Krooninen sairaus

tiivistelmä

potentiaalinen sovellus multipleksoidun kvanttipiste merkinnät (MQDL) syövän havaitsemiseen ja ennustetta ja seurantaa terapeuttisen vaikutuksen on herättänyt etuja bioinsinöörien, patologeja ja syöpä biologeja. Useat julkaistut tutkimukset väittävät, että MQDL on tehokas syövän biomarkkereiden tunnistus ja käyttökelpoisia syövän diagnosointiin ja ennuste, nämä tutkimukset eivät ole standardoitu määrällisiin biokemialliset ja molekyylitason määritykset. Tässä tutkimuksessa käytimme molekyylirakennetta ominaista ihmisen eturauhassyövän solumallin näytteille aktivoitu c-Met signalointia epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) ja tappava metastasointiin luuhun ja pehmytkudoksiin kuten kultakantaan, ja verrattiin c-Met cell signalointi verkko tässä mallissa, kliinisissä ihmisen eturauhassyövän kudosnäytteet ja on kastraatio kestävä ihmisen eturauhassyövän ksenograftimallissa. Havaitsimme c-Met signaloinnin verkkoon aktivointia, joka ilmenee lisääntynyt fosforyloitua c-Met kaikissa kolmessa. Alavirran eloonjääminen signaloinnin verkkoon välitti NF-KB ja Mcl-1 ja EMT ajoi reseptorin aktivaattori NF-KB-ligandin (RANKL), yksisoluvaiheessa tasolla kliinisissä eturauhassyövän yksilöitä ja ksenograftimallissa. Tulokset varmistettiin reaaliaikaisen RT-PCR ja western blotit ihmisen eturauhassyövän solumallin. MQDL on tehokas väline arvioitaessa biomarkkereiden ilmaisua ja se tarjoaa molekyylitason oivalluksia syövän etenemisen sekä solu- ja kudosten tasolla on erittäin haavoittuvainen.

Citation: Hu P, Chu GC-Y, Zhu G, Yang H, Luthringer D, Prins G, et ai. (2011) Multipleksoidut Quantum Dot leimaaminen Aktivoitu c-Met signaloinnin kastraatio hylkivät Human Eturauhassyöpä. PLoS ONE 6 (12): e28670. doi: 10,1371 /journal.pone.0028670

Editor: Dean G. Tang, The University of Texas M. D Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 lokakuu 2011; Hyväksytty: 12 marraskuu 2011; Julkaistu: 21 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Hu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee tutkimusapurahoja 2PO1CA098912 ja 1RO1CA122602 National Institutes of Health /National Cancer Institute, ja Eturauhassyöpä Foundation Challenge Award (LWK Chung). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Puolijohdemoduulit kvanttipistei- (QDS) loisteputki nanohiukkasten on tunnustettu yhdeksi suurista viimeisin kehitys meidän kyky havaita merkittävät biomarkkerit ilmaiseman solujen, kudosten ja seerumit [1], [2], [3 ], [4], [5]. Ainutlaatuinen optiset ja elektroniset ominaisuudet QDS kuuluvat niiden kapea ja symmetrinen emissiokaistat, koko- ja materiaali-viritettävät valoemission, suuri pinta-alan suhde tilavuuteen, valostabiilius, signaali kirkkaus ja herkkyys, ja samanaikainen magnetointi useiden fluoresenssi- värien avulla on mahdollista havaita useita kohteita samanaikaisesti yksittäisen solun tasolla [3], [6]. Kvanttipiste merkintöjä, QDL, on ylivoimainen perinteiseen orgaanisten väriaineiden solujen ja kudosten värjäys, erityisesti koska jälkimmäinen tuotto laaja kaistanleveys päällekkäin signaali päästöjä ja ovat erittäin herkkiä Valovalkaistuminen. Multiplexing biomarkkerit eri väreillä tarjoaa merkittäviä etuja perinteisiin orgaanisia tai fluoresoivia väriaineita havaitsemiseksi ja analysointi dynaamisia muutoksia proteiinien ja nukleiinihappojen soluissa tai kudoksissa patofysiologisia olosuhteissa. QDL on sovellettu onnistuneesti havaita ekspressiotasot geenien

