Krooninen sairaus

tiivistelmä

Angiogeneesi tapahtuu kudosten kasvua, kehitystä ja haavan paranemista. Sitä tarvitaan myös syövän etenemiseen ja edustaa järkevä kohde terapeuttisen intervention. NBM-T-BMX-OS01 (BMX), johdettu puolisynteesillä ja osthole aktiivinen ainesosa kiinalaisen yrtti

Cnidium monnieri

(L.) Cuss., On viime aikoina osoittanut parantaa oppimista ja muistia rotilla . Tässä tutkimuksessa olemme tunnettu antiangiogeenisiä toimintaa NBM-T-BMX-OS01 (BMX), jolla pyritään kehittämään uusia estäjiä tukahduttaa angiogeneesiä ja kasvaimen kasvua. BMX esti verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) aiheuttaman lisääntymisen, migraation ja endoteelin putken muodostumiseen ihmisen napanuoran endoteelisoluja (HUVEC). BMX myös heikennettyjä VEGF: n indusoimaa pienten suonten versoja aorttarenkaat

ex vivo

ja pienentää HCT116 peräsuolen syövän solut angiogeneesissä

in vivo

. Lisäksi BMX esti fosforylaatiota VEGFR2, FAK, Akt ja ERK sisään HUVEC alttiina VEGF. BMX osoitettiin myös estävän HCT116 soluproliferaatiota ja tukahduttaa kasvun ihonalainen ksenograftien of HCT116-solujen

in vivo

. Yhdessä tämä tutkimus antaa näyttöä, että BMX moduloi verisuonten endoteelisolujen remodeling ja johtaa tuumorin angiogeneesiä. Nämä tulokset tukevat myös rooli BMX mahdollisena lääkeainekandidaatti ja takaa kliinisen kehityksen syövän hoidossa.

Citation: Yang HY, Hsu YF, Chiu PT, Ho SJ, Wang CH, Chi CC, et ai. (2013) syövän vastaista aktiivisuutta sellaisen Osthole Johdannaissopimukset, NBM-T-BMX-OS01: kohdistaminen endoteelikasvutekijä reseptorisignalointi ja Angiogeneesi. PLoS ONE 8 (11): e81592. doi: 10,1371 /journal.pone.0081592

Editor: Masuko Ushio-Fukai, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 5. kesäkuuta, 2013 Hyväksytty 15. lokakuuta 2013. Julkaistu: 27 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Science neuvoston Taiwan [NSC98-2320-B-038-007]; myöntää [99TMU-WFH-02-4] päässä Taipei Medical University-Wan Fang Hospital, Taipei, Taiwan; ja myöntää [LSH-2012-04] päässä Landseed Hospital, Taoyuan, Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: NatureWise Biotech Medicals Corporation on kehittäjä ja patentinhaltija BMX ja sen johdannaiset useissa maissa. Patentti nimi: CINAMIC yhdisteet ja sen johdannaiset inhiboimiseksi histonideasetylaasi. Patentti numero: US7994357. Shiau-Jing Ho Chi-Wang, Chih-Chin Chi Cheng-Feng Lee ja Ying-Shiuan Li työskentelee NatureWise Biotech Lääkärintarkastukset Corporation. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Angiogeneesi on monimutkainen prosessi, jossa uusia alukset muodostuvat preexisting verisuonistoon. Se ei vain osallistuu erilaisiin fysiologisiin prosesseihin, mutta myös tärkeä rooli syövän etenemisen ja metastaattisen leviäminen kasvainten [1] – [3]. Kasvain verisuonisto on yleensä korreloi huonon lopputuloksen. Kasvaimen käynnistämän angiogeneesin on siis ollut houkutteleva kohde kehittämiseksi syövän hoitomuotoja [4]. Alkuvaiheen suonettoman kasvaimen kasvua, kasvainsolujen selvitä rajoittamisesta diffuusio päässä lähellä verisuonia ja tullut hypoksinen. Tasapaino angiogeenisten ja anti-angiogeenisten signalointi siirtyy kohti verisuonten muodostumista [5]. Tämä angiogeenisten kytkin aktivoi joukko geenin transcriptions ja käynnistää angiogeneesiä [6]. Lukuisat angiogeenisten tekijöiden, mukaan lukien verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) [7], emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF) [8], [9], epidermaalisen kasvutekijän (EGF) ja angiopoietiini [10] ovat sekaantuneet kasvaimen angiogeneesiä. Näistä angiogeenisten sääntelyviranomaisten, VEGF-A, jäsen VEGF-perheen, on kriittisin ja erityisiä välittäjänä, joka edistää angiogeneesiä [11], [12]. VEGF-A tarvitaan kemotaksista ja erilaistumista endoteeliprekursorisoluja, endoteelisolujen proliferaation, vaskulogeneesiä ja angiogeenisten remodeling [13]. Soluvasteita VEGF-A välittyvät reseptorityrosiinikinaasin VEGFR2 (tunnetaan myös KDR tai Flk-1) endoteelisolujen pinnalla [14]. Aktivointi VEGFR2 kytkee päälle signa- lukien ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK), Akt (tunnetaan myös proteiinikinaasi B), polttoväli adheesiokinaasi (FAK) ja Src-ryhmän kinaasien [15]. Akt signalointireitin säätelee endoteelisolujen migraatiota, proliferaatiota ja apoptoosin [16]. ERK-reitin aktivoidaan VEGF on liitetty eri solujen toimintaan kuten proliferaatiota, erilaistumista, soluliikkuvuus ja eloonjääminen [17]. FAK vaikuttaa myös kasvaimen pahanlaatuisuuden [18]. Näistä syistä VEGF ja VEGFR2 tunnustetaan houkuttelevia kohteita terapeuttisen intervention syövän [19]. Monia strategioita estää VEGF signaloinnin arvioidaan parhaillaan kliinisissä kokeissa. Näihin kuuluvat liukoiset reseptorit, jotka sitovat VEGF [20], vasta-aineet kohdistuvat VEGF tai VEGFR [21], ja pienmolekyylisalpaajilla VEGFR2 [22]. Lisäksi jotkut pienmolekyylisalpaajien kuten sorafenibin ja Sunitinibin on jo hyväksynyt Yhdysvaltojen Food and Drug Administration hoitoon tietyntyyppisten syöpään [23].

