Krooninen sairaus

tiivistelmä

Jotta ymmärtää molekyylitason mekanismeja Bifidobacterium infantis tymidiinikinaasin /nukleosidianalogin gansikloviiri (BI-TK /GCV) käsittelyjärjestelmä, joka oli osoitettu näytteille kestäviä anti-kasvaimen kasvua aktiivisuutta ja aiheuttaa apoptoosin virtsarakon syöpä, Proteomisten lähestymistapa isobaaristen tunnisteita suhteellisen ja absoluuttisen määrän (iTRAQ), mitä seurasi nestekromatografia-tandem-massaspektrometrialla (LC-MS /MS) käytettiin. 192 alassäädetty ja 210 sääteli proteiinit tunnistettiin hoidon jälkeen BI-TK /GCV järjestelmä Sprague-Dawley (SD) rottia. Western blot analyysi ja immunohistokemia analyysi vahvisti, että Peroxiredoxin-I (Prx-I) oli merkitsevästi alassäädetty virtsarakon syövän hoidon jälkeen. PRX-I hiljentäminen transfektoimalla PRX-I shRNA merkittävästi tukahdutti kasvua, edisti apoptoosin ja säännelty solusyklin T24-soluissa ja vähensi fosfo-NF-KB: n p50 ja p65-proteiinin ilmentymisen, joka paljasti yhteyksiä PRX-I ja NF-KB polku epäsuorasti Ingenuity koulutusjakson analyysi (IPA). Nämä havainnot tuottavat uusia oivalluksia hoito virtsarakon syövän, paljastaen Prx-I uutena terapeuttisena kohteena ja osoittaa BI-TK /GCV järjestelmän mahdollinen hoito alas- säätely Prx-I läpi NF-KB-signalointireitin.

Citation: Jiang L, Xiao X, Ren J, Tang Y, Weng H, Yang Q, et al. (2014) proteomiikan analyysi Virtsarakon syövän Osoittaa Prx-I on keskeinen Molecule BI-TK /GCV käsittelyjärjestelmä. PLoS ONE 9 (6): e98764. doi: 10,1371 /journal.pone.0098764

Toimittaja: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences keskus, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 joulukuu 2013; Hyväksytty: 06 toukokuu 2014; Julkaistu: 06 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Jiang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain tutkimus avustusta Natural Tiedesäätiö of China (nro 81072087 /H1619). URL National Natural Science Foundation of China: https://www.nsfc.gov.cn/publish/portal0/default.htm. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on yleisin urologiset syöpä Aasiassa ja sen kliininen hallinta on erittäin kallista [1]. Vuonna 2014 noin 74690 uutta tapausta virtsarakon syövän odotetaan diagnosoitu, ja noin 15580 heistä kuolee [2]. Virtsarakon syöpä voidaan jakaa kahteen suureen kliiniset ja patologiset alatyypeistä: pinnallinen kuin lihas-invasiivisia tyyppi ja kehittyneet lihas-invasiivisia type [3]. Yleensä pinnallinen virtsarakon syöpä käsitellään endoskooppiset resektio suotuisa ennusteeseen, mutta se joskus toistuu arvosanalla eteneminen [4]. Johto kehittyneitä virtsarakon syöpä on suuri haaste, ja näillä potilailla on epäedullisempi ennuste on hyvin pieni 5 vuoden pysyvyys; siksi, aggressiivisempia hoitovaihtoehdot ovat tarpeen, kuten radikaali cystectomy ja virtsan kulkeutuminen [5]. Edelleen, virtsarakon syöpä erityisesti kehittyneen tyyppinen toistuu huomattavassa määrä potilaita, ja jopa kuolemaan johtavaa, ja siksi, edullisesti vähemmän aggressiivinen lähestymistapoja pitäisi kehittää taudin torjumiseksi.

Herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasin (HSV -tk) -välitteisen itsemurha geeniterapiaa kuin yleisesti hyväksytty strategia virtsarakon syöpä voi muuntaa myrkyttömiä nukleosidianalogi gansikloviiri (GCV) tulee myrkyllinen trifosfory- muoto, joka myöhemmin aiheuttaa kuoleman nopeasti jakautuvat solut [6]. Olemme aiemmin turvautuneet

Bifidobacterium infantis

(BI), joka on kasvain, kohdistaminen bakteeri, koska se selektiivisesti paikallistaa ja lisääntyy sisällä hypoksisten alueiden kasvaimia ei-patogeenisen ja anaerobinen bakteeri [7], [8] . Huomasimme, että BI ja TK /GCV (BI-TK /GCV) järjestelmä osoitti kestävä anti-kasvaimen kasvua aktiivisuuden jyrsijän virtsarakon syövän malli in vivo, johon osallistui sekä ulkoisten ja sisäisten apoptoosin reittejä [9].

