään kriittisin signalointi solmun tämän reitin säädellään eri alustoille vaikuttavat solujen prosessien valvontaan solujen kasvua ja selviytymistä [11]. Akt signalointi suppenee kautta mukuloita skleroosi proteiinit 1/2 (TSC1 /2) ja pieni GTPaasi Rheb on mTOR, seriini /treoniini-kinaasi, joka muodostaa kaksi erillistä proteiinia komplekseja joko raptor (sääntelyyn liittyvä proteiini mTOR), jolloin saatiin mTORC1 tai rictor (rapamysiini tunteeton kumppani mTOR), jolloin saatiin mTORC2 [10]. mTORC2 voidaan aktivoida PI3K suoraan ja fosforyloi Akt at S473, joka yhdessä fosforylaation T308 testit tehdään koko aktivointi Akt [12], [13]. Akt fosforyloitiin S473 on liitetty huonoon ennusteeseen monissa syövissä, mukaan lukien ne, haima, maksa, eturauhanen ja rintojen [13]. Parhaiten määritelty substraatteja mTORC1 ovat kinaasit p70S6K1 (S6K1) ja EIF4E sitova proteiini 1 (4E-BP1), jotka molemmat ovat tärkeitä valvonnassa proteiinin translaation aloitus- [14], [15], [16]. Defosforyloituun 4E-BP1 voi sitoutua elF4E proteiinikompleksi estää cap-riippuvaisten käännös ja tärkeä rooli välittämisessä signalointi tapahtumia PI3K ja MAPK-reitin kasvaimissa [15]. Fosforyloitua S6K1 tarvitaan kääntämistä 5 ’päätteen oligopyrimidine (TOP) mRNA: t. Defosforylaatio S6K1 johtaa takaisinkytkentäsilmukan, joka johtaa upregulation reseptorityrosiinikinaasien tai insuliinin reseptorin alustan proteiinien (IRS), joka sitten aktivoi PI3K ja myös MAPK-signalointireitin [17], [18]. Ylikuuluminen välillä PI3K ja MAPK signaloinnin verkkoon tapahtuu myös tapa RAS ja ERK1 /2, aktivointi PI3K ja lisäksi mTORC1 kautta TSC1 /2 [19], [20], [21], [22].

mTORC1 voidaan selektiivisesti estää rapamysiini, joka on makrolidiantibiootti, että kompleksin sytosoliproteiiniin FKBP12 estää mTORC1 ja suurempina pitoisuuksina myös mTORC2 [23], [24]. Novel mTOR-inhibiittorit kliinisessä käytössä, kuten everolimuusi (RAD001) tai temsirolimuusia (CCI-779) ovat Rapamysiinijohdannai-. Annosteltiin anti-kasvain huumeet, vasteprosentit potilailla poikkeavat 0-30% riippuvainen kasvain [25]. Arvellaan, että suurin rajoite kliinisessä soveltamisessa mTOR estäjät tulokset mTORC1-S6K1-PI3K takaisinkytkentäsilmukka. Tämä johti estäjien kehittymisen, jotka kohdistuvat sekä, PI3K ja mTOR, kuten NVP-BEZ235 imidatso [4,5-c] kinoliini johdannainen [24].

