Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Epstein Barrin virus (EBV) tarttuu enemmistö ihmisiin, aiheuttaen hengenvaarallisia tauteja pienellä osalla yhdessä ympäristötekijöiden. Sen jälkeen ensisijainen infektio, EBV jää piileviä muistissa B-solupopulaatio elämää. Toistuva aktivoituminen viruksen tapahtuu, johtuu todennäköisesti aktivointi muistin B-lymfosyyttejä, jolloin viruksen replikaation ja uudelleen infektio B-lymfosyyteissä. Metylaatio virus-DNA on CpG-motiiveja, johtaa hiljentäminen viruksen geenin ilmentymisen aikana latenssi. ZTA, avain virusproteiini, joka välittää latenssi /uudelleenaktivointi tasapaino, vuorovaikutuksessa metyloituja DNA. ZTA on transkriptiotekijä, sekä virus- ja isännän geenejä. Sub-sarja sen DNA sitoutumiskohdista (ZREs) sisältää CpG-motiivin, joka on kirjattu sen metyloituja muodossa. Yksityiskohtainen analyysi promoottori viruksen geenin

BRLF1

paljasti, että vuorovaikutus metyloitua CpG ZRE (RpZRE3) on avain mullistaa epigeneettiset hiljentäminen geenin.

Menetelmät ja tärkeimmät havainnot

tässä kyseenalaistamme voimme käyttää näitä tietoja tunnistamaan jotka isäntägeenejä sisältävät promoottorit samanlaisia ​​vastaus elementtejä. Tietokoneavusteinen haku ihmisen geenin promoottorit tunnistettu 274 tavoitteet sisältävä 7-nukleotidin RpZRE3 keskeinen elementti. DNA sitova analyysi ZTA 17 Näiden tavoitteiden paljasti, että reunustavia yhteydessä keskeinen elementti ei ole suuri vaikutus kykyyn ZTA vuorovaikutuksessa denaturoidulla sivustoja. Toinen rinnakkain ZRE havaittiin yksi promoottori. ZTA pystyi vuorovaikutuksessa tämän sivuston, vaikka yhteistyössä täyttöaste kanssa RpZRE3 ydinosan ei havaittu.

Johtopäätökset /merkitys

Tämä tutkimus osoittaa, 274 ihmisen promoottorien on potentiaalia säädellä ZTA kumoamaan epigeneettiset vaiennettu geeniekspression aikana viruksen reaktivaatiosta latenssi.

Citation: Flower K, Hellen E, Newport MJ, Jones S, Sinclair AJ (2010) Evaluation of a Prediction pöytäkirjan tunnistaa mahdollisia kohteita epigeneettiset uudelleenohjelmointi jonka Cancer Associated Epstein-Barrin virus. PLoS ONE 5 (2): e9443. doi: 10,1371 /journal.pone.0009443

Editor: Maria G. Masucci, Karolinska Institutet, Ruotsi

vastaanotettu: 14 lokakuu 2009; Hyväksytty: 02 joulukuu 2009; Julkaistu: 26 helmikuu 2010

Copyright: © 2010 Flower et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat studentships yliopistosta Sussex ja Brighton and Sussex Medical School. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epstein Barrin virus (EBV) tartuttaa ja aiheuttaa useita sairauksia ihmisillä kuten Burkittin lymfooma, nenänielun karsinooma, Hodgkinin tauti, elinsiirron jälkeinen lymfoproliferatiivinen häiriö ja tarttuva mononukleoosi (rauhas kuume) [1] – [4]. Kuten muut jäsenet gammaherpesviruses perheen, EBV-infektio kestää elämän seuraavien alkuperäisen tartunnan. Virus säilyy tilassa latenssi muistiin B-lymfosyyttejä ja satunnaista uudelleenaktivointi ja replikointi pidetään säilyttää viruksen sisällä yksilöiden [5]. EBV-indusoidun lymfoomat, EBV on läsnä myös piilevänä. Solulinjoissa, jotka ovat peräisin näistä lymfoomat, virusgenomin on pääasiassa metyloitu [6] – [9]. Vaikutus vaientaa viruksen geenin ilmentyminen ei ainoastaan ​​tukien kiertämisen päässä immuunijärjestelmän [10], mutta myös estää tuumorisolujen tuhoamisessa viruksen replikaation. Itse asiassa, aktivoituminen EBV latenssista on ehdotettu reitti hoitoon EBV-liittyvät lymfoomat [11], [12].

