Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ilmaisu Gangliosidien usein liittyy syövän etenemiseen. Sialyylitransferaasit ovat saaneet paljon huomiota kannalta heidän suhteensa syövän, koska ne ilmentymisen moduloimiseksi gangliosidien. Olemme aiemmin osoittaneet, että GD1a tuotanto oli korkea kastraatio kestävä eturauhassyövän solulinjoissa, PC3 ja DU145, lähinnä niiden korkean ilmentymisen β-galaktosidi α2,3-sialyylitransferaasin (ST3Gal) II (ei ST3Gal I), ja ilmaus molemmat ST3Gals säädeltiin NF-KB: n, lähinnä RelB. Olemme tässä osoittaa, että GD1a tuotettiin runsaasti syöpä- kudosnäytteitä ihmispotilaissa hormoniherkän eturauhasen syövät sekä kastraatio kestävä eturauhasen syöpiä. Ekspressio ST3Gal II konstitutiivisesti aktivoitu kastraatio kestävä eturauhassyövän solulinjoissa, PC3 ja DU145, koska hypometylaatio CpG-saarekkeen sen promoottorin. Kuitenkin androgeeni-köyhdytettyä LNCap-soluja, hormoni-herkkä eturauhassyöpä-solulinjaa, ekspressio ST3Gal II vaimennettu, koska hypermetylaation promoottorialueen. Ilmaisu on ST3Gal II LNCaP-solujen määrä nousi testosteroni hoitoa, sillä demetylaation CpG sivustoja. Tämä testosteroni riippuva ST3Gal II ilmentyminen tukahdutettiin RelB siRNA, mikä osoittaa, että RelB aktivoitu ST3Gal II transkription testosteronin aiheuttama demetyloitunutta promoottori. Siksi hormoniherkän eturauhasen syöpiä, tuotanto GD1a voidaan säädellä androgen. Tämä on ensimmäinen raportti osoittaa, että ilmaus sialyylitransferaasipoly- on transkriptionaalisesti säätelee androgeeniriippuvaisissa demetylaation CpG sivustoja sen geenin promoottori.

Citation: Hatano K, Miyamoto Y, Mori M, Nimura K, Nakai Y, Nonomura N, et al. (2012) androgeenisäädellyn transkriptionaalisen säätelyn Sialyylitransferaasit eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (2): e31234. doi: 10,1371 /journal.pone.0031234

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 elokuu 2011; Hyväksytty: 04 tammikuu 2012; Julkaistu: 08 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Hatano et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Program edistämisen Fundamental Studies in Health Sciences of National Institute of Biomedical Innovation (Project ID: 10-03) ja pohjoisen Osaka (Saito) Biomedical Knowledge-Based Cluster Creation projekti. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Monet syöpäsolut ovat poikkeavien sialyloiduilla glykaanien pinnallaan. Nämä poikkeava molekyylit voivat olla mukana syövän etenemisessä [1] – [3], mutta sialyloiduilla glykaanien myös olla monia rooleja terveillä organismien ja ei-syöpäsolujen, kuten alkionkehityksen sääntely immuunivastetta ja viruksen sitoutumista, joka johtaa infektioita [4 ], [5]. Sialyloiduilla glykaanien syntetisoidaan sialyylitransferaasit, jotka lisäävät siaalihappoja oligosakkaridiketjujen glykoproteiinien ja glykosfingolipidien (GSLs) [5]. Tähän mennessä 20 sialyylitransferaasi on kloonattu, ja vastaavat entsyymit on jaettu neljään ryhmään mukainen hiilihydraatti sidoksia ne katalysoivat: p-galaktosidi α2,3-sialyylitransferaasit (ST3Gal I-VI), β-galaktosidi α2,6- sialyylitransferaasit (ST6Gal I ja II), GalNAc α2,6-sialyylitransferaasit (ST6GalNAc I-VI), ja α2,8-sialyylitransferaasit (ST8Sia I-VI) [6]. Aikana neoplastisen transformaation ja syövän etenemisessä, aktiivisuus sialyylitransferaasit on usein muutettu, ja näin ollen, syöpäsolut ovat raskaammin sialoidun glykaanien niiden pinnalla kuin ei-syöpäsolujen [1], [2], [7].