Cnidium monnieri

(L. ) Cuss. on pitkään käytetty laajalti itämaisen lääketieteen parantaa immuniteettia ja lievittää hepatiitti. Osthole, bioaktiivinen komponentti uutetaan siemenistä

Cnidium monnieri

(L.) Cuss., Odotetaan näin ollen olevan immunomodulaarisia toimintaan. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat myös, että osthole hallussaan hermosoluja suojaava [24], hepatoprotective [25], anti-diabeetikoilla [26], ja anti-syöväntorjuntatoimista [27], [28]. Kun otetaan huomioon, osthole laaja spektri biologisia aktiivisuuksia, se näyttää olevan lupaava johtaa yhdisteen lääkekehityksen. Äskettäin NBM-T-BMX-OS01 (BMX) (Fig. 1), johdannainen semisynthesized päässä osthole, todettiin voimakas histonideasetylaasi-inhibiittori, ja sen osoitettiin parantaa oppimista ja muistia rotilla [29]. Yrittäessään löytää tuumoriangiogeneesissa estäjät, me siis arvioitiin antiangiogeenisiä ominaisuuksia BMX. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että BMX esti VEGF: n indusoiman solujen lisääntymisen, migraation ja putken muodostumiseen ihmisen napanuoran endoteelisoluja (HUVEC). VEGF: n indusoiman fosforylaation VEGFR2- Src, ERK, Akt ja FAK myös tukahdutettiin HUVEC alttiina BMX. Käyttämällä HCT116 peräsuolen syövän solut ksenografti angiogeneesiä malli, BMX Lisäksi osoitettiin tukahduttaa kasvaimeen liittyvien angiogeneesiin. Lisäksi BMX estivät merkittävästi HCT116 peräsuolen syövän solujen lisääntymisen ja tukahdutti kasvaimen kasvua vierassiirrännänmallissa kasvain malli. Yhdessä nämä tulokset viittaavat potentiaalia BMX terapeuttisena aineena dual aktiivisuutta sekä kasvaimen leviämisen ja angiogeneesiin.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

3 – [4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT), toluidiinisininen O, ja McCoy5A väliaine olivat Sigma (St Louis, MO). Medium 199 (M199), naudan sikiön seerumia (FBS), ja kaikki soluviljelyreagenssit ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Vasta-aineet CDK4, VEGFR2, VEGFR2 fosforyloitu tyrosiini 1175 (Y1175), VEGFR2 fosforyloitu tyrosiini 1214 (Y1214), ERK1 /2, ERK1 /2 fosforyloitiin treoniini 202 /tyrosiini 204 (T202 /Y204), Akt, Akt fosforyloitiin seriini 473 (S473), FAK ja FAK fosforyloitu tyrosiini 397 (Y397), Src ja Src fosforyloitu tyrosiini 416 (Y416) ostettiin Cell Signaling (Danvers, MA). Spesifisiä vasta-aineita p21 ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Vasta-aineita GAPDH, α-tubuliinin, surviviini ja cyclinD1 ja anti-hiiri-anti-kani-IgG: llä konjugoituna peroksidaasiin vasta-aineet hankittiin GeneTex Inc (Irvine, CA). Parannettu kemiluminesenssidetektiolla pakki oli GE Healthcare (Pieni Chalfont, UK). Cell Proliferation ELISA, BrdU iinianalyysikitissä hankittiin Roche (Indianapolis, IN). Kaikki materiaalit Immunoblottausta ostettiin GE Healthcare (Pieni Chalfont, UK). Kaikki muut kemikaalit saatiin Sigma (St. Louis, MO).