EBV latenssi häiriintyy seuraavista fysiologisista aktivaation B-lymfosyyttien, ilmaisun kautta ZTA (BZLF1, ZEBRA, EB1, Z) [13] – [15]. ZTA on sekvenssi-spesifisen DNA-sitovan proteiinin, joka muistuttaa bZIP perheen transkriptiotekijöiden ja sillä on kriittinen rooli aktivoituminen viruksen geenien ilmentymistä ja replikaatiota genomin. Suoran vuorovaikutuksen välityksellä ZTA vaste-elementit (ZREs) in promoottorit, ZTA säätelee ilmentymistä viruksen ja solun geenejä. Monet isäntä ja virus- promoottorit, jotka on arvioitu tähän mennessä sisältävän ZREs sisällä proksimaali- viisisataa nukleotidin 5′-sekvenssi. Tähän mennessä kahdeksan on kokeellisesti todistettu sitoutumiskohdat ZTA niiden proksimaalisessa promoottorialueille:

BSLF2 + BMLF1

[16], [17];

BRLF1

[18];

BZLF1

[17], [19], [20]; yhteinen promoottori

BHLF1

ja

BHRF1

[19]; lyyttisen

EBNA1

promoottori Fp [21];

BRRF1

[22]; ja

BMRF1

[23]. Lisäksi 6 isäntägeenejä suoraan säätelee ZTA kautta ZREs niiden promoottorien

DHRS9

[

24

];

EGR1

[25], [26];

CIITA

[27];

IL-8

[28];

IL-10

[29]; ja

IL-13

[

30

]. ZTA vuorovaikutuksessa monipuolista ZREs [31] ja useita sivustoja eräissä ZTA reagoivat promoottorit, joskus lähellä. Yksi esimerkki on viruksen promoottori

BZLF1

geeni, Zp, joka sisältää kaksi toiminnallista ZIIIA ja ZIIIB ZREs sisällä yhteensä span 20 nukleotidin [17], [19], [20].

ZTA on epätavallinen ominaisuus vuorovaikutuksessa sub-sarja ZREs jotka sisältävät metyloitua CpG-motiivin [32]. Joissakin tapauksissa ZTA pystyy vuorovaikutuksessa ei-metyloitu ZRE, kun taas muut ZREs vuorovaikutus ZTA on riippuvainen metylaatio [22], [26], [32] – [34]. Tämä on johtanut siihen, että luokittelu ZREs kolmeen luokkaan: luokka I ZREs eivät sisällä CpG-motiivin; luokan II ZREs sisältävät CpG-motiivin, joka tunnustetaan sekä metyloidut ja metyloitumattomien valtioissa; ja luokan III ZREs sisältävät CpG-motiivin, mutta kirjataan vain silloin, kun metyloidut [35]. Kyky ZTA vuorovaikutuksessa metyloitu CpG: tä sisältävän ZREs avulla ZTA aktivoida geeniekspressiota piilevä virusgenomin huolimatta tukahduttavaa metylaatiostatus ja näin kumota epigeneettisenä hiljentäminen virusgenomin [22], [32] – [35].

Toistaiseksi kolme geeniä CpG- sisältävien ZREs on tutkittu: EBV

BRLF1

, EBV

BRRF1

ja ihmisen

EGR1

[22], [26], [32] – [35]. Näistä tutkimus sääntely EBV geenin

BRLF1

avulla on saatu näyttöä siitä, että vuorovaikutus ZTA kanssa denaturoidulla ZRE oli keskeinen reaktivoiville EBV osaksi lyyttinen sykli in B-lymfosyyteissä [32] – [35]. Viruksen

BRLF1

geeni sisältää kolme ZREs promoottori- proksimaalinen alue [18], [32]. Kaksi ZREs sisältävät CpG-motiivit; RpZRE2, on luokan II ZRE ja toinen, RpZRE3 on luokan III ZRE [35]. Kyky yhden pisteen-mutaation ZTA erottamaan vuorovaikutusta ZTA denaturoidulla ja metyloitumattomien RpZRE3 sallittu merkitystä vuorovaikutuksen ZTA tämän promoottori perustetaan [34], [36], [37]. Viruksen

BRRF1

geeni sisältää kaksi CpG: tä sisältävän ZREs, joka ZTA vain vuorovaikutuksessa niiden metyloituja valtioissa [22]. Läsnäolo CpG: tä sisältävän ZRE promoottorissa ihmisen

EGR1

geeni, joka tunnistaa ZTA sen metyloituja muodossa, viittaa siihen, että EBV saattaa kaatua epigeneettisellä hiljentäminen isäntägeenejä moduloimiseksi isäntäsolun ympäristö [26].

RpZRE3 peruselementti (TCGCGAA), joka oli selvästi osoitettu vaaditaan kaatumista epigeneettisellä vaiennettu

BRLF1

B-lymfosyyteissä [34], [36], [37], valittiin tunnistaa kaikki ihmisen geenejä, jotka sisältävät tarkan vastaavuuden tämän CpG: tä sisältävän ZRE sisällä -500-+1 alueelle promoottorin ja arvioida ovatko ne tunnustavat ZTA luonnollisessa yhteydessä.

