PLoS ONE: n synergistinen anti-kasvain vaikutukset Yhdistelmä fotodynaaminen hoito ja arseeniyhdiste kohdunkaulan syövän solut: In vivo ja in vitro -tutkimukset
tiivistelmä
The effects of As
4O
6 liitännäishoitona annetun fotodynaamisen hoidon (PDT) tutkittiin. Kuten
4O
6 katsotaan olevan syövän vastaista aktiivisuutta kautta useita biologisia toimintoja, kuten vapaiden radikaalien tuotantoa ja VEGF ilmaisua. PDT tai Kuten
4O
6 esti merkittävästi TC-1 soluproliferaatiota annosriippuvaisesti (
P
0,05) MTT: llä. Antiproliferatiivista vaikutusta yhdistelmähoidon oli huomattavasti korkeampi kuin TC-1-solujen hoidettiin joko fotodynaamiseen tai As
4O
6 yksin (62,4 ja 52,5% matalampi kuin ajoneuvon vain käsitellyn TC-1-soluissa vastaavasti
P
0,05). Lisäksi soluproliferaatiota yhdistelmänä fotodynaamiseen ja As
4O
6 hoito merkitsevästi väheni 77,4% (
P
0,05). Solujen eloonjääminen polku (
Naip1, Tert
ja
Aip1
) ja p53-riippuvaisen reitin (
Bax, p21
CIP1, Fas, Gadd45, IGFBP-3
ja
Mdm-2
) on merkittävästi kasvanut yhdistelmähoidon fotodynaamiseen ja As
4O
6. Lisäksi immuunivastetta NEAT reitin (
Ly-12, CD178
ja
IL-2
) on myös moduloitu yhdistämisen jälkeen hoidon, mikä viittaa siihen, parannettu antituumorivaikutukset ohjaamalla ei-toivotun kasvun stimuloivaa reittejä. Yhdistelmä vaikutus ilmeisesti heijastuu yhteensopivuutta in vitro -tiedot, rajoittamiseen kasvaimen kasvu
in vivo
ja suhteessa joitakin yhteisiä signalointireittien luokkaa kuin
in vitro
. Nämä havainnot viittaavat siihen, hyöty kombinatoorista hoidon fotodynaamisen hoidon ja As
4O
6 inhibitiolle kohdunkaulan syöpäsolujen kasvua.
Citation: Kim YW, Bae SM, Battogtokh G, Bang HJ, Ahn WS (2012) synergistinen antituumorivaikutuksia of Yhdistelmä fotodynaaminen hoito ja arseeniyhdiste kohdunkaulan syövän solut: in vivo ja in vitro -tutkimuksissa. PLoS ONE 7 (6): e38583. doi: 10,1371 /journal.pone.0038583
Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Yhdysvallat
vastaanotettu: 19 joulukuu 2011; Hyväksytty: 7. 2012 Julkaistu: 08 kesäkuu 2012
Copyright: © 2012 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tutkimus tukivat katolinen Harvard Wellman Photomedicine Core Technique Development Center, Seoul, Korean tasavalta (Grant # 5-2012-A0154-00001). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
fotodynaaminen hoito (PDT) sisältää yhdistelmän myrkytön väriaineita tunnetaan valoherkistiminä (PSS) ja näkyvän valon oikean aallonpituuden imeytyä PSS. Kun läsnä on happea, tämä johtaa reaktiivisten hapen lajien (ROS), joka voi vahingoittaa solun ainesosien, mikä johtaa solun kuolemaan [1], [2]. Löytö ohjelmoidun solukuoleman eli apoptoosin, on mullistanut sytotoksisen hoidon yleensä ja PDT erityisesti [3] – [5]. Kuitenkin täydellisen hävittämisen kasvainsolujen PDT yksinään ei ole taattu [6]. Lisäksi tutkimuksessa ei-toivotun kasvun stimuloivien reittejä PDT: n jälkeen on toivottavaa minimoida haitallisten haitallisia vaikutuksia.