GSLs, jotka sisältävät siaalihappoa tunnetaan gangliosidien ja ilmentyvät korkeilla tasoilla eri syöpäsoluissa [3]. Gangliosidien läsnä syöpäsolujen käytetään biomarkkereina tai hoidon tavoitteet, ja rikastettu gangliosidit vaihtelevat syöpäsolutyyppien [8] – [10]. Olemme keskittyneet GD1a synteesiin syöpäsoluissa koska GD1a on useita biologisia vaikutuksia, jotka edistävät syövän etenemistä. Esimerkiksi, erittäin metastaattinen syöpäsolut on runsaasti GD1a, ja GD1a on mukana syöpäsolujen tarttumista endoteelisolujen etäpesäkkeen muodostumisen aikana [11]. GD1a irtoa kasvainsolujen kasvaimen mikroympäristössä edistää angiogeneesiä ja tehostaa kasvutekijän signalointi lisäämällä dimerointi Kasvutekijäreseptorien [12] – [15]. Siksi GD1a voi olla osallisena syöpäsolujen lisääntymistä ja etäpesäkkeiden. Lisäksi tämä gangliosidi on reseptori Sendai-viruksen [16], ja inaktivoitu Sendai-viruspartikkeleita [hemagglutinoiva virus of Japan vaipan (HVJ-E)] indusoida apoptoosia useissa ihmisen syöpäsoluja rikastettua GD1a niiden pinnalla [17]. Näin ollen, GD1a voi olla houkutteleva molekyyli kannalta syövän hoidossa.

GD1a on raportoitu runsaasti tuotetaan kastraatio-resistenttien syöpäsolujen [17] – [20], ja olemme aiemmin osoittaneet, että kastraation kestävä eturauhassyövän solut tehokkaasti poistettavissa HVJ-E [17]. GD1a syntetisoidaan GM1 mukaan ST3Gal I ja II. Km-arvo ST3Gal II GM1 on pienempi kuin ST3Gal I; Näin ollen, ST3Gal II edullisesti edistää GD1a synteesi [6], [21] – [24]. Olemme viime aikoina osoittaneet, että runsas tuotanto GD1a in kastraatio kestävä syöpäsolujen korreloi korkea ST3Gal II ilmaisun [20] ja että ST3Gal II ilmentymistä säätelee NF-KB: n, lähinnä RelB, vuonna kastraatio kestävä eturauhassyövän soluihin [20]. Vaikka RelB tasot olivat samanlaiset hormoni-herkkä eturauhassyöpä-solulinjaa (LNCap) ja kastraatio kestävä eturauhasen syöpäsolujen, ja vaikka ST3Gal I ilmennettiin LNCap-soluissa [20], ilmentyminen ST3Gal II vaiennettu LNCaP-soluissa, ja GD1a oli paljon vähemmän runsaita LNCap-soluissa [17], [20].

on toistaiseksi ollut julkaistu analyysi gangliosidin tasot syöpä- kudosnäytteitä ihmispotilaille, joilla on eturauhasen syöpä; kuitenkin, endogeeninen immuunivasteen GD1a havaittiin potilailla, joilla on hormonin herkkä eturauhassyöpä, mutta ei terveillä verrokeilla [19], mikä viittaa siihen, että GD1a on runsaasti tuotettu hormoni-herkkä eturauhasen syöpiä. Eturauhassyöpä esiintyy androgeeniriippuvaisissa kasvuun ja etenemiseen [25]; Siksi androgeenien voi myös säädellä GD1a tuotantoa, joka liittyy syövän etenemisessä. Kuitenkin on myös ollut julkaistu tutkimuksia, jotka ovat tutkineet hormonaalisen valvonnan sialyloiduilla glykaania synteesin.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, onko GD1a tuotetaan runsautta hormoniherkän eturauhasen syöpiä potilailla ja analysoida transkription valvonta sialyylitransferaasit, erityisesti ST3Gal II, joita tarvitaan synteesiin GD1a hormoni-herkkä eturauhasen syöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics esitetyt

Kirjallinen tietoinen suostumus saatiin kaikista potilaista käyttöön niiden kudosnäytteiden, ja tällaisten näytteiden hyväksynyt Osakan yliopistollisen sairaalan Institutional Review Board (Osaka, Japani).

Soluviljely

kastraatio kestävä ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, PC3 ja DU145, ja hormoni-herkkä ihmisen eturauhassyövän solulinjaa LNCap klooni FGC, hankittiin American Type Culture Collection (Rockville, MD). Normaali ihmisen eturauhasen epiteelisolujen, PNT2, ostettiin European Collection of Animal Cell Cultures (Porton Down, UK). PC3-soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioitua Eagle F12 -alustassa (Nacalai Tesque, Kioto, Japani), ja DU145, LNCap ja PNT2 soluja pidettiin RPMI 1640-alustassa (Nacalai Tesque, Kioto, Japani). Kaikki alustat täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2.