Kun pyritään ymmärtämään taustalla molekyylitason mekanismit ja tunnistaa mahdolliset kohdeproteiinin molekyyli tämän turvallinen ja tehokas hoito, meidän turvautuneet massaspektrometriaa (MS) -pohjaisen isobaaristen tunnisteita suhteellisen ja absoluuttisen kvantifiointi (iTRAQ) kattavien ero proteiini profiileja. Lisäksi tutkimme molekyyli koulutusjakson Peroxiredoxin-I (Prx-I), yksi tunnistettu alassäädetty proteiinien virtsarakon syövän tunnistaa iTRAQ hoidon jälkeen BI-TK /GCV.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

BI-TK /GCV käsittelyjärjestelmä rakennettiin onnistuneesti meidän tutkimusryhmän (Chongqing, Kiina) [9].

Koe-eläimet

seitsemänkymmentä Sprague-Dawley-rottia (ikä 6-8 viikkoa, paino 180-200 g) ostettiin Chongqing National Biological Industry Base of Experimental Animal Center (Kiina) ja sijoitetaan erityisissä patogeenivapaissa kunnossa 23-27 ° C ja kosteus 55-65% 12 tunnin valo-pimeä jaksoissa. Kaikki eläin menettelyt hyväksymiä eläinten käytön ja hoidon komitean Chongqing Medical University. Rotan virtsarakon kasvainmuoto rakensi perfuusio N-metyyli-nitrosoureaan (MNU) (Sigma, USA). MNU laimennettiin 20 g /l, jonka sitruunahappoa puskuriliuosta. Kukin virtsarakon perfusoitiin 0,1 ml 2 viikon välein, yhteensä neljä -perfuusioiden.

Studies in vivo

Kuusikymmentä kasvain Sprague-Dawley-rottia jaettiin sattumanvaraisesti neljään ryhmään (kukin

n

= 15): normaali suolaliuos ryhmä, BI ryhmä, BI /PGEX-1 ryhmä, ja BI-TK ryhmä. Sen jälkeen, kun Bifidobacterium konsentroitiin noin 0,5 ml: aan vastaavaa interventioiden injektoitiin häntäsuonen kautta (bakteeri count, 4,4 x 10

9) kerran viikossa 4 viikon ajan. Kaikki ryhmät saivat päivittäin injektoimalla vatsaonteloon GCV (50 mg /kg) ja 28 päivää. Kaikki rotat tapettiin nukutuksessa natriumpentobarbitaalilla. Osa virtsarakon syöpä kudoksiin neljään ryhmään säilytettiin parafiiniin immunohistokemiallista (IHC) analyysi, ja loput kudosten pidettiin -80 ° C: ssa lisäanalyysiä varten.

Protein näytteen valmistus ja iTRAQ merkinnät

kudokset lyysattiin lyysipuskurissa (7 m ureaa, 1 mg /ml DNaseI, 1 mmNa

3Vo

4, ja 1 mm fenyylimetaania sulfonylfl uoride, PMSF) ja sentrifugoitiin 6000 g ja 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Supernatantti kerättiin ja kokonaisproteiinipitoisuus mitattiin käyttämällä 2D kvantifiointi Kit (Amersham Biosciences, Uppsala, Ruotsi). Kukin näyte pilkottiin 20 ui 0,1 ug /ul trypsiini-liuosta (Promega, Madison, USA) 37 ° C: ssa yön yli ja sitten leimattiin iTRAQ tagit seuraavasti: (i) normaalia suolaliuosta ryhmä, 114 tunnisteita; (Ii) BI-TK ryhmä, 115 tunnisteita; (Iii) BI /PGEX-1 ryhmä, 116 tunnisteita; (Iv) BI ryhmä, 117 tunnisteita. Leimatut näytteet yhdistettiin ennen tarkempaa analysointia.