NBM-T-BMX-OS01 (BMX) B

BMX, (

E

) -2 – (4-metoksibentsyylioksi) -3-prenyyli-4-metoksi-

N

-hydroxycinamide, saatiin NatureWise Biotech Medicals Corporation (Taipei, Taiwan), ja niiden puhtauksien ( 99%) vahvistettiin

1H-NMR-analyysi ja HPLC.

1 H-NMR-spektrit rekisteröitiin Bruker Avance DRX-500 MHz Fourier-muunnos spektrometri huoneenlämmössä.

1H-NMR (DMSO

d

6

, 500 MHz) δ: 7,70 (1 H, d,

J

= 16,0 Hz), 7,46 (1 H, d,

J

= 8,5 Hz), 7,40 (2H, d,

J

= 8,5 Hz), 6,97 (2H, d,

J

= 8,5 Hz), 6,87 (1 H , d,

J

= 8,5 Hz), 6,38 (1 H, d,

J

= 16,0 Hz), 5,11-5,05 (1H, m), 4,65 (2H, s), 3,82 (3H, s), 3,78 (3H, s), 3,28 (2H, d,

J

= 7,0 Hz), 1,64 (3H, s), 1,60 (3H, s). Anaali. HPLC

t

R = 9,57 min (puhtaus 99,3%). Analyyttinen HPLC UV-puhtaus arvioitiin käyttäen JASCO LC-2000Plus järjestelmä ja seuraavaa menetelmää. Menetelmää varten 210 nm: ssä, Phenomenex Luna 5 pm, 250 mm x 4,60 mm: n C18 (2) -pylvästä virtausnopeudella 1,0 ml /min, ja liikkuvana faasina metanoli /vettä (v /v = 80:20 ) 30 minuutin aikana.

Ethic selvitys

tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokollat ​​kuten alla on kuvattu hyväksyi Taipei Medical University Laboratory Animal Care ja Käytä komitea (Luvan numero: LAC-100-0097). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Soluviljely

Ihmisen napanuoran verisuonten endoteelisolujen (HUVEC) saatiin Bioresource Collection ja Research Center ( Hsinchu, Taiwan). Soluja ylläpidettiin M199, joka sisälsi endoteelikasvutekijä täydennysosa (EKG) (Millipore), 10% FBS: ää, 5 U /ml hepariinia, 20 mM HEPES, 100 U /ml penisilliini G ja 100 ug /ml streptomysiiniä kostutetussa 37 ° C: ssa inkubaattorissa. HCT116 kolorektaalisyöpä solulinja saatiin Bioresource Collection ja Research Center (Hsinchu, Taiwan). Soluja ylläpidettiin McCoy5A, joka sisälsi 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliini G ja 100 ug /ml streptomysiiniä kostutetussa 37 ° C: ssa inkubaattorissa.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus mitattiin kolorimetrisellä 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT), kuten aiemmin on kuvattu [30].

(LDH) vapautumisen määrityksellä

LDH vuoto mitattiin määrällisesti sytotoksisuuden kanssa CytoTox96 ei-radioaktiivinen sytotoksisuuskokeeseen kit (Promega). Supernatantit kulttuuriin analysoitiin perustuvat valmistajan ohjeita. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä mikrolevylukijalla. Hajotuspuskuria lisättiin 10 min käytettiin positiivisena kontrollina solujen täydellisen kuolion. Sitten aineisto lasketaan prosentteina lyysipuskuria-käsitellyssä ryhmässä.

Soluproliferaatiomääritys (BrdU) B

HUVEC-soluja (2 x 10

4 per kuoppa) ympättiin 96- kuoppaiset kudosviljelylevyille ja niitä inkuboitiin 24 h. Sitten soluja nälkiinnytettiin M199, joka sisälsi 2% FBS: ää ilman endoteelisolujen kasvun täydentää vielä 16 tuntia. Jälkeen nälkään, soluja esi-käsiteltiin 30 minuutin ajan eri pitoisuuksilla BMX, jota seuraa stimulointi VEGF (20 ng /ml) vielä 24 tunnin ajan. Solujen proliferaatio määritettiin sitten käyttäen solun lisääntymis- ELISA, BrdU (kolorimetrinen) kit (Roche), joka perustuu kolorimetrisesti sisällyttäminen BrdU, seuraten valmistajan ohjeita.