UC, geneettisten muutosten PI3K reitin ovat yleisiä ja ilmenevät lähinnä PIK3CA, PTEN, Akt tai TSC1 /2 [26]. PTEN deleetiot ja mutaatiot sekä pienentynyt proteiinin ilmentyminen havaitaan etenkin suurilla kasvain vaiheissa ja laadut. Fosforyloituu S6K1 on itsenäinen ennustaja tautikohtaisia ​​selviytyminen [27], [28]. Prekliinisissä tutkimuksissa UC solulinjojen, PI3K esto LY294002 riippuvaisia ​​solulinjasta käytetään minimaalinen 40% alennus proliferatiivisia vaikutuksia ja estää solujen invaasiota [29], [30], [31]. Käyttökuntoon PTEN tukahdutti kasvaimen kasvun ja geneettinen vaiennettu Akt lisännyt radioherkkyyttä kasvainsolujen [27], [32]. Mahdollinen soveltaminen rapamysiinijohdannaisten UC terapiassa tukivat niiden kyky vähentää solujen elävyys eri virtsarakon syövän solulinjat ja hiirimallissa progressiivisen virtsarakon syövän, joissa p53 ja PTEN poistetaan virtsarakon uroteeliin [9], [33], [34], [35], [36]. Huolimatta tällaisen lupaava prekliinisissä havaintoja, alustavia tuloksia yhden varren, vaiheen II tutkimuksessa everolimuusiin yksinään osoitti vain vaatimaton antituumorivaikutus metastasoituneen UC [37]. Tiedot toiminnallista roolia ja molekyylitason mekanismi PI3K /Akt /mTOR ja MAPK signaalireaktioteissä UC ovat hyvin rajalliset tasalla ja voi selittää kliinisiä tuloksia. Niinpä tunnettu molekyylimekanismi PI3K /AKT /mTOR-signalointireitin ja sen rajat sääntelyn kanssa MAPK-reitin in vitro solulinjoissa kätkeminen tyypillisiä mutaatioita UC. Toiminnalliset seuraukset soluviestitykseen tapahtumista ja solujen kasvua tutkittiin jälkeen farmakologisen tai geneettinen häiriö eri molekyylikomponentit tämän reitin kautta pienmolekyylisalpaajien tai siRNA /shRNA oligonukleotideja. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy uusia oivalluksia molekyylitasolla verkostoon signalointireittien tutkittu, että tulos on perusta uusille hoitostrategioita ja ehdottaa ehdokas proteiinien molekyyli- kerrostuminen sairastavat metastaattista UC.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja reagenssit

solulinjat RT4, HT1376, 647V, 486P, J82, 253J, EJ28, T24 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) ja RT112 (German Collection of Microorganisms ja Cell Cultures), pidettiin 37 ° C: ssa RPMI 1640 tai DMEM, johon oli lisätty 10% FCS: ssa kosteutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5%: n tai 7,5% CO

2. NVP-BEZ235 ja RAD001 ystävällisesti toimittanut Novartis Pharma. U0126 ostettiin Cell Signaling Technology ja LY294002 Promega. Kantaliuokset valmistettiin DMSO: hon. Työskentely liuokset juuri valmistettuja soluviljelyelatusainetta klo kuvattu pitoisuuksina.

konstruktiot, transfektio ja infektio

siRNA oligonukleotideja vastaan ​​4E-BP1, S6K1 ja valvonta on suunnitellut ja Qiagen GmbH ja Akt 1, -2, -3 stealth siRNA oligonukleotidien Invitrogen. Ohimenevä transfektiot suoritettiin käyttämällä X-treme geenin transfektio tai Lipofec- tamin’ia reagenssia (Roche Diagnostics, Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden, käyttäen 2 ug /siRNA /6-hyvin. Triple transfektiota adenovirus mTOR shRNA ja ohjaus shRNA ostettiin SIRION Biotech. 1,5 x 10

5-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille päivää ennen infektiota ja adenovirus hiukkasia lisättiin infektiokertoimella 30. Suppression proteiinin ilmentyminen analysoitiin immunoblot 2-6 päivää transfektion jälkeen tai infektio.

immunoblottauksella ja vasta-aineet

Solut lyysattiin RIPA-puskuriin (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI, pH 7,2, 1% Triton X-100, 0,1% SDS: ää, proteaasi-inhibiittori cocktail (Roche Diagnostics ), fosfataasinestäjällä Mix (SERVA) 20 minuuttia jäillä. Liukenematon materiaali pelletoitiin sentrifugoimalla 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa, 30000 g. proteiini kvantifioitiin kanssa BCA ™ Protein Assay (Pierce). Yhtä suuret määrät proteiinia oli SDS-PAGE on 7,5-12% polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Zefa). immunoblottausta, käytetyt vasta-aineet olivat: Akt (C67E7), Akt1, Akt2, Akt3, Phospho-Akt (Ser473), Phospho-Akt (Thr308), GSK3p, Phospho-GSK3p (Ser9), mTOR, Phospho-mTOR (Ser2448), 4E-BP1, Phospho-4E-BP1 (Thr37 /46), S6K1, Phospho-S6K1 (Thr389), S6RP, fosforia S6RP, p44 /42 MAPK, Phospho-p44 /42 MAPK, c-Raf, Phospho-c-Raf (Ser338) (Cell Signaling Technologies). Toissijainen HRPO konjugoidut vasta-aineet hankittiin Dianova. Immunoblottaus suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu tai muunnettu mukaisesti valmistajan suositusten [38]. ECL-reaktio tehtiin näkyväksi käyttämällä Hyperfilm ECL autoradiografia elokuvat (GE Healthcare). Kvantifioinnin, kemiluminesenssin signaali analysoitiin kautta ChemiDoc ™ XRS ja määrä One® ohjelmistoa Bio-Rad Laboratories, Inc.

Cell kasvun

arvioimiseksi solujen kasvuun, soluja siirrostettiin 1000 solua /96-hyvin ja käsitelty kuvatulla. Sadonkorjuun jälkeen solut värjättiin trypane sininen ja elävien solujen laskettiin Neubauer kammiossa.

Solulisääntyminen

Solulisääntyminen mitattiin 24 tunnin kuluttua solujen käsittely RAD001, NVP-BEZ235 ja U0126 tai 48-72 h kuluttua transfektion /infektion siRNA /shRNAs. Bromideoksiuridiinia (BrdU) sisällyttäminen havaitsemiseksi juuri syntetisoidun DNA: n ja 7-amino-aktinomysiini D (7-AAD) värjäys havaitsemiseksi kaksijuosteista DNA: ta suoritettiin käyttäen APC BrdU Flow Kit (BD Biosciences) sykkivä solut kaksi tuntia mukainen valmistajan protokollan ja sen jälkeen virtaussytometrialla analysointia.

apoptoosimäärityksessä

Apoptoosi havaita mittaamalla kaspaasi 3/7 käyttämällä kaspaasi-Glo 3/7 Pitoisuus Promega GmbH, mukaan valmistajan protokollaa.

Solujen elinkelpoisuus

Soluja käsiteltiin RAD001, NVP-BEZ235 ja U0126 96-kuoppaisilla levyillä. 36 h, soluja inkuboitiin 3 h XTT. Entsyymireaktio analysoitiin 450 ja 650 nm: ssä ELISA-lukijalla.

Tilastollinen analyysi

Student T-testiä käytettiin vertaamaan keinot eri ryhmissä. Tilastolliset laskelmat tehtiin käyttäen Microsoft Office Excel.

Tulokset

Expression ja aktivoinnin tilan PI3K /Akt /mTOR väylän urothelial sinoomasolulinjoja

Analysoimme ilmaisun ja aktivointi tilan molekyyli keskeisten komponenttien PI3K väylän paneelin 9 UC solulinjat. Solut kerättiin ja hajotettiin proteiinin analyysi on subkonfluenteista vaiheessa. Expression of Akt, mTOR, S6K1, S6RP, 4E-BP1 ja PTEN havaittiin kaikissa solulinjoissa (kuvio 1A). Fosforylaatiota Akt at T308 ja S473 ja mTOR, 4E-BP1, S6K1 ja S6RP havaittiin 7 ulos 9 solulinjoissa. O aktivointi Akt voitu havaita RT4 ja 647V soluja. Näissä kahdessa solulinjoista mTOR, S6K1 ja S6RP fosforylaatio väheni merkittävästi, kun taas 4E-BP1 oli edelleen fosforyloituu RT4 soluissa. Näin ollen suurin osa tutkitaan solulinjojen näytteillä konstitutiivisesti aktivoitua PI3K /Akt /mTOR-signalointireitin. Expression of PTEN ei estä tätä aktivointia alle kasvuolosuhteet tutkittiin. Lisäkokeita varten päätimme työskennellä kaksi UC solulinjoista RT112 (yli-ilmentävät FGFR3) ja T24 (onkogeeninen H-Ras, homotsygoottinen PTEN mutaatio), sekä näytteille usein löytyy genomista muutoksia virtsarakon syöpä [39], [40], [41 ].

: proteiinin analyysiä varten solut lyysattiin RIPA-puskuri soveltaa SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Fosforylaatio ja ilmentymistilanne proteiinien analysoitiin immunobloteissa. B, C: Solulinjat käsiteltiin 1 h: n konsentraatiot RAD001 ja NVP-BEZ235. Ohjaus (0) sisälsi samoja pitoisuuksia DMSO kuin näytteitä kemiallisia yhdisteitä. Yksi edustaja tulos 3 itsenäisestä kokeesta on esitetty. D: inhiboiva konsentraatio 50% (IC 50) määritettiin kohdeproteiineja PI3K ja mTORC1. Kemiluminesenssin signaalit kvantitoitiin käyttäen ChemiDoc kuvantamisjärjestelmä (BioRad Laboratories) ja normalisoitiin ekspressiotaso. Keskiarvoja kolmesta tai useammasta itsenäisen kokeen näkyvät.

RAD001 /CCI-779 ja NVP-BEZ235 lohkon PI3K ja mTOR loppupään tavoitteita annoksesta riippuvaisella tavalla – mTORC1 riippumaton sääntely 4E-BP1

jotta luonnehtia toiminnallista merkitystä tämän reitin UC käytimme rapamysiinijohdannaisten RAD001 ja CCI-779 ja PI3K-estäjä NVP-BEZ235. Koska vaikutukset CCI-779 ja RAD001 hoito olivat identtisiä me vain kuvata RAD001 tuloksia. Ensimmäinen, annos-vaste-määrityksiä suoritettiin sen aktiivisuuden arvioimiseksi RAD001 ja NVP-BEZ235 1 h kuluttua solujen hoidon. Yhdisteiden aktiivisuus leimasi fosforylaation kuvio S6K1 /S6RP /4E-BP1 sekä aineille ja lisäksi varten Akt käytettäessä NVP-BEZ235. Signaali-intensiteetit mitattiin kemiluminesenssi kuvantamisjärjestelmä ja inhiboiva pitoisuus on 50% (IC 50) ja fosforylaation tason normalisoitu proteiinin taso laskettiin (kuvio 1 B, D). RAD001 inhiboi fosforylaatiota S6K1 ja S6RP mutta ei 4E-BP1 (kuvio 1 B). Kun altistamalla solut NVP-BEZ235, inhibitio S6K1 /S6RP havaittiin alhaisempi IC50 pitoisuuksilla kuin ne, jotka tarvitaan estämään AKT-fosforylaation T308 /S473 (kuvio 1C, D). 4E-BP1 fosforylaatio oli huomattavasti vähentynyt pitoisuuksina, jotka korreloivat näitä välttämättömiä Akt eston. Siten esto mTORC1 mukaan rapamysiinijohdoksille säännelty vain S6K1 /S6RP fosforylaation taas esto PI3K ja mTORC1 /2 esti molempia S6K1 ja 4E-BP1 /S6RP fosforylaatio. T24 solut reagoivat samanlaisilla keskittymän RAD001 kohtelu RT112 mutta 3 kertaa niin herkkä NVP-BEZ235 hoitoa.

Pitkäaikainen hoito RAD001 ja NVP-BEZ235 tuloksia S6K1 välittämää hyperactivation PI3K /Akt

on kuvattu, että S6K1 aktivaatio johtaa negatiivinen kierre säännellään paitsi PI3K joka on luultavasti vastaa vähäistä menestystä rapamysiinijohdosten kliinisessä käytössä [17]. Niinpä on osoitettu vaikutus yhdisteiden käyttää tässä takaisinkytkentäsilmukkaa. Käytimme kolmea eri pitoisuuksia RAD001 ja NVP-BEZ235, joka johti noin 50%: sta 100%: n inhibitio niiden molekyyli- tavoitteet ja analysoitiin vaikutukset PI3K-signalointireitin aktivaatio yli 72 tunnin ajan. RAD001 hoito johti S6K1 defosforyloinnilla ja indusoi hyperfosforylaatiota Akt on T308 ja S473 pitoisuusriippuvaisella tavalla koko tarkkailujakson aikana (1-72 h) RT112 soluissa taas T24-soluissa Akt hyperactivation indusoitiin vasta 24-72 tunnin kuluttua hoidon (kuva 1B /C, 2A, data 72 tuntia ei ole esitetty). Aktivoinnin tila Akt alavirran kohde GSK3-β korreloi fosforylaation taso Akt molemmissa solulinjoissa (kuvio 2A). 4E-BP1 fosforylaation tai proteiinin taso ei vaikuttanut RAD001 hoitoa. Kun käytetään NVP-BEZ235 alkuperäisen defosforyloitumista Akt 1 h kuluttua hoidon päinvastaiseksi kuluttua 24 h ja jopa konsentraatioilla 100-kertaisesti yli IC50 eivät riittäneet estämään fosforylaatio T308 ja vain osittain S473 (kuvio 2B). Joka vastaa aktivoinnin tila Akt, fosforylaation Akt substraatin GSK3-β havaittiin. Erityisesti, toistettiin hoito juuri valmistettua NVP-BEZ235 1 h ajaksi ennen solujen keräämistä ei estänyt tätä hyperactivation Akt (tuloksia ei ole esitetty). Fosforylaatio 4E-BP1 pysyivät tukahdutetaan koko tarkkailujakson aikana (kuvio 2C).

A, B: Effect of RAD001 tai NVP-BEZ235 hoitoa yli 24 tuntia fosforylaatiota tasolla Akt, S6K1, 4E-BP1 ja GSK3 -β in RT112 ja T24 soluja. Kokosolulysaateille sovellettiin SDS-PAGE: lla ja blotattiin PVDF-kalvoille ja sen jälkeen immunoblot havaitsemiseksi ilmentymisen ja fosforylaation taso kuvattu proteiineja. Ohjaus (0) sisälsi saman pitoisuuden DMSO kuin näytteitä kemiallisia yhdisteitä. C: RT112 solut transfektoitiin kaksi itsenäistä S6K1 erityistä siRNA-oligonukleotidien ja yhden satunnaisen siRNA oligonukleotidi kontrollina (CTR siRNA). Kolme päivää transfektion jälkeen, ilmaisun ja fosforylaation taso S6K1, Akt ja GSK3-β analysoitiin immunobloteissa.

Onko S6K1 suoraan indusoi PI3K /Akt-aktiivisuutta käsiteltiin hiljentämällä S6K1 ilmaisua käyttäen kahta erityistä siRNA: illa suunnattu vastaan ​​S6K1. Kaksi päivää transfektion jälkeen, Western blot analyysit osoittivat 90-96%: n vähennys S6K1 proteiinin taso (kuvio 2C). Vaimennussäätely S6K1 ilmaisun korreloi hyperfosforylaatiota Akt at S473 ja T308 ja GSK3-β, tukemalla kuvattu S6K1-PI3K /Akt takaisinkytkentäsilmukka.

esto PI3K /mTOR mutta kumpikaan vaiennettu mTOR eikä Akt ilme säätelee 4E-BP1 fosforylaation

Nämä tulokset sai meidät luonnehtia signalointi piirit PI3K, mTOR, Akt ja 4E-BP1 yksityiskohtaisemmin. Useimmissa ehdotti malleissa S6K1 ja 4E-BP1 ovat alavirtaan tavoitteita Akt ja mTORC1 ja fosforylaatio useimmissa raporteissa on samanaikaisesti säännellään [14], [15]. Tuloksemme osoittavat, että vain UC soluja käsiteltiin NVP-BEZ235 mutta ei RAD001 näytteillä tukahduttaminen sekä S6K1 ja 4E-BP1 fosforylaation viittaa siihen, että 4E-BP1 säädellään eri tavalla kuin S6K1. Koska NVP-BEZ235 tavoitteet jäseniä PI3K proteiinin perhe, PI3K tai sen alavirran kohde Akt tai mTOR saattaa olla mukana säätelyssä 4E-BP1 fosforylaatiota. Ensin testataan, jos voisimme tarkistaa vaikutuksia NVP-BEZ235 käyttämällä perusteellisesti tunnettu estäjä LY293002, joka oli alun perin suunniteltu erityinen PI3K estäjä mutta näyttää myös aktiivisuutta muita PI3K kuin liittyvien kinaasien [42], [43]. S6K1 fosforylaatio oli vähennetty, jonka IC50 on 3 nM ottaa huomioon, että IC50 kaksinkertaistui 7 nM indusoimaan vähenemiseen Akt (S473 /T308) ja 4E-BP1 fosforylaation, mikä muistuttaa kinetiikka NVP-BEZ235 aktiivisuus Akt /4E-BP1 fosforylaation (kuvio 3A ja 1B).

V: Annosvastearvot soluilla käsiteltiin 24 tuntia PI3K estäjän LY294002. Solulysaatit analysoitiin immunobloteilla osoittavat annoksesta riippuvaisia ​​vaikutuksia ilmaisun ja fosforylaation taso Akt, S6K1 ja 4E-BP1 in RT112 soluissa. B: hiljentäminen mTOR ilmaisun 3 vuorokauden kuluttua infektion adenoviruksen mTOR shRNA tai ohjaus shRNA (ctr shRNA). Kokosolulysaateille analysoitiin immunobloteilla fosforylaatioon ja ilmentymistason S6K1, S6RP, Akt ja 4E-BP1. C: Akt ilmaus säätelee fosforylaatio S6K1 muttei 4E-BP1. Transfektoimalla soluja erityisiä varkain siRNA oligonukleotidien tai kontrolloida siRNA vaiennettu ilmaus kaikkien kolmen isomuotoa Akt. 3 vuorokauden kuluttua transfektiosta solut lyysattiin sovellettu SDS-PAGE blotattiin PVDF-kalvolle ja ilmentymistason Akt isoformeja ja ilmaisun sekä fosforylaation taso 4E-BP1 ja S6K1 analysoitiin.

Jotta edelleen tutkia tämän havainnon, käytimme adenoviruksen shRNA lähestymistapa vaientaa mTOR-proteiinin ilmentymisen jonka pitäisi johtaa erityinen poistoa sekä, mTORC1 ja mTORC2 proteiini kompleksit. Kaksi päivää infektion jälkeen, western blot-analyysit vahvisti 85-96% Knockdown vuonna mTOR-proteiinin taso, joka pysyi vakaana 5 päivää (kuvio 3B). Knockdown johti defosforylointia S6K1 ja S6RP vaikuttamatta ekspressiotaso. Vain vähäisiä vaikutuksia 4E-BP1 fosforylaation suhteessa 4E-BP1 proteiinin tason havaittiin. Erityisesti Akt fosfory- väheni 40-60% enemmän T308 ja S473 jäämiä.

Viime, vaikutus Akt on 4E-BP1 fosforylaatio leimasi käyttämällä siRNA kohdistuu kolmeen eri isoformit Akt. Kolme päivää transfektion jälkeen, yhdistetyt kaataa kaikki kolme isoformeja johti 90% vähentää proteiinin ilmentymistä kaikissa kolmessa Akt isoformeja (kuvio 3C). Vain S6K1 fosforylaatio muttei 4E-BP1 fosforylaation tason vähenivät vaikuttamatta proteiinin taso osoittaa, että 4E-BP1 toisin S6K1 ei alavirtaan Akt tutkituissa solulinjoissa.

Ylikuuluminen välillä PI3K ja MAPK -signalointireitistä tapahtuu useita vaiheita

Kun otetaan huomioon PI3K ja MAPK-reitin biologian, selvitimme vuorovaikutusta kahden reitin virtsarakon syöpään. Soluja käsiteltiin RAD001, NVP-BEZ235 kanssa tai MEK1 /2-estäjän U0126 ja aktivointi asema avaimen proteiinien sekä reittien 1-72 h käsittelyn jälkeen analysoitiin Western blot. Esto mTORC1 mukaan RAD001 aiheuttama aktivoituminen ERK1 /2 fosforylaation 24-72 h käsittelyn jälkeen (kuvio 4A, yläpaneeli). Sama vaikutus havaittiin, kun hiljentäminen S6K1 proteiinin ilmentyminen, mikä johti lisääntyneeseen Raf1 /ERK1 /2-fosforylaation (kuvio 4B). Kuitenkin esto sekä PI3K ja mTOR by NVP-BEZ235 nopeasti aiheuttama ERK1 /2 fosforylaation koko havaitun ajan 1-72 h (kuvio 4A, alempi paneeli). Voimme päätellä, että suppressio PI3K /Akt /mTOR aktiivisuus johtaa yleensä aktivointi Raf /MEK /ERK signalointireitin, mutta kinetiikka prosessi riippuu siitä, mikä molekyyli tavoite entisen reitti estyy.

: RT112 ja T24-soluja käsiteltiin RAD001 tai NVP-BEZ235 1 h tai 24 h. Expression ja fosforylaatio tila ERK1 /2 analysoitiin immunoblot-kokeilla kokosolulysaateista. B: Kaksi päivää transfektion jälkeen siRNA oligonukleotidien vastaan ​​S6K1 tai ohjaus siRNA (CTR siRNA), solut hajotettiin ja fosforylaation ja ekspressio tilan Raf ja ERK1 /2 analysoitiin immunobloteissa. C: Soluja käsiteltiin 24 h RAD001, NVP-BEZ235 ja U0126 yksin tai yhdessä ja vaikutukset ilmaisun ja fosforylaation taso Akt, S6K1 ja ERK1 /2 analysoitiin immunobloteissa.

sitten analysoitiin biokemiallisia seurauksia kun estämällä sekä PI3K /AKT /mTOR ja MAPK-reitin käyttäen RAD001, NVP-BEZ235 tai U0126 yhdistelmänä tai U0126 yksin. Kun soluja käsiteltiin U0126 yksin, ERK1 /2-fosforylaation on poistettu kokonaan ottaa Akt fosforylaatio S473 ja T308 on voimistunut (kuvio 4C). Mielenkiintoista, emme voineet osoittaa muutoksia S6K1 fosforylaatioon. Kun yhdistetään U0126 joko RAD001 tai NVP-BEZ235, Akt hyperfosforilointi lisääntyi merkitsevästi verrattuna hoitoon joko yhden aineen T24-soluissa.

PI3K /AKT /mTOR ja MAPK signalointi säätelevät solujen lisääntymistä, elinkelpoisuuden ja apoptoosin

Seuraavaksi määritetään miten manipulointia PI3K ja MAPK signalointi vaikutteita soluproliferaatiota in UC. Ensimmäinen, soluja käsiteltiin RAD001, NVP-BEZ235 ja U0126 yksinään tai yhdistelmänä, ja solujen lisääntyminen tarkkailtiin ajan kuluessa. Kolme päivää hoidon jälkeen, RAD001 inhiboi soluproliferaatiota 62% vuonna RT112 ja 40% T24-soluissa verrattuna liuotinkontrolliryhmän (kuvio 5A). Hoito NVP-BEZ235 estivät täysin soluproliferaatiota RT112 soluissa ja vähensi sitä 66% vuonna T24-soluissa. U0126 hoito esti lisääntymistä 70% ja 76% vuonna RT112 tai T24-soluissa, vastaavasti. Yhdistämällä RAD001 tai NVP-BEZ235 kanssa U0126 tuotti additiivisia vaikutuksia, yhdistelmällä NVP-BEZ235 /U0126 on tehokkain (kuvio 5A). Karakterisoimiseksi näitä vaikutuksia yksityiskohtaisemmin, solusyklin analyysi mitattiin yhdistämällä sisällyttämällä BrdU ja 7-AAD värjäys, apoptoottisen vasteen mittaamalla kaspaasiaktiivisuus ja elinkelpoisuus /metabolian XTT-määrityksissä. Kuten solusyklin analyysi, RAD001 hoito vähentynyt osa läpikäyvien solujen S-vaiheessa 11% molemmissa solulinjoissa (kuvio 5B). NVP-BEZ235 vähensi S-vaiheessa olevien solujen 84% RT112 ja 22% T24, kun taas U0126 vähensi solujen S-vaiheen 97% vuonna T24 mutta vain 52% RT112 soluissa. Yhdistelmä PI3K ja MAPK signaloinnin inhibiittorit oli additiivinen vaikutus soluproliferaatioon yhdistelmällä NVP-BEZ235 /U0126 on tehokkain vähentämään solumäärät S-faasissa 94-98%. Kaikki aineet aiheuttama kasvu soluissa pidätetty G1 vaiheeseen, korreloi lasku solujen päästä S-vaiheeseen, mikä osoittaa, että inhibitio joko reitti johtaa G1 pidätys UC solulinjoissa (kuvio 5B). Apoptoosi mitattiin kaspaasiaktiivisuus (kuvio 5C) [11]. Sekä, RAD001 ja NVP-BEZ235 hoito laski kaspaasin aktivaatio RT112 soluissa 32-45%. Vuonna T24 soluja, RAD001 ja NVP-BEZ235 vähennetään kaspaasiaktiivisuus mukaan 43-48%. U0126 ei ollut merkittävää vaikutusta kaspaasiaktiivisuus eikä lisätä aktiivisuutta RAD001 tai NVP-BEZ235 kun yhdistetään. Mittaamiseksi solujen elinkykyä, sama määrä soluja analysoitiin käyttäen XTT-määritystä. Riippuvainen solujen taustalla, havaitsimme 30-50% kanssa RAD001 ja 70-85% kanssa NVP-BEZ235 (kuvio 5D). Mielenkiintoista, emme voineet havaita additiivisten yhdistetyllä estämällä PI3K /Akt /mTOR ja MAPK polkuja. Olemme päätellä, että PI3K /mTOR ja MAPK-reitin aktiivisuutta UC ohjaus solujen lisääntymisen, apoptoosin ja solujen elinvoimaisuutta ja että molemmat reitit voivat osittain korvata menetyksen toistensa suhteen leviämisen.

RT112 ja T24 soluja käsiteltiin RAD001 (5 nM), NVP-BEZ235 (100 nM T24, 500 nM RT112) ja U0126 (25 nM), yksin tai ilmoitettu yhdistelmä ja DMSO-kontrollin (CTR). V: solumäärät, solut värjättiin trypaanisinisellä ja numerot eläviä soluja määritettiin. B: Solusyklianalyysiä kuluttua 24 h hoidon kemialliset yhdisteet mukaan BrdU yhdistettynä 7-AAD värjäystä. C: mittaaminen kaspaasi 3/7 toiminnan muuttujana apoptoosin ja D: XTT-testi havaitsemiseksi solun elinkelpoisuuden suoritettiin 24 tuntia hoidon jälkeen. Esitetyt arvot ovat keskiarvo ± keskihajonta 3 riippumattomasta kokeesta. Studentin t-testi suoritettiin tilastollinen analyysi (*: p 0,05).

Yhdistetty aktiivisuus S6K1 ja 4E-BP1 säätelevät solujen proliferaatiota urothelial karsinooma

Lopuksi me käsiteltiin kysymystä, miksi NVP-BEZ235 vaikuttaa solujen kasvuun enemmän efficaciously kuin RAD001. Olemme osoittaneet, että NVP-BEZ235 toisin RAD001 vaikuttaa sekä, S6K1 ja 4E-BP1 fosforylaatiota. Siten käytimme joko siRNA oligonukleotidien suunnattu S6K1 tai 4E-BP1 tai yhdistettynä RAD001 kanssa 4E-BP1 siRNA jäljittelemään oletetun lisävaikutusta NVP-BEZ235. Kaksi päivää transfektion jälkeen siRNA vastaan ​​4E-BP1 tai S6K1 alennetaan proteiinin ilmentymistä 80-96% (kuvio 6A, 2C). Solut vaimentaa S6K1 tai 4E-BP1 ilmentymisen osoittivat merkittävästi vähentää solujen lisääntymistä 40% (RT112) 60% (T24) verrattuna kontrolleihin (Fig. 6B), jolloin saatiin vastaava vaikutus, jotka havaittiin sen jälkeen, kun everolimuusille hoidon (kuvio 5A). Kuitenkin yhdistelmä 4E-BP1 siRNA ja everolimuusi vähensi solujen kasvua 80-85%, samassa määrin kuin havaittiin NVP-BEZ235. Analyysi soluproliferaation osoittaneet, että vaikutus oli jälleen välittämä solusyklin pysähtymisen G1 /G0 vaihe (tuloksia ei ole esitetty). Yhteenvetona, sekä mTORC1 alavirrassa oleva kohde S6K1 ja 4E-BP1 ovat samassa määrin osallisena säätelyssä UC solujen lisääntymistä säätelemällä solukierron etenemisen G1 /0 S-vaiheeseen ja solujen elinkykyä.

: Kaksi päivää transfektion jälkeen siRNA vastaan ​​4E-BP-1, proteiinin ilmentymistä RT112 ja T24-solujen havaittiin immunobloteista. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. B: Kasvu elävien solujen, vaimentaa S6K1 tai 4E-BP1 ilmentymisen tai solujen vaimentaa 4E-BP1 ilmaisun ja inkuboitiin everolimuusiin (RAD001) seurattiin ajan kuluessa. Keskiarvot ± standardipoikkeamat esitetään; tilastolliset vertailut suoritettiin käyttäen opiskelija T-testiä (*: p 0,05).

Keskustelu

Vaikka ymmärtää paremmin virtsarakon syövän biologian sisällä viime vuosina vähäisiä parannuksia hoitona tämän sairauden on saavutettu viimeisen kahden vuosikymmenen aikana. PI3K /Akt /mTOR ja MAPK signalointireittejä ovat alttiita mutaatioita ja poikkeava aktivaatio tässä kasvain kokonaisuus ja saattaa antaa sopivan tavoitteet tehokkaampien hoitojen [44]. Niinpä me tyypillistä signaalireaktioteissä osalta aktivoinnin tila, molekyylimekanismin ja merkitystä soluproliferaatiota in UC. Voisimme vahvistaa aiemmin kuvattu sääntely circuitries jotka ohjaavat aktivointia näistä reiteistä. Tuloksemme viittaavat vahvasti siihen uudella mekanismilla, joka ohjaa aktivointi loppupään elementin 4E-BP1 tämän signalointia verkossa.