Strong kationinvaihto (SCX) kromatografia

vähentämiseksi näytteen monimutkaisuutta nestekromatografia (LC) -MS /MS-analyysia yhdistetyssä näytteet olivat laimennettu 10-kertaisesti SCX puskuri A (10 mm KH

2PO

4 25% asetonitriili, pH 3,0) ja käytetään 2,1 x 200 mm polysulfoethyl SCX-kolonniin (yhtiö PolyLC, Columbia, USA). Pylväs eluoitiin gradientilla 0-25% SCX puskuria B (10 mM KH

2PO

4 pH 3,0 25% asetonitriiliä, joka sisälsi 350 mM KCI), 30 minuutin aikana, minkä jälkeen gradientilla 25- 100% SCX puskuri B: tä 40 minuutin ajan. Nämä SCX fraktiot lyofilisoitiin tyhjiössä rikastamon ja altistettiin C-18 clean-up käyttäen uuttokolonnin (100 mg kapasiteetti, Supelco, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).

Sähkösumutusmassaspektrometria ioni-kvadrupoli -of-lento MS (ESI-Q-TOF-MS) analyysi

MS suoritettiin käyttäen nano-LC kytketty verkossa on QStar Elite massaspektrometri (Applied Biosystems). LC eluentti suunnattu ESI lähde Q-TOF-MS-analyysiä. Massaspektrometri asetettiin suorittamaan tietojen riippuvainen hankinnasta (IDA) on positiivinen ioni-tilassa valitun massa erilaisia ​​300-2,000 m /z. Peptidejä, joilla 2-4 varaustiloissa valittiin tandemmassaspektrometrian, ja aika summattu MS /MS tapahtumia asetettiin 3 s. Suhteelliseksi kvantitoimiseksi proteiineja, jos iTRAQ, suoritettiin MS /MS skannaa, ja se oli pinta-alojen suhde alle piikit 113, 114, 115, ja 116 Da, jotka olivat massojen tunnisteita, jotka vastaavat iTRAQ reagenssit.

proteomiikan analyysi

bioinformatiikka prosessit ja molekyylitason toimintaa tunnistettujen proteiinien BI-TK ryhmä käsittelyn jälkeen luokiteltu PANTHER luokitusjärjestelmän (www.pantherdb.org). Väylät ilmentyvät eri proteiinien tunnistetaan iTRAQ analysoitiin Ingenuity koulutusjakson analyysi (IPA) ohjelma (https://www.ingenuity.com). Että ohjelmiston kekseliäisyyttä, käyttänyt tietoja poimia vuorovaikutteisia verkostoja proteiinit kansainvälisessä Protein Index (IPI) tietokantaan. Verkko pistemäärällä yli 2 pidetään yleensä voimassa.

Validation Western blot ja IHC

Western blotting ja IHC käytettiin vahvistamaan ilmentymistä Prx-I. T Proteiininäytteet (noin 20 mg) erotettiin SDS-PAGE: lla. SDS-PAGE-elektroforeesilla, proteiinit siirrettiin PVDF-membraaneille. Tämän jälkeen lysaatit inkuboitiin primäärisen anti-Prx-I kanin monoklonaalista vasta-ainetta (1:1500) (Abcam, USA). Immunoreaktiivisia signaalit havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla (Amersham Biosciences, Ruotsi). Menettelyt mukaisesti toteutettiin valmistajan ohjeiden. Virtsarakon syöpä kudoksia neljä ryhmää inkuboitiin yön primaarisilla vasta-aineilla. Kudoksia inkuboitiin toissijaisen vasta 2 tuntia. Solutumien vastavärjättiin hematoksyliinillä. Osuus positiivisesti värjättyä kasvainsolujen määritettiin Image-Pro Plus (IPP) 6,0 ja luokiteltiin seuraavasti: 0, negatiivinen; 1, 10%; 2, 10-50%; 3, 50%. Immunovärjäyksen intensiteetti pisteytettiin seuraavasti: 0, poissa; 1, vaaleankeltainen; 2, kellanruskea; 3, ruskea. Proteiini virtsarakon syövän kudoksissa arvioitiin käyttämällä värjäystä (SI):

SI

= osuus x intensiteetti positiivisia kasvainsoluja.