Reagenssit ja vasta-aineet

Trichostatin A (TSA) ja 5-atsa 2′-deoksisytidiini (5-azadC) ostettiin Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japani). Testosteroni hankittiin Tokio Chemical Industry (Tokio, Japani). Bicalutamide ostettiin Enzo Life Sciences (Plymouth Meeting, PA). Restriktioentsyymejä,

Msp

I ja

Hpa

II, hankittiin New England Biolabs (Ipswich, MA). Anti-ihmis-RelB (C1E4) ostettiin Cell Signaling (Danvers, MA). Anti-ihmisen β-aktiini (AC-15) hankittiin Abcam (Cambridge, UK).

Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR

Yhteensä-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy RNA eristyspakkausta (Qiagen, Valencia, CA). CDNA syntetisoitiin käyttäen High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-Time PCR -järjestelmää seuraavissa olosuhteissa: 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min. Koetinseoksia ja alukepareja spesifinen ihmisen ST3Gal I (Hs00161688_m1), ST3Gal II (Hs00199480_m1), ST3Gal VI (Hs00196086_m1), RelB (Hs00232399_m1) ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) (Hs99999905_m1) hankittiin Applied Biosystems . Suhteellinen ekspressiotasoja laskettiin standardikäyrästä saadaan käyttämällä log-laimennoksia cDNA, joka sisälsi mielenkiinnon kohteena olevan geenin, ja arvot normalisoitiin GAPDH, sisäinen kontrolli.

Arviointi käyttäen reportterigeenin

geenit transfektoitiin soluihin yhdessä lusiferaasireportteri- konstrukti ohjaa NF-KB: n sitoutumiskohdan, RelA, ja RelB (NF-KB: n lusiferaasireportterigeeniin, BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA), käyttäen Fugene HD-reagenssia (Roche, Basel, Sveitsi). Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin dual-lusiferaasianalyysissä (Promega, Madison, WI).

Western blot-analyysi

solut kerättiin ja lyysattiin RIPA-lyysipuskuria. Proteiini näytteet erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi. Erotetut proteiinit siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvoja, sitten membraanit blokattiin kuoritun maidon 5% ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa anti-RelB (1:500) tai anti-β-aktiini (1:2000) vasta-aineita. Membraanit pestiin ja leimattu 1:2000 laimennus piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) huoneenlämpötilassa noin 1 tunnin ajan. Detection kemiluminesenssimittauksella suoritettiin ECL käyttöopas (Amersham, Buckinghamshire, UK). Kuvat otettiin ImageQuant LAS 4000mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), ja kvantifiointi Western blot signaaleja suoritettiin densitometrialla ImageQuant TL ohjelmisto (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).

RNA-interferenssi kokeiluja

seuraavat kaksisnauhaiselle stealth sirna (siRNA) oligonukleotidit ja salattu RNA ostettiin Invitrogen (Tokio, Japani): siRNA oligonukleotidit vastaan ​​RelB olivat (sense) 5′-UCUUCAGGGACCCAGCGUUGUAGGG-3 ’ja (antisense) 5 ”-CCCUACAACGCUGGGUCCCUGAAGA-3 ’. Transfektiot suoritettiin lipofektamiinin RNAiMAX (Invitrogen, Tokio, Japani), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Metylaatiospesifinen PCR (MSP) analyysi