in situ

liittyy tärkeitä biologisia prosesseja, kuten epiteelin ja mesenkymaalitransitioon [6] syövän etäpesäkkeiden [7], proteiini biomarkkereita veressä, läsnäollessa nukleiinihappojen, microRNA ja DNA: n metylaation seerumista tai kudoksen uutteiden näytteitä Barcoded nopeaa käsittelyä automaattisin protokollat ​​[8], [9], [10]. Tässä tutkimuksessa käytimme multipleksoitu quantum dot merkintöjä (MQDL) havaitsemiseksi aktivoitu c-Met-välitteisen solun signalointireitin johtavat EMT, syövän kasvua ja luun ja pehmytkudoksen etäpesäke uudella eturauhassyövän etäpesäkkeiden malli [11], [ ,,,0],12], [13]. Varmistimme geeni-ilmentymisen arvioitiin MQDL geenin ilmentyminen määritettynä RT-PCR: llä ja Western blot. Sitten soveltanut MQDL protokolla määrittää, onko c-Met solun signalointireitin ja EMT aktivoidaan kastraatiotasolle kestävä eturauhassyöpä (CRPC) eläinmallissa ja kliinisissä eturauhassyövän näytteet saatiin potilailta, joilla on korkea Gleason tulokset ja luun etäpesäke. Havaitsimme, että aktivointi c-Met liittyy läheisesti EMT syöpäsoluja ja niiden myöhempää lisääntynyt maahanmuutto, invaasio ja etäpesäkkeiden [14], [15], [16]. c-Met-signaalin aktivoitumista ihmisen eturauhassyövän on tärkeitä kliinisiä: 1) c-Met loppupään signalointi ajaa EMT ja syöpäsolujen muuttoliike, invaasio, etäpesäke ja selviytymistä useissa ihmisen kiinteiden kasvainten mallit mukaan lukien eturauhassyöpä [15], [17], [18], [19]. 2) Koska kohdistaminen c-Met ja VEGFR2 alavirran signalointia synteettisellä useita tyrosiinikinaasiestäjä, cabozantinib (XL-184), johti merkittävä päätöslauselmassa luun ja pehmytkudoksen etäpesäkkeitä suuri määrä potilaita, joilla oli kiinteä kasvain lukien CRPC potilaille [20 ], [21], olisi tärkeää osoittaa, jos nämä solun signalointipolkujen saattaa aktivoitua kliinisistä näytteistä ja asiaa -tuumoriksenografti malleja. Käytimme ihmisen eturauhassyövän solulinjaa osoittaa, että c-Met: aktivointi antaa EMT ja eturauhassyövän luuhun ja pehmytkudoksen etäpesäkkeitä ja tutkittu perusteellisesti c-Met signaloinnin aktivaatiota molekyyli analyysien tulokset vahvistettiin MQDL. Sitten käytetty MQDL arvioida c-Met aktivaatiota kliinisissä eturauhassyövän kudosnäytteet ja korreloivat tulosten kanssa kastraatio kestävä ihmisen eturauhassyövän ksenograftimallissa. Osoitimme, että MQDL yhdistettynä Vectra Image Analysis, parantaa määrällistä profilointi kyky yksittäisten biomarkkereiden yhteismarkkinavaiheessa solutasolla. Sarja biomarkkerit liittyvät EMT, kuten vähentynyt ilmentyminen EpCAM, ja lisääntynyt ilmentyminen N-kadheriinin, vimentiinistä ja RANKL, sekä c-Met-signaalin aktivoinnin, kuten VEGF, neuropi- 1, pc-Met ja fosfo (p) -NF -κB p65 [15], [22], analysoitiin. Tulokset näistä tutkimuksista osoittivat huomattavaa yhdensuuntaisuus EMT ja c-Met aktivoinnin välillä eturauhassyövän solu malli, CRPC ksenograftimallia ja kliinisistä eturauhassyövän yksilöitä. Menetelmien perustettiin tässä tutkimuksessa voisi olla merkittävää arvoa lähitulevaisuudessa luonnehtimaan muu aktivoitunut signalointireitteihin kliinisistä näytteistä, kuulustella molekyylitason mekanismit syövän etenemistä, tunnistaa druggable tavoitteet sekä seurata kliinisen vasteen potilaiden terapeuttisen intervention.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja solujen transfektio

LNCaP-solulinja, jonka toimitti ystävällisesti myöhään Dr. Gary Miller yliopiston Colorado (Denver, CO), oli viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen), jota oli täydennetty 5% naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals, Lowrenceville, GA), penisilliiniä (100 ug /ml) ja tetrasykliiniä (100 u /ml) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2. Perustaminen kloonien yli-ilmentämään RANKL proteiini raportoitu aiemmin [23]. Lyhyesti, täyspitkä cDNA, joka koodaa ihmisen RANKL päässä Origene (Rockville, MD) kloonattiin yksisuuntaisesti ja p3 × FLAG- myc-CMV-25 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) on Notl ja Xbal restriktioentsyymikohdat. Sen jälkeen transfektion LNCaP 75% konfluenssiin lippu-tagged RANKL ja neo plasmidista käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) kanssa 6-kuoppalevyllä 48 tuntia, solut trypsinoitiin ja ympättiin 15 cm: n maljalla. Stabiili LNCaP-neo ja LNCaP-RANKL solut altistettiin G418-valinnan (400 ug /ml) ja yhden solun klooneja eristettiin ja ylläpidetään 200 ug /ml G418: aa RNA: n ja proteiinin uutto ja immunomääritys, jossa käytetään 8-kuoppaisille chambered kalvot (Thermo Scientific, Rochester, NY). Kolme LNCaP-RANKL ja 2 LNCaP-neo solujen kloonit valittiin. Koska niiden biokemialliset fenotyypit olivat samanlaisia ​​käytimme yksi klooni kustakin tutkimukseen.