Prx-1 Knockdown by shRNA

T24-soluja altistettiin Prx1 pudotus. Lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) oli exprssed kanssa GV102 järjestelmän (GeneChem, Kiina). Kolme paria sense ja antisense-oligonukleotidien sekvenssejä kohdistaminen ihmisen Prx1 (GeneBank_ID: NM_002574) olivat seuraavat: PRDX1-RNAi (sh-1) sense-juosteen 5′-GATCCCGCTTTCAGTGATAGGGCAGAACTCGAGTTCTGCCCTATCACTGAAAGCTTTTTGGAT-3 ’, PRDX1-RNAi (sh-1) antisense-juoste 5’-AGCTATCCAAAAAGCTTTCAGTGATAGGGCAGAACTCGAGTTCTGCCCTATCACTGAAAGCGG-3 ’; PRDX1-RNAi (sh-2) sense-juosteen 5’-GATCCCGATGAGACTTTGAGACTAGTTCTCGAGAACTAGTCTCAAAGTCTCATCTTTTTGGAT-3 ’, PRDX1-RNAi (sh-2) antisense-juoste 5′-AGCTATCCAAAAAGATGAGACTTTGAGACTAGTTCTCGAGAACTAGTCTCAAAGTCTCATCGG-3′; PRDX1-RNAi (sh-3) sense-juosteen 5’-GATCCCCCATGAACATTCCTTTGGTATCTCGAGATACCAAAGGAATGTTCATGGTTTTTGGAT-3 ’, PRDX1-RNAi (sh-3) antisense-juoste 5′-AGCTATCCAAAAACCATGAACATTCCTTTGGTATCTCGAGATACCAAAGGAATGTTCATGGGG-3’.A salattu sekvenssin Prx-I tavoite käytettiin negatiivisena ohjaus (con sh). T24-soluja transfektoitiin väliaikaisesti Prx1-shRNA ekspressiovektorit käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA). Non-tartunnan T24 soluja (vanhempien) ja Prx-hallita shRNA tartunnan T24 soluja (con sh) käytettiin myös. Korkeimmat tehokkuutta Knockdown mukaan shRNA vektoreita T24-soluissa määritettiin kvantitatiivisen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR). Aluke sekvenssit Prx-I olivat 5′-AGCCTGTCTGACTACAAAG-3 ’(eteenpäin) ja 5′-TCTGCCCTATCACTGAAAG-3′ (taaksepäin), mikä tuotti 104 bp: n tuotteen. Alukesekvensseissä sisäisen valvonnan GAPDH olivat 5’-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’ (reverse), joka tuotti 110 emäsparin tuotteen. Ilmaisu arvo Prx-I verrattuna GAPDH laskettiin 2-ΔΔCt. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina. Sitten ilmaisuja Prx-I T24-soluissa tippuu alas shRNAs mitattiin Western blottauksella.

Soluproliferaatiomääritys

Kun transfektio Prx-I shRNA 24 tunnin T24 soluja ympättiin 96-kuoppaisille viljelylevyille tiheydellä 4 x 10

3 solua lopullisessa tilavuudessa 100 ul /kuoppa, ja transfektoidut solut, käytettiin kontrollina. Soluproliferaatioon laskettiin eri ajankohtina (24, 48 ja 72 h) käyttäen Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Sigma, USA). Kokeet suoritettiin valmistajan protokollan. Absorbanssi 450/630 nm mitattiin Thermo spektrofotometrillä (Waltham, USA). Keskimääräinen absorbanssi kuudesta kuopista ryhmää kohti laskettiin.

Virtaussytometrinen analyysi

transfektion jälkeen 48 tuntia, solut trypsinoitiin ja sentrifugoitiin 1500 rpm 5 minuutin ajan. Solut kerättiin ja pestiin kahdesti PBS: llä. Sen jälkeen värjättiin 50 ug /ml anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) (BD Biosciences, USA) ja 20 ui 500 ug /ml propidiumjodidia (PI) (Sigma, USA) ja apoptoosin havaitsemiseen, soluja inkuboitiin pimeässä huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan ja altistettiin virtaussytometria-analyysi (FACS). Sitten solut kerättiin, pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 75% etanolilla -20 ° C: ssa yön yli. Kiinnitetyt solut pestiin kylmällä PBS: llä kaksi kertaa, lisättiin 500 ui DNA värjäysliuosta (mukaan lukien 200 ug /ml RNaasi A: ta ja 20 ug /ml propidiumjodidivärjäys liuosta) ja inkuboitiin 30 minuuttia. Lopuksi solut altistettiin solusyklin analyysi FACS. Aineisto analysoitiin ja arvioitiin ohjelman ModFit (Topsham, USA).

vaikutus Prx-I fosfo-NF-KB: n p50 ja p65

Yhteys Prx-I ja NF-kappa-B (NF-KB) kompleksi signalointi oli hiljaista proteiinissa reitin IPA. Näin ollen, jotta tutkia, onko vaikutus Prx-I apoptoottisten viestintäproteiinit johtui NF-KB eston, arvioimme ydin- tasoja fosfo-NF-KB: n p50 ja p65 (Abcam, USA) Western blot.

tilastollinen

tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (SD) ja verrattiin käyttämällä varianssianalyysiä. Taso merkittävä ero määriteltiin p 0,05. Kaikki analyysit suoritettiin SPSS 18,0 (SPSS, Chicago, USA) for Windows.