DNA: n metylaatio tarkastettiin CpG-saarekkeiden jonka MSP-analyysi, kuten aiemmin on raportoitu [26]. MSP-analyysi, genominen DNA uutettiin soluista ja puhdistettiin käyttämällä QIAamp DNA (Qiagen, Valencia, CA). Genomi-DNA alistettiin bisulfiittikonversion käyttämällä EZ DNA Metylointi Kit (Zymo Research, Irvine, CA). Sekvenssin perusteella, että ST3Gal II p1-promoottorin ja ST3Gal I P1-promoottorin, metyloidut-spesifisiä alukkeita ja metyloimattoman-alukkeet suunniteltiin käyttämällä metyyli Primer Express Software ohjelman versio 1.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA). ST3Gal II-metyloitu alukkeita olivat mielessä, 5′-TAGGGCGTAGCGGTTTTATC-3 ’, antisense, 5′-ACTAACCGAAAACGCCTCTC-3′, ja ST3Gal II-metyloimattoman alukkeita olivat mielessä, 5’-GGTTAGGGTGTAGTGGTTTTATT-3 ’, ja antisense, 5’-CACACTAACCAAAAACACCTCTC-3 ’. ST3Gal II 5′-transloimaton alue -659–495 valittiin MSP-analyysi. ST3Gal I-metyloitu alukkeita olivat mielessä, 5’-TAGGGTCGGTCGTAGTGTTC-3 ’, antisense, 5′-ACCGATCCCCTACTAACGAC-3′, ja ST3Gal I-metyloimattoman alukkeita olivat mielessä, 5’-TTAGGGTTGGTTGTAGTGTTT-3 ’, ja antisense, 5’-AACCAATCCCCTACTAACAAC-3 ’. ST3Gal I 5′-transloimaton alue -697–535 valittiin MSP-analyysi. Glutationi-S-transferaasi-π-geenin (GSTP1) metyloitua alukkeita olivat mielessä, 5’-AGTTGCGCGGCGATTTC-3 ’, antisense, 5′-GCCCCAATACTAAATCACGACG-3’, ja GSTP1-metyloimattoman alukkeita olivat sense, 5 ’ -GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT-3 ’, ja antisense, 5′-CCACCCCAATACTAAATCACAACA-3’, kuten aiemmin on kuvattu [27]. Puhdistettu genomista DNA: ta, käsiteltiin natriumbisulfiitin monistettiin PCR: llä seuraavasti: 2 min 95 ° C: ssa denaturoinnin, 35 sykliä monistusta (95 ° C: ssa 30 s, 56 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C 30 s) . Ihmisen genomista DNA: ta tai entsymaattisesti metyloitua ihmisen genomista DNA: ta (Chemicon International, Temecula, CA) oli bisulfiitti-muunnetaan, ja sitä käytettiin positiivisena kontrollina metyloimattomia tai metyloituja geenejä. Koska DNA-templaatin toimi negatiivisena kontrollina. Tuotteet analysoitiin 2% agaroosigeeleillä värjättiin etidiumbromidilla.

eristäminen happamien GSLs eturauhassyöpään kudoksista

Potilaat, joilla on diagnosoitu eturauhasen syöpä oli tehty eturauhasen biopsia tai resektio kasvaimia Osakan yliopisto Hospital (Osaka, Japani). Ensisijainen syöpä kudosnäytteet jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Suurin osa koe-menettelyjä on raportoitu aiemmin [28]. Lyhyesti, näytteet homogenisoitiin kloroformi /metanoli (02:01, v /v), ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 2 h 30 s sonikoimalla 30 minuutin välein. Metanoli lisättiin sitten näytteet, jotka sentrifugoitiin 1800 x g 15 minuuttia. Pelletit homogenoitiin kloroformi /metanoli /vesi (1:2:0.8, v /v /v), inkuboitiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia, ja sentrifugoitiin sitten 1800 x g: ssä 15 minuutin ajan. Molemmat uutteet yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa keskittimeen. Jäännös liuotettiin kloroformi /metanoli /vesi (30:60:8) ja fraktioitiin DEAE-Sephadex A25 pylväskromatografoimalla erottaa neutraali GSLs happamat GSLs.

Analyysi happamien GSLs

rakenteiden happaman GSLs analysoitiin entsymaattisella vapautuminen hiilihydraattiosien, fluoresoivia kanssa aminopyridiinin, ja kaksiulotteinen kartoitus sen jälkeen massaspektrometrialla. Suurin osa kokeellisia toimenpiteitä on raportoitu aiemmin [28]. Lyhyesti, hapan GSLs uutettiin primaarisen syövän hoidossa kudosnäytteistä tai viljellyistä syöpäsolujen ja pilkottiin rekombinantti endoglycoceramidase II:

Rhodococcus

sp. (Takara Bio Inc., Shiga, Japani). Vapautuneet oligosakkaridit leimattiin 2-aminopyridiinin (2-AP) ja erotettiin Shimadzu LC-20A HPLC-järjestelmää (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japani), joka oli varustettu Waters 2475 fluoresenssi-ilmaisimella. Normaali-HPLC suoritettiin TSK gel Amide-80-pylvääseen (0,2 x 25 cm, Tosoh, Tokio, Japani). Molekyyli- koko kunkin pyridylaminated (PA) -oligosaccharide annetaan glukoosiyksikköä (Gu), joka perustuu eluoitumisajat PA-isomalto. Käänteisfaasi-HPLC suoritettiin TSK gel ODS-80Ts -pylvääseen (0,2 x 15 cm, Tosoh). Retentioaika kunkin PA-oligosakkaridi annetaan glukoosista perustuu eluoitumisajat PA-isomalto. Siksi käyttäytymistä tietyn yhdisteen näissä kahdessa sarakkeessa tarjoavat ainutlaatuisia Gu (amidi) ja Gu (ODS) arvot, jotka vastaavat koordinaatit on 2-D kartalla. PA-oligosakkaridit analysoitiin LC /ESI-MS /MS. Standard PA-oligosakkarideja, PA-GM1 ja PA-GD1a, ostettiin Takara Bio, ja PA-LST-a ja PA-SPG eristettiin kuin edellisessä tutkimuksessa [28].