arseenipitoisia yhdisteiden on osoitettu olevan elämän säilyttämisen ominaisuuksia syövän hoidossa [7] – [10]. Lupaavia tuloksia on raportoitu, mikä osoittaa, että diarsenic oksidi (As
2O
3) hoito voisi tarjota vaihtoehdon kemoterapiaa akuuttiin promyelosyyttinen leukemia (APL). Cytopathological Tutkimukset osoittivat myös induktion apoptoosin APL soluissa. Viimeaikaiset raportit ehdotti, että arseenipohjainen yhdisteitä inhiboimaan ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) kautta G1 ja G2 /M-vaiheen pysähtymisen solusyklin [8]. Lisäksi inhiboiva vaikutus bFGF- tai VEGF-stimuloimaa solujen lisääntymistä ehdottaa antiangiogeenisen potentiaalia arseenipohjainen yhdisteiden [11]. Lisäksi tetra-arseeni oksidi (As
4O
6) raportoitiin olevan antiangiogeenista vaikutuksia NGF aiheuttama muodostamalla uusia aluksia rotan sarveiskalvossa verrattuna kontrolliryhmässä ja As
2O
3 käsitelty ryhmä [9]. On ollut siis ehdotettu, että As
4O
6 saattaa olla uusi arseeniyhdiste, koska se indusoi apoptoosin syöpäsoluissa paljon alemmilla pitoisuus kuin As
2O
3 [10]. Arseeniyhdisteet voidaan lisätä reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) soluissa ja siten lisätä apoptoosia indusoivan tekijän (AIF) eritystä aktivoimalla PARP-1, ja lopulta aiheuttaa solujen apoptoosia. Vapautuminen sytokromi c ja apoptoosia indusoivan tekijän (AIF) on hienosäädetty by Bcl-2-perheen proteiinien jommallakummalla seuraavista tavoista: erään mahdollinen mekanismi, Bax läsnä solulimassa kulkeutua sen mitokondrion kalvon, jossa se käy läpi konformaatiomuutoksiin avustamana Bid. Sitoutumisen Bax ulkokalvon (OM) aiheuttaa sen
in situ
multimerisaatiota, jolloin PTP on aidatulla ja sytokromi c: n on julkaissut. Bcl-2 ja Bcl-x L estävät konformaatiomuutoksia Bax ja siten estävät vapautumista sytokromi c: n ja apoptoosin. Korkea ROS tuotanto on tärkein syy apoptoosin arseeniyhdiste. Vapaiden radikaalien, ROS voi reagoida useimpien biologisten makromolekyylien, ja näin ollen ei ainoastaan voi aiheuttaa oksidatiivista vaurioita DNA: ta, mutta myös muuttaa rakenne ja toiminta proteiini [12] – [14].
Toisaalta, ROS voi moduloida geneettistä ilmentymää toimimalla toisena messenger. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että hapettumista mahdollisesti liittyi alkutapahtumat syöpään, ja voisi auttaa aiheuttaa aloittamisesta apoptoosin kasvun jälkeen soluproliferaatioon [15], [16]. Arseeniyhdiste voisi myös tiettävästi säädellä immuunivastetta ottamaan syöpälääkkeen toiminnon kautta väheneminen VEGF ilmaisun [12] – [14].
Tässä tutkimuksessa olemme ensinnäkin osoitti parempi syövänvastainen vaikutus PDT käyttämällä Radachlorin As
4O
6 hiirillä kasvaimia johtuu ihmisen papilloomaviruksen (HPV) 16 E6 /E7-onkogeenin ilmaistuna TC-1 kasvainsoluja. Tämä tutkimus osoitti, että yhdistelmähoito PDT plus As
4O
6 oli paljon tehokkaampi ehdotusta poistaa kasvaimen kasvua verrattuna PDT tai As
4O
6 yksin.
tulokset
In vitro solun kasvua estävä vaikutus Kuten
4O
6 plus Radachlorin /PDT TC-1-soluja
Jos haluat nähdä kasvun estäminen vaikutusta PDT TC -1 solu, valossa 6.25J /cm
2 altistettiin 12 tunnin kuluttua Radachlorin hoidon soluihin, ja sitten solujen kasvu mitattiin ennalta määrätyn ajan. Solujen elinkelpoisuus käsiteltiin erilaisilla annoksilla Radachlorin seuraa säteilylle väheni annoksesta riippuvalla tavalla verrattuna kontrolliin, vastaavasti (kuvio 1A). Nähdä kasvun estäminen vaikutusta As
4O
6 TC-1 soluun, solujen kasvua mitattiin ennalta määrätyn ajan kuluttua As
4O
6 hoitoa. Solujen elinkelpoisuus käsiteltiin erilaisilla annoksilla kuin
4O
6 väheni annoksesta riippuvalla tavalla verrattuna kontrolliin, vastaavasti (kuvio 1 B). Käyttämällä näitä tietoja, elinkelpoisuutta solujen määritettiin käsittelyn jälkeen viljelty TC-1-solujen 3 uM As
4O
6 ja erilaisia annoksia Radachlorin /PDT päivässä. Yhdistelmähoidon osoitti synergistisen vaikutuksen, pienenee elinkelpoisuuden annoksesta riippuvalla tavalla verrattuna kontrolliin, kuten on esitetty kuviossa 1C. Solujen elinkelpoisuus todettiin olevan 62,4% PDT yksin ja 52,5% sen jälkeen As