Tulokset

kvantifiointi ja tunnistaminen ilmentyvät eri proteiinien iTRAQ

Yhteensä 2343 ainutlaatuinen proteiinit tunnistettiin 95% luottamusväli, jonka ProteinPilot hakualgoritmi vastaan ​​IPI rotan proteiini tietokantaan v3.49. Tiukka raja-arvo 1,3-kertainen muutos johti viimeiset 402 ilmentyvät eri proteiineja, mukaan lukien 192 alassäädetty proteiineja ja 210 säädelty proteiineja BI-TK ryhmä hoidon jälkeen. Silmiinpistävän, uusi molekyyli Prx- I kiinnitti erityistä huomiota, jossa on 0,52-kertainen lasku BI-TK ryhmä verrattuna normaaliin suolaliuosta ryhmä. Kaaviokuva iTRAQ on esitetty kuviossa 1A, ja MS /MS-spektri Prx- I (peptidisekvenssi: VVGDHVEVHAR) on esitetty kuviossa 1B. ITRAQ tunnisteet ovat seuraavat: (i) normaali suolaliuos ryhmä, 114 tunnisteita; (Ii) BI-TK ryhmä, 115 tunnisteita; (Iii) BI /PGEX-1 ryhmä, 116 tunnisteita; (Iv) BI ryhmä, 117 tunnisteita. Proteiini ID IPI, nimi ja tärkeimmät toiminnot runsaasti muutoksia epitomized taulukossa S1.

V: kaavioesitys työnkulun iTRAQ. B: MS /MS-spektristä, jossa peptidien Prx-I (peptidisekvenssi: VVGGDHVEVHAR). 4 huippu ääriviivat kuvaavat että näytemäärät ovat samoja joka takaa tulokset ovat aitoja ja luotettavia.

bioinformatiikka- toiminnallinen analyysi ilmentyvät eri proteiinien käsittelyn jälkeen BI-TK /GCV

koetin osaksi niiden biologista roolit parantava vaikutus BI-TK /GCV virtsarakon syöpä, differentiaalisesti ilmaisi proteiinit luokitellaan eri prosessien ja toiminta luokat perustuvat PANTHER luokitusjärjestelmää. Biologisessa prosessianalyysin, suurin osa ilmentyvät eri proteiinien oli aineenvaihduntaa, jonka jälkeen soluprosessi ja solujen viestintä prosessi (kuvio 2A). Huomattavaa on, että proteiinit, jotka osallistuvat katalyyttiseen aktiivisuuteen, sitova, rakenteelliset molekyyli aktiivisuus, entsyymin säädin aktiivisuutta, ja reseptorin aktiivisuus olivat viisi molekyyli- funktioluokista (kuvio 2B). Lisäksi proteiinit, jotka osallistuvat antioksidantti oli 1,3%, vastaavasti. Kuvio 2C esittää ensisijaisen reittejä syntyy IPA differentiaalisesti ilmaisi proteiineja. Tämä verkosto sai 36 ja koostui 37 osallistuvien proteiinien apoptoosin, oksidatiivista stressiä, ja aineenvaihduntaa. Erityisesti Prx-I merkittävästi alas-ilmennetty proteiini hoidon jälkeen, liittyy suoraan transkriptiotekijä NF-kappa-B (NF-KB) kompleksi reitin tähän verkkoon, mikä osoittaa, että Prx-I voi olla tärkeä rooli apoptoosin virtsarakon syövän BI-TK /GCV järjestelmä osittain NF-KB-signalointireitin.

PANTHER luokittelu proteiinien perustuva (A) biologinen prosessi ja (B) molekyyli toiminto. (C) Interplaying verkon proteiinien runsaus muutoksen tuottamat kekseliäisyyttä reitin analyysi (IPA). Verkko hiljaista liitäntä Prx-I ja NF-KB: n monimutkainen.

validointi Prx-I Western blot ja IHC

ero ekspressiotasot Prx- I tunnistaa iTRAQ lähestymistapa todensi Western blot (kuvio 3A). Verrattuna normaalilla suolaliuoksella ryhmä, ilmentyminen Prx-I on alassäädetty muissa kolmessa ryhmässä (etenkin BI-TK ryhmä), joka on samanlainen kuin saadut tulokset iTRAQ. Lisäksi Prx-I ilmentyminen kasvainkudoksessa varmistettiin IHC-analyysi (kuvio 3B). Prx-I-pitoisuus virtsarakon syövän soluissa BI-TK ryhmässä oli merkittävästi pienempi kuin muissa ryhmissä (p 0,05, kuvio 3B), joka on yhdenmukainen tulosten kanssa, joka on saatu iTRAQ ja Western blot.