Tilastolliset analyysit

tulokset raportoidaan keskiarvoina ± keskivirhe (SE). Kaksi-tailed paritonta Studentin

t

-testiä käytettiin tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi eroja kahden ryhmän välillä. Todennäköisyyden arvot P 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen StatView 5.0 ohjelmisto (SAS Institute, Cary, NC).

Tulokset

Analyysit gangliosidien syöpäkudoksessa näytteissä potilailta, joilla on eturauhasen syöpä

Olemme aiemmin osoittaneet, että GD1a oli runsaasti kastraatio kestävä eturauhassyövän solulinjoissa (mukaan lukien PC3 ja DU145), kun se oli tuskin havaittavissa hormoni-herkkä eturauhassyöpä-solulinjaa (LNCap) ja normaalissa eturauhasessa epiteelisolulinja (PNT2) [17]. Tutkimme tasot gangliosidit näytteitä syöpäkudoksen kahdeksan potilaille, joilla on eturauhasen syöpä, mukaan lukien kuusi potilailla, joilla on pitkälle hormoni-herkkä eturauhassyöpä ja kaksi potilasta kastraatio kestävä eturauhasen syöpä (taulukko 1). Hapan GSLs uutettiin syöpäkudoksesta näytteitä näistä potilaista tutkittiin käyttäen HPLC (Fig. 1). Sekä GM3 ja GD3 ovat yleisiä gangliosidien ilmaistaan ​​sekä eturauhasen syöpäsolujen ja normaalien eturauhasen epiteelisolujen [18], [19]. GD1a tuotettiin syöpäkudoksen näytteet sekä potilailla, joilla on hormonin herkkä eturauhasen syöpien ja ne, joilla kastraatio kestävä eturauhasen syöpien (Fig. 1A, 1 B). Kaikki potilaan näytteitä (hormoni-herkkä ja kastraatio kestävä), keskimääräinen prosentuaalinen osuus happamien GSLs kanssa GD1a oli 8,1%, ja ei havaittu tilastollisesti merkitsevää eroa ei havaittu verrattuna arvo kastraation kestävästä eturauhassyövän solulinjoissa ( PC3 ja DU145) (Fig. 1 C).

(A) hapan GSLs päässä syöpäkudoksen näytteet kahdeksan potilasta, joilla on eturauhassyöpä, joista kuusi potilailla, joilla on pitkälle hormoni-herkkä eturauhassyöpä ja kaksi potilasta, joilla castration- resistenttejä eturauhassyövän erotettiin molekyylikoon oligosakkaridien normaalilla-HPLC: llä. Näytteitä yhdeltä potilaalta (nimetty tapaus 1) otettiin sekä eturauhasen ja luustometastaaseja arvioitavaksi. (B) hapan GSLs ensisijainen syöpäkudoksen näytteet erotettiin molekyylikoon oligosakkaridien käyttäen HPLC: tä. Määrä GD1a on esitetty prosentteina happaman GSLs kanssa GD1a. (C) Hapan GSLs viljellyissä eturauhassyövän solut erotettiin molekyylikoon oligosakkaridien käyttäen HPLC: tä. Määritys tehtiin kolmena kappaleena, ja välineet ± S.E. GD1a tasot on esitetty suhde kokonaismäärään hapan GSLs solulinjoissa. Keskiarvoa ± S.E. GD1a taso oli myös esitetty suhdeluvun koko hapan GSLs potilaiden näytteitä (HS + CR) kuvassa 1B. (HS, hormoni-herkkä; CR, kastraatio kestävä, F, vapaa glykaania).

androgeeniriippuvaisissa sääntely ST3Gal II LNCaP

synteesi GD1a säätelee pääasiassa ST3Gal II, ja ilmentymistä ST3Gal II säätelee NF-KB: n, lähinnä RelB, in kastraatio kestävä eturauhassyövän solulinjoissa [20]. Määrät ydin- RelB oli samankaltainen hormoniherkän LNCaP ja kastraatio kestävä PC3 ja DU145 solujen [20], mutta ilmaus ST3Gal II oli pienempi LNCaP kuin PC3 ja DU145 soluihin [20].