Virtaussytometrinen analyysi

HUVEC-solut olivat ilman ravintoa 2% FBS: ää M199: ssä, ilman endoteelisolujen kasvun lisäravinteet 16 tuntia. Sitten soluja inkuboitiin BMX on ilmoitettuina pitoisuuksina 30 minuuttia, mitä seurasi käsittely VEGF (20 ng /ml) vielä 24 tunnin ajan. Lopussa kokeiden, apoptoottisten solujen havaittiin propidiumjodidilla (PI) ja anneksiini V-FITC merkintöjä kuten aiemmin on kuvattu [31]. Kaksinkertainen leimaus suoritettiin 37 ° C: ssa käsittelemällä soluja PI (50 ug /ml) ja anneksiini V-FITC (2 ug /ml) 15 minuutin ajan pimeässä.

Haavan naarmu migraatiokokeessa

Kun nälkään M199, joka sisälsi 2% FBS: ssa 16 tuntia, yksikerroksista HUVEC haavoittui raaputtamalla kanssa pipetinkärjet ja pestään PBS: llä. Sitten soluja käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla BMX puuttuessa tai läsnä VEGF (20 ng /ml) vielä 16 tunnin ajan. Solut valokuvattiin käyttäen faasikontrastimikroskoopissa digitaalikameran 0 h ja 16 h kuluttua VEGF hoidon. Nopeus solumigraation määritettiin laskemalla siirtynyt solujen alle käännetyn kontrastin vaiheen mikroskoopilla (Nikon, Japani).

TranswellTM invaasiomääritys

Migration määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [32 ]. Lyhyesti, alapinnan suodatin transwell levyyn (Corning, NY, USA) päällystettiin 0,2% gelatiinia. Pohja kammiot täytettiin M199, joka sisälsi 2% FBS: ää, kun läsnä on VEGF (20 ng /ml) ja HUVEC-soluja (10

4 solua per kuoppa) 200 ui M199 (ilman kasvutekijöitä) ympättiin alkuun kammiot. Top kammio sisälsi ajoneuvon tai eri pitoisuuksilla BMX. Solujen annettiin kulkeutua 16 h. Non-Siirretyt solut (päällä puolella suodatin) kaavittiin vanupuikolla, ja siirtyneet solut kiinnitettiin ja värjättiin 0,5% toluidiinisinillä 4% paraformaldehydillä. Solut valokuvattiin ja kvantitoitiin laskemalla värjäytyneiden solujen alle käännetyn sijaan vaiheessa mikroskooppia (Nikon, Japani).

Matrigel-putken muodostumiseen määrityksessä

putken muodostumiseen määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [32]. Matrigel, tyvikalvo matriisin (Becton Dickinson, Mountain View, CA), polymeroitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. HUVEC suspendoitiin M199, joka sisälsi 2% FBS: ää läsnä ollessa tai puuttuessa VEGF (20 ng /ml) ympättiin Matrigel. Ne käsiteltiin tämän jälkeen ajoneuvon tai BMX osoitettuina pitoisuuksina. 16 tunnin kuluttua solut valokuvattiin käyttäen faasikontrastimikroskoopilla.

immunoblot-analyysi

immunoblot-analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [30]. Lyhyesti, solut hajotettiin uutto- puskurissa, joka sisälsi 10 mM Tris (pH 7,0), 140 mM NaCl, 2 mM PMSF, 5 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,05 mM pepstatiini A: ta, ja 0,2 mM leupeptiiniä. Näytteet on yhtä suuret määrät proteiinia tehtiin SDS-PAGE ja siirrettiin NC kalvo, joka sen jälkeen inkuboitiin TBST-puskurissa, joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa. Proteiinit visualisoitiin inkuboimalla erityisiä primaaristen vasta-aineiden ja sen jälkeen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita. Immunoreaktiivisuus havaittiin perustuen tehostetun kemiluminesenssin ohjeiden valmistajan. Kvantitatiiviset tiedot saatiin käyttämällä computing densitometriä jonkin tieteellisen kuvantamisjärjestelmä (Biospectrum AC System, UVP).