käänteistranskriptaasia (RT) PCR

Yhteensä solujen RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen Sciences, Inc. ; Germantown, MD) mukaan valmistajan ohjeiden. Komplementaarisen DNA: n (cDNA) muodostettiin 3 ug kokonais-RNA: sta käyttämällä SuperScript® III Ensimmäisen Strand Synthesis System (Invitrogen, 1 ui cDNA altistettiin PCR-analyysejä käyttäen seuraavia alukkeita: RANKL F, 5′-TGG ATC ACA GCA CAT CAG AGC AG-3 ’; RANKL R, 5′- TGG GGC TCA ATC TAT ATC TCG AAC-3′, E-kadheriinin F, 5’-GCC AAG CAG CAG TAC ATT CTA CAC G-3 ’, E-kadheriinin R , 5’-GCT GTT CTT CAC GTG CTC AAA ATC C-3 ’, N-kadheriinin F, 5′-GAT GTT GAG GTA CAG AAT CGT, N-kadheriinin R, 5′-GGT CGG TCT GGA TGG CGA-3′ ; vimentiinista F, 5′-GGA CTC GGT GGA CTT CTC; vimentiinista R, 5’-CGC ATC TCC TCC TCG TAG-3 ’, c-Met F, TGGGAATCTGCCTGCGAA c-Met R, CCAGAGGACGACGCCAAA. PCR reaktiosykleissä liittyi alkudenaturaatio 94 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 36 sykliä 94 ° C: ssa, 1 min, 55 ° C, 30 sekuntia; ja RANKL72 ° C, 1 min, mitä seurasi lopullinen 72 ° C: ssa 10 minuutin ajan pidennystä. E-kadheriinin ja N-kadheriinin geenimonistuksen, PCR-reaktioissa juoksi 32 kierrosta ja hehkutus lämpötilat olivat 55 ° C ja 47 ° C, vastaavasti 30 sekuntia. Jos vimentiinista ja GAPDH vahvistus, PCR-reaktioissa kesti 28 sykliä hehkutuslämpötiloja 48 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Monistetut PCR-tuotteet havaittiin ja analysoitiin 1% agaroosigeelillä.

Western blot-analyysi

Solut lyysattiin RIPA-puskurilla, joka sisälsi 1 x proteaasiestäjäseostabletit (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) ja sentrifugoitiin, ja supernatantit otettiin talteen ja kvantitoitiin käyttäen Bradfordin Protein Assay (Thermo Fisher Scientific). Solulysaatit (20-30 ug) eroteltiin 4-12% Bis-Tris gradientti SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA) pelkistävissä olosuhteissa, mitä seurasi transblotting nitroselluloosakalvolle (BioRad Laboratories, Hercules, CA), ja blokattiin 5% rasvatonta maitoa /PBST: ssä yhden tunnin ajan huoneenlämmössä (RT) ja inkuboitiin laimennetulla ensisijainen Abs estopuskurissa 4 ° C: ssa yön yli. Lähde ja laimentaminen ensisijaisen Abs olivat: RANKL (sc-74261; 1:400), E-kadheriinin (sc-7870, 1:1000), vimentiinistä (sc-6260, 1:500), c-Met (SC- 10; 1:500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), N-kadheriinin (# 610920; 1:200) (BD Transduction Laboratories, San Jose, CA ja Santa Cruz Biotechnology), p-Met (Tyr-1230 /34/35) (# 44888G; 1:500) (Invitrogen), p-NF-KB: n p65 (Ser536) (# 3033; 1:1000), NF-KB: n p65: n (# 4764; 1:1000) (Cell Signaling teknologia, Danvers, MA). Tuotanto ja käyttö androgeenireseptorin vasta-aineen (PG21; 1:500) raportoitiin aiemmin [24]. Membraanit huuhdottiin 3 x PBST: llä, inkuboitiin peroksidaasiin konjugoidulla anti-hiiri- tai anti-kaniini-Abs huoneenlämpötilassa yksi tunti ja huuhdeltiin 3 x PBST: llä. Signaalit visualisoitiin käyttämällä ECL Plus-reagenssia (GE Healthcare Biosciences, Pittsburg, PA). Palauta Plus Western Blot kuoriminen Buffer (Thermo Fisher Scientific) käytettiin ennen uudelleen testauksella eri Abs.

In vivo kokeita

Kaikki eläin menettelyt suoritettiin hyväksytyn protokollan Institutional animal Care ja Käytä komitea (IACUC # 2999, Cedars-Sinai Medical Center, ja A10-0100, University of British Columbia). LNCaP-RANKL ja LNCaP-neo-soluja (1 x 10

6 solua /50 ui PBS) inokuloitiin intrakardiaalisesti osaksi 5- 7-viikon ikäisiä urospuolisia kateenkorvattomia nude-hiiriä (Charles River; n = 20 LNCaP-RANKL ja n = 15 LNCaP-neo). Kaikki hiiret seurattava säännöllisesti etäpesäkekasvainten muodostumiseen, joka tapahtui ensimmäisen kerran 8 viikkoa. Eläimet lopetettiin 12 viikkoa.