LNCap soluviljelyalusta on rutiininomaisesti täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Äskettäinen raportti osoitti, että materiaali, johon on lisätty 10% FBS: ää on vain castrate testosteronin [29]; Sen sijaan hormoni-herkkä eturauhasen syöpiä käsittelemättömän potilaiden tavallisesti kasvaa sellaisessa ympäristössä, joka sisältää testosteronia

in vivo

. Analysoida transkription valvonta ST3Gal II hormoniherkän eturauhasen syöpiä, tutkimme onko ilmaus ST3Gal II kontrolloitiin testosteronia LNCaP. LNCap-soluja käsiteltiin testosteroni (0-1000 nM), ja inkuboitiin 120 tuntia. Määrälliset reaaliaikainen PCR-analyysit osoittivat, että ilmentyminen ST3Gal II oli suurempi LNCap soluissa, joita käsiteltiin testosteroni kuin LNCap-soluissa, jotka eivät olleet (kuvio. 2A). Lisäksi induktio ST3Gal II sen jälkeen, kun testosteronin hoidon tukahdutettiin antiandrogeeni, bikalutamidi, LNCaP-solut (Fig. 2B). Sen varmistamiseksi, ettei Androgeenit läsnä tiedotusvälineissä, LNCap soluja inkuboitiin hiilellä erotettua seerumia 48 tuntia. Pohjapinta taso ST3Gal II ei ollut merkitsevää eroa 10% FBS- ja puuhiilellä puhdistettua seerumin täydennetty LNCaP (Fig. 2C). LNCaP-soluja käsitellään myöhemmin 100 nM testosteronia, ja aika-kurssi ilmaisun seuraavista Testosteronihoidon arvioitiin. Ekspressio ST3Gal II lisättiin 48 tunnin kuluttua Testosteronihoidon, ja pysyi koholla yli 120 h LNCap-soluissa (kuvio. 2C). Arvioida NF-KB-aktiivisuus, kun testosteronin hoidon, LNCap-soluja transfektoitiin NF-KB-lusiferaasireportteri konstrukti ja inkuboitiin 120 tuntia tai ilman testosteronia. NF-KB-aktiivisuutta ei ollut merkitsevästi erilainen testosteronin käsiteltyjen LNCaP verrattuna soluihin viljelty ilman testosteronia (kuva S1). PC3 ja PNT2-soluissa ei havaittu merkittävää lisäystä ilmentyminen ST3Gal II havaittiin riippumatta siitä, viljeltyjen solujen kanssa tai ilman testosteronia (Fig. 2A). Ilmaisu on ST3Gal II ei lisääntynyt, kun testosteroni hoidon PC3 soluissa milloin tahansa vaiheessa jopa 120 tuntia (kuvio S2). Näiden tulosten perusteella, me arveltu, että median kastraatiotasolle testosteronin johti epigeneettiset vaiennettu ST3Gal geeni vaaditaan synteesiin GD1a, LNCaP-soluissa.

(A) LNCap, PC3, ja PNT2-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman testosteronia (0-1000 nM) 120 tuntia, jonka ajaksi ravittaviksi uudelleen tuoreella väliaineella tai ilman testosteronin 72 tunnin ajan. Määrälliset reaaliaikainen PCR-analyysit ST3Gal II mRNA tehtiin, ja ekspressiotasot ilmoitetaan keskiarvoina ± S.E. (N = 3) ja kertainen ero mRNA normalisoinnin jälkeen arvot ilmentymisen tasoa käsittelemättömien solujen. ** P 0,001. (B) LNCap-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman testosteronia (0-100 nM), ja samanaikaisesti tai ilman 10 uM bikalutamidi 120 tuntia, jonka ajaksi ravittaviksi uudelleen tuoreella väliaineella tai ilman testosteronia ja /tai bikalutamidi 72 tuntia. Määrälliset reaaliaikainen PCR-analyysit ST3Gal II tehtiin, ja ekspressiotasot ilmoitetaan keskiarvoina ± S.E. (N = 3) ja kertainen ero mRNA normalisoinnin jälkeen arvot ilmentymisen tasoa käsittelemättömien solujen. ** P 0,001. (C) LNCap-soluja inkuboitiin hiilellä erotettua seerumia (CSS) 48 tuntia ja sitten käsiteltiin 100 nM testosteronia ja osoitetut ajat. Määrälliset reaaliaikainen PCR-analyysit ST3Gal II tehtiin, ja ekspressiotasot ilmoitetaan keskiarvoina ± S.E. (N = 3) ja kertainen ero mRNA normalisoinnin jälkeen arvot ilmentymisen tasoa käsittelemättömien solujen. * P 0,05, ** P 0,001.