Materiaalit ja menetelmät

tunnistaminen Ihmisen Promoottorit sisältävät RpZRE3-Core elementit: Alkunäytteenotto

Promoottorialueet (määritelty -500-+1 emäsparia transkription aloituskohdasta) näytteen ihmisen proteiinia koodaavan geenien Ensembl (49) [38] poimittiin käyttäen Biomart donhallintajärjestelmään [39]. Otos edusti 40% ihmisen genomin. Haku tehtiin kaikki esiintymät tarkka (eteen- ja taaksepäin) ottelu tunnistaa ne promoottorit kanssa TCGCGAA RpZRE3 keskeinen elementti.

tunnistaminen Ihmisen Promoottorit sisältävät RpZRE3-Core elementit: Whole Genome skannaus

identtinen näyttö tehtiin koko ihmisen genomi Ensembl (50) [40], jolloin tunnistaminen 274 promoottorit, jotka on nimennyt RpZRE3-promoottori-274 data-set. 7 nukleotidit RpZRE3 ydinelementin, yhdessä 10 reunustavan nukleotidien kummallakin puolella, uutettiin kustakin 5 geenien alkuperäisestä näytteenottoa. Transkriptiotekijän sitoutumiskohta (TFBS) Perl moduulit [41], käytettiin luomaan kannan Paino Matrix (PWM), joka perustuu koko pituudeltaan näiden 27-nukleotidisekvenssejä. TFBS Perl moduuleja käytettiin myös etsiä promoottorialueissa (-500-+1) kaikista ihmisen proteiinia koodaavan geenin Ensembl 50 [40], jotka on uutettu käyttäen Biomart [39]. Ne promoottorit joka vastasi PWM kynnysarvoon 80% ja se sisälsi tarkan ottelu on RpZRE3-core-elementin lisäksi suodatetaan 2 kriteerit (a) läsnäolo CpG-saarekkeiden ja (b) toiminto (perustuen yli- edustus Gene ontologia (GO) ehdot [42]). Sijainti CpG-saarekkeiden ennustettiin käyttämällä EMBOSS ohjelmaa CpGPlot [43] oletusvalitsimilla. Vain geenejä CpG saari läsnä promoottori olivat säilyneet. GO Termi merkinnät Molekyylien toiminta ja biologisten prosessien poimittiin Ensembl kutakin geeniä [40]. Määrä geenien RpZRE3 promoottori aineisto jokaisen GO aikavälillä annotation verrattiin kokonaismäärään geenien Ensembl samalla GO aikavälillä. GO termejä tapahtuneet jossa on huomattavasti suurempi taajuus (p 0,05) RpZRE3 aineisto, verrattuna koko genomin, määriteltiin yliedustettuna.

DNA Binding Analysis EMSA on RpZRE3 sisältävät Promoottorit

kaksijuosteinen leimattuja DNA-koettimia valmistettiin leimaamalla 6 pmol oligonukleotidiä (27 nt pitkä) 5 ’päättyy [γ-

32P] ATP: tä (30 pCi) käyttäen polynukleotidikinaasia (Roche). 12 pmol komplementaarisen oligonukleotidin juosteen lisättiin ja inkuboitiin leimatun yksijuosteisen 95 ° C: ssa 2 minuutin ajan, 65 ° C: ssa 10 minuuttia, ja 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan annealing-säikeet. Pitoisuus koetin oli 33,3 nM. Oligonukleotidit käsitti ydin 7-mer sekvenssin ympäröi 20 nukleotidin vastaava sukulais reunustavan sekvenssin kullekin promoottori ja syntetisoitiin. Jos kuviossa on esitetty, keskeinen CpG-motiivi on metyloitu molemmille sytosiinit synteesin aikana (Sigma).

ZTA proteiini oli

in vitro

käännetään wheatgerm uutetta (Promega). Tätä inkuboitiin leimatun koettimen kanssa (lopullisessa koettimen pitoisuus 3,3 nM) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, ennen kuin näyte fraktioitiin 8% natiivi polyakryyliamidigeelillä 100 volttia 1 tunti. Havaitsemisen jälkeen radio leimatun DNA käyttämällä Storm phosphorimager, suhteellinen signaalit kvantitoitiin käyttäen ImageQuant-ohjelmisto (GE Healthcare, UK).