aortan rengas itäminen määritys

määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [32]. Aortan kaaren leikeltiin 8.-10 viikkoa vanhoja Sprague-Dawley rottia. Poistamisen jälkeen ympäröivään fibro-rasvakudoksesta ja perusteellisesti huuhtelu M199 viljelyalustan, The aorttoja leikattiin 1 mm renkaan segmentit. Aortan renkaat upotettiin Matrigel kuoppiin 48-kuoppalevyllä. VEGF (20 ng /ml) kanssa tai ilman BMX lisättiin sitten kuoppiin. Aortan renkaat viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ja elatusaine vaihdettiin joka 3 päivä. Kasvava ituja endoteelisolujen havaittiin ja valokuvattiin päivänä 8. Kuvat valokuvattiin mikroskoopilla, ja itäneet alue määritettiin tietokoneella digitalisoitu kuvia Kuvan-Pro Plus (Media Cybernetics) ohjelmisto. Analyysi itäneet alueella tehtiin tarkkailija, joka oli sokkoutettu hoitoryhmään. Kaikki protokollat ​​hyväksyttiin Taipei Medical University Laboratory Animal Care ja käyttö komitea.

Kasvainsolulinja angiogeneesissä Matrigel plug määritys

3-5 viikkoa vanhoja nude

nu /nu hiirille saatu BioLasco (Taipei, Taiwan) ja sijaitsee puhdas tiettyjä taudinaiheuttajista vapaa (SPF) huonetta. HCT116-solut otettiin talteen ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään. -Soluja (5 x 10

6 solua) tilavuudessa 150 ul hepariinin läsnä ollessa (20 U) sekoitettiin Matrigelillä (150 ui) ja sen jälkeen injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen kunkin hiiren. Istutuksen jälkeen eläimet satunnaistettiin kontrolliryhmään ja hoitoryhmissä, jotka saivat BMX 20 mg /kg /päivä. Käsittely intraperitoneaalisesti kerran päivässä 10 päivää. Lopussa hoidon, eläimet tapettiin, matrigeelin tulpat poistettiin ja ympäröivien kudosten leikattu. Hemoglobiinin Matrigel tulpat arvioitiin Drabkinin reagenssipakkauksen (Sigma-Aldrich) val- mistajan ohjeiden mukaisesti. Hemoglobiinin pitoisuus laskettiin joukko hemoglobiinin standardeja. Lisäksi, parafiiniin upotetut leikkeet värjättiin CD31-spesifistä vasta-ainetta (Santa Cruz) ja havaitaan aluksen tiheys Matrigel plug kuten aiemmin on kuvattu [33]. Kaikki protokollat ​​hyväksyttiin Taipei Medical University Laboratory Animal Care ja käyttö komitea.

Hiiri ksenograftimallia

3-5 viikkoa vanhoja nude

nu /nu hiiret saatiin BioLasco (Taipei , Taiwan) ja sijaitsee puhdas tiettyjä taudinaiheuttajista vapaa (SPF) huonetta. HCT116-solut otettiin talteen ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään, ja 5 x 10

6 solua tilavuudessa 0,3 ml injektoitiin subkutaanisesti oikeaan kylkeen kunkin hiiren. Kun kasvain saavutti noin 150 mm

3, eläimet satunnaistettiin kontrolliryhmään ja hoitoryhmässä sai BMX 20 mg /kg /vrk. Käsittely intraperitoneaalisesti kerran päivässä 22 päivää. Kasvaimet mitattiin päivittäin digitaalisella paksuus. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa

V

(mm

3) = [

ab

2] x 0,52, jossa

on pituus ja

b

on leveys kasvaimen [34]. Lopussa hoidon, eläimet tapettiin ja tuumorit poistettiin ja punnittiin. Kaikki protokollat ​​hyväksyttiin Taipei Medical University Laboratory Animal Care ja käyttö komitea.

Tilastollinen

Tulokset esitetään keskiarvona ± keskivirhe vähintään kolmen erillisen kokeen. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) seurasi Newman-Keuls testin, kun se on tarkoituksenmukaista, jotta tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi välisen eron avulla.