Epigeneettiset sääntely ST3Gal II LNCaP

Seuraavaksi tutkittiin, ST3Gal II epigeneettiseltä säännelty LNCaP. LNCaP-soluja käsiteltiin DNA-metyylitransferaasi-inhibiittorin, 5-azadC, ja inkuboitiin 120 h (Fig. 3A). Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysit osoittivat, että ilmentyminen ST3Gal II sääteli jälkeen 5-azadC hoitoa. Tämän jälkeen kokeessa LNCap-soluja käsiteltiin histonideasetylaasi-inhibiittori TSA, ja inkuboitiin 48 h (Fig. 3B). Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysit osoittivat, että ilmentyminen ST3Gal II sääteli jälkeen TSA hoidon. Nämä tulokset viittaavat siihen, että epigeneettiset asetuksen, mukaan lukien DNA: n metylaation ja histonimodifikaation, voi olla mukana tukahduttamisen ST3Gal II -geenin LNCaP. Lisäkokeissa keskityimme DNA metylaatio klo CpG saari ST3Gal II-promoottori.

(A) LNCap soluja käsiteltiin 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-azadC) (0-50 uM) 120 tuntia, jonka ajaksi ravittaviksi uudelleen tuoreella alustalla tai ilman 5-azadC 72 tuntia. Määrälliset reaaliaikainen PCR-analyysit ST3Gal II tehtiin, ja ekspressiotasot ilmoitetaan keskiarvoina ± S.E. (N = 3) ja kertainen ero mRNA normalisoinnin jälkeen arvot ilmentymisen tasoa käsittelemättömien solujen. * P 0,05. (B) LNCap-soluja käsiteltiin 5 uM trikostatiini A (TSA) 48 tuntia. Määrälliset reaaliaikainen PCR-analyysit ST3Gal II tehtiin, ja ekspressiotasot ilmoitetaan keskiarvoina ± S.E. (N = 3) ja kertainen ero mRNA normalisoinnin jälkeen arvot ilmentymisen tasoa käsittelemättömien solujen. * P 0,05.

Ohjaus DNA metylaatio klo CpG saari ST3Gal II-geenin promoottori eturauhassyöpäsoluissa

Geeni ihmisen ST3Gal II on kloonattu, ja p1 promoottori on kuulemma välttämätöntä aktiivisen transkription tämän geenin eturauhassyövän soluissa [30]. ST3Gal II promoottorisekvenssejä ovat julkisesti saatavilla, ja tunnistimme CpG saari ST3Gal II p1 promoottori käyttäen metyyli Primer Express Software-ohjelma, versio 1.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) (Fig. 4A). Tutkimme metylaation CpG että ST3Gal II promoottori käyttäen MSP analyysiä. Genominen DNA eristettiin LNCap-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 5-azadC 120 tuntia, joka sitten käsiteltiin natrium- bisulfiitti, ja DNA monistettiin alukkeilla, jotka ovat spesifisiä metyloimattomia tai metyloituja ST3Gal II-promoottori (Fig. 4B). LNCaP-solut, CpG saari ST3Gal II promoottori, joka oli alun perin hypermetyloitunut oli demetelyloitiin 5-azadC hoitoa. Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus testosteronin metylaation CpG että ST3Gal II promoottori LNCaP-soluissa käyttäen MSP-analyysi (Fig. 4C). Vuonna PC3 ja DU145 solujen CpG saari ST3Gal II promoottori oli konstitutiivisesti hypometyloidut. Vuonna LNCap solujen CpG-saarekkeen, että ST3Gal II-promoottori hypermetyloitunut ilman testosteronia ja demetyloida testosteronin läsnäollessa. Lisäksi demetylaatio klo CpG saari ST3Gal II promoottori jälkeen Testosteronihoidon tukahdutettiin antiandrogeeninen, bikalutamidin, LNCaP-soluissa (kuvio. 4D).