Kilpailu EMSAs tehtiin 100X ylimäärän kaksijuosteisen ei-leimatun oligonukleotidin lisäksi standardin EMSA reaktiota. Yhtä suuret määrät kutakin täydentävät oligonukleotidit samalla tavalla kuin leimatut koettimet ja laimennettiin, jolloin saatiin liuos, konsentraatio 3,33 uM. Tämä lisättiin EMSA reaktio lopulliseen konsentraatioon 333 nM (eli 100 x ylimäärä).

Oligonukleotidit

oligonculeotides käytettiin kaksijuosteisen versiot on seuraavat sekvenssit (5′-3 ’ ):

XPC GGTGCGTCACTCGCGAAGTGGAATTTG

ZC3H8 GCTTCCCGGCTCGCGAAAGGGAGGACC

HDAC2 TCCCCCACTGTCGCGAAGCTCCCGCCC

MNT CCGCGGCGTCTCGCGAAGGGAGGGGCG

sykliini L2 GGGCGGCTCCTCGCGAAGCTCCACGGC

RpZRE3 GTTTATAGCATCGCGAATTTTGAGTGC

CAPN2 CCGGGGAGGCTCGCGAATCGCGGTCCA

CDO1 CGTCCCAGCGTCGCGAACCACAGCGGC

Falz GGCGCGCAGCTCGCGAAATGCCCGGCG

KIF1B GCTTCGGCCCTCGCGAAACTCCGCCCG

LLGL1 TCGGCCGGGCTCGCGAAGGGACGCCCG

LMO4 GGATCCCGGGTCGCGAAGGGCAGCCCA

MBD4 CCTCCTGCTCTTCGCGAACCGCCCCGC

PLEKHJ1 AGCCGCTCCCTCGCGAAAGTTGGCCCC

PRKD1 CTTCCTGGGGTCGCGAACTTCCCGGGC

SEC14L CGCCCGCTACTCGCGAAGCCCAGCCCG

TADA3L GCTGCGCTTCTCGCGAAAGGGCAGGCA

TOP2B CCGCGCCCCATCGCGAAGATCCGGAGC

XPCLMNTR GGTGCGTCACTCGCGAAGGGAGGGGCG

MNTLXPCR CCGCGGCGTCTCGCGAAGTGGAATTTG

XPC mCore GGTGCGTCACCCCCTTAGTGGAATTTG

XPCLM3Mcore GGTCCGCCTCCCCCTTAGTGGAATTTG

AP1 mut GATCCACCCCTTAGAGGAAAACATACG

ennustaminen transkriptiotekijä Binding Sites Käyttämällä Promo

transkriptiotekijän sitoutumiskohta ennustus ohjelma PROMO [44] käytettiin Oletusasetuksella 15% erilaisuus arvo, tunnistaa mahdolliset bZIP transkriptiotekijän sitoutumiskohdista sisällä XPC oligonukleotidin.

tulokset

tunnistaminen ihmisen promoottorit, jotka käsittävät RpZRE3-Core Element: Alkunäytteenotto

Ensimmäinen etsiä RpZRE3-keskeisiä elementtejä näytteessä ihmisen promoottorien paljasti 67 geenien kanssa RpZRE3-core elementti . 5 näistä, jotka ovat mukana geenin asetuksessa valittiin DNA: ta sitova analyysiä. Nämä 5 geenit olivat ZC3H8 (ENSG00000144161), HDAC2 (ENSG00000196591), XPC (ENSG00000154767), MNT (ENSG00000070444) ja CyclinL2 (ENSG00000116148) ja yhdessä RpZRE3 elementin viruksen

BRLF1

promoottori (Rp), on muodostettu RpZRE3-promoottori-6 data-set.

DNA-sitoutumismääritykset tehtiin kanssa denaturoidulla muotoja kunkin 5 ihmisen promoottorien avulla 27-meeri kaksijuosteisen oligonukleotidien kattaa 7 nukleotidin peruselementti ja 10-nukleotidin reunustavan alue molemmin puolin yhdessä RpZRE3 Rp. Elektroforeettinen liikkuvuus shift määritykset (EMSA) on ryhdytty

in vitro

käännetty ZTA proteiinia. ZTA proteiini /DNA-kompleksit on muodostettu helposti kanssa oligonukleotidien kaikki kuusi promoottorit (kuvio 1). Spesifisyyden määritys osoittaa, ettei kompleksin muodostumisen valvonta-proteiinin. Lisäksi olemme sitoutuneet kilpailu kokeissa ylimäärin leimaamatonta oligonukleotidien ja mukana versio, mutantti ZRE edelleen koetin vuorovaikutuksen spesifisyyttä. Tämä vahvistaa sen, että ZTA vuorovaikutuksessa kaikkien kuuden RpZRE3 keskeisiä tekijöitä erityisesti.