p

arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

BMX estää VEGF: n indusoimaa soluproliferaatiota HUVEC

endoteelisolujen proliferaatiota on välttämätön askel etenemistä angiogeneesiä. Sen arvioimiseksi, anti-angiogeeninen aktiivisuus BMX (Fig. 1), ensin arvioidaan sen inhiboivia vaikutuksia soluproliferaatioon VEGF: n stimuloimaa HUVEC. Solut nälässä 2% FBS: ää sisältävässä väliaineessa 16 h ja sitten stimuloitiin VEGF: n (20 ng /ml) läsnä ollessa tai poissa ollessa BMX vielä 24 tuntia. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, solujen käsittely BMX konsentraatiosta riippuvaa laskua solujen elinkykyä VEGF: n stimuloimaa HUVEC-määritettynä MTT-määrityksellä. BrdU merkinnät analyysi käytettiin sitten vahvistaa, onko BMX aiheuttama vähennys solujen elinkelpoisuus johtui soluproliferaation inhibointi. Kuva. Kuvio 2B esittää, että prosenttiosuus BrdU-leimattujen solujen lisäsi merkittävästi sen jälkeen, kun 24 h VEGF-hoidon verrattuna kantoaineella käsiteltyyn ryhmään. BMX inhiboi merkittävästi VEGF: n indusoiman solujen lisääntymistä konsentraatiosta riippuvaisella tavalla. Sen määrittämiseksi, ovatko BMX kohdistama mitään sytotoksista vaikutusta HUVEC altistuu VEGF, joka on LDH määritystä käytettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 2C, solujen käsittely BMX 10 uM 24 tuntia ei lisännyt merkittävästi LDH: n vapautuminen. Käytimme myös flow-sytometria-analyysi propidiumjodidilla (PI) ja anneksiini V-FITC: llä merkintöjä havaitsemaan apoptoosia VEGF-stimuloitujen solujen läsnä ollessa BMX. Kuten on esitetty kuviossa. 2D, BMX ei merkittävästi muuttanut prosenttimäärää anneksiini V

+ PI

– soluja (oikeanpuoleiseen alanurkkaan, varhainen apoptoottiset solut) ja anneksiini V:

+ PI

+ soluja (oikeasta yläneljänneksestä , advanced apoptoottisia soluja ja /tai nekroottisia soluja). Nämä tulokset viittaavat siihen, että BMX voidaan käyttää anti-proliferatiivista aktiivisuutta aiheuttamatta sytolyyttinen tai apoptoottinen vaikutus HUVEC alttiina VEGF.

(A) HUVEC nälkiinnytettiin 2% FBS: ää sisältävässä väliaineessa ilman EKG: ssa 16 tuntia. Ruoattaolon jälkeen solut esikäsiteltiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla BMX jota seuraa stimulointi VEGF (20 ng /ml) vielä 24 tunnin ajan. Solujen elinkyky määritettiin sitten MTT-määrityksellä. Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ± S.E.M. Viiden erillisen kokeen suoritettiin kahtena *

p

0,05 verrattuna ryhmään hoidettiin VEGF yksin. (B) HUVEC käsitelty (A), ja solujen lisääntyminen määritettiin kuten on kuvattu ”

Materiaalit ja menetelmät

” -osiossa. Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ± SEM viidestä riippumattomasta kokeesta, jotka suoritettiin kahtena kappaleena. *

p

0,05 verrattuna ryhmään hoidettiin VEGF yksin. (C) HUVEC käsitelty (A), ja sytotoksisuus BMX määritettiin LDH-määrityksellä. Soluja käsiteltiin myös soluhajotuspuskurin (yhteensä lyysi) toimimaan positiivisena kontrollina. (D) HUVEC käsitelty (A), prosenttiosuus apoptoottisten solujen analysoitiin sitten virtaussytometrialla sytometria-analyysi, kuten on kuvattu ”

Materiaalit ja menetelmät

” -osiossa. Vasemmassa alakulmassa neljännekseen kunkin paneelin (anneksiini V

pi

-) esittää elinkelpoisten solujen, jotka sulkevat pois PI ja ovat negatiivisia anneksiini V: n sitoutumisen. Oikeanpuoleiseen alanurkkaan (anneksiini V

+ PI

-) edustaa varhain apoptoottisia soluja, anneksiini V: positiivinen ja PI-negatiivinen, mikä osoittaa solukalvon eheyden. Oikeassa yläkulmassa neljännekseen (anneksiini V

+ PI

+) sisältää kehittyneet apoptoottisia soluja ja nekroottisia soluja, jotka ovat positiivisia anneksiini V: n sitoutumisen ja PI ottoa. Esitetyt tulokset edustavat neljän erillisen kokeen välillä.

BMX estää VEGF aiheuttaman muuttoliikkeen ja kapillaarirakenteella muodostumista HUVEC