Eturauhassyöpä kudosnäytteiden

Formaliinifiksoidusta ja parafiiniin upotetut (FFPE) ihmisen eturauhassyövän näytteet saatiin Department of Pathology of Cedars-Sinai Medical Center (IRB # Pro 00021228). Muita kliinisiä eturauhassyövän kudosnäytteet saatiin tri Fouad Habib yliopiston Edinburgh, Skotlanti, ja tohtori Hua Yang Jilinin yliopisto, Kiina. Käyttö kliinisistä näytteistä hyväksyttiin ihmisen kudos Institutional Review valiokuntien vastaavissa toimielimissä.

CRPC ksenografteissa

perustaa työ- protokollia yhden ja juokseva useita QD merkintöjä, päätimme käyttää LTL -313 CRPC ksenograftimallia koska se jäljittelee kastraatio kestävä eturauhassyövän ja antaa johdonmukaisen ja helposti saatavilla useita kudosnäytteiden kriittinen kehittämistä ja perustetaan uusi MQDL protokollaa. FFPE kudoksiin kastraatiotasolle kestävä eturauhassyövän (CRPC) LTL-313 (Living Kasvain Laboratory, www.livingtumorcentre.com) ksenograftimallia saatiin Vancouver Cancer Center, BC Cancer Agency, Vancouver, Kanada. LTL-313 kasvainlinjaan kehitettiin eturauhasen neulabiopsiaan näyte 80-vuotiaalla potilaalla on diagnosoitu Gleason Pisteet 8 eturauhassyövän seerumin PSA taso 17 ng /ml aikaan diagnoosi [25]. Kasvain line kehitys protokolla hyväksyi Clinical Research Ethics Board of University of British Columbia, mukaisesti Laboratory Animal suuntaviivat Institute of Experimental Animal Sciences (Human mallin käyttö oli kanssa hyväksynnät University of British Columbia, Kanada (IRB # UBC BCCA REB # H04-60131). Lyhyesti, vahvistaa kastraatio kestäviä eturauhassyöpä, tuore LTL-313 tuumorikudoksista päässä 5th sukupolven varttaminen leikattiin 3 x 3 x 1 mm paloiksi ja uudelleen oksastetaan sisälsivät kapselin alle kapselit uros NOD-SCID-hiirissä. eläimiä pidettiin kasvainten muodostumista kaksi kuukautta ennen kastraation poistaa androgeenien. Kolme viikkoa kastraation jälkeen, kun kasvaimen tilavuus väheni merkittävästi, jäljellä kasvaimen kudokset kerättiin ja valmistettiin kuten FFPE kudospaloista. Xenongraft kudoksia, joita käytetään tässä tutkimuksessa, olivat peräisin 9 kasvainten kastroitu hiirillä ja 5 kasvaimia 5 ehjä hiiren isännät täydennetty testosteronia, joka oli tehty lumetoimenpideryhmään.

Immunoassay reagenssit

primaaristen vasta-aineiden (Ab: t) ja niiden lähteet olivat: hiiren monoklonaalinen Ab ihmisen EpCAM (VU-1D9) ja RANKL (12A668) alkaen Novus Biologicals (St. Charles, MO); Hiiren monoklonaalinen Ab c-Met (25H2) ja kanin monoklonaalinen Ab E-kadheriinin (24E10) Cell Signaling Technology; kanin polyklonaalista Ab androgeenireseptorin, AR, (PG 21), tri Gail Prins alkaen University of Illinois (Urbana, IL); vuohen polyklonaalista Ab neuropiliini-1 (C-19), kanin polyklonaalinen Abs N-kadheriinin (H-63), Mcl-1 (S-19), p-NF-KB: n p65: n (Ser 536), ja VEGF: n (A -20) Santa Cruz Biotechnology, Inc .; ja kanin polyklonaalista Ab p-c-Met (pYpYpY1230 /1234/1235) Invitrogen. Toissijainen Abs tutkimuksessa käytetyt valmistettiin biotinyloituja Abs hiiren, kani, ja vuohen IgG (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS) ja streptavidiini-konjugoitua QDS on 565-, 585-, 605-, 625, 655- ja 705 nm aallonpituuksilla 1 uM kantaliuos ostettiin Invitrogen.