(a) nukleotidisekvenssi yhden juosteen kumpaakin oligonukleotidia ulottuu ilmoitettu ZREs on esitetty, jossa konservoituneet RpZRE3 sydänosa (TCGCGAA) linjassa. Kaksinkertainen lanka versiot näistä sekvensseistä käytettiin koettimina EMSA, jossa 2 sytosiinit sisällä CpG ydinaihe metyloitu. RpZRE3 EBV BRLF1 promoottori sisältyy. (B) DNA: ta sitovan välillä

in vitro

käännetty ZTA kanssa kukin koetin tehtiin EMSA. Kyky ZTA (Z) vuorovaikutuksessa anturin verrattiin ohjelmoimatonta käännös lysaatti (C) negatiivisena kontrollina. Kompleksi erotettiin 8% geeliä elektroforeesilla ja visualisoidaan fosfokuvantamisella. Ylimääräinen koetin voidaan nähdä alareunassa geelin. Käytetty koetin kussakin kokeessa on esitetty seuraavassa geeli. (C) Kilpailu kunkin ZRE sekvenssin (100 kertaa ylimäärin) vastaan ​​leimattu RpZRE3 määritettiin kilpailevan EMSAs. Tiedot vähintään 2 kokeissa otettiin laskea kilpailu eli prosenttiosuus leimatun koettimen syrjäyttämän merkitsemätöntä kilpailija. Metyloidut ZREs käytettiin sekä koetin ja kilpailua. AP1 mut, oligonukleotidi aiemmin osoitettu, ettei vuorovaikutuksessa ZTA [36], käytettiin negatiivisena kontrollina määrittää tason ei-spesifisen sitoutumisen. Virhe palkit esittävät keskivirhettä.

tunnistaminen Ihmisen Promoottorit sisältävät RpZRE3-Core elementit: Whole Genome Skannaus

Täydellinen Ihmisen genomin skannattiin ylimääräisiä RpZRE3-keskeisiä tekijöitä. Tämä johti data-joukko 274 geenejä, merkitään RpZRE3-promoottori-274 data-sarja (katso taulukko S1). Sen arvioimiseksi, onko siellä oli vaikutusta sivuavan sekvenssin vuorovaikutuksesta ZTA näillä ZREs olemme sitoutuneet järjestelmällistä suodatus prosessi. RpZRE3-promoottori-274 aineisto ensin suodatetaan kannan Paino Matrix (PWM), joka generoidaan RpZRE3-promoottori-6 data-set. Ottelut olivat edelleen suodatetaan geenien kanssa vähintään yhden CpG saari promoottori ja yliedustettuna GO aikavälillä. Tämä johti 12 aiemmin tunnistamattomia promoottorit sekä yhdeksi joka oli yksilöity aloitusnäyttö (kuva 2). Yhdessä promoottorit alkuperäisestä näytön ja viruksen

BRLF1

promoottori (RpZRE3-promoottori-6 data-sarja), nämä muodostavat RpZRE3-promoottori-18 data-set.

(a ) bioinformatiikan analyysi siitä, että genomin laaja skannaus edustaa vuokaaviona. Geneettiset tulo tai lähtö edustaa suorakaide, ja suodattimia puolisuunnikkaan. (B) Position Paino Matrix (PWM) luotiin käyttäen linjassa sekvenssit RpZRE3-promoottori-6 data-set. Nämä sekvenssit on esitetty kuviossa. 1 (a). Tätä käytettiin suodattaa genomisen tiedot ihmisen promoottorisekvenssit (-500-1). (C) yliedustettuna GO ehdot löytynyt 274 geenit tunnistettiin. (D) 13 geenit tunnistettu kandidaattigeenit, 12 aiemmin tuntemattomia geenejä ja 1 alkuperäisestä näytössä, ja niihin liittyvien Ensembl liittymisen koodeja.

Oligonukleotidit suunniteltiin käyttäen samoja periaatteita 10 nukleotidin reunustavien sekvenssin kummallakin puolella RpZRE3-core elementti, ja kyky ZTA vuorovaikutuksessa jokaisen sivuston sen metyloitu muodossa arvioitiin. EMSA-analyysi paljasti, että kaikki kaksitoista vasta tunnistettu metyloitu promoottorit tunnustettu ZTA (kuva 3).

EMSA-analyysi

in vitro

käännetty ZTA proteiini (Z) tai ohjelmoimatonta käännös lysaattia (C), jossa koettimet osoitetaan oikealle kunkin geelin suoritettiin, kuten on kuvattu kuviossa. 1.