4O
6 yksin hoito pienellä annoksella. Sitä vastoin, kun PDT-hoitoa Kuten
4O
6 hoitoa, prosentuaalinen solujen kasvun havaittiin pienempi kuin 23%. Havaitsimme myös yhdistetty vaikutus vs. kerta-annoksina ajan selvittämään, onko kombinatoorista lähestymistapa voi johtaa pitkällä elivät rajoitus solujen lisääntymisen verrattuna yksittäisiin hoitoihin (kuva 2). Solujen elinkelpoisuus havaittiin olevan alle 10% 0,2 ug /ml Radachlorin /PDT plus Kuten
4O
6 hoitoa kolme päivää, verrattuna yksilöllisen kohtelun. Arvioimiseksi synergian Radachlorin /PDT ja As
4O
6 hoitoa, käytimme yhdistelmä indeksi lasketaan Chou ja Talalayn menetelmää (taulukko 1). Joukossa useita yhdistelmiä hoidon, 0,2 ug /ml Radachlorin /PDT plus 3 uM As
4O
6 päivänä 3 ja 4 johtivat suurimpaan solukuoleman määrä ja se osoitti synergiaa. Muutama solulinjat, kuten HaCaT, HeLa, ja SiHa-soluja mukana arvioimiseksi solujen kasvun esto (Supplement kuvio S1). Vaikka tulokset HaCaT ja SiHa olivat yhdenmukaisia aikaisempien arvioiden MTT-määritystä, HeLa osoitti Radachlorine /PDT kestävä kehitys verrattuna muihin soluihin. Solu elinkelpoisuus kahden solulinjan havaittiin olevan alle 25% 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT plus Kuten
4O
6 hoitoa neljä päivää, verrattuna yksilöllisen kohtelun. Olemme tunnettu solukuoleman värjäämällä TC-1-soluja käsiteltiin 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT tai /ja 3 uM As
4O
6 1 päivä. Kuten odotettua, vaikutus yhdistelmän hoitoaika oli suurempi kuin kunkin yksittäisen hoidon. Koska Radachlorin /PDT tai As
4O
6, solut saavutti täysin konfluentti, tiheä yksikerroksista jälkeen 48 tunnin viljelyn (kuvio 1 D). Solut pysyivät kiinni kudosviljelmän alustan ja ne hyväksyttiin pitkänomainen morfologia. Sen sijaan suurin osa soluista käsitelty Radachlorin /PDT plus Kuten
4O
6 irrotettiin levystä ja oli pyöristetty; ominaisuus läpikäyvien solujen kuolemaan apoptoosin. Solut käsiteltiin Radachlorin /PDT tai As
4O
6 kuitenkaan hyväksynyt morfologit jotka olivat väli- luonnossa. Laskimme eri apoptoottisen solu- populaatioiden aiheuttamaa 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT tai /ja 3 uM As
4O
6 1 päivä. Kuten esitetään Supplement kuvassa S2 solukuolemaa huomattavasti jälkeen Radachlorin /PDT plus Kuten
4O
6 hoitoa. Varhainen apoptoottinen väestöstä oli 9,9%: iin Radachlorin /PDT plus Kuten
4O
6 hoitoa. Sen sijaan varhainen apoptoottiset solupopulaatioiden olivat 4,3% ja 4,1%: iin Radachlorin /PDT ja As
4O
6 hoitoa, vastaavasti. Tämä osoittaa, että yhdistelmä indusoi enemmän varhaiseen apoptoottisia soluja verrattuna yksittäisiin hoitoihin.
(A) TC-1-soluja (3 x 10
3) viljeltiin 12-kuoppalevyillä kolmena kappaleena yön yli ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Radachlorin ja PDT (6,25 J /cm
2), kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. PDT: n jälkeen, soluja viljeltiin ennalta määrätyn ajan. (B) esto vaikutukset solujen kasvuun As
4O
6 TC-1-soluja. TC-1-soluja viljeltiin ja käsiteltiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Jälkeen Kuten
4O
6 hoitoa, soluja viljeltiin ennalta määrätyn ajan. Solujen elinkyky määritettiin perustuen MTT-määritystä. (C)
In vitro
solujen kasvua estäviä vaikutuksia As
4O
6 plus Radachlorin /PDT TC-1-soluja. TC-1-soluja viljeltiin 3 uM As
4O
6 ja erilaisia annoksia Radachlorin /PDT 1 päivä, kuten edellä on kuvattu. Solujen elinkyky määritettiin perustuen MTT-määritystä. Jokainen pylväs edustaa keskiarvo [± SD (pystysuora viiva)] kolme rinnakkaista per annos (
n
= 3). * Ja #: merkitsevästi erilainen (
P
0,05) ohjauspaneelista ja PDT opiskelijan t-testillä. (D) Morfologiset muutokset TC-1-soluja. TC-1-soluja käsiteltiin 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT tai /ja 3 uM As
4O
6 1 päivä. Sitten solut tarkasteltiin mikroskoopilla. Kuvat on otettu faasikontrastimikroskopialla klo X300. (A) ei-käsitelty; (B) 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT yksin; (C) 3 uM Kuten
4O
6 yksin; (D) 3 uM Kuten
4O
6 plus 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT.
TC-1-solua viljeltiin 3 uM As
4O
6 ja (A) 0,15 ug /ml ja (B) 0,2 ug /ml Radachlorin /PDT, vastaavasti. Solujen elinkyky määritettiin perustuen MTT-määritystä. Jokainen pylväs edustaa keskiarvo [± SD (pystysuora viiva)] kolme näytteitä (n = 3). * Ja #: merkitsevästi erilainen (P 0,05) ohjauspaneelista ja PDT opiskelijan t-testiä.
geeniekspressioprofiili TC-1-soluja käsiteltiin As
4O
6 plus Radachlorin /PDT
Käytimme RT
2 Profiler PCR Array System ymmärtää soluprosessia muutoksia, joiden kautta TC-1-soluja voitaisiin vaikuttaa yhdistelmähoito As
4O
6 plus Radachlorin /PDT. Löydettiin 63-geenit, jotka olivat vähintään kaksi kertaa ylä- tai vaimentua (kunkin geenin on esitetty yksityiskohtaisesti taulukossa 2) ja käytettiin hierarkkinen klusterointi osoittamaan differentiaalisesti ilmentyvien geenien (kuvio 3A). Havaita eroja toiminnalliset profiilit, otimme differentiaalisesti ilmentyvien geenien yhteydessä esillä interactome tiedon käyttäen Ingenuity Pathways Analysis työkalut (
P
kaikille 0,05), mikä osoittaa, että tehostettu solukasvuneston ja antituumorivaikutukset merkittävästi liittyvät geenin ilmentymisen tasoa liittyvien geenien solukuolemaan eli p53 ja NF-AT-reitin (kuvio 3B). Kukin geeni reitin testattiin kvantitatiivista PCR: ää (kuvio 4), ja tulokset PCR array ja qRT-PCR olivat samanlaiset. Nämä sisältyvät geenit, jotka koodaavat Tert, Aip1, Bax, p21, Fas, Gadd45, IGFBP-3, Mdm-2, Ly-12 ja IL-2 verrattuna hieman ilmaistuna geenejä, kuten Naip1 ja CD178. Huomattavasti sääteli molekyylitason toimintojen yhdistäminen hoitoryhmän oli p53-reitin. Alas-säännelty molekyyli toiminto oli NEAT kautta. MAPK, sytokiini-sytokiinireseptorin vuorovaikutus, fokaalisen adheesion, soluadheesion reittejä tutkittiin myös geenin sarjaa, mutta ei korreloi tiukasti parannetun solukasvuneston (
P
kaikille 0,05) (kuvio 3C F).
(A) Kaikki tiedot olivat mediaani keskitetty ja aihekokonaisuuksien käyttäen hierarkkinen klusterointi. Klusteri kuva edustaa 63 geenien esitetään matriisimuodossa, jossa rivit edustavat yksittäisiä geenejä ja pylväät edustavat kutakin määritystä. Kukin solu matriisissa edustaa ilmentymistason geenin yksilön määrityksessä. Punainen ja vihreä soluja heijastavat korkea ja matala ilme tasolla, vastaavasti. (B) Kymmenen geenien (p53 ja NEAT reitit) osoittaa tilastollisesti merkitseviä eroja kolmen ryhmän on esitetty klusterin kuva. (C) MAPK-reitin kuin klusterin kuvana. (D) Sytokiini-sytokiini-reseptori vuorovaikutuksen kautta. (E) Focal tarttuvuus kautta. (F) Soluadheesio reitin.
Tulokset esitetään transkriptipitoisuuksissa suhteessa tasolle käsittelemätön kontrolli-soluissa käyttäen CT menetelmää, jossa keskimääräinen mRNA-tasolla viisi sisäisen valvonnan geenejä, mukaan lukien b- aktiini, käytetään normalisointia ohjaus. (A) Solujen eloonjääminen kautta. (B) NEAT kautta. (C) p53-reitin.
Koska
4O
6 plus Radachlorin /PDT estää kasvaimen kasvua in TC-1 eläinmallissa
Voit selvittää synergistinen antituumorivaikutukset As
4O
6 plus Radachlorin /PDT
in vivo
, C57BL /6 hiiret altistettiin sc TC-1-soluja ja sitten käsiteltiin As
4O
6 tai /ja Radachlorin /PDT. Hoito aloitettiin päivänä 0, jolloin kasvaimet olivat ~230 mm
3 kokoisia. Kuten on esitetty kuviossa 5A, kuten
4O
6 tai Radachlorin /PDT käsiteltyjen eläinten ryhmät osoittivat merkittävää kasvaimen kasvun estoa, verrattuna hoitamattomaan verrokkiryhmään. Kuitenkin eläimillä, joita hoidettiin yhdistelmällä As
4O
6 plus Radachlorin /PDT osoittivat merkittävin tuumorisuppressiogeeneksi, verrattuna muihin ryhmiin. Tämä viittasi siihen, että As
4O
6 voi olla tärkeä rooli kasvun estämisessä mukaan Radachlorin /PDT.
(A) Kasvaimen kasvukäyrät TC-1 hoidettujen hiirien Radachlorin /PDT ja /tai As
4O
6 (n = 7 kussakin ryhmässä). Kasvaimen kantavien hiirten annettiin laskimoon injektoitiin Radachlorin (10 mg /kg ruumiinpainoa) ja /tai vatsakalvon injektion 7,5 mg /kg As
4O
6. Kolme tuntia myöhemmin, solut altistettiin laser, kasvaimen kokoa seurattiin sen jälkeen, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät, ja sen keskimääräinen ellipsoid tilavuus ajan funktiona. Merkittävä tuumorin kasvun havaittiin ANOVA. *:
P
0,01 verrattuna kontrolliryhmään, #:
P
0,01 verrattuna Radachlorin /PDT yksin ryhmä ja $:
P
0,01 verrattuna As
4O
6 yksin ryhmä. (B) perfuusio ja morfologisia muutoksia TC-1 kasvaimia C57BL /6 hiirillä, joita hoidettiin As
4O
6 (10 mg /kg ruumiinpainoa vatsaontelon sisäisesti). Kasvaimen kudokset kerättiin talteen 48 h kuluttua Kuten
4O
6 hoitoa. Tissue näytettiin aallonpituudella 365 nm ja valokuvannut x200 suurennoksella. (C) Prosenttia alueen perfuusion alueen TC-1 kasvaimia C57BL /6-hiiret, joita käsiteltiin Kuten
4O
6 verrattuna ei käsitellyt tuumorit. Kasvain kudokset kerättiin ilmoitetuilla aikoina jälkeen Kuten
4O
6 hoitoa. Juokseva muutokset perfusoitiin alueiden 1, 3, 6, 12, 24, ja 48 tunnin kuluttua Kuten
4O
6 hoitoa. *
P
0,05, verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. (D) CD31-immuno- tuumorisektioiden (alkuperäinen suurennos, X400) ja As
4O
6 saaneista ovat näkyvissä. Kaksikymmentäneljä tuntia Kuten
4O
6 hoitoa, TC-1 kasvaimia osoitti laaja menetys CD31 värjäystä osoittaa merkittävää As4O6 aiheuttaman verisuonten vaurioita.
vaikutus arseenin hoidon alueellisen veriperfuusio kasvainkudoksessa
Hoechst 33342 käytettiin visualisoimaan perfusoitavan aluksia kuvatun materiaalin ja menetelmät. Vuonna kontrollikudoksen, verisuonten endoteelin solut selvästi värjättiin Hoechst 33342 sekä niiden ulkoreunaa ja keskialue (kuvio 5B). Käsitelty kudos keskitetysti väri poistettiin ja periferiassa florescence signaali oli lähes huomaamaton. Tämä ilmiö jatkui 24 h kohta. Kuitenkin fluoresenssi kehällä solujen näkyi selvästi 48 tunnin hoidon jälkeen, kun taas Keski-värjäys oli edelleen poissa. Jotta tarkkailla muutoksia aluksen toiminta kokonaan kasvain, kasvain jakso skannattiin kenttä kentältä. Peräkkäiset perfuusion alue muuttuu jälkeen Kuten
4O
6 käsittely on esitetty kuvassa 5C. Kunakin ajankohtana, prosenttiosuus jokaisen osan kasvaimen kenttä oli verrattavissa kontrolloida kudoksen kunakin ajankohtana. Perfuusio alue pieneni heti Kuten
4O
6 hoitoa. 6 ja 12 tuntia, perfuusion alue oli pienin, 24 tunnin perfuusion alue oli 14,4% verrattuna kudoksen PBS-käsitellyt ohjaus kudosta. Kasvain mikroverisuonitiheys mitat mitattiin annon jälkeen As
4O
6 hiirille TC-1 tuumoriksenograftien. Kuten kuviossa 5D, oli merkittävä ero kasvaimen suonitiheys havaittuna CD31 värjäys välillä As
4O
6-hoidetussa ryhmässä ja aika-Hyväksytty PBS-käsitellyt kontrolliryhmään jälkeen 24 h As
4O
6 hoitoa. Hiiret käsiteltiin As
4O
6 oli vähenemiseen kasvaimen astiassa mitat kontrolliin verrattuna eläimiin, jossa CD31 värjätään mikrosuonten silti ilmeiseksi ulkoreunaan kasvain.
In vivo geeniekspression tasot tuumorikudoksista käsitelty As
4O
6 plus Radachlorin /PDT
TC-1-soluja käsiteltiin As
4O
6 ja Radachlorin /PDT 1 päivän, kuten ilmoitetaan ”Materiaalit ja menetelmät” -osassa. Geenien mRNA: n kasvaimen kudoksissa tutkittiin qRT-PCR: llä (kuvio 6A). Tulokset on esitetty transkriptitasot tasoon nähden käsittelemättömissä kontrollisoluissa käyttäen CT menetelmällä, ja b-aktiinin mRNA-tasot käytettiin normalisoinnin ohjaus. Käyttämällä CD5 antigeeni yhdistelmähoitoa saaneiden ryhmässä, Ly-12 ja IL-2-geenin ilmentyminen kasvoi 26 ja 17 kertaiseksi, verrattuna kontrolliryhmään, joka osoittaa, että p53 oli mukana säännellä NFAT koulutusjakson p21, Gadd45, IGFBP-3 , Mdm-2 ja muita geenejä. Geenien ilmentyminen havaittiin lisääntynyt kolmen peräkkäisen kokeissa. Määrittämään rooleja p53 signalointireittien synergistisessä antituumorivaikutukset As
4O
6 plus Radachlorin /PDT
in vivo
, me tutki tarkemmin p53, p21, ja Gadd45 proteiinin tasot in vivo (kuvio 6B). Kuten
4O
6 tai Radachlorin /PDT hoidetun eläimen ryhmissä ei todettu merkitsevää ilmaisun muutoksia, verrattuna hoitamattomaan verrokkiryhmään. Sen sijaan, p53, p21, ja Gadd45 proteiinia lisättiin merkittävästi yhdistelmähoidon As
4O
6 plus Radachlorin /PDT.
(A) ilmentyminen geenien mRNA kasvainkudoksissa oli tutkittiin Q-PCR: llä. Tulokset on esitetty transkriptitasot tasoon nähden käsittelemättömissä kontrollisoluissa käyttäen CT menetelmää, jossa b-aktiinin mRNA-tasot käytetään normalisointia ohjaus. (B) Western blot-analyysi in vivo kasvaimen kudoksissa käsiteltiin 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT tai /ja 3 uM As
4O
6 useita päiviä.
Keskustelu
tässä tutkimuksessa olemme verrattain analysoi tulokset kertahoitona As
4O
6 tai fotodynaamiseen ryhmiä saatujen kanssa yhteistyössä hoitoon käytetään E6 /E7 ilmentävät TC-1-solulinjassa ja C57BL /6 hiirimallissa oli siirretty tämän solun. Olemme vihdoin ilmoittamaan parannetun solukasvuneston ja antituumorivaikutuksia ja muutoksia geenien ekspressiotasoja liittyvien geenien solukuolemaan eli p53 ja NFAT reitin, aiheuttama tämä As
4O
6 ja PDT yhteistyössä hoitomuoto.
Nämä vaikutukset tuottanut fotodynaamiseen riippuen pitoisuudesta photosensitizer Radachlorin, ja jonka As
4O
6 hoitoa pitoisuusriippuvaisella tavalla. Vuonna PDT-käsittelemättömien solujen, solujen kasvu johdonmukaisesti yllä loppuun saakka tarkkailujakson aikana. PDT-käsitellyt solut olivat palautui vain 1 päivä PDT, mutta solujen kasvu uudelleen lisääntyi sen jälkeen, kun 2 päivää PDT: n jälkeen. Mitä pienempi As
4O
6 taso oli, sitä hitaammin solukasvua estävä vaikutus osoitettiin. Alle 3 uM As
4O
6, solukasvuneston näytti alkaa 1. hoitopäivänä ja johdonmukaisesti ylläpidetään 60~80% tasosta solujen kasvun ensimmäisen 4 hoitopäivän. Sen sijaan pitoisuudet As
4O
6 yli 3 uM tuntui olevan sytotoksinen. Vuonna yhteistyössä hoitoryhmässä As
4O
6 ja PDT, lisää merkittäviä vaikutuksia solujen kasvun esto ja morfologisia muutoksia havaittiin verrattuna kunkin yksittäisen-hoitoryhmässä. On tunnettua, että kasvaimia estävinä aineina tuottavat reaktiivisia happi- ja reaktiivisen typen lajit apoptoosin indusoimiseksi ja nekroosia solun [17] – [19]. Yhtenä antituumoriaineita, antituumo- mekanismi arseeniyhdiste tuottaa reaktiivisia hapen ja typen lajien peräsuolen syövän solulinja on myös raportoitu [20]. Tarjonnan riittävästi happea ja tuottaa reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), tiedetään olevan merkittäviä tekijöitä vaikutuksen fotodynaamiseen [4], [21]. Siksi induktio ROS välittämän antituumoriaineista saattanut vaikuttaa tehostamalla PDT.
Seuraavaksi verrattain analysoi muutoksen solunsisäisten signaalireitin kunkin yksi- /co-hoitoryhmässä käyttäen RT
2Profiler
TM PCR array menetelmällä, ja sen tulokset on vahvistettu reaaliaikainen PCR tutkimus käyttäen 13 eri alukkeita. Käyttäen reaaliaikaista PCR-menetelmällä, analysoitiin muutos ekspressiotasot 84 geenien 15 signalointireitteihin. Löydettiin merkittäviä muutoksia ekspressiotasot geenien tiedetään osallistuvan solujen eloonjäämisen reitin (esim Naip1, Tert, Aip1, jne.), P53-reitin (esimerkiksi, Bax, p21, Fas, Gadd45, IGFBP-3, Mdm- 2, jne.), ja NFAT (ydin- tekijä aktivoida T-solu) reitti (esim, Ly-12, CD178, IL-2, jne.), jotka modulaatio immuunivasteen. Erityisesti ekspressiotasot Naip1, joka tunnetaan apoptoosin estävä geeni, ja Tert, telomeraasin käänteistranskriptaasin, määrä väheni jokaisen solun eloonjäämisen reitti, kun taas ilmentymistaso apoptoosia indusoiva geeni Aip1 on parannettu. Lisäksi PCR array tulokset osoittivat alentuneesta Tert geenin ilmentymisen 2,7, 17,1 ja 34,6-kertaisesti As
4O
6 yksin, PDT yksin, ja co-hoitoryhmissä, vastaavasti, kukin verrattuna kontrolliryhmään . Tert-geenin tiedetään liittyvän aktivoinnin telomeraasin, ja jos kohdunkaulan syöpä, c-myc-geenin näyttää aiheuttavan telomerase aktivaatio tert ilmaisun [22]. Siksi ehdotamme, että alas-sääntely Tert-geenin aiheuttama tämän yhteistyön hoidossa As
4O
6 ja PDT ehkä ovat olleet mukana solukuolemaan. Estyminen Tert-geenin vahvistettiin myös reaaliaikaisen PCR tutkimus suoritetaan sen jälkeen RT
2 Profiler
TM PCR erilaisia analyysi, ja tämä vähentäminen Tert-geenin ilmentymisen taso oli johdonmukaisesti esitetty co-hoitoryhmässä, molemmat
in vitro
ja
in vivo
.
Havaitsimme myös muutoksia ekspressiotasot p21, Fas, Gadd45, IGFBP-3, ja Mdm-2-geenien, tunnetut olla mukana p53-reitin, ja co-hoitoryhmässä osoitti enemmän merkittävä kasvu verrattuna kunkin yksittäisen-hoitoryhmässä. Kuitenkin, mikä tahansa merkittävä muutos Bax-geenin ilmentymisen (tiedetään aktivoituvan p53) ei havaittu. Lisäksi, siitä ei ole merkittäviä muutoksia p53 tason muutokset p21, Fas, Gadd45, IGFBP-3, ja Mdm-2-geenin ilmentymisen taso näyttää välittyvän p53-riippumattoman reittejä.
Lisäksi ottaen huomioon ekspressiotasot geenien kuten Ly-12, CD178, ja IL-2, tiedetään osallistuvan NFAT koulutusjakson, Ly-12 ilmentyminen lisääntyi, kun taas CD178 ja IL-2 ilmaisuja pikemminkin pienentynyt yhteistyössä hoitoryhmässä, verrattuna kunkin yksittäisen-hoitoryhmässä. Koska solunsisäinen polun NFAT on tiedetty liittyvän lisääntynyt immuunivaste, odotimme että kävisi ajan säädellä PDT; kuitenkin, geenin ilmentymisen tasoa tämän reitin, mukaan lukien IL-2, laski jälkeen PDT hoidon ja edelleen väheneminen havaittiin yhteistyössä hoitoryhmässä. Kuitenkin, kun yritimme tulosten varmistamiseksi RT
2Profiler
TM PCR array käyttäen reaaliaikaista PCR-menetelmällä, löydettiin vastapäätä tuloksia verrattiin RT
2Profiler
TM PCR array, eli IL-2: n ilmentymisen pienentynyt PDT yksin hoitoryhmässä ja kasvoi yhdessä hoitoryhmässä, molemmat osoittavat samanlaisia tuloksia alle
in vitro
ja
in vivo
olosuhteissa. Kerrottiin, että PDT saattaa stimuloida kasvaimen kasvua edistäviä immuuni signaaleja ja voitaisiin parantaa ohjaamalla toivottuja kasvua stimuloiva reittejä [23], [24]. Siksi meidän tulokset IL-2 näyttävät osoittavan, että PDT pienensi tämän geenin ilmentyminen, kun se kasvatti arseeniyhdiste hoito, mikä osoittaa, että yhdistelmähoito yhdistää kaksi etua indusoimalla immuunivälittäjäaineiden ja antituumorivaikutukset. Lisäksi tämä samanaikainen hoito lisäsi
in vitro
ja
in vivo
ilmentymistasojen CD5-antigeenin geenin ja Ly-12 jopa 23 ja 26-kertaisesti, vastaavasti. Kuitenkin ekspressiotasot Ly-12 tai IL-2 eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia PDT yksin hoitoryhmään Näin ollen, lisääntynyt geeniekspression näytti indusoida arseeniyhdiste. Toistaiseksi ei kuitenkaan ole muita tutkimukset ovat suhde yhdistetyn PDT-As
4O
6 hoitoa ja NFAT polku, ja intensiivisempää tutkimuksia olisi tehtävä.
Vastaavasti meidän TC-1 solulinja-istutetut hiirimallissa osoitti merkittävästi parannettu antituumorivaikutus in PDT ja As
4O
6 co-hoitoryhmässä verrattuna kunkin yksittäisen-hoitoryhmässä. Tunnistaa mekanismia tämän vaikutuksen, suoritimme reaaliaikainen PCR koe käyttäen 10 eri alukkeita ja lopulta havaittu merkittäviä muutoksia ekspressiotasot geenien tiedetään osallistuvan solujen elossapysymisreitin, p53-reitin, ja NFAT koulutusjakson, vastaavia kanssa saatu
in vitro
kokeita. Meidän western blot tiedot osoittavat, että co-hoito lisäsi p53, p21, Gadd45 klo 7 päivää verrattuna yhden aineella hoitoa ja valvontaa. Aktivointi p53-proteiinin keskeinen rooli valvonnassa kasvaimen soluvasteen kemoterapeuttiset aineet ja DNA: ta vaurioittavien aineiden kanssa. p21 ja GaDD45, alavirran efektoreja p53, aktivoitiin yhdistelmähoitona tuottaa apoptoosin TC-1 kasvainsoluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että apoptoosin voidaan välittyvä p53 signalointireitin kautta lisäävä säätely proapoptoottiset proteiineja.
aikana PDT, solunsisäinen ehtyminen hapen ja romahtanut verisuonet saattavat aiheuttaa solunsisäisiä hypoksia ja tämä saattaa ajan säännellä tasolle VEGF ilmaisun katalysoimaan angiogeneesiin [25]. Monet tutkimukset PDT ovat yrittäneet tehostaa tämän menetelmän tukemalla sukupolven solunsisäisten ROS, tai suorittamalla tämä menetelmä yhdistettynä useita angiogeneesin estäjiä, kuten COX-2: n, MMP tai VEGF [9], [ ,,,0],26] – [31]. Arseeniyhdisteet käytetään tällä hetkellä terapeuttisina aineina akuutti leukemia ja erilaisia kiinteitä kasvaimia, ja ne on myös raportoitu tuottaa ROS ja inhiboivat VEGF: n ilmentymisen [17], [19]. Tässä tutkimuksessa verisuonten häiriöitä vaikutus As
4O
6 määritettiin Hoechst33342 perfuusio ja CD31 immunohistokemia värjäystä. Veriperfuusio ala pieneni nopeasti sen jälkeen Kuten
4O
6 hoitoa. Vuodesta 3 h ajankohtana, keskeinen osa kasvaimista katosi suhteen perfuusio toimintaa ja lopuksi melkein mitään signaalia ei voitu havaita koko kasvaimen alueelle, vaikka ulkoreunaan. Kiinnostavaa kyllä, tämä vähentäminen perfuusion alue otettiin talteen 24 h ajankohtana, ja fluoresenssi ilmi ulkoreunasta selvästi 48 ja 72 tuntia. Vaikka veren perfuusion näytti talteen ulkoreunasta 72 tuntia käsittelyn jälkeen, mitään signaalia ei havaittu sisäpuolelta kasvaimia. Nämä tulokset osoittivat, että paljon intensiivisempää immunoreaktiivisia mikroverisuonten havaittiin tuumorikudoksissa hiirille on PBS, mutta vähän CD31 värjäytymistä oli läsnä keskialueella tuumorikudoksista hiirille on As
4O
6. Tulokset kaiku kuin tutkimuksissa, joissa As
2O
3 ja Conbretastatin A-4 [32], [33]. Kuten
2O
3 vähentynyt veriperfuusio suhteessa kontrolleihin jopa 6 h kuluttua Kuten
2O
3 hoitoa joitakin elpymisen 24 h [32], ja myös CA-4-P, 24 h käsittelyn jälkeen P22 kasvainten verisuonten toiminnot näkyvät osittain takaisin [33]. Siksi tässä tutkimuksessa käytimme yksi arsenikkiyhdisteitä eli As
4O
6, yhdessä PDT menetelmällä tutkia yhä antituumorivaikutuksen ja myös sen solunsisäinen signalointi reittejä. Nämä tulokset osoittivat, että vaikutus kombinatoorista terapiassa VEGF ja niihin liittyviä reittejä vahvistuivat kanssa arviointeja kasvaimeen liittyvän verisuoniston on eläinmallissa ja angiogeneesin merkkiaineiden kasvain vaurioita.