endoteelisolujen migraatiota on keskeinen vaihe angiogeneesin [35]. Vaikutus BMX HUVEC liikkuvuuteen määritettiin haavan tyhjästä muuttoliike ja siirtokuoppaan invaasio määrityksissä. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, BMX estivät merkittävästi VEGF: n indusoiman HUVEC maahanmuuttoa pitoisuudesta riippuvalla tavalla. BMX 5 uM myös merkittävästi vähentänyt siirtynyt solujen läpi siirtokuoppaan kalvon este käytettäessä VEGF kuin kemoatrak- (Fig. 3B). Angiogeneesi on monimutkainen prosessi ja putkimainen muodostumista endoteelisolujen on myös tärkeä askel angiogeneesiä. Vaikutuksen arvioimiseksi BMX putkimaiseen muodostumista endoteelisolujen, HUVEC-ympättiin pinnalla Matrigel läsnä VEGF käsiteltiin joko BMX tai ajoneuvon kontrollina. Solut ajoneuvon käsitellyssä ryhmässä tuli pitkänomainen ja muodostettu kapillaarimaisen rakennetta 16 tuntia. VEGF huomattavasti kapillaarimaisen verkkoon. Kuitenkin hoito BMX pitoisuudesta riippuvaisella tukahdutti muodostumista kapillaarimaisen verkon (Fig. 3C). Me seuraavaksi tutkitaan mahdollisia vaikutuksia BMX VEGF angiogeneesissä käyttämällä rotan aortan rengas pienten suonten versoja määrityksessä. Kuten on esitetty kuviossa. 3D, VEGF merkittävästi laukaisi pienten suonten itämistä, johtaa kompleksin muodostumiseen verkoston pienten verisuonten ympärille aorttarenkaat, kun taas hoito BMX (5 uM) antagonized versomistilanteen. Nämä tulokset osoittavat, että BMX voi ilmetä anti-angiogeenisen aktiivisuuden eston kautta solun proliferaatiota, migraatiota ja putken muodostumiseen endoteelisolujen.

(A) HUVEC nälkiinnytettiin 2% FBS: ää sisältävässä väliaineessa ilman EKG: ssa 16 tuntia. Yksisolukerros sitten naarmuuntunut ja vehikkeliä tai konsentraatiot BMX läsnä VEGF vielä 16 tuntia. Määrä siirtynyt solujen määritettiin sitten. Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ± S.E.M. neljästä itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 verrattuna ryhmään hoidettiin VEGF yksin. (B) Kun nälkään, kuten on kuvattu (A), solut ympätään sitten yläkammiossa puuttuessa tai läsnä BMX (5 uM) käyttäen VEGF kuten kemoterapia-houkutinta. 16 tunnin kuluttua, tunkeutuu soluihin gelatiini-päällystetyn kalvon värjättiin ja määrällisesti. Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ± S.E.M. neljästä itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 verrattuna ryhmään hoidettiin VEGF yksin. (C) HUVEC ympättiin Matrigel läsnä VEGF: n (20 ng /ml) kanssa tai ilman sitä BMX osoitettuina pitoisuuksina. Sitten solut valokuvattiin faasikontrastimikroskoopilla jälkeen 16 h. Pylväsdiagrammit osoittavat koottu tiedot keskimääräisestä itää kaaren numerot (n = 4). *

p

0,05 verrattuna ryhmään hoidettiin VEGF yksin. (D) rotan aortan renkaat laitettiin Matrigel ja käsiteltiin VEGF (20 ng /ml) läsnä tai poissa ollessa BMX (5 uM). Vaikutus BMX muodostamisesta aluksen itää eri aortan näytteistä tutkittiin päivänä 8. Pylväsdiagrammit osoittavat koottu tiedot keskimääräisestä mikroverisuonten ala (n = 4). *

p

0,05 verrattuna ryhmään hoidettiin VEGF yksin.

BMX inhiboi VEGF: n indusoimaa ERK ja Akt-fosforylaation

VEGF signaloinnin kautta VEGFR2 on tärkeimmistä väylän asiakkuutta endoteelisolujen proliferaatiota, migraatiota ja putken muodostumiseen, mikä johtaa angiogeneesin [36]. VEGF sitoutumisen VEGFR2 indusoi VEGFR2 dimerointi- ja myöhemmin autofosforylaatio sen tyrosiinitähteillä. Takahashi et al osoitti, että tyrosiinitähdettä 1175 ja 1214 ovat kaksi VEGF-riippuvainen autofosforylaation sivustoja VEGFR2 [37]. Meillä on siis selvitettävä, BMX vaikuttaa VEGFR2 Y1175 ja Y 1214 fosforylaatiota VEGF-stimuloimaa HUVEC. Tutkimme myös fosforylaation tilan Src, Akt, ERK ja FAK, jotka ovat välttämättömiä proteiinikinaasien mukana VEGFR2 signalointi. Kuten on esitetty kuviossa. 4, BMX esti VEGFR2 Y1175 ja Y1214 fosforylaatiot VEGF-stimuloimaa HUVEC (Fig. 4B). BMX osoitettiin myös tukahduttaa fosforylaatiota Src (Fig. 4C), FAK (Fig. 4D), Akt (Fig. 4E) ja ERK (Fig. 4F) VEGF-stimuloidun HUVEC. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että BMX kohdistuu sen angiogeneesiä inhiboimalla VEGFR2 aktivointi ja lukitus VEGFR2-välitteisen signa-.