Tämä analyysi osoitti, että varten RpZRE3-promoottori-18 data-asettaa, sivuavan sekvenssin ympärillä metyloitu ydin 7-mer elementti ei ollut suuri vaikutus kykyyn ZTA olla vuorovaikutuksessa promoottorien ja siksi keskeinen elementti oli riittävä sitoutumisen helpottamiseksi. Tätä havainnollistaa sukupolven PWM käyttäen sekvenssi RpZRE3-promoottori-18 data-set (kuvio 4), joka paljasti merkityksetön sekvenssikonservoinnista ulkopuolella ydinosan.

(a) Position Paino Matrix (PWM), luotu koetin sekvenssit aineisto RpZRE3-promoottori-18.

tunnustamisesta metyloimattoman Promoottorit

ZTA pystyy tunnistamaan monta vastausta tekijöitä, jotka tekevät ei sisällä CpG-motiivin, ja siksi ei ole metyloitu sydänosa (luokka I ZREs) [15], [35]. Lisäksi, ZTA tunnistaa yhden CpG sisältävät ZRE, RpZRE2, jopa ilman metylaation (luokka II ZREs) [33]. Kyky ZTA tunnistaa promoottorien niiden metyloitumattomien muodot voivat vaikuttaa kykyyn EBV muuttamaan geenin ilmentymistä, joten tutkimme luokittelua ZRE kullekin 17 ihmisen promoottorien.

sarja DNA sitova kokeiluja oligonukleotidien edustaa ihmisen promoottorit RpZRE3-promoottori-18 data-sarja, tehtiin vertaamalla metyloimattomaan denaturoidulla RpZRE3-keskeisiä tekijöitä. Vuorovaikutus ZTA sivustojen kanssa oli kvantitatiivinen, kuten on osoitettu väheneminen kompleksin muodostumiseen, kun ZTA proteiinipitoisuus titrattiin kuhunkin metyloitu promoottorit (kuvio 5). Kaikki bar yhden näytön vähäisessä määrin ei-metyloitu oligonukleotidit (vähintään 10 kertaa pienempi kuin sen metyloitu sivustoja), joten sitä voidaan luokitella luokkaan III ZREs.

DNA sitova analyysi

in vitro

käännetty ZTA proteiini (Z) tai ohjelmoimatonta käännös lysaatti (C) sekä metyloitumattomien ja metyloidut versiot koettimien ilmoitti oikealle kunkin geelin suoritettiin EMSA kuvatulla kuvassa. 1. titraus ZTA proteiinin (1:02, 1:04, 1:08) käytettiin vertaamaan metyloimattoman sitoutumisen kuin metyloitua vastaava. Kvantitointi komplekseja muodostettu ZTA ja metyloitumattomien ja metyloitujen koettimet, vähintään 2 kokeissa, edustaa histogrammin oikealla vastaavan geelin. Kompleksin muodostuminen on esitetty suhteessa suurimpaan sitovat kunkin koettimen. Virhe palkit esittävät keskivirhettä.

ZTA näkyy toistettavalla vuorovaikutus metyloimattomaan XPC oligonukleotidi; vuorovaikutus saavutti 50%: n sitoutumisen havaittiin metyloitua oligonukleotidin (kuvio 5). Tämä nostaa esiin mahdollisuuden, että XPC ydin RpZRE3 elementti vaikuttavat reunustavan sekvenssin käyttäytyä luokan II ZRE.

Muita ZRE rinnastuvat kanssa RpZRE3-Core Element vierusalueeseen

Tunnistaa onko sekvenssit annetaan metylaatio riippumaton tunnustus oli sidottu tiettyyn kylki XPC sarja mutantti oligonukleotidikoettimia, vaihdetaan reunustavat sekvenssit välillä XPC ja luokan III sivusto (MNT), joka ei tunnisteta, kun metyloitumattomien, suunniteltiin. Analyysi vuorovaikutusta ZTA EMSA paljasti, että kyky antaa ZTA sitoutuminen asuivat alueella 5 ’sekvenssi XPC; hybridi XPCLMNTR kykeni sitoutumaan mutta MNTLXPCR ei ollut (kuvio 6). Tämä viittasi siihen, että 5 ”XPC reunustavan sekvenssin RpZRE3 elementin vaikuttanut sitovia. Se oli kuitenkin yllättävää havaita, että mutaatio RpZRE3 elementin sisällä XPC ei estä vuorovaikutusta ZTA (kuvio 6).

(a) Kaavamainen esitys koettimien, joka havainnollistaa XPC ja MNT koettimia, ja kylki swap koettimet XPCLMNTR ja MNTLXPCR vieressä vastaavan EMSA-analyysi, joka suoritetaan samalla tavalla, kuten on kuvattu kuviossa. 1. (b) kvantifiointi komplekseja muodostettu kukin koetin, 2 kokeita tehtiin. Kompleksin muodostuminen on edustettuna prosentteina ZTA kompleksin ei-metyloitu XPC koetin. Virhe palkit esittävät keskivirhettä. (C) Kaaviokuva antureista, mikä osoittaa mutatoidun ydinsekvenssi. EMSA-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu kuviossa. 1. (d) kvantitointi komplekseja muodostettu kukin koetin, 2 kokeita tehtiin. Kompleksin muodostuminen on edustettuna prosentteina ZTA kompleksin, joka on muodostettu ei-metyloitu XPC koetin. Virhe palkit esittävät keskivirhettä.