immunohistokemiallinen (IHC ) värjäys

IHC seurannut julkaistu protokolla [26] pienin muutoksin. FFPE osat (4 um) poistettiin parafiini, vedettömät, ja altistettiin antigeenille haku. Kun oli inkuboitu in Dual Endogeeninen Enzyme Block liuosta (Deeb, Dako, Carpinteria, CA) 10 minuutin ajan, osa käsiteltiin primaarisen vasta-aineen laimennettiin vasta-aineen liuotinta liuosta (Dako) seuraavasti: RANKL (1:100), c-Met: ( 1:50), neuropiliini 1 (1:100), androgeenireseptorin (1:200), N-kadheriini (1:100), Mcl-1 (1:100); p-NF-KB p65 (Ser536) (1:100), VEGF (01:50) ja pc-Met [pYpYpY1230 /1234/1235] (1:100), vimentiinistä (1:100), ja E-kadheriinin ( 1:200) 4 ° C: ssa yön yli. Osa pestiin sitten 3 kertaa PBST: ssä (PBS, joka sisältää 0,2% Tween 20) 5 minuutin ajan per pesu. Spesifisten värjäystä, osassa käsiteltiin 30 minuuttia EnVision

+ Dual Link System-HRP (Dako), joka sisälsi piparjuuriperoksidaasiin konjugoitu vuohen vasta-aineita hiiren ja kanin Ig. Osio pestiin 3 kertaa 5 minuuttia kutakin, ja erityiset tahrat kehitettiin 3,3′-diaminobentsidiinillä (Dako).

Yhden QD Nimeäminen (SQDL) B

IHC värjäytyminen protokolla muunnettu yhden QD merkintöjä. Streptavidiini-konjugoitua QDS (565-, 585-, 605-, 625, 655- ja 705 nm) valmistettiin 10 nM PBS: ssä, jossa 6% IgG-vapaa, proteaasi-BSA: ta (Jackson Immuno- research, West Grove, PA) . Antigeeni kudokset tai kiinteän solu- näytteitä inkuboitiin PBS: ssä, joka sisälsi 2,5% hevosen seerumia (Vector Laboratories) ja 20% streptavidiini Block reagenssia (Invitrogen) 20 minuuttia, minkä jälkeen seuraa käsittely ensisijaisen Abs kuten edellä on kuvattu edellä immunoreagensseja osassa PBS plus 1% hevosen seerumia ja 20%: Biotiini Block reagenssia (Invitrogen) 4 ° C: ssa yön yli. Sen jälkeen, kun 3 x 5 min PBST (PBS + 0,4% Triton X-100), huuhdellaan näytteitä inkuboitiin toissijaisen Ab cocktail huoneenlämpötilassa 30 minuuttia ja sitten inkuboitiin vastaavan streptavidiini-QD 37 ° C: ssa 60 min. Lopussa kunkin Inkuboinnin näytteet altistettiin rutiini 3 x 5 min PBST (PBS + 0,4% Triton X-100) huuhtele. Loppuhuuhtelun jälkeen, kalvot kiinnitettiin vesipitoisessa kiinnitysväliaineet sisältävä 4’6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (Vector Laboratories) kuvantamiseen. Ab laimennokset kuvattu IHC edellä.

Multipleksattu QD Nimeäminen (MQDL) B

yksittäinen QD merkinnät protokolla modifioitiin MQDL, joissa yhden kudosleike alistettiin värjäyksen useita markkereita peräkkäisellä tavalla. Jokaista biomerkkitesti merkintöjä alkoi streptavidiini esto, jonka jälkeen ensisijainen Ab reaktio ja biotinyloidun sekundaarisen Ab inkubaation ja reaktio streptavidiiniliitetyillä konjugoidun QD tiettynä aallonpituudella. Leikkeitä inkuboitiin peräkkäin (jossa on 3 x 5 min PBST huuhdellaan jokaisen inkubaation). Ensisijainen Abs ja laimennetaan MQDL olivat samat, joita käytetään SQDL. Immunoreaktion sekvenssit olivat: 1) Anti-Neuropiliini-1 Ab, 2 tuntia, huoneenlämpötila; hevosen biotinyloidun anti-vuohi lgG: llä, huoneenlämmössä, 30 min; streptavidiini-QD705, 37 ° C: ssa, 1 tunti. 2) Anti-p-c-Met Ab, 4 ° C: ssa, yön yli; hevosen biotinyloidun anti-kani-IgG, huoneenlämmössä, 30 min; streptavidiini-QD655 37 ° C: ssa, 1 tunti. 3) Anti-VEGF Ab, huoneen lämpötilassa, 2 tuntia; hevosen biotinyloidun anti-kani-IgG, on roomtemperature, 30 min; streptavidiini-QD625 37 ° C: ssa, 1 tunti. 4) Anti p-p65-NFKB Ab 4 ° C: ssa, yön yli; hevosen biotinyloidun anti-kaniini-IgG huoneenlämpötilassa 30 min; streptavidiini-QD565 37 ° C: ssa, 1 tunti. 5) Anti RANKL Ab huoneenlämmössä, 2 tuntia; hevosen biotinyloidun anti-hiiri-IgG huoneenlämpötilassa 30 min; streptavidiini-QD585 37 ° C: ssa, 1 tunti. 6) Asennus vesipitoisessa kiinnitysväliaineet sisältävien DAPI. Ab pitoisuudet kuvattu IHC osiossa. Jaksot FFPE LNCaP-RANKL ihmisen eturauhassyövän soluja käytettiin positiivisena kontrollina. Negatiivisia kontrolli, ensisijainen Abs korvattiin isotype- ja lajien yhteensopivat ohjaus Abs ja levitetään välittömästi viereiseen kudokseen osassa, ja MQDL suoritettiin rinnakkain kudoksen dia merkitty testaus ensisijaisen Abs.