(A) CpG saari ST3Gal II p1 promoottori ja sijainti MSP alukkeita. Pystysuorat pylväät edustavat CpG sivustoja ja TSS edustaa transkription aloituspaikan. (B-D) MSP analyysit CpG saaren ST3Gal II. DNA eristettiin LNCap-soluja käsiteltiin 5-azadC (0-50 uM) 120 tuntia (B), kastraatio kestävä eturauhassyövän solulinjoissa (PC3 ja DU145) tai LNCap-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 100 nM testosteronia 120 h ( C) tai LNCap-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 100 nM testosteronia samanaikaisesti tai ilman 10 uM bikalutamidi 120 h (D). Sitten DNA käsiteltiin natriumbisulfiitin, ja lopulta monistettiin alukkeilla, jotka ovat spesifisiä metyloimatonta (USP) tai metyloituja (MSP) muodossa CpG-saarekkeen, että ST3Gal II-promoottori (M, metyloitu valvonta; UA, metyloimattomia ohjaus A; UB, metyloimattomia kontrolli B). MSP analyysit toistettiin 3 kertaa samat tulokset, ja edustava kuva kuvioissa esitetty.

Meillä on myös tutkinut, maailmanlaajuinen DNA demetylaatio on alle androgeeniriippuvaisissa ohjaus LNCaP-soluissa. Tutkimme yleinen rajoitus kuviot

Msp

I- tai

Hpa

II-pilkottu genominen DNA. Nämä entsyymit ovat isoschizomers, jotka tunnistavat kohdesekvenssin 5′-CCGG-3 ’, mutta aktiivisuus

Hpa

II inhiboi metylaation sisemmän sytosiini tämän sekvenssin. Genomi-DNA eristettiin muodossa LNCap-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman testosteronin digestoitiin käyttäen

Msp

I tai

Hpa

II (kuvio S3A). Testosteroni hoito ei suuresti vaikuta ruoansulatusta mallia

Hpa

II käsiteltyä genomista DNA LNCaP, mikä osoittaa, että maailmanlaajuinen DNA demetylaatio LNCaP-soluissa ei ollut alle androgeeniriippuvaisen ohjaus. Sitten tutki CpG saaren GSTP1, joka on raportoitu hypermetyloitunut aikana eturauhasen syövän synnyn ja myös LNCaP [27]. Perustuen MSP-analyysi, testosteroni hoito ei vaikuta metylointi GSTP1 LNCaP-soluissa (kuvio S3B). Siten androgeeniriippuvainen valvonta DNA demetylaatio voidaan indusoida valikoivasti CpG- saari ST3Gal II-geenin promoottori LNCaP-soluissa.

androgeeniriippuvaisissa ja epigeneettiset sääntelyn ST3Gal I LNCaP

Vaikka GD1a syntetisoidaan GM1 lähinnä ST3Gal II, ST3Gal I voi myös edistää synteesiä GD1a [6], [21] – [24]. Olemme aiemmin raportoitu, että ST3Gal I ilmennettiin LNCap-soluissa, kun taas ekspressio ST3Gal II vaiennettu [20]. Siksi sääntely ST3Gal I transkriptio voi olla erilainen kuin ST3Gal II. Olemme sen jälkeen tutki ilmaus ST3Gal I, kuten ST3Gal II säädettiin testosteronia LNCaP. Tässä kokeessa LNCap-soluja käsiteltiin testosteroni ja inkuboidaan 120 tuntia. Määrälliset reaaliaikainen PCR-analyysit osoittivat, että testosteroni-hoito johti lisääntyneen ilmentymisen ST3Gal I LNCap-soluissa (kuvio. 5A), vaikka ilmentymisen ST3Gal VI, sialyylitransferaasia tarvitaan synteesiin sialyyli paragloboside, ei indusoitunut Testosteronihoidon (Kuva S4). Lisäksi testosteroni-välitteisen induktion ST3Gal I LNCaP tukahdutettiin bikalutamidin (Fig. 5B). Sen varmistamiseksi, että ei ollut androgeenien läsnä soluviljelyaine, LNCap-soluja inkuboitiin hiilellä erotettua seerumia 48 tuntia. Pohjapinta taso ST3Gal en ollut merkitsevästi erilainen LNCaP viljelty 10% FBS ja hiilellä erotettua seerumia (Fig. 5C). Sitten LNCap-soluja käsiteltiin 100 nM testosteronia, ja aika-kulku muuttuu seuraavien Testosteronihoidon arvioitiin. Ilmaus ST3Gal I kasvoi 72 h kuluttua Testosteronihoidon ja pysyi koholla yli 120 h LNCap-soluissa (kuvio. 5C). PC3 ja PNT2-soluissa ei havaittu merkittävää lisäystä ilmentyminen ST3Gal I havaittiin sen jälkeen, kun testosteronin hoidon (kuvio S5).

(A) LNCap-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman testosteronia (0-1000 nM) 120 h, jonka ajaksi ravittaviksi uudelleen tuoreella alustalla tai ilman testosteronia 72 tuntia. * P 0,05.