Toinen selitys vuorovaikutuksen ZTA kanssa metyloitumattomien XPC promoottori on, että epämääräinen ZRE on läsnä 5 ’kylki. Ongelman edelleen yritimme tunnistaa otaksuttu ZREs että XPC promoottori käyttäen transkriptiotekijän sitoutumiskohdassa ennustus ohjelma PROMO [44], [45]. Vaikka tämä ohjelma sisältää PWM ZTA sitoutumiskohtia, yksikään ennustettiin tässä järjestyksessä. Kuitenkin PROMO ennustettu läsnäolo AP1, c-fos ja c-jun sitoutumiskohtien 5 ’kylkeen XPC (5’TGCGTCA) (kuvio 7). c-fos ja c-jun proteiinit ovat jäseniä bZIP transkriptiotekijän perhe; ne muodostavat AP1 sitoutuu DNA: han joko homodimeerejä tai heterodimeerejä. On merkittävää, että fos /kesäkuu dimeerit jakaa joitakin DNA tunnustusta motiivien kanssa ZTA [15] – [17], [31], [46] – [49]. Tämä johti hypoteesiin, että ennustettu AP1 sivusto 5 ’reunustavan sekvenssin on ylimääräinen ZRE, joka on vastuussa sitoutumisesta metyloimattoman XPC oligonukleotidi. Sen hypoteesin testaamiseksi, lisäksi mutaatioita tuotiin 5 ’XPC reunustava sekvenssi on ennustettu AP1 sivuston (5’TCCGCCT). Kyky ZTA vuorovaikutuksessa kaksinkertainen AP1 /core mutantti site (XPCLM3Mcore) verrattiin ydin-vasta mutantti. Dual mutaatio ennustetun AP1 päällä ja ydin kumotaan kyky ZTA vuorovaikutuksessa XPC oligonukleotidin, mikä osoittaa, että sitoutuminen ZTA ei-metyloitu XPC päällä asuivat tällä AP1 päällä (kuvio 7).

(a) PROMO transkriptiotekijän sitoutumiskohdassa ennustaminen ohjelmisto havainnut AP1 sivusto, joka on korostettu 5 ”kylki sekvenssi XPC. Erityinen nukleotidin mutaatiot on alleviivattu. Muodostamien kompleksien EMSA on esitetty oikealla vastaavan koettimen sekvenssi. (B) kvantitointi komplekseja muodostettu kukin koetin, 2 kokeita tehtiin. Kompleksin muodostuminen on edustettuna prosentteina ZTA muodostuneen kompleksin kanssa XPC mutatoitunut ydin koetin. Virhe palkit esittävät keskivirhettä.

Tämä analyysi osoitti, että RpZRE3 sydänosa ei kirjattu sen metyloimattomaan tilassa yhteydessä jonkin viruksen tai solun promoottorit RpZRE3-promoottori-18 data-set, ja että tämä ZRE on nimenomaisesti tunnustettu, kun metyloitu.

keskustelu

laskennallinen haku paljasti joukon 274 ihmisen geenien kanssa cellular promoottorit, jotka käsittävät 7-mer RpZRE3 keskeinen elementti. Reunustava sekvenssi voi vaikuttaa vuorovaikutusta joidenkin transkriptiotekijöiden DNA, esimerkiksi vuorovaikutus E2F perheen DNA vaikuttaa alueella, joka on vähintään 8 nukleotidiä 5 ’ja 11 nukleotidit 3′ keskeinen nukleotidin [50]. Ennen kuin heille määrätään kaikki 274 geenit ehdokkaiksi sääntelyä ZTA, oli tärkeää arvioida, sukulais reunustava sekvenssi oli syvällinen vaikutus sitova ZTA. Huomioon sekvenssien edustettuina puoleinen sekvenssi Tästä geenejä paljasti sen olevan monipuolista; kaikki neljä nukleotideja edustivat 55%: kannat ja kolme neljästä nukleotidien olivat edustettuina jäljellä kantoja. Itse asiassa, välitön kylkeen RpZRE3 ydinelementin, joka koostuu neljän nukleotidin sekä 5’- ja 3 ’, oli 100% esitys kaikkien neljän nukleotidin. Näin ollen voidaan päätellä, että reunustava sekvenssi ei estä sitoutumista metyloituneessa RpZRE3 ydin, ja PWM syntyvät RpZRE3-promoottori-18 data-set osoittivat hieman säilyttäminen ytimen ulkopuolella motiivi. Sen sijaan, vuorovaikutus ei-metyloitu keskeinen tekijä aluksi näytti vaikuttaa reunustava sekvenssi on vain 1 18 promoottorit. Kuitenkin edelleen analyysi osoitti tämän olevan läsnäolon takia toisen ZRE että reunustava sekvenssi.