Kuva hankinta

CRi spektrin kuvantamisjärjestelmä (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) sisäänrakennetulla Nuance v3.1 ohjelmaa käytettiin dokumentoida spektrikuviin seuraten valmistajan suosittelemaa menetelmää. Kukin kenttä syövän kudoksen sarja- kuvat hankittiin 10 nm: n aallonpituudella välein 450-800 nm, erilaisia ​​valittu, joka vastaa aktiivista fluoresoiva QDS. Se luo käsittelemättömän kuva ”kuution”, kuten pino 36 eri kuvaa jokaisen kuvan, joka sisältää täydellisen spektri tiedot kaikista pikselin että tietyllä aallonpituudella. Kaikki kuvat hankittiin 400 × suurennuksella, jossa on 50 millisekunnin altistumista. Välttämiseksi vaihtelut merkintöjen takia soluun heterogeenisuus, viisi kuvaa erilaisista syöpäkudoksen sivustoja otettiin jokaisesta kudosnäytteestä myöhemmin kvantifiointiin.

Kuva Dekonvoluutio

Kuva dekonvoluutiolla tai unmixing protokollaa käytetään erottamaan erityisiä merkintöjä tietyllä QD. Spektrin kirjasto 565, 585, 605, 625, 655, ja 705 nm rakennettiin dekonvoluutiolla by performimg useita SQDLs käyttäen androgeenireseptorin (AR) vasta-aine ilman lopullista DAPI counterstaining sarjatuotannossa viereisten kudosleikkeiden. Positiivinen merkitseminen AR varmistettiin rinnakkain IHC värjäys vierekkäisillä kudoksiin. Kirjo DAPI saatiin asentamalla viereinen kudos vesipitoisessa asennus alustassa, joka sisältää DAPI. Spectra kudosta autofluorisaatiota hankittiin kustakin kudoksesta negatiivinen kontrolli luistin (ks MQDL jakso) valmistetaan IHC ilman loisteputki markkereita. Autofluorisaatiota vähennys suoritettiin käyttäen Real Component Analysis plug-in ohjelmisto. Spektrin kirjastoa käytettiin sitten unmix kuution. Erillinen spektrin osuus data ”kuution” tuodaan ulos nimetty värillinen intensiteetti karttoja. Nämä kuvat edustavat jakautuminen kunkin QDS ja autofluoresenssi kudoksessa. Kun dekonvoluutio kuvien, taustan merkintöjä suodatettiin ja ainoastaan ​​oikeita positiivisia signaaleja näytettiin kuvia Esitetyt luvut.

Signal Kvantifiointi

spektrin kirjastoa käytettiin deconvolute kuvauskuution poimia merkintöjä yksittäisten QD käyttää ilmoittamaan v1.3 ohjelmisto (Etu) seuraavat suositellun strategian. Ensin koulutus joukko, joka käsittää kaksi luokkaa kudos luotiin: ”syöpä” ja ”ei-syöpä”. Ohjelmisto oli koulutettu näillä alueilla käyttäen spektrit sekä DAPI vastavärinä ja multipleksoidun QD immunoleimaus ja testattu 50 satunnaisesti valittua solua kustakin kuvan tarkkuuden määrittämiseksi eriyttää kahteen luokkaan. Tämä prosessi toistettiin, kunnes edelleen toistojen ei enää parantunut tarkkuus. Histologinen H /E kuvia käytettiin sitten paikallistaa syöpäsoluja perustuu ydin- DAPI merkintöjä. Sisäänrakennettu algoritmia käytettiin sitten määritellä sytoplasmista vs. ydin- subsellulaarisista alueilla. Perustuu analyysiin kuvien 400 kertainen suurennus, optimaalinen kynnys asetukset arviolta: kiinteän asteikon 200, minimi möykky koko 20, maksimi möykky koko 10000, kierron kynnys 0, terävyyden 0, täytä reikä käytössä (ydinaseiden parametrit); sisempi etäisyys tumaan 1, ulompi etäisyys tumaan 7, vähintään sytoplasma Näytteen koon 1, pienin signaalialue 0, maksimi signaali alueen 65535 (sytoplasminen parametrit). Poistamaan epäspesifiset signaalit määritetyn spektrin, soluttoman alue kentässä analysoitavan käytettiin tausta merkintöjä. QD fluoresenssin voimakkuuden kussakin solussa vietiin Excel-taulukko (Microsoft, Seattle, WA) ja alistettiin tilastollinen analyysi [27], [28].