V: ilmaisujen Prx-I neljään ryhmään Western blot-analyysi. Beeta-aktiini käytettiin latauskontrollina. B: Havainnollinen esittävät kuvat immunoexpression of Prx-I kasvainkudoksissa neljästä ryhmästä. Verrattuna normaalilla suolaliuoksella ryhmä, ilmentyminen Prx-I on alassäädetty muissa kolmessa ryhmässä (etenkin BI-TK ryhmä), joka on samanlainen kuin saadut tulokset iTRAQ. (Tähdellä (*) tarkoittaa, P 0,05 BI-TK ryhmä vs. normaali suolaliuosta ryhmä)

qPCR ja Western blot varten häiritsevän tehokkuutta T24-soluissa

Ensinnäkin Prx- I-mRNA-tasot neljän shRNA vektorit transfektoitiin 48 h T24 solulinjoja mitattiin qPCR käyttämällä Lipofectamine 2000 Prx-I ilmentymisen laski -40%, 26%, 18% ja 1%: sh-1, sh -2, sh-3 ja con sh-ryhmässä verrattuna vanhempien ryhmään (kuvio 4A). Vahvista tämä häiritsee tehokkuutta, proteiinin ekspressiotasot Prx-I T24-soluissa transfektion jälkeen tutkittiin Western blot. Tulokset osoittivat, että Prx-I-tasot laskivat merkittävästi ~48%, 30%, 18% ja 3% lähtötilanteesta sh-1, sh-2, sh-3 ja con sh ryhmiä (kuvio 4B), mikä osoittaa, että korkein puuttumatta tehokkuuden T24-soluissa oli sh-1 ryhmässä.

V: n ilmentyminen Prx-I-mRNA tutkittiin qPCR. GAPDH toimi sisäisenä kontrollina. B: Tällä Prx-I-proteiinin tasot analysoitiin Western blot transfektion jälkeen. Sh-1 käsittely johti huomattavaan vähenemiseen Prx-I-proteiinin ilmentymisen T-24-soluihin. (Tähdellä (*) tarkoittaa, P 0,05 in sh-1 ryhmässä vs. vanhempien ryhmä)

Prx-I pudotus inhiboi T-24 solujen kasvua

The effects of Prx-I shRNA transfektio on T24 solujen kasvuun tutkittiin läpi CCK8 määrityksissä. Hieman kasvun inhibointi havaittiin 24 tunnin kuluttua transfektion. Lisäksi ilmeinen estovaikutusta soluproliferaatiota havaittiin Prx-I Knockdown-solujen 48 ja 72 tuntia, verrattuna vanhempien ja con sh ryhmät (kuva 5, p 0,05), mikä viittaa siihen, että esto Prx-voisin tukahduttaa T24 solujen kasvua in vitro.

kasvuvauhti Prx-I pudotus ryhmä väheni merkittävästi verrattuna vanhempien ja con sh ryhmien mitattuna CCK8 määrityksessä.

Vaikutus PRX-I shRNA transfektio on apoptoosin ja solusyklin T-24 solujen

The effects of PRX-I pudotus apoptoosiin ja solusyklin T24 solun tutkittiin. 48 tunnin kuluttua transfektion apoptoosin korko on sh-1 ryhmässä (21,99 ± 1,10%) oli merkitsevästi korkeampi verrattuna con shRNA ryhmän (4,51 ± 0,73%) ja vanhempien ryhmässä (4,96 ± 0,46%) (P 0,05) (kuvio 6A). Solusyklin analyysi osoitti, että G0 /G1 vaihe suhde sh-1 ryhmässä (61,13 ± 0,50%) oli merkitsevästi korkeampi verrattuna con sh ryhmä (49.62 ± 0,84%) ja vanhempien ryhmässä (48,03 ± 1,17%) (P 0,05) (kuvio 6B).