Soluja esikäsiteltiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla BMX 30 (20 ng /ml) ja vielä 5 (VEGFR2 ja Src) tai 30 (FAK, Akt ja ERK1 /2) min. Fosforylaatiotilaa VEGFR2, Src, FAK, Akt, ja ERK1 /2 määritettiin sitten immunoblottauksella. Luvut on esitetty (A) edustavat neljää itsenäistä koetta samoin tuloksin. Koottu tulokset VEGFR2 Y1175 ja Y1214 (B), Src Y416 (C), FAK Y397 (D), Akt S473 (E), ja ERK1 /2 T202 /Y204 (F) fosforylaatiot on esitetty. Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ± S.E.M. neljästä itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 verrattuna kontrolliryhmään; #

p

0,05 verrattuna ryhmään hoidettiin VEGF yksin.

BMX lisää p21

CIP /Waf1 ilme, mutta vähenee cyclinD1, CDK4 ja surviviiniperäistä ilmaisuja

läpikulun solukierron säätelee sykliini-CDK-komplekseja, heterodimeeriproteiinia kinaasien [1] – [3]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että induktio tai kohdunulkoinen ilmentymistä p21

CIP /Waf1, negatiivinen säätelijä CDK, estää soluproliferaatiota ja aiheuttaa erilaistumista useissa solutyypeissä. p21

CIP /Waf1 on siten tärkeä säätelijä leviämisen kehityksen aikana, erilaistumisen, ja kasvaimen kehittymisen [38]. Lisäksi surviviiniperäiset, estäjä apoptoosin (IAP) perheenjäsen, todettiin olevan yli-ilmentynyt ihmisen syövissä ja ilmoitettiin ratkaiseva rooli säätelyssä solusyklin etenemisen, apoptoosin, ja kasvaimen kehittymisen [39] – [42] . Koska BMX tukahdutti HUVEC lisääntymistä aiheuttamatta apoptoosin kuten edellä on kuvattu, me tutki BMX vaikuttaa proteiinin tasot p21

CIP /Waf1 ja surviviinille HUVEC. Tasot solusykliä säätelevien proteiinien, kuten cyclinD1 ja CDK4 määritettiin myös in BMX stimuloiman HUVEC. Kuten on esitetty kuviossa. 5, hoito HUVEC BMX 24 tuntia aiheutti lisääntymisen proteiinin taso p21

CIP /Waf1 (Fig. 5B). Sitä vastoin proteiini tasot sykliini D1 (Fig. 5c), CDK4 (Fig. 5D) ja surviviinin (Fig. 5E) määrä väheni BMX stimuloiman HUVEC. Nämä tulokset viittaavat siihen, että BMX-esti solujen proliferaatiota HUVEC voidaan myös välittyy muutoksia proteiinin tasoja p21

cip /Waf1, cyclinD1, CDK4 ja surviviini.

Soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla BMX 24

CIP /Waf1, cyclinD1, CDK4 ja surviviini sitten määritettiin immunoblottauksella. Luvut on esitetty (A) edustavat neljää itsenäistä koetta samoin tuloksin. Koottu tulokset p21

CIP /Waf1 (B), cyclinD1 (C), CDK4 (D), ja surviviini (E) tasot on esitetty. Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ± S.E.M. neljästä itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 verrattuna kontrolliryhmään

BMX esti tuumorin indusoimaa angiogeneesiä nude-hiirissä

Seuraavaksi käytimme kasvaimen aiheuttamaa angiogeneesiä malli tutkia tarkemmin, ovatko BMX estää kasvaimen aiheuttamaa angiogeneesiä. HCT116 peräsuolen syövän solut sekoitettiin Matrigel ja injektoitiin kylkiin hiirillä. Gel tulpat kerättiin 10 päivää istutuksen jälkeen. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, HCT116-solut syvästi indusoi verisuonten muodostumista tulpan (Fig. 6A). Kuitenkin vaalea väri tulpat poistettiin hiiriltä vatsaonteloon BMX (20 mg /kg /päivä) osoitti, että HCT116-solujen aiheuttama vähemmän uudissuonittumisen yli 10 vuorokauden ajan. Suoritimme CD31 immunohistokemiallinen värjäys havaita mikroverisuonitiheys ningstappar. Kuten on esitetty kuviossa. 6B, tulpat johdettu BMX-käsitellyistä hiiristä osoittivat laskua mikroverisuonitiheys verrattuna näiden ajoneuvojen-käsiteltyihin kontrollihiiriin. Olemme myös määrällisesti Angiogeneesin taso määrittämällä hemoglobiinin pitoisuus tulpat. Vähentynyt selvästi uudissuonittumista osoitettiin tulpat BMX-käsitellyistä hiiristä verrattuna niillä, apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään hiirissä (Fig. 6C). Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa.