Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aiemmat tutkimukset ehdotti ataksia-telangiektasiassa ryhmä D täydentävät geeni (ATDC) kuin onkogeenilla monissa syöpien riskiä. Kuitenkin sen ilme ja biologisia toimintoja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) jää epäselväksi. Tässä tutkimme sen ilmentämiskuviota 109 tapausta ihmisen NSCLC näytteiden immunohistokemiallisesti ja totesi, että ATDC yliekspressoitui vuonna 62 109 NSCLC näytteistä (56.88%). ATDC yliekspressio korreloi histologinen tyyppi (p 0,0001), kasvain tila (p = 0,0227) ja histologisia eriyttäminen (p = 0,0002). Seuraavaksi yliekspressoituu ATDC normaaleissa ihmisen keuhkoputkien epiteelisolujen linja HBE ja tyhjentynyt sen ilmentymistä NSCLC solulinjoissa A549 ja H1299. MTT ja pesäkemuodostusta osoittivat, että ATDC yliekspressio edistää solujen lisääntymistä, kun taas sen loppuminen esti solujen kasvua. Lisäksi solusyklin analyysi osoitti, että ATDC yli-ilmentyminen väheni prosenttiosuus soluja G1 vaiheeseen ja lisääntynyt solujen prosenttiosuus S-vaiheessa, kun taas ATDC siRNA-hoito lisäsi G1 vaiheen prosenttiosuus ja vähensi S-vaiheen prosenttiosuus. Lisäksi tutkimuksessa kävi ilmi ATDC yliekspressio voi säätää ylös sykliini D1 ja c-Myc ilmentymistä HBE-soluissa, kun taas sen loppuminen alassäädetty sykliini D1 ja c-Myc ilmentymistä A549 ja H1299 soluja. Lisäksi ATDC yliekspressio liittyi myös lisääntynyt leviämisen indeksi, sykliini D1 ja c-Myc ilmentymistä ihmisen NSCLC näytteissä. Edelleen kokeet osoittivat, että ATDC sääteli sykliini D1 ja c-Myc ilmentyminen riippumattomaksi Wnt /β-kateniinin tai p53 signalointireitille. Mielenkiintoista, ATDC yliekspressio lisäsi NF-KB toimittaja lusiferaasivaikutusta ja p-IKB proteiinin tason. Vastaavasti NF-KB estäjä esti vaikutus ATDC on ylössäätöä sykliini D1 ja c-Myc. Lopuksi osoitimme, että ATDC voisi edistää keuhkosyövän lisääntymistä kautta NF-KB aiheuttama säätely ylöspäin sykliini D1 ja c-Myc.

Citation: Tang ZP, Dong QZ, Cui QZ, Papavassiliou P, Wang ED Wang EH (2013) ataksia-verisuoniluomen Group D täydennykseksi Gene (ATDC) Edistää Keuhkosyöpä soluproliferaatiota aktivointi NF-KB Pathway. PLoS ONE 8 (6): e63676. doi: 10,1371 /journal.pone.0063676

Editor: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italia

vastaanotettu: 15 marraskuu 2012; Hyväksytty 7 huhtikuuta 2013 Julkaistu: 12 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Tang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (avustukset 81071905 ja 81272606). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on yksi johtavista syistä kaikkien syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti ja erityisesti ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) muodostaa suurimman osan diagnosoitujen [1], [2] . Useita tekijöitä, kuten geneettiset, epigeneettiset ja microenvironmental, tärkeitä rooleja selviytymisen ja kolonisaatio kasvainsolujen kaukana olevan kudoksen päällä, joka johtaa etäpesäkkeiden [3]. Kuitenkin, vaikka monet kokeelliset tutkimukset, taustalla molekyylitason mekanismi, joka ohjaa etäpesäke yksittäisten kasvainten ei ole vielä täysin ymmärretty. Rajallisen menestyksen tavanomaisten hoitomuotojen saavuttaa pitkän aikavälin selviytymisen keuhkosyöpäpotilaita, tutkimustyötä on keskittynyt biologisiin reittejä mukana kasvainprogression ja neoplastisen solujen eloonjäämistä, jotta voidaan tunnistaa mahdollisia terapeuttisia kohteita [4].

ataksia-telangiektasiassa ryhmä D täydentävät geeni (ATDC) kuuluu kolmikantaista motiivin (TRIM) perhe [5]. TRIM proteiinit tyypillisesti useita konservoituneiden domeenien kuten useiden sinkkiä sormi motiiveja ja leusiinivetoketjuun motiivi. Nämä proteiinit ovat osoittautuneet osallistua solujen kasvun säätelyssä ja kehitystä ja ovat sekaantuneet useissa ihmisen sairauksiin, kuten HIV-infektio ja leukemia [6], [7]. Erityisesti, TRIM proteiineja, kuten TRIM8, TRIM22, TRIM38 ja TRIM40 on raportoitu harjoittaa säännellä NF-KB: n aktivaation [8] – [11]. ATDC, joka tunnetaan myös nimellä TRIM29, tunnistettiin alun perin etsiä vastaavan geenin geneettisen häiriön ataksia-telangiektasiassa ja sen havaittiin olevan radioherkkyyttä vaimennin toiminnot [12]. Myöhemmät tutkimukset osoittivat, että ATDC on yli-ilmentynyt useissa syöpien, mukaan lukien haiman, mahalaukun, virtsarakon, paksusuolen ja peräsuolen, munasarja- ja kohdun limakalvon syöpien, sekä plasmassa solun myelooma [13] – [21]. Kun taas sen ilmentyminen oli ilmeisesti vähentää useissa muissa kasvaimissa, kuten melanooma, rinta-, eturauhas-, pään ja kaulan alueen syövissä [22] – [27]. Vain yksi kuvattiin lisääntynyt ATDC mRNA: n ilmentymisen yhteydessä korkea histologinen asteen, suuri kasvain koon, laajuuden kasvaimen invaasion ja imusolmuke etäpesäke mahasyövän [15]. Kuitenkin parhaan tietomme mukaan proteiinin ilmentymistä ATDC ja sen suhdetta kliinis tekijät ensisijainen keuhkosyövässä ole koskaan tunnettu.

Tuoreen tutkimuksen haiman adenokarsinooman solulinjan osoitettiin, että ATDC vuorovaikutuksessa epäsiisti -2 ja komponentit β-kateniinin tuhoa monimutkainen vakauttaa β-kateniinin ja aktivoida Wnt signalointia, ratkaiseva polku, joka edistää syövän etenemisen monenlaisia ​​syöpä [13]. Muut tutkimukset ehdotti, että ATDC sitoo p53 sytoplasmassa ja takavarikoida sen ydin johtaa alas-säätely sen kohdegeenin p21 [28]. Kun A431 ihmisen levyepiteelikarsinoomasolu linja, ATDC todettiin vuorovaikutuksessa välissä filamentti proteiinin vimentiinista ja inhibiittori proteiinikinaasi C, ja se toimii näin osa proteiinikinaasi C signaalinvälitysreitin [29]. Kaiken kaikkiaan nämä aiemmat tutkimukset viittaavat siihen, että ATDC voi toimia onkogeenin edistää syöpäsolujen lisääntymistä ja invaasiota. Kuitenkin biologinen roolit ATDC keuhkojen syöpäsoluja ei ole vielä määritelty.

Jotta edellä mainittuihin kysymyksiin, pyysimme ATDC ilmaisun ja kudosjakautumisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä immunohistokemiallisesti ja analysoidaan sen yhdessä kliinis parametreja. Tutkimme myös roolit ATDC soluproliferaatioon ja solusyklin etenemisen käyttämällä vahvistus- tai menettämisestä toiminnon lähestymistapoja. Vielä tärkeämpää on, selvitimme mahdollisia mekanismi, jolla ATDC toimintojen edistämiseksi leviämisen keuhkosyövän soluja.

Methods

Potilaat ja näytteet

Tutkimus suoritettiin hyväksynnän institutionaalisten Review board China Medical University. Kirjallinen suostumus antoivat osallistujien tietonsa tallennetaan sairaalan tietokantaan niiden yksilöitä voidaan käyttää tässä tutkimuksessa. Kaikki kliiniset tutkinnan suorittamisen periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Primaarikasvaimen näytteet kerättiin 109 potilaalla on levyepiteelisyöpä (SCC) tai adenokarsinooma keuhkojen, joille tehtiin täydellinen kirurginen resektio ensimmäisessä Affiliated sairaala China Medical University vuosien 2001 ja 2004 Suuri cell carcinoma, adenosquamous karsinooma tai muu NSCLC alatyypit jätettiin pois tästä tutkimuksesta. Seurantatiedot saatiin tarkistamalla potilasasiakirjamerkinnöistä. Kukaan potilaista ei ollut saanut sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen kirurgista resektion, ja kaikki potilaat hoidettiin rutiinia kemoterapian jälkeen resektio. Kaikki 109 tapausta tarkistettiin histologista alatyypin, erilaistumista ja kasvaimen vaiheessa. Histologinen diagnoosi ja laatu arvioitiin hematoksyliinillä ja eosiinilla leikkeitä mukaan Maailman terveysjärjestön (WHO) suuntaviivat luokittelusta. 109 tapausta, 46 (42,2%) oli SCC ja 63 (57,8%) oli adenokarsinooma. Imusolmukemetastaaseja todettiin 44 (40,4%) ja 109 potilasta. P-TNM pysähdyspaikan järjestelmä International Union syöpää vastaan ​​(seitsemäs painos) käytettiin luokittelemaan tapauksia.

Soluviljely ja hoito

NHBE, A549, H1299, H157 ja H460-solulinjoja saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). LH7 ja LK2 solulinjoja ostettiin Shanghai Cell Bank of Kiinan Academy of Science. BE1 solulinja saatiin lahjana Dr. J Zheng (Department of Pathology, Pekingin yliopiston School of Medicine). BE1 solulinja perustettiin Dr. J Zheng ja Dr. WY Zhu vuonna 1995 ja nyt voisi ostaa National Platform of Experimental Cell resurssit Sci-Tech (Peking, Kiina). Soluja viljeltiin RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia. Soluja kasvatettiin steriileillä kudosviljelymaljoihin ja siirrostettiin joka 2 päivää käyttäen 0,25% trypsiiniä (Invitrogen). NF-KB estäjä BAY 11-7082 (10 uM, 6 tuntia) ostettiin Sigma Aldrich.

immunohistokemia

Kirurgisesti leikattiin kasvain näytteet kiinnitettiin 10% neutraaliin formaliiniin, valettiin parafiiniin ja 4 um: n paksuisia leikkeitä valmistettiin. Immunovärjäys suoritettiin käyttämällä avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksin menetelmä (Ultra Sensitive TM, Maixin, Fuzhou, Kiina). Kohdat poistettiin parafiini ksyleenillä, vedettömät asteittaisella alkoholi-sarjan ja keitettiin 0,01 M sitraattipuskurissa (pH 6,0) 2 minuutin ajan autoklaavissa. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin käyttämällä vetyperoksidia (0,3%) ennen inkubointia osien normaalia vuohen seerumia voidaan vähentää ei-spesifisen sitoutumisen. Kudosleikkeitä inkuboitiin sitten ATDC kanin polyklonaalisella vasta-aineella (1:150 laimennos) (cat.17542-1-AP, Proteintech, IL, USA). Kanin immunoglobuliini (samaan pitoisuus antigeenispesifisten vasta-aine) (cat.NC-100, Maixin, Fuzhou, Kiina) käytettiin negatiivisena kontrollina. Immunohistokemiallinen värjäys Ki67 (1:200 laimennus) (cat.MAB-0129, Maixin, Fuzhou, Kiina), c-Myc (1:500 laimennus) (cat.ab32, Abcam) ja sykliini D1 (1:100 laimennus) ( cat.2978, Cell signalointi tekniikka, Boston, MA, USA) suoritettiin myös seuraavasti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Värjäys kaikkien primaaristen vasta-aineiden suoritettiin huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan. Biotinyloitu vuohen anti-hiiri-seerumin IgG- tai biotinyloidulla vuohen anti-kanin seerumi IgG (ready-to-use) (cat.KIT-9922, Maixin, Fuzhou, Kiina) käytettiin toisena vasta-aineena. Pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua streptavidiinia-biotiini, jota seurasi 3, 3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla kehittää Peroksidaasireaktio. Counterstaining tehtiin hematoksyliinillä ja leikkeet sitten dehydratoidaan etanolin kanssa, ennen kuin se on asennettu.

kaksi tutkijat arvioitu riippumattomasti kaikki kasvaimen dioja. Viisi sattumanvaraisesti kentät tutkittiin kullekin levylle ja 100 solua kohden arvioitiin korkea suurennus kenttä (400 x). Normaali keuhkoputken epiteelin kasvain kohdissa käytettiin sisäisenä negatiivisena kontrollina. Immunovärjäystä ATDC teki seuraavat puoliksi Paljousosuusmenetelmää arvioimalla värjäytymisen intensiteettiä ja prosenttiosuus solujen edustavan kasvaimen aloilla suhteessa havaittuun valvonnassa soluissa. Positiivinen immunovärjäyksellä määriteltiin selvä sytoplasmista värjäytymistä syöpäsoluja. Intensiteetti ATDC sytoplasmista värjäytymistä oli edelleen ositettu kuin 0 (ei värjäystä), 1 (heikko) ja 2 (voimakas). Prosenttiosuus tulokset nimettiin 1 (1-25%), 2- (26-50%), 3 (51-75%) ja 4 (76-100%). Tulokset Kunkin kasvaimen näytteen kerrottiin antamaan lopullinen pistemäärä 0-8 ja koko ilmaus ATDC määritettiin joko negatiivisia tai heikkoa ilmentymistä (-), jos koko tilanne oli 4, ja positiivisena ilmaisun tai korkea lauseke (+), jos koko tilanne oli ≥4.

Immuunihistokemialliset värjäyksen Ki-67 arvioitiin ja pisteytettiin prosenttiosuutena immunoreaktiivisten syöpäsolujen, joissa on yhteensä 500 kasvainsolujen tutkittiin leikettä kohti. Mediaaniarvon tämän sarjan (35%) käytettiin kynnysarvon ositusta kasvaimia ryhmään, jolla on alhainen (alle 35%) indeksin ja toisessa on korkea (≥35%) indeksi solujen lisääntymisen. Ilmaisu c-Myc ja sykliini D1 määriteltiin korkea ilmentymisen tai alhainen mukaan edellisen kriteerien [30], [31].

Quantitative Reaaliaikainen PCR (SYBR Green Method)

Quantitative reaaliaikaisia ​​PCR suoritettiin käyttäen SYBR Green PCR master mix, joissa on yhteensä 20 ui vuonna 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Reaktio ehto on seuraava: 95 ° C 30 sekuntia, 40 sykliä 95 ° C 5 sekuntia ja 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Dissosiaa- askel levitettiin tuottaa sulamiskäyrään vahvistaa spesifisyyden vahvistusta. p-aktiini transkriptien monistettiin ja toimi viitteenä. Suhteellisen geeni-ilmentymisen olivat edustettuina ACt = Ct-geenin -Ct viite, ja kertainen muutos geenien ilmentyminen laskettiin 2-ΔΔCt menetelmällä. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Alukesekvenssit olivat seuraavat:

β-aktiini eteenpäin, 5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3 ’, β-aktiini käänteinen, 5′-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′ ; ATDC eteenpäin, 5’-GCACCGGACACCATGAAGA-3 ’, ATDC käänteinen, 5′-GGAGACGAGGGCTGGTATGA-3’.

Western Blot analyysi

Yhteensä proteiineja NSCLC kudoksista ja keuhkosyövän solulinjoja poimittiin lyysipuskuria (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) ja mittaamaan Bradfordin menetelmällä. Viisikymmentä mikrogrammaa proteiinia erotettiin SDS-PAGE (12%). Siirron jälkeen, polyvinyli- fluoridi (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, USA) inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa seuraavilla vasta-aineilla: ATDC (1:1000; cat.17542-1-AP, Proteintech), β- aktiini (1:500, cat.612657), β-kateniinin (1:1000, cat.610154) (BD Transduction Laboratories), sykliini A2 (1:1000, cat.4656S), sykliini D1 (1:1000; cat. 2978), sykliini E1 (1:800, cat.4129), CDK2 (1:1000, cat.2546), CDK4 (1:1000, cat.2906), CDK6 (1:1000, cat.3136), p- Rb (Ser807 /811) (1:2000, cat.8516), P21 (1:800, cat.2947), p-IKB (Ser32) (1:500, cat.2859) (Cell signaling tekniikka, Boston, MA , USA), c-Myc (1:1000; cat.ab32, Abcam), aktiivinen β-kateniinin (1:500; cat.05-665, Millipore), p65 (1:500, sc-8008, Santa Cruz) . Inkuboinnin jälkeen peroksidaasiin kytkettyä anti-hiiri (cat.sc-2005) tai kanin (cat.sc-2004) IgG: tä (Santa Cruz Biotechnology), 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan, sitoutuneet proteiinit tehtiin näkyviksi käyttämällä ECL (Thermo Fisher Scientific) ja kvantitoitiin käyttäen Bioimaging Systems (UVP Inc., Upland, CA, USA). Suhteellinen proteiinin tasot laskettiin viitaten P-aktiini kuin latauskontrollina.

plasmiditransfektiolla ja Sirna Treatment

pCMV6-ATDC plasmidi ostettiin Origene. pCMV6 tyhjää vektoria käytettiin negatiivisena kontrollina. Paikan tavoite plus siRNA varten ATDC (M-012409-01) ja ei-kohdistaminen siRNA # 1 (D-001810-01) ostettiin Dharmacon (Lafayette, CO, USA). Plasmidi ja siRNA transfektoitiin soluihin käyttäen Attractene transfektioreagenssia (Qiagen, Hilden, Saksa). Lyhyesti, solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle 24 tuntia ennen koetta. MRNA ja proteiini tasot ATDC määritettiin 48 tuntia transfektion jälkeen.

Cell Proliferation Test ja Colony muodostumisen määritys

Soluproliferaatiomääritys suoritettiin käyttäen Cell Counting Kit-8-liuosta (Dojindo, Gaithersburg, MD) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, solut ympättiin pitoisuutena 5 x 10

3 solua /100 ul /kuoppa 96-kuoppaisille viljelylevyille ja käsiteltiin 10 ul /kuoppa Cell Counting Kit-8 ratkaisu viime 4 tunnin viljelmän . Optinen tiheys kuopista mitattiin 450 nm: ssä aallonpituudella käyttäen mikrolevylukijaa.

pesäkemuodostusta, solut istutettiin kolmeen 6 cm soluviljelymaljoille (1 x 10

3 solua per malja ) ja inkuboitiin 12 päivää. Levyt pestiin PBS: llä ja värjättiin Giemsa. Pesäkkeiden lukumäärä, joissa on enemmän kuin 50 soluja laskettiin.

Cell Cycle Analysis

Solut (5 x 10

5) ympättiin 6 cm: n kudosviljelymaljaa. Sen jälkeen, kun 12 tunnin inkuboinnin jälkeen solut käsiteltiin seerumistarvaatio 24 tuntia ennen transfektiota ilmoitetuilla annoksilla plasmidit tai siRNA. Ilmoitettuina ajankohtina, solut kerättiin, kiinnitettiin 1% paraformaldehydi, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja värjättiin 5 mg /ml propidiumjodidia PBS: ään lisättynä RNaasi A: lla (Roche, Indianapolis, IN) 30 minuutin ajan huonelämpötila. Värjätyt solut kerättiin talteen ja analysoitiin käyttäen BD virtaussytometrialla järjestelmiä.

Luciferase Reporter Assay

Reportteri geeni transfektio ja lusiferaasin aktiivisuuden määritys suoritettiin, kuten seuraavat: solujen konfluentteja kasvun 24-kuoppalevyllä oli kotransfektoitiin tulikärpäsen lusiferaasi toimittaja (0,2 ug) yhdessä Renilla lusiferaasireportterigeenin (Promega Co.) (0,02 ug) 12 tuntia käyttäen attractene reagenssia (Qiagen) protokollien mukaisesti, jotka valmistajien. Reportteri plasmidit TOP /FLASH, p53 ja NF-KB ostettiin Biotime Biotechnology, Kiina. Lusiferaasin aktiivisuus mitattiin solu-uutteita käyttämällä kahta lusiferaasireportteriplasmidin geenin määritys kit (Promega, CA, USA). Suhteellinen aktiivisuus reportterigeenin laskettiin jakamalla signaalit tulikärpäsen lusiferaasi reportteri mukaan saadut signaalit Renilla lusiferaasireportterigeenin.

Tilastollinen analyysi

SPSS versio 16.0 for Windows käytettiin kaikissa tilastollisissa analyysit. Chi-neliö testiä käytettiin tutkimaan mahdollisia korrelaatioita ATDC ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia tekijöitä. Studentin t-testiä käytettiin testaamaan ero ryhmien ja p-arvot perustuvat kaksipuolisen tilastollinen analyysi, jossa on p-arvo 0,05 nimeävän tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

yli-ilmentyminen ATDC proteiinin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä kudokset ja sen Suhde kliinis tekijät

tutkiakseen ATDC proteiinin tasot keuhkosyöpää, tarkastelimme ATDC ilmaisun paneeli 109 NSCLC yksilöiden ja 20 pariksi homologisia normaali keuhkojen kudoksia käyttäen immunohistokemiallista määritystä. Yliekspressio ATDC todettiin 62 (56.88%) ulos 109 NSCLC yksilöitä, ja ATDC proteiini pääasiassa lokalisoitu sytoplasmassa kasvainsolujen (kuvio 1 C-F). Ei tai heikkoa värjäytymistä signaalit havaittiin normaalin keuhkojen kudoksia ja normaali keuhkoputken epiteelin vieressä kasvain (kuvio 1A-B).

. Negatiivinen värjäytyminen normaalissa penumosyy- keuhkorakkuloihin ei-neoplastisten keuhkokudoksessa. B. Negatiivinen värjäys normaaleissa keuhkoputken epiteelin epäneoplastisis- keuhkokudoksessa. C. Negatiivinen ATDC värjäytymistä keuhkoadenokarsinooma. D. Heikot ATDC värjäytymistä keuhkoadenokarsinooma. E. Heikko ATDC värjäytymistä keuhkojen okasolusyöpä. F. Strong ATDC värjäytymistä keuhkojen levyepiteelikarsinooma.

Suhde ATDC ilme ja useita ennusteeseen viittaavia parametreja analysoitiin myös. Kuten taulukosta 1, joka on merkittävää yhteyttä ei havaittu ATDC yli-ilmentymisen ja laajuus primaarikasvaimen (T1 vs. T2-T4:42.11% vs. 64.79%, p = 0,0227), histologinen eriyttäminen (no eriyttäminen vs. kohtalainen /heikko eriyttäminen: 31,43% vs. 68,92%, p = 0,0002) ja histologisia tyyppejä (levyepiteelikarsinooma versus adenokarsinooma: 97,83% vs. 26,98%, p 0,0001). Tilastollisesti merkitsevää eroa havaittiin välillä ATDC yli-ilmentymisen ja potilaan iän (p = 0,5449), sukupuolen (p = 0,3696), imusolmukestatuksesta (p = 0,2327) tai TNM (p = 0,5085).

ATDC edistää solujen lisääntymistä keuhkosyövän solulinjat

Expression of ATDC analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä ja western blot analyysit paneelissa keuhkosyövän solulinjoja ja normaalitilanteessa keuhkoputken epiteelisolulinja HBE (kuvio 2A B). Huomasimme, että molemmat ATDC mRNA ja proteiini ekspressiotasot NSCLC solulinjoissa olivat paljon suurempia kuin HBE, erityisesti A549 ja H1299 solulinjoissa. Jotta tutkia mahdollisen roolin ATDC solun kasvua keuhkosyöpään, me transfektoimme ATDC cDNA ilmentämisrakenne HBE soluihin ja sovelsivat altaan koostuu kolmesta ATDC kohdistaminen siRNA jotta pudotus ATDC ilmaisua sekä A549 ja H1299 soluja (kuvio 2C-D). HBE-solut osoittivat merkittävää kasvua ATDC ilmaisun jälkeen ATDC transfektion taas ATDC-specific siRNA tehokkaasti estetty ATDC ilmentymistä A549- ja H1299 solulinjoissa.

. mRNA: n ekspression tasojen ATDC analysoitiin Real-time PCR paneelissa keuhkosyövän solulinjat. Huomaa korkein ilmaus havaitaan A549 solulinjassa ja alin näkyy HBE solussa. B. proteiinin ekspressiotasot ATDC analysoitiin Western blot paneelissa keuhkosyövän solulinjat. Huomaa suora korrelaatio proteiinin taso (B) kanssa selostukset (A) kussakin solulinjassa. C. Reaaliaikainen PCR-analyysi ATDC yli-ilmentymisen tehokkuuden HBE-soluissa ja ehtyminen tehokkuutta A549 ja H1299 solujen transkription tasolla. D. Western blot-analyysi ATDC yli-ilmentymisen tehokkuuden HBE-soluissa ja ehtyminen tehokkuutta A549 ja H1299 solujen proteiinin tasolla. Yhtye alemman MW H1299 soluissa on proteiini hajoamistuote. Huomaa suora korrelaatio proteiinin taso (D) kanssa selostukset (C) kussakin solulinjassa.

MTT-analyysi osoitti, että transfektointi ATDC cDNA HBE soluihin edistää solujen kasvua verrattuna ohjaus (transfektio tyhjien vektorien) (HBE ohjata versus ATDC cDNA: 1,06 ± 0,05 vs. 1,41 ± 0,05, p 0,05). Vaikutus ATDC proliferaatioon kapasiteetti analysoitiin myös käyttämällä pesäkemuodostusta. ATDC yliekspressio HBE-soluissa johti huomattava nousu pesäkemäärät (HBE ohjaus vs. ATDC cDNA: 221 ± 13 versus 441 ± 9, p 0,05). Toisaalta, solujen lisääntymistä korko (A549 NC versus siATDC: 1,23 ± 0,03 vs. 0,84 ± 0,03; H1299 NC vs siATDC: 1,72 ± 0,01 vs. 1,19 ± 0,02; p 0,05) ja pesäkkeiden muodostuminen kyky (A549 NC versus siATDC: 400 ± 12 versus 150 ± 14; H1299 NC versus siATDC: 258 ± 20 versus 119 ± 17; p 0,05) on heikennettyä A549 ja H1299 solujen ATDC taintumisen (kuva 3). Nämä tulokset kokonaan viittaavat siihen, että ATDC pystyi mukauttamaan keuhkosyövän solujen lisääntymisen.

. MTT-analyysi osoittaa, että ATDC transfektion HBE soluissa edistää solujen kasvua ja ATDC knockdown A549 ja H1299 solujen estää soluproliferaatiota. B-C. Arviointi klonogeeniset potentiaalit ATDC yli-ilmentävät solut ja ATDC köyhdytettyä soluja laskemalla pesäkkeen numeroita. Merkittävä lisäys pesäkemäärät havaittiin HBE solujen ATDC yli-ilmentymisen verrattuna ohjaus, ja pesäkkeiden lukumäärä muodostaman A549 ja H1299 soluja käsiteltiin ATDC siRNA oli huomattavasti vähemmän kuin kontrolli soluja. Sarakkeet C edustaa keskiarvo 3 kaksoiskappaleita; pylväät edustavat keskihajonta [13]. * Tarkoittaa tilastollista merkitystä eron eroksi 2 bar arvot (p 0,05).

ATDC Helpottaa G1 /S Transition ja Up-regulation sykliini D1 ja c-Myc Expression in Lung Cancer Cells

Solusyklianalyysiä fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) suoritettiin ATDC yliekspressoivat HBE-soluissa ja ATDC köyhdytettyä A549 ja H1299-solut (kuva 4). ATDC yli-ilmentyminen väheni prosenttiosuus soluja G1 vaiheessa (HBE kontrolli versus ATDC cDNA: 68,04% ± 0,04% vs. 57,74% ± 0,51%, p 0,05) ja lisäsi solujen prosenttiosuus S-vaiheessa (HBE kontrolli versus ATDC cDNA: 12.48% ± 0,74% vs. 27,62% ± 0,61%, p 0,05). Toisaalta, ATDC siRNA-hoito lisäsi solujen G1 vaiheeseen (A549 NC versus siATDC: 64,99% ± 0,57% vs. 75,99% ± 2,72%; H1299 NC versus siATDC: 52,66% ± 1,47% vs. 63,80% ± 1,13%; p 0,05 ) ja vähensi solujen S-vaiheeseen (A549 NC versus siATDC: 29,59% ± 0,45% vs. 9,24% ± 0,06%; H1299 NC versus siATDC: 37,55% ± 3,13% vs. 20,80% ± 3,11%; p 0,05) verrattuna ohjaus. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ATDC voivat edistää solusyklin etenemisen kautta G1 /S rajan.

Huomaa ATDC yliekspressio HBE soluissa kasvattaa S vaiheessa olevien solujen ja vähentää G1 vaiheessa olevien solujen (p 0,05 verrattuna kontrolli). ATDC Knockdown A549 ja H1299 soluja kasvattaa G1 vaiheessa olevien solujen ja vähentää S-vaiheessa solut (p 0,05 verrattuna kontrolli).

tutkimiseksi mekanismia solusyklin etenemistä säätelee ATDC keuhkosyövän, me tutkittiin, mikä vaikutus ATDC on sykliini A, sykliini D1, sykliini E, CDK2, CDK4, CDK6, p-Rb ja c-Myc keuhkosyövässä solulinjoissa. Kuten kuviossa 5 on esitetty, Western blotting-analyysi paljasti, että ATDC yliekspressio säädelty proteiini tasot sykliini D1, CDK4, CDK6, p-Rb ja c-Myc HBE-soluissa, kun taas knockdovvn ATDC vähentyneen ilmentämisen näiden proteiinien A549 ja H1299-soluja. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että ATDC voi edistää G1 /S siirtymisen kautta säätelystä sykliini D1 ja c-Myc ilmentymistä.

Western blotting-analyysi paljastaa, että ATDC transfektio lisää sykliini D1 ja c-Myc ilmentymisen HBE-soluissa ja knockdovvn ATDC vähentää proteiinin tasot sykliini D1 ja c-Myc sekä A549 ja H1299 soluja, ilman merkittäviä muutoksia sykliini ja sykliini E ilme.

ATDC Expression korreloi Ki67 Labeling Index, sykliini D1 ja c-Myc tasot NSCLC kudokset

tutkinut suhdetta taso koko ATDC proteiinin ja leviämisen indeksin (Ki67 merkinnät) in NSCLC. Huomasimme, että tapauksissa, joissa on korkea ATDC proteiinin ilmentymisen yleensä selvästi olemassa leviämisen indeksi, verrattuna niihin, joilla on alhainen ATDC (p = 0,0022) (kuvio 6). Immuunivärjäytyminen sykliini D1 ja c-Myc suoritettiin myös NSCLC yksilöitä ja niiden yhteenliittymien kanssa ATDC ilme analysoitiin (kuvio 6). Kuten on esitetty taulukossa 1, ATDC yli-ilmentyminen korreloi korkean sykliini D1 (p = 0,0010) ja c-Myc ilmentymistä (p = 0,0150).

immunohistokemiallinen värjäys ATDC (A ja B), sykliini D1 (C ja D), c-Myc (E ja F) ja Ki67 (G ja H) in NSCLC yksilöitä. A, C, E ja G osoittavat edustaja tapauksessa positiivinen ATDC osoittavat korkeaa sykliini D1 ja c-Myc, korkea merkintöjä indeksi Ki67, kun taas B, D, F ja H edustavat tapauksessa negatiivinen ADTC ja vastaavan negatiivisen sykliini D1 ja c-Myc värjäys tai alhainen Ki67 merkintöjä.

ATDC Up-regulation sykliini D1 ja c-Myc in Lung Cancer Cells Riippumaton Wnt /β-kateniinin tai p53 signalointireittiin

Viimeaikaiset tiedot osoittavat, että yli-ilmentyminen ATDC johtaa wnt signalointia aktivointi haiman adenokarsinooman solulinjoja. Tämä herättää kysymyksen, ATDC välittämä lisäävä säätely sykliini D1 ja c-Myc keuhkojen syöpäsoluja johtuu aktivoitumisen Wnt signaalinvälitysreitin jossa sykliini D1 ja c-Myc ovat kriittisiä komponentteja. Tämän testaamiseksi mittasimme koko β-kateniinin ja aktiivisen β-kateniinin tasoja Western blot -analyysillä, ja tutki Wnt aktiivisuutta lusiferaasireportterista määrityksiä HBE soluissa yliekspressoivien ATDC ja H1299 ja A549-soluja tippuu alas of ATDC. Mitään ilmeistä muutoksia wnt aktiivisuus ja β-kateniinin tasoja havaittiin näissä soluissa, joilla on muuttuneita tasoja ATDC (kuvio 7A-B). Näin ollen, vaikutusta ATDC keuhkosyöpään solujen lisääntymisen näyttää olevan riippumaton wnt /β-kateniinin signaalitransduktioreitin.

. Ei ollut merkittävää muutosta Topflash lusiferaasin aktiivisuuden jälkeen ATDC transfektion HBE-soluissa ja sen jälkeen siRNA hoidon A549 ja H1299 soluja. B. ei tapahtunut merkittävää muutosta β-kateniinin ja aktiivisen β-kateniinin proteiinin tasot jälkeen ATDC transfektion HBE-soluissa ja sen jälkeen siRNA hoidon A549 ja H1299 soluja. C. ATDC transfektio HBE soluissa tai sen ehtyminen A549-solut eivät muuta tasoa p53 lusiferaasin aktiivisuuden. D. ATDC transfektio HBE tai sen ehtyminen A549-solut eivät muuta proteiinin taso p53 kohdegeenin p21.

Koska ATDC ilmoitettiin kohonneen solujen lisääntymistä estämällä p53 ydinalan toimintaa mietimme jos ATDC välittämä lisäävä säätely sykliini D1 ja c-Myc keuhkojen syöpäsoluissa voisi johtua sen estävää vaikutusta p53-proteiinin. Niistä 3 käytetyt solulinjat edellä, H1299-solut ovat hyvin tiedossa on p53-geenin menetetään, kun taas HBE ja A549-solut ilmentävät villityyppistä p53: n. Siksi arvioimme vaikutus ATDC p53 toimintaa HBE ja A549-soluja. Kuten on esitetty kuviossa 7C-D, yliekspressio ATDC HBE-solut eivät merkittävästi muuta aktiivisuutta p53: een reagoiva lusiferaasireportteri tai p53: n kohdegeenin p21. Kumpikaan muutos havaittiin A549-solut köyhdytetty endogeenisen ATDC. Yhdessä että ATDC säännelty sykliini D1 ja c-Myc tasolla p53-null H1299 soluja, ajattelimme, että vaikutus ATDC solusyklin etenemistä keuhkosyöpäsoluissa voisi olla riippumaton p53 aktiivisuuden.

ATDC Up-regulation sykliini D1 ja c-Myc kautta NF-KB Pathway

Koska sekä sykliini D1 ja c-Myc olivat alavirtaan tavoitteita NF-KB, tutkimme proteiinin ilmentymistä p65, p-IKB ja NF-KB: n lusiferaasiaktiivisuuden arvioida, ATDC voisi säädellä NF-KB: n reitin (kuvio 8A-B). Kävi ilmi, että ATDC yliekspressio HBE soluissa sääteli NF-KB: n toimittaja lusiferaasivaikutusta, ja vastaavasti, ATDC ehtyminen A549 ja H1299 solujen alassäädetty sen toimintaa. Toisaalta, taso p-IKB oli säädellään ylöspäin HBE transfektoiduissa soluissa ATDC ja alassäädetty A549 ja H1299 solut köyhdytetty endogeenisen ATDC, vaikka ei ollut merkittävää muutosta koko p65 tason näissä soluissa. Nämä tulokset viittaavat mahdolliseen osallistumiseen NF-KB: n aktivaation ATDC aiheuttama säätely ylöspäin sykliini D1 ja c-Myc. Bay 11-7082, joka inhiboi fosforylaatiota ja hajoamista IkBa estää NF-KB: n aktivoitumista, käytettiin myös HBE transfektoiduissa soluissa ATDC vahvistaa vaikutuksen NF-KB: n aktivaation. Kuten on esitetty kuviossa 8C, NF-KB-inhibiittori päinvastainen vaikutus ATDC on sykliini D1, c-Myc, ja p-Rb HBE soluissa. Siksi NF-KB voi olla edellytys ATDC aiheuttama säätely ylöspäin sykliini D1 ja c-Myc.

. ATDC yli-ilmentyminen sääteli NF-KB: n toimittaja lusiferaasivaikutusta HBE-soluissa ja ATDC ehtyminen esti NF-KB toimittaja lusiferaasin aktiivisuutta sekä A549 ja H1299 soluja. B. ATDC transfektio kasvoi p-IKB ilmentymistä HBE-soluissa ja ATDC ehtyminen laski tasolle p-IKB A549 ja H1299 soluja.