Tulokset

kehittäminen kvantitatiivisen QD merkinnät protokolla arvioitaessa geeniekspression liittyvän aktivoitumisen c-Met: signalointi ja EMT viljellyissä ihmisen LNCaP vakaasti tansfected kanssa RANKL

LNCaP luu- ja pehmytkudoksen etäpesäkkeitä malli: A novel LNCaP luumetastaasipotilailla kehitettiin by vakaa transfektio tämän solulinjan kanssa RANKL (LNCaP-RANKL), joka käyttää EMT transfektoiduissa soluissa. Kun RANKL yli-ilmentävät LNCaP solua injektoitiin intrakardiaalisesti hiirillä ne osoittivat lisääntynyttä esiintymistä luun ja pehmytkudoksen etäpesäkkeitä (taulukko 1).

validointi aktivoitua c-Met signalointi komponentteja, jotka johtavat EMT by RT PCR, Western blot ja Single Quantum Dot Labeling, SQDL: vertailu geenin ilmentymisen välisen stabiilin LNCaP-neo-ohjaus ja LNCaP-RANKL-soluissa käyttäen RT-PCR: ää ja Western blot osoitti näyttöä aktivoidun c-Met: signalointi lisääntyneen ekspression c-Met: n, pC-Met, ja p-NFKB p65 (kuvio 1). Solut läpikävivät morfologisia (paneeli A) ja biokemialliset (paneelit B ja C) epiteelin ja mesenkymaalitransitioon, alentuneeseen solujen välistä adheesiota välittämä E-kadheriinin ja EpCAM, ja lisääntynyt N-kadheriinin, vimentiinistä ja RANKL. Nämä arvioinnit c-Met aktivaatiota ja EMT alistettiin SQDL analyysit tietyn pyrkimystä vahvistaa, jos c-Met aktivointi ja EMT esiintyi tällä solumallissa eturauhassyövän etenemistä. SQDL vahvisti, että verrattuna ohjaamaan LNCaP-neo-soluissa (kuvio 2A), LNCaP-RANKL-soluja (kuvio 2B) oli aktivoitu c-Met: signaloinnin, joka käy ilmi kohonnut ilmentyminen RANKL, c-Met, pc-Met ja p-NFKB p65 ja todisteet EMT, joka on kadheriinin kytkin kohonnut ilmentyminen N-kadheriinin, vimentiinistä ja RANKL, mutta laski ilmentyminen E-kadheriinin ja AR. Kvantitatiiviset analyysit (kuvio 3) 1000 satunnaisesti valittu syöpäsolujen ilmoittaa ohjelmisto (Etu) tuki kuvatiedon jossa sekä AR ja E-kadheriinin ilmentyminen voimakkaasti vähentynyt ja aktivoitu c-Met: signalointi komponenttien johti EMT, kuten kohonnut ilmentyminen c-Met, pc-Met, p-NFKB p65, N-kadheriinin, vimentiinin, ja RANKL havaittiin LNCaP-RANKL, verrattuna LNCaP-neo-soluissa. Tämä kvantitatiivinen SQDL pöytäkirja hyväksyttiin geenien ilmentymisen analysointiin vakiintunut CRPC LTL-313 ksenograftimallissa.

RANKL-transfektoiduissa LNCaP aiheuttama EMT in histomorphology (A) ja geenien ilmentymiseen mRNA (B) ja proteiini (C ). Data edustaa yhtä 3 RANKL-stabiilisti transfektoitu ja 2 neo-stabiilisti transfektoitu LNCaP-solukloonien.

Differential QD merkintöjä proteiinien suoritettiin LNCaP-neo (A) ja LNCaP-RANKL (B-solut) käyttämällä DAPI tumavärjäystä referenssinä. Jokaista analyysia varten QD leimatun proteiinin ilmentymistä on esitetty pseudovärin, jossa päällekkäin kuvan DAPI ja QD signaaleja (Yhdistetty). × 400.

Solupohjaisilla miedommilta lukumääristä 1000 kustakin neo- ja RANKL-transfektoidut LNCaP kloonit kvantitoitiin käyttäen INFORM ohjelmistoa. Tilastollisesti merkittäviä muutoksia proteiinien ilmentyminen havaittiin (

P

0,05).

Validation c-Met: signaloinnin aktivointi ja EMT että CRPC LTL-313 Mallin tulosten vahvistanut IHC ja SQDL

ymmärtää kliinistä merkitystä c-Met signaloinnin aktivointi ja EMT että LNCaP-RANKL malli ja siihen liittyvä nousu eturauhassyöpäetäpesäkkeet, määrittelimme c-Met-signalointireitin ja EMT on CRPC LTL-313 ksenograftimallia saatu Living Kasvaimen Laboratory (livingtumorcentre.com). Olemme sisältyy lisäksi c-Met: liittyvää signalointia geenejä, kuten neuropiliini-1, VEGF, p-Akt, VEGFR2, Mcl-1 ja AR, jolle oli ominaista välittäjinä c-Met: alavirtaan eloonjäämisen signalointi [15], [21], [ ,,,0],29], [30]. Kuvio 4 esittää, että lisääntynyt c-Met signalointi liittyvien geenien ja laski AR ilmaisun CRPC LTL-313 ksenograftien ylläpidetään kastroitu uros isännät, joka arvioidaan IHC (paneeli A) ja SQDL (paneeli B) verrattuna ksenograftien säilyy ehjänä hiirillä androgeenin täydentämistä.