Nämä tulokset osoittavat, että lähestymistapa yrityksen laskennallisen mallin ottelu hakua varten 7-mer RpZRE3 keskeinen elementti on nopea ja luotettava menetelmä tunnistaa promoottorit, jotka ZREs jotka tunnistavat ZTA vain silloin, kun ne ovat metyloituja (luokka III ZREs).

tunnistaminen kahden vierekkäisen rinnakkain ZREs että XPC promoottori esittelee mielenkiintoinen ongelma; voidaan molempien sivustojen täyttyä kerralla? Luonnollinen rinnakkain ZREs on aiemmin kuvattu viruksen promoottori;

BZLF1

ja matkapuhelinverkon promoottori

EGR1

.

BZLF1

promoottorin elementit sijaitsevat 12 emäsparia välillä Keski nukleotidien; molemmat voi täyttyä samanaikaisesti ja molemmat ovat toiminnallisesti asiaan [17], [19] – [20]. Sillä

EGR1

promoottori, elementit ovat välittömässä läheisyydessä vain 8 nukleotidin välinen keskeinen nukleotidien [25], [26]. Ei ole näyttöä siitä samanaikaiseen miehityksen ZTA ja vain yksi tekijä näyttää olevan toiminnallisia

in vivo

[26]. Järjestely

XPC

promoottori asettaa elementtien 8 nukleotidin erilleen, identtinen

EGR1

, eikä ole mitään todisteita DNA-sitoutumiskokeissa samanaikaiseen miehityksen sivustoja. Yhtenä ZRE kirjataan metylointi riippuvaisella tavalla ja toinen kirjataan kun metyloitumattomien, on mahdollista, että järjestely voi tarjota vikaantuessa turvallinen mekanismi, jolla varmistetaan, että geeni on säännelty kummassakin sen metyloitu ja metyloitumattomien valtioiden .

yksinkertainen laskennallinen lähestymistapa sijainnin määrittämiseen tämän metyloinnin riippuvaisia ​​ja uusia DNA-sitova motiivi ihmisen geenin promoottorit tunnistettu 274 geenit mahdollisesti säätelee voittamiseksi epigeneettiset hiljentäminen aikana viruksen replikatiivisen syklin. Koska tunnetut toiminnot ZTA vuonna uudelleenohjelmointi viruksen geenien ilmentymisen, häiritsevät solusyklikontrollin ja jäljittelevän virus-DNA, se on mielenkiintoista huomata, että Gene ontologia termejä, jotka ovat yliedustettuina että RpZRE3-promoottori-274-geeni-set ovat pitkälti mukana transkriptio, kromatiinin uudelleen mallinnus ja mitoosin. Tämä viittaa vahvasti siihen, että ZTA voi aktivoida tämän joukon solujen geenien, jotta näiden toimintojen toteuttamiseen. Testataan onko nämä geenit aktivoidaan latenssi häiriöitä muistissa B-lymfosyyttien

in vivo

on teknisesti haastavaa annetaan sekä niukkuus muistin B-lymfosyyttien in ääreisverenkierron ja harvinaisesta latenssi häiriöitä

in vivo

.

co-sijainti RpZRE3 keskeinen osa 274 ihmisen promoottorien tuskin on ajanut evoluution etu virus, mutta saattaa heijastaa osallistumista solun transkriptiotekijän vuorovaikutuksessa saman elementin . Tämä viittaisi siihen, että tämä joukko geenejä on yhteinen tila sääntelyn aikana inhimillistä kehitystä tai erilaistumista. Lisäksi on mielenkiintoista kysyä, onko yhteistyössä esiintyminen RpZRE3-core elementti muiden transkriptiotekijän sitoutumiskohtia muodostaa osuuskunta

cis

-regulator moduuli, joka voi valaista sääntely näiden isäntä ja viruksen geenien .

tukeminen Information

Taulukko S1.

RpZRE3-promoottori-274 data-sarja: taulukko geenien, jotka sisältävät RpZRE3 keskeinen elementti 500 emäsparin promoottorialueen.

doi: 10,1371 /journal.pone.0009443.s001

(0,05 MB XLS ) B

Kiitokset

Kiitämme Queensta Miller ja James Heather keskustelua.