V: Prx-I knockdovvn aiheuttama apoptoosin T24-soluissa. B: Havainnollinen kuvaa FACS osoittaa Prx-I Knockdown aiheuttama G0 /G1 solusyklin pysähtymisen T24-soluissa ja vastaava lasku S-vaiheessa olevien solujen (P 0,05).

vaikutus Prx- I NF-KB-reitin

Kuten edellä on kuvattu, Prx-I on suoraan yhteydessä NF-KB: n kompleksi, joka on hiljaista proteiinin reitin (kuvio 2C). Tutkia, voitaisiinko Prx-I apoptoottisten viestintäproteiinit johtuivat NF-kB esto, aktivoituneet muodot fosfo-NF-KB: n p50 ja p65 tutkittiin Western blot transfektion jälkeen Prx-I shRNA in T24-soluissa. Merkittävä väheneminen (P 0 · 05) proteiinissa ilmentyminen sekä fosfo-NF-KB: n p50 ja p65 havaittiin sh-1 ryhmässä (kuvio 7), verrattuna con sh ja vanhempien ryhmiä, mikä osoittaa, että Prx-I pudotus esti NF-KB: n P50 ja p65 in T24-soluissa.

pienenee merkittävästi proteiinin ilmentymistä sekä fosfo-NF-KB: n p50 ja p65 in sh-1 ryhmässä. (Tähdellä (*) tarkoittaa, P 0,05 in sh-1 ryhmässä vs. vanhempien ryhmä)

Keskustelu

Meidän Edellisessä tutkimuksessa BI-TK /GCV rakennettiin ja osoittautunut tehokkaaksi estämällä asteittaista kasvua virtsarakon kasvain, joka liittyi apoptoosin in vivo [9], [10], mikä osoittaa, että BI-TK /GCV oli menestyksekäs käsittelyjärjestelmän ja saattaa aikaansaada uusi strategia edenneen tai metastaattisen virtsarakon syövän tulevaisuudessa .

tässä tutkimuksessa Proteomisten lähestymistapa iTRAQ käytettiin tunnistamaan ilmentyvät eri proteiineja, joilla pyritään paljastamaan molekyylitason mekanismeja ja antaa teoreettista tukea tehokkuuden BI-TK /GCV järjestelmässä. iTRAQ tunnistettu 402 ilmennetty eri proteiineja virtsarakon syövän kudoksissa hoidon jälkeen, mukaan lukien 192 vaimentua proteiinit ja 210 voimistunut proteiineja. Kohdennusvektori proteiinien ero runsauden (taulukko S1) pelataan keskeisiä rooleja useissa solureiteillä, kuten aineenvaihdunta, apoptoosin, antioksidantti, solusyklin, lisääntymistä, signaalitransduktion ja soluadheesion. Vaikka tarkkaa mekanismia, jolla BI-TK /GCV saavuttaa solunsisäisen tavoitteet on epäselvä, kohdistaminen proteiinit BI-TK /GCV on tarkoitus osallistua leviämisen ja apoptoosin virtsarakon syövän solujen ja tarjota uusia kohteita tulevaisuudessa hoito.

Prx-I erottui meidän proteomiikka-analyysi, koska se oli harvoin yhdistetty suoraan virtsarakon syöpä, vaikka se on osoitettu alas-express virtsarakon syövän kudoksissa hoidon jälkeen BI-TK /GCV. Nisäkkäiden peroxiredoxin (Prx) perhe, joka koostuu kuudesta proteiineista on H