c-Met aktivoitu ja EMT liittyneet proteiinit havaittiin CRPC LTL-313 ksenograftimallia tavanomaisilla IHC (A) ja SQDL (B). Kastraatio lisääntynyt paneeli geenien LTL-313 vierassiirrettä eturauhassyöpä ja laski AR ilmaisun verrattuna ksenograftien saadaan ehjä isäntien sekä IHC ja SQDL. × 400.

MQDL analyysi osoitti aktivoitu c-Met ja EMT on CRPC LTL-313 ksenograftimallia ja primaarinen ja metastaattinen ihmisen eturauhassyövän kudosnäytteet. Joukko ihmisen eturauhassyöpäksenografteista saatu Living Kasvaimen Laboratory käytettiin testaamaan määrällisiä MQDL protokollaa. Valitsimme LTL-313 malli tähän tehtävään, koska tämä malli esittelee CRPC ominaisuuksia Jonka halukkuutta ensisijaisesti imusolmuke keuhko- ja maksametastaaseista kanssa harvoin luun etäpesäke, kun kasvaimet implantoidaan ja kasvatetaan alle munuaiskotelo. Testasimme hypoteesia, että kasvaimet kasvatettiin kastroitu hiiret kehittävät kastraatio vastus ja se on aktivoitu c-Met: signalointi johtaa EMT, verrattuna kasvaimia kasvatettiin hiirissä täydennetty eksogeenisen androgeenin (kuvio 5A). Kolme lähestymistapoja otettiin: 1) laatia vankka MQDL protokolla tunnistaa ja määrällisesti paneelia geenin lausekkeita CRPC LTL-313 malli kudosnäytteen kanssa tuloksiin verrattuna SQDL; 2) käyttää tätä koskevat määrälliset MQDL protokolla vahvistaa, jos aktivointi c-Met ja EMT esiintyy CRPC LTL-313 kudoksia säilytetään kastroitu isännät; ja 3) osoittaa, että standardoidun MQDL protokollan aktivoinnin c-Met ja EMT induktio sekä ensimmäisen ja luuston metastaattinen ihmisen eturauhassyöpäkudoksille. Kuvio 5B esittää kvantitatiivinen MQDL analyysit neuropili-1, PC-Met, VEGF, p-NFKB p65, ja RANKL, aiemmin raportoitu liittyvän c-Met-signaalin aktivaatiota [15], [22] ja EMT [26], [31] ihmisen eturauhasen syöpäsolujen ja CRPC LTL-313 malli. Osoitimme aktivoitu c-Met signalointi ja EMT, kuten näytteillä lisääntynyt ilmentyminen neuropi–1, VEGF, ja RANKL proteiinia ja aktivointi pc-Met ja p-NFKB p65 on CRPC LTL-313 kasvain malli suurempi ekspressio ja aktivaatio näiden geenien LTL-313 tuumoriksenografteja ylläpidetään kastroitu verrattuna ennallaan hiiriin. Sisäisenä kontrollina minimoida mahdolliset fluoresenssi häiriöitä useiden QD antureista, suoritimme MQDL vierekkäin kanssa SQDL protokollan (katso edellä). Kohonnut ekspressio 5 tutkittu geenien havaittiin olevan tilastollisesti merkitsevä, jonka inFom kvantitatiiviset analyysit (kuvio 5B). Me määritelty tämä paneeli 5 geenien ensisijainen eturauhassyövän näytteitä eri Gleason tulokset ja totesi, että ilmentyminen neuropi–1, VEGF, pc-Met, RANKL, ja p-NFKB p65 olivat koholla heikosti eriytetty (Gleason pisteet 10) kuin kohtuullisesti erilaistunut (Gleason pisteet 7, 3 + 4) eturauhassyöpä (kuva 6). Nämä tulokset, yhdessä, vahvisti, että QD merkinnät on erittäin herkkä ja monipuolinen ja sitä voidaan käyttää multiplexing geeniekspressioprofiilien kokeellisissa malleissa yhteismarkkinavaiheessa solutasolla.

Yhden kasvainkudossektioista koskemattomista ja kastroitu isännät joutuivat järjestysehtojen MQDL. Tehostettu ekspressio c-Met: aktivoitu geenien havaittiin kasvaimen kudoksissa kastroitu isännät. (A) pino useita kuvia (Cube), tumavärjäystä (DAPI), ja yksittäiset geenin ilmentymistä (in pseudocolors) esitetään. Geenien ilmentyminen signaalit päällekkäin DAPI ydin- signaalit saadaan yhdistelmäkuva analyysiä varten. × 400.