2O

2-huuhteluilman entsyymien prokaryootti- ja eukaryoottisoluissa [11] – [13]. PRX-I kuuluu tyypillisiä-2-Cys ja on yleisin ja kaikkialle jaetaan isoformin PRDX [14], [15], joka on kiinteästi toisiinsa solujen lisääntyminen ja erilaistuminen, solunsisäinen redox signalointi, ja apoptoosin [16] – [19]. Prx-I on erittäin ilmaistaan ​​kiinteiden elinten ja kudosten joidenkin syöpien [20] -, ja se on myös positiivisesti liittyy sairauden uusiutumisesta ja kehityksestä virtsarakon syövän [24], [25]. Samoin Prx-I over-ilmentyminen on heikentynyt kokonaiselinaika, huono kliinisistä tuloksista, ja vastus syöpäsolujen sädehoito ja kemoterapia [26] – [28], kun taas alas-ilmentyminen Prx-I RNAi liittyy terapeuttinen haasteita maksasyövän, ruokatorven syöpä, ja kilpirauhasen syöpä [29] – [31]. Oikeastaan ​​perustuu iTRAQ analyysi (taulukko S1), Western blot (kuvio. 3A) ja IHC analyysi (Fig. 3B) tässä tutkimuksessa, Prx-I ilmentymisen merkittävästi vähentynyt virtsarakon syövän kudoksissa hoidon jälkeen BI-TK /GCV , mikä osoittaa, että Prx-I voi myötävaikuttaa vaikutus BI-TK /GCV hoito anti-kasvua ja pro-apoptoosi virtsarakon syöpään. Knockdovvn Prx-I-geenin shRNA merkittävästi tukahdutti kasvua, edisti apoptoosin ja säännelty solusyklin virtsarakon syövän soluissa (kuvio 6, 7). Nämä tulokset osoittavat myönteistä roolia Prx-I kehittämisessä virtsarakon syöpä. Oletamme, että BI-TK /GCV käsittelyjärjestelmä pystyy estämään kasvaimen kasvua ja aiheuttaa apoptoosin jyrsijän virtsarakon syövän mallin alaspäin säätäminen Prx-I ilmaisun. Mutta mitä signalointireitin se on kautta?

Onneksi yhteyksiä Prk-I ja NF-KB-kompleksin signalointi on hiljaista proteiinissa reitin IPA (kuvio 2C), mikä johtaa meidät löytää vihje . Prxs ovat sekaantuneet keskeisiksi sääntelyn tekijöitä redox signalointi [32] – [34]. Prxs voi sammuttaa toisiolähetiksi H

2O

2 ja estävät signaalitransduktion aktivoimalla aineenvaihdunnan H

2O

2. Ylihapettuminen of Prx peräisin kysteiini-sulfenic happo (Cys-SOH) on kysteiinisulfiinihappo (Cys-SO

2 H) voi pysäyttää aineenvaihduntaa H

2O

2, jolloin kertyminen H

2O

2-pitoisuus ja leviämistä signaalitransduktion. Vähentäminen Cys-SO2H Cys-SOH saavutetaan toimien sulfiredoxin, joka palauttaa Prx välittämää H

2O

2 aineenvaihdunta [35] – [37]. Sytoplasmisen Prx1 säätelee H

2O

2-riippuvaisen NF-KB: n aktivaation ja tumaansiirtymiseen, ja ydin- Prx1 säätelee NF-KB /DNA sitova poistamalla H

2O

2 kuin p50-alayksikköä hapetin [ ,,,0],38]. Prx1 tehostaa p65-välitteisen syklo-oksygenaasin (COX) -2-geenin ilmentymistä estrogeenireseptori (ER) puutteellinen ihmisen rinta- syöpäsolujen (MDA-MB-231), ja pudotus on Prx-I voi vaimentaa COX-2: n ilmentymisen vähentämällä täyttöaste NF -κB ylävirran promoottorielementin, mikä osoittaa, että Prx-I toimii kaperonina parantaa transaktivaatio potentiaalia NF-kappaB in ER-puutosta-rintasyövän solujen [39]. Oikeastaan ​​tässä tutkimuksessa, knockdovvn Prx-I vähensi proteiinin ilmentymiä fosfo-NF-KB: n p50 ja p65, ja siten se vaimentaa kasvua, edisti apoptoosin ja säännelty solusyklin virtsarakon syöpäsolujen estämällä NF, KB-reitin, joka sopeutui IPA verkkoon (kuvio 2C).

Johtopäätökset

yhdessä tunnistimme että Prx-I yhdessä NF-KB-reitin osaltaan virtsarakon syöpään ensimmäistä kertaa. BI-TK /GCV käsittelyjärjestelmä esillä kestävän anti-kasvaimen kasvun aktiivisuus ja indusoi apoptoosin virtsarakon syövän kudoksissa estämällä Prx-I-NF-KB-reitin kautta. Tutkimuksemme tarjoaa uutta tietoa virtsarakon syövän hoitoon ja osoittaa, että BI-TK /GCV käsittelyjärjestelmä kohdistamalla klo Prx-Voin olla uusi terapeuttinen strategia tulevaisuudessa.

tukeminen Information

Taulukko S1.

iTRAQ analyysi ilmentyvät eri proteiinien normaaliin suolaliuokseen ryhmässä (iTRAQ 114), BI-TK ryhmä (iTRAQ 115), BI /PGEX-1 ryhmässä (iTRAQ 116) ja BI ryhmä (iTRAQ 117).

doi: 10,1371 /journal.pone.0098764.s001

(